WO2011052750A1 - 抗がん剤の感受性判定マーカー - Google Patents

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anticancer drug
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祐介 谷川原
鈴木　哲也
章戸 西牟田
伸二 杉本
義晃 五十嵐
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株式会社ヤクルト本社
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Definitions

  • the present invention relates to an anticancer drug sensitivity determination marker used for determining whether or not a cancer of a subject patient has therapeutic reactivity to an anticancer drug, and its application.
  • anticancer agents such as alkylating agents, platinum preparations, antimetabolites, anticancer antibiotics, and anticancer plant alkaloids. These anticancer drugs may or may not be effective depending on the type of cancer. However, it is known that some types of cancer that are recognized as effective may or may not be effective depending on the individual patient. Whether or not an anticancer drug shows an effect on such individual patient's cancer is called anticancer drug sensitivity.
  • CPT-11 Irinotecan hydrochloride
  • CPT-11 is an anticancer agent developed in Japan and having an action mechanism of topoisomerase I inhibition.
  • CPT-11 was approved in January 1994 as an effective drug for non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, cervical cancer and ovarian cancer, and in July 1995, gastric cancer, colorectal cancer, breast cancer Indications for squamous cell carcinoma and malignant lymphoma are recognized.
  • CPT-11 occupies the position of a global standard therapeutic agent as a first-line drug or second-line drug for multi-drug combination therapy particularly in the region of colorectal cancer, and its usefulness has been recognized (Non-patent Documents 1 to 6). .
  • Chemotherapy for advanced and metastatic colorectal cancer is centered on key drugs such as CPT-11 and oxaliplatin, which appeared in the 1990s, and fluorouracil (5-FU), which has been a central treatment for colorectal cancer.
  • the combined use with the fluorinated pyrimidine preparation dramatically improved clinical outcomes including survival.
  • the response rate is still around 50%, and in the current situation, half of the patients who received anticancer drugs at the high risk of serious side effects have not been effective.
  • the cancer chemotherapy treatment schedule is long-term, and after determining how many cool treatments have been performed while observing the occurrence of side effects, it is determined whether the effect has been obtained or whether the administration should be continued as is. Until then, it took a long time, expensive medical expenses, and side effects have occurred. Therefore, if there is a means for predicting whether or not an effect can be obtained for each patient before treatment or at an early stage of treatment, the burden on the patient and the occurrence of side effects can be reduced, and medical costs can be reduced.
  • CPT-11 itself has antitumor activity, it is activated by carboxyesterase in the body and has an antitumor activity of about 100 to several thousand times stronger than CPT-11 (7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN-38)). ). It is considered that CPT-11 and SN-38 are present in the body at the same time to exhibit an antitumor effect.
  • SN-38 is glucuronidated by UDP-glucuronosyltransferase (UGT) in hepatocytes to become a non-cytotoxic SN-38 glucuronide conjugate (SN-38G), mainly in bile It is excreted and transferred to the intestinal tract, and then excreted in the stool.
  • UDP-glucuronosyltransferase UDP-glucuronosyltransferase
  • SN-38G non-cytotoxic SN-38 glucuronide conjugate
  • a part of SN-38G excreted in the intestinal tract is deconjugated by ⁇ -glucuronidase contained in the intestinal bacterium to become active SN-38 again, and is reabsorbed through the intestinal epithelial transporter to enter the intestinal liver circulation, intestinal epithelium. It undergoes metabolism and excretion through steps such as glucuronidation by UGT in cells (Non-patent Document 7).
  • SN-38 is thought to damage the intestinal mucosa and induce diarrhea. It also affects the bone marrow where cell division is active and has been shown to cause erythrocyte depletion, leukopenia and thrombocytopenia.
  • Tumor-side factors involved in CPT-11 sensitivity or resistance include the presence or absence of the mutation and expression level of SN-38 target topoisomerase I, and carboxylesterase activity involved in the conversion of CPT-11 to SN-38 (non- (Patent Document 9), reports on the involvement of transporters (multidrug resistance protein (MRP) -1, MRP-2, breast cancer resistant protein (BCRP) / ABCG2) affecting the amount of intracellular accumulation of CPT-11 and SN-38
  • MRP multidrug resistance protein
  • BCRP breast cancer resistant protein
  • / ABCG2 cell proliferation antigen Ki-67, tumor suppressor gene p53, and the like have also been investigated for their association with the responsiveness to treatment with CPT-11.
  • Non-patent Document 10 plasma levels of Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1), which has anti-apoptotic effects, may be significantly correlated with the clinical prognosis of CPT-11 + 5-FU combination therapy for metastatic colorectal cancer Recently reported (Non-Patent Document 11).
  • Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 Tissue inhibitor of metalloproteinase-1
  • Non-patent Document 12 there is a report that no clear relationship was found with the therapeutic response of 11 combination therapy (Non-patent Document 12), and no clear biomarker that can predict the therapeutic response has been established.
  • An object of the present invention is to provide an anticancer drug sensitivity determination marker capable of discriminating treatment responsiveness of individual patients and a new cancer treatment means using the same.
  • the present inventors cultured human cancer cell lines and comprehensively analyzed changes in intracellular metabolism after exposure to SN-38 using capillary electrophoresis-time-of-flight mass spectrometer (CE-TOFMS).
  • CE-TOFMS capillary electrophoresis-time-of-flight mass spectrometer
  • a marker for determining sensitivity to an anticancer drug was searched, a peak in which a significant increase in intracellular level was observed after SN-38 exposure in SN-38 low-sensitivity cells or SN-38 exposure in SN-38 high-sensitivity cells
  • asparagine and aspartic acid have been found to show changes in intracellular levels different from the control group after SN-38 exposure in SN-38 highly sensitive cells or SN-38 low sensitive cells. It was found that the value calculated by dividing the aspartic acid ratio by the ratio of asparagine to aspartic acid when SN-38 was not exposed was a marker for determining the sensitivity of anticancer agents. Furthermore, the present inventors cultured eight types of human cancer cell lines and searched for anticancer drug sensitivity determination markers using CE-TOFMS for their intracellular metabolites.
  • a metabolite whose intracellular level increased with a decrease in sensitivity to cancer drugs was found, and the metabolite was found to be a substance on the metabolic system involving GABA, 1-methyladenosine and glutathione (GSH).
  • GABA 1-methyladenosine and glutathione
  • the concentration of these metabolites in a biological sample derived from a cancer patient or the ratio of the above metabolite concentrations is used as an index
  • the cancer of the cancer patient against anticancer drugs It is possible to determine whether or not there is sensitivity, and it is possible to screen for anticancer drug sensitivity-enhancing agents by using the concentration and fluctuation of these metabolites and the ratio of the metabolite concentration as an index, and
  • the present inventors have found that the therapeutic effect of the anticancer agent can be drastically improved by using a cancer drug sensitivity enhancing agent in combination with the anticancer agent that is the subject of sensitivity enhancement, and the present invention has been completed.
  • metabolite B A molecule detected as an anion of 99 to 153.00
  • the present invention also provides a method for determining sensitivity to an anticancer agent, characterized by measuring the above-mentioned substance in a specimen.
  • the present invention also provides a kit for carrying out a method for determining sensitivity to an anticancer agent, comprising a protocol for measuring the above substances. Furthermore, the present invention provides a method for screening an anticancer agent sensitivity enhancer using the expression variation of the substance as an index. Furthermore, this invention provides the anticancer agent sensitivity enhancer obtained by said screening method. Furthermore, this invention provides the composition for cancer treatment which combines said anticancer agent sensitivity enhancer and the anticancer agent used as the object of sensitivity enhancement. Furthermore, this invention provides said substance for determining anticancer agent sensitivity.
  • the anticancer drug treatment reactivity of each patient can be accurately determined before anticancer drug administration or early after anticancer drug administration, It is possible to select anti-cancer drugs with higher therapeutic effects, and as a result, it is possible to prevent the progression of cancer and the increase in side effects associated with continuous administration of anti-cancer drugs that cannot be expected to have therapeutic effects, and further reduce the burden on patients. Reduction of medical expenses can also be expected.
  • this marker it is possible to screen for drugs that enhance the sensitivity of anticancer drugs, and if the anticancer drug and anticancer drug sensitivity-enhancing agent are used in combination, the effect of cancer treatment will jump dramatically. Improve.
  • the measurement reagent of the anticancer drug sensitivity determination marker of the present invention is useful as an anticancer drug sensitivity determination reagent.
  • FIG. 3 is a graph showing changes over time in the average survival rate of HT-29 and HCT-116 cells upon exposure to 50 nmol / L SN-38. It is a figure which shows the time-dependent change of the intracellular level of the metabolite A after SN-38 exposure in HT-29 and HCT-116. It is a figure which shows the time-dependent change of the intracellular level of the metabolite B after SN-38 exposure in HT-29 and HCT-116. It is a figure which shows the time-dependent change of the intracellular level of 2-methylbutyroylcarnitine after SN-38 exposure in HT-29 and HCT-116.
  • HCT-116 is a view showing the change over time in the intracellular levels of BH 2 after SN-38 exposure. It is a figure which shows the time-dependent change of the intracellular level of the metabolite D after SN-38 exposure in HT-29 and HCT-116. It is a figure which shows the time-dependent change of the intracellular level of glycerol 3-phosphate after SN-38 exposure in HT-29 and HCT-116. It is a figure which shows the time-dependent change of the intracellular level of GABA after SN-38 exposure in HT-29 and HCT-116.
  • Anticancer drug sensitivity determination markers in the present invention are metabolites A, B, D, glycerol triphosphate, dihydrobiopterin, GABA, lactic acid, asparagine, aspartic acid, 2-methylbutyroylcarnitine, 1-methyladenosine, glutathione And a molecule selected from substances on the metabolic system in which these molecules are involved (hereinafter also referred to as “metabolic substances”).
  • the molecule to be detected In addition, all substances in the metabolic system that change the concentration of these molecules are included. These substances include substances that enhance and inhibit metabolism to these molecules, and promote metabolism from these molecules. Substances, inhibiting substances, etc. are mentioned.
  • One of the anticancer drug sensitivity determination markers in the present invention is glycerol triphosphate or a substance on a metabolic system (also referred to as a glycerol 3-phosphate metabolite) involved in the glycerol triphosphate.
  • a metabolic system also referred to as a glycerol 3-phosphate metabolite
  • all substances that vary the concentration of glycerol triphosphate in the metabolic system are included, substances that enhance metabolism, substances that inhibit metabolism, substances that promote metabolism from glycerol triphosphate, Inhibiting substances are included. Of these, glycerol triphosphate is particularly preferred.
  • One of the anticancer drug sensitivity determination markers in the present invention is dihydrobiopterin (BH 2 ) or a substance on the metabolic system (also referred to as BH 2 metabolite), which includes BH 2 in addition to BH 2 . Included are all substances that change the concentration of BH 2 in the metabolic system, such as substances that enhance metabolism to BH 2 , substances that inhibit, substances that promote metabolism from BH 2, and substances that inhibit. Of these, BH 2 is particularly preferred.
  • GABA anticancer drug susceptibility determination markers in the present invention
  • GABA or a substance on the metabolic system (also referred to as GABA metabolic substance) in which this is involved, and as this substance, in addition to GABA, the concentration of GABA in the metabolic system All substances that change the pH are included, including substances that enhance metabolism to GABA, substances that inhibit, substances that promote metabolism from GABA, and substances that inhibit. Of these, GABA is particularly preferred.
  • One of the anticancer drug sensitivity determination markers in the present invention is lactic acid or a substance on a metabolic system (also referred to as a lactic acid metabolic substance) in which this is involved, and as the substance, in addition to lactic acid, the concentration of lactic acid in the metabolic system All substances that change the pH are included, including substances that enhance metabolism to lactic acid, substances that inhibit, substances that promote metabolism from lactic acid, and substances that inhibit. Of these, lactic acid is particularly preferred.
  • One of the anticancer drug sensitivity determination markers in the present invention is asparagine, aspartic acid, or a substance on a metabolic system involving these. These ratios are important in the case of asparagine and aspartic acid, specifically the ratio of asparagine to aspartic acid calculated from the concentrations of asparagine and aspartic acid, more specifically asparagine when exposed to anticancer drugs. Calculated by dividing the ratio of aspartic acid to asparagine to aspartic acid without exposure to anticancer drugs
  • asparagine and aspartic acid-related substances can be used as substances used for calculating the ratio. Include all substances that change the concentration of asparagine and aspartic acid in the metabolic system, asparagine, substances that enhance metabolism to aspartate, inhibitors, asparagine, substances that promote metabolism from aspartate, inhibit Examples include substances. Of these, asparagine and aspartic acid are particularly preferred.
  • One of the anticancer drug susceptibility determination markers in the present invention is 2-methylbutyroylcarnitine or a substance on a metabolic system (also referred to as 2-methylbutyroylcarnitine metabolite) that involves this,
  • 2-methylbutyroylcarnitine a substance on a metabolic system
  • all substances that change the concentration of 2-methylbutyroylcarnitine in the metabolic system are included, and substances that enhance or inhibit metabolism to 2-methylbutyroylcarnitine, 2- Substances that promote or inhibit metabolism from methylbutyroylcarnitine.
  • 2-methylbutyroylcarnitine is particularly preferred.
  • One of the anticancer drug sensitivity determination markers in the present invention is 1-methyladenosine or a substance on a metabolic system (also referred to as a 1-methyladenosine metabolite), which includes 1-methyladenosine.
  • a 1-methyladenosine metabolite also referred to as a 1-methyladenosine metabolite
  • all substances that change the concentration of 1-methyladenosine in the metabolic system are included, substances that enhance metabolism, substances that inhibit metabolism, substances that promote metabolism from 1-methyladenosine, Inhibiting substances are included. Of these, 1-methyladenosine is particularly preferred.
  • One of the anti-cancer drug sensitivity determination markers in the present invention is glutathione or a substance on the metabolic system (also referred to as glutathione metabolic substance) in which this is involved, and the substance includes glutathione and glutathione concentration in the metabolic system. All substances that change the pH are included, including substances that enhance metabolism to glutathione, substances that inhibit, substances that promote metabolism from glutathione, and substances that inhibit.
  • glutathione, hypotaurine, 1-methylnicotinamide, taurine, glutathione disulfide (GSSG), S-adenosylhomocysteine, nicotinamide, ⁇ -glutamylcysteine ( ⁇ -Glu-Cys), and spermine are preferred, and glutathione is particularly preferred.
  • Hypotaurine and 1-methylnicotinamide are preferred.
  • the metabolite A, B, 2-methylbutyroylcarnitine showed a significant increase in intracellular levels after exposure to SN-38 in HT-29, which is less sensitive to SN-38. .
  • HCT-116 which is highly sensitive to SN-38, no significant change in intracellular level was observed. Therefore, these substances are particularly useful as markers for determining sensitivity to anticancer agents such as CPT-11 and SN-38.
  • Metabolite D, glycerol triphosphate, BH 2 , and lactic acid showed a significant increase in intracellular levels in HCT-116, which is highly sensitive to SN-38 after exposure to SN-38. It was. On the other hand, in HT-29, which is less sensitive to SN-38, there was no significant change in intracellular level. Therefore, these substances are particularly useful as markers for determining sensitivity to anticancer agents such as CPT-11 and SN-38.
  • GABA showed a marked increase in intracellular level in HT-29, which is less sensitive to SN-38, after exposure to SN-38.
  • HCT-116 which is highly sensitive to SN-38, no significant change in intracellular level was observed.
  • intracellular level was high in HT-29 having a low sensitivity to SN-38, and intracellular level was low in HCT-116 having a high sensitivity to SN-38.
  • GABA is particularly useful as a marker for determining sensitivity to anticancer agents such as CPT-11 and SN-38.
  • Asparagine as shown in the examples below, showed a variation in intracellular levels of HCT-116, which is highly sensitive to SN-38, different from the control group after SN-38 exposure, but HT-, which is sensitive to SN-38. In 29, there was no difference in intracellular level between the SN-38 exposed group and the control group.
  • aspartic acid as shown in the examples described later, showed a change in intracellular level different from the control group after exposure to SN-38 in HT-29, which was SN-38 low sensitive, but it was highly sensitive to SN-38. In one HCT-116, there was no difference in intracellular level between the SN-38 exposed group and the control group.
  • 1-Methyladenosine and glutathione metabolites were examined using 8 types of human cancer cell lines, as shown in the examples below. As a result, the sensitivity of SN-38 to these substances in cells decreased. Level increased. Therefore, 1-methyladenosine and glutathione metabolites are particularly useful as markers for determining sensitivity to anticancer agents such as CPT-11 and SN-38.
  • the anticancer agent that is a target of the anticancer drug sensitivity determination marker of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include CPT-11, SN-38, oxaliplatin, cyclophosphamide, ifosfamide, Thiotepa, melphalan, busulfan, nimustine, ranimustine, dacarbazine, procarbazine, temozolomid, temozolomid, temozol , Nedaplatin, methotrexate method, pemetrexed, fluorouracil, tegafur / uracil, doxyfluridine, tegafur / teracil, tegafur / cite Enocitabine, gemcitabine, 6-mercaptopurine, fludarabine, pentostatin, cladribine, hydroxyurea (hy) roxyurea, doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, idarubi
  • Medroxyprogesterone anastrozole, exemestane, letrozole, rituximab, imatinib, gefitinib (gefinib) inib), gemtuzumab ozogamicin (gemtuzumab ozogamicin), bortezomib (bortezomib), erlotinib (erlotinib), cetuximab (cetuximab), bevacizumab (bevacizumab), sunitinib (sunitinib), sorafenib (sorafenib), dasatinib (dasatinib), panitumumab (panitumumab) , Asparaginase, tretinoin, arsenic trioxide, or salts thereof, or active metabolites thereof, among which plant alkaloid anticancer agents such as CPT-11, SN-38 or a salt thereof is preferred.
  • these metabolic substances in a sample may be measured.
  • the specimen include biological samples derived from subjects having cancer (cancer patients) such as blood, serum, plasma, urine, tumor tissue / cells, ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid, stool, sputum, and the like. Serum is particularly preferred.
  • lip, oral and pharyngeal cancer typified by pharyngeal cancer
  • digestive organ cancer typified by esophageal cancer
  • stomach cancer colon / rectal cancer
  • lung cancer Respiratory and intrathoracic organ cancer, bone and joint cartilage cancer, cutaneous malignant melanoma, squamous cell carcinoma and other skin cancers, mesothelioma and mesothelioma Tissue cancer, breast cancer, uterine cancer, female genital cancer represented by ovarian cancer, male genital cancer represented by prostate cancer, urinary tract cancer represented by bladder cancer, brain tumor Representative eye, brain and central nervous system cancer, thyroid and other endocrine adenocarcinoma, non-Hodgkin lymphoma, lymphoid leukemia, lymphoid tissue, hematopoietic tissue and related tissue cancer, and these as the primary focus Include metastatic tissue cancers, especially non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, small cell lung cancer, small cell lung
  • the means for measuring these metabolic substances in a sample may be appropriately determined depending on the substance to be measured.
  • CE-TOFMS various mass spectrometers such as gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), HPLC, immunological It can be measured by a measurement method, biochemical measurement method or the like.
  • GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
  • HPLC HPLC
  • immunological It can be measured by a measurement method, biochemical measurement method or the like.
  • these metabolisms in biological samples derived from cancer patients before and after the administration of the anticancer drug are used. If the concentration of these metabolic substances increases after administration compared to before administration of the anticancer drug, the cancer is not anticancer drug sensitive and its metabolism before and after administration of the anticancer drug. If the concentration of the system substance does not change, it can be determined that the cancer is sensitive to an anticancer drug. In the early stage after administration of an anticancer drug, if the concentration of these metabolic substances is determined to be higher than a predetermined standard concentration, the cancer is against the targeted anticancer drug. It can be determined that there is no sensitivity.
  • the anticancer drug sensitivity determination marker in the present invention not only determines the anticancer drug treatment responsiveness, but also prevents an increase in side effects associated with continuous administration of an anticancer drug that cannot be expected to have a medicinal effect. Contribute greatly.
  • the cancer is sensitive to the anticancer drug. If the concentration of these metabolic substances increases after administration compared to before administration of the anticancer drug, the cancer is sensitive to the anticancer drug. If the concentration of the metabolic substance does not change, it can be determined that the cancer is not sensitive to an anticancer drug. In the early stage after administration of an anticancer drug, if the concentration of these metabolic substances is determined to be lower than a predetermined standard concentration, the cancer is against the targeted anticancer drug. It can be determined that there is no sensitivity.
  • the anticancer drug sensitivity determination marker in the present invention not only determines the anticancer drug treatment responsiveness, but also prevents an increase in side effects associated with continuous administration of an anticancer drug that cannot be expected to have a medicinal effect. Contribute greatly.
  • the concentration of these metabolic substances in a biological sample derived from a cancer patient before and after administration of the anticancer agent is measured, and the anticancer agent is measured. If the concentration of these metabolic substances increases after administration compared to before administration, the cancer is not sensitive to anticancer drugs, and if the concentration of these metabolic substances does not change before and after administration of anticancer drugs, Can be determined to be sensitive to anticancer drugs. In addition, if the concentration of these metabolic substances is determined to be higher than a predetermined standard concentration before or after the administration of the anticancer agent, the cancer is the target anticancer agent. It can be determined that there is no sensitivity to.
  • the anticancer drug sensitivity determination marker in the present invention not only determines the anticancer drug treatment responsiveness, but also prevents an increase in side effects associated with continuous administration of an anticancer drug that cannot be expected to have a medicinal effect. Contribute greatly.
  • the concentrations of asparagine and aspartic acid in biological samples derived from cancer patients before and after administration of the anticancer drug If the ratio of asparagine to aspartic acid after administration is higher than that before administration of the anticancer drug, the cancer is sensitive to the anticancer drug, and asparagine to aspartic acid before and after administration of the anticancer drug. If the ratio decreases, it can be determined that the cancer is not sensitive to anticancer drugs. In addition, if the ratio of asparagine to aspartic acid is determined to be lower than a predetermined standard at an early stage after administration of the anticancer drug, the cancer is sensitive to the target anticancer drug.
  • the anticancer drug sensitivity determination marker in the present invention not only determines the anticancer drug treatment responsiveness, but also prevents an increase in side effects associated with continuous administration of an anticancer drug that cannot be expected to have a medicinal effect. Contribute greatly.
  • the concentration of these metabolite substances should be higher than a predetermined standard concentration before administration of the anticancer drug. If it has the determined concentration, it can be determined that the cancer is not sensitive to the anticancer agent of interest. If there is no sensitivity to the targeted anticancer drug, its efficacy cannot be expected, and if the administration of an anticancer drug that cannot be expected to have such efficacy is continued, There is concern about progression and increased side effects.
  • the anticancer drug sensitivity determination marker in the present invention not only determines the anticancer drug treatment responsiveness, but also prevents an increase in side effects associated with continuous administration of an anticancer drug that cannot be expected to have a medicinal effect. Contribute greatly.
  • kits including a protocol for measuring these metabolic substances in a sample.
  • the kit includes a reagent for measuring these metabolic substances, a method for using the measuring reagent, a standard for determining the presence or absence of anticancer drug sensitivity, and the like.
  • These standards include standard concentrations and standard ratios of these metabolites, concentrations and ratios that are judged to be high, concentrations and ratios that are judged to be low, factors that affect measurement results, and the extent of the impact. These concentrations can be set for each target anticancer agent. Using the reference, it can be determined as described above.
  • an anticancer drug sensitivity-enhancing agent can be screened. That is, substances that reduce the concentration of metabolites A, B, 2-methylbutyroylcarnitine, GABA, 1-methyladenosine, and glutathione metabolites in vitro or in vivo before exposure to anticancer agents, anticancer agents Substances that suppress fluctuations or reduce concentrations after exposure increase sensitivity to anticancer drugs.
  • intracellular metabolites A, B, 2-methylbutyroylcarnitine, GABA, 1-methyladenosine, glutathione The substance that decreases the concentration of the metabolic substance is a substance that enhances the sensitivity of the anticancer drug (anticancer drug sensitivity enhancer). In vitro, it also suppresses changes in intracellular metabolites A, B, 2-methylbutyroylcarnitine, GABA, 1-methyladenosine, and glutathione metabolites after exposure to anticancer drugs in various cancer cell lines.
  • the substance that enhances the sensitivity of the anticancer drug is an anticancer drug sensitivity enhancer.
  • anticancer agent sensitivity enhancer Can be screened. That is, a substance that promotes fluctuation or increases the concentration of metabolite D, glycerol triphosphate, BH 2 , and lactic acid after exposure to an anticancer agent in vitro or in vivo enhances anticancer agent sensitivity.
  • substances that promote changes in metabolites D, glycerol triphosphate, BH 2 , and lactic acid in cells after exposure to anticancer agents in various cancer cell lines are sensitive to the anticancer agents.
  • anticancer agent sensitivity enhancer It is a substance (anticancer agent sensitivity enhancer) that enhances In vivo, substances that promote or increase the concentration of metabolites D, glycerol triphosphate, BH 2 , and lactic acid after exposure to anticancer drugs in cancer-bearing animals are sensitive to the anticancer drugs. It is a substance (anticancer agent sensitivity enhancer) that enhances
  • anticancer drug sensitivity-enhancing agents can be screened by using asparagine to aspartic acid ratio change after exposure to an anticancer drug, specifically, an increase in the ratio as an index. That is, a substance that increases the ratio of asparagine and aspartic acid concentration after exposure to an anticancer agent in vitro or in vivo enhances the sensitivity of the anticancer agent. For example, in vitro, substances that increase the ratio of asparagine and aspartic acid concentrations in cells after exposure to anticancer drugs in various cancer cell lines are substances that enhance the sensitivity of the anticancer drugs (anticancer drugs). Agent sensitivity enhancer).
  • a substance that increases the ratio of asparagine and aspartic acid concentration after exposure to an anticancer drug in a cancer-bearing animal is a substance that enhances the sensitivity of the anticancer drug (an anticancer drug sensitivity enhancer).
  • an anticancer drug sensitivity enhancer As the ratio of these concentrations, a value calculated by dividing the ratio of asparagine to aspartic acid at the time of anticancer drug exposure by the ratio of asparagine to aspartic acid at the time of non-anticancer drug exposure may be used.
  • an anticancer agent sensitivity-enhancing agent can be screened with high sensitivity and sensitivity.
  • antimetabolite drugs can be screened using metabolites A, B, 2-methylbutyroylcarnitine, GABA, 1-methyladenosine, and glutathione metabolites as indicators. That is, if the concentration of these metabolic substances varies in vitro or in vivo depending on a certain substance, the substance is an anticancer agent. For example, in vitro, the concentration of metabolites A, B, 2-methylbutyroylcarnitine, GABA, 1-methyladenosine and glutathione metabolites after exposure of a substance to various cancer cell lines is higher than before exposure. If it fluctuates, the substance is an anticancer drug.
  • the substance is an anticancer agent.
  • anticancer drugs that can be expected to have a medicinal effect, the concentration fluctuations of these metabolic substances appear faster than the tumor shrinkage or cell killing effect. It can be determined whether or not the substance is useful as an anticancer agent. A significant effect can be expected from the viewpoint of reducing labor and costs associated with the development of anticancer drugs.
  • anticancer agents can be screened using metabolites D, glycerol triphosphate, BH 2 , and lactic acid as indices. That is, if the concentration of these metabolic substances is increased by a certain substance in vitro or in vivo, the substance is an anticancer agent. For example, in vitro, if a substance is exposed to various cancer cell lines and the concentrations of metabolite D, glycerol triphosphate, BH 2 , and lactic acid metabolites increase compared to before the exposure, It is a cancer drug. Moreover, if the concentration of these metabolic substances increases after administering a substance to a cancer-bearing animal, the substance is an anticancer agent.
  • anticancer drugs that can be expected to have a medicinal effect, the increase in the concentration of these metabolic substances appears earlier than the tumor reduction or cell killing effect. It can be determined whether or not the substance is useful as an anticancer agent. A significant effect can be expected from the viewpoint of reducing labor and costs associated with the development of anticancer drugs.
  • anticancer agents can be screened using the ratio of aspartic acid to aspartic acid as an index. That is, if the ratio of asparagine to aspartic acid concentration is increased by a certain substance in vitro or in vivo, the substance is an anticancer agent. For example, in vitro, if a substance is exposed to various cancer cell lines and the ratio of asparagine to aspartic acid concentration is increased compared to before exposure, the substance is an anticancer agent. In addition, if a ratio of asparagine and aspartic acid concentration increases after administering a substance to a cancer-bearing animal, the substance is an anticancer agent.
  • the increase in the ratio of asparagine and aspartic acid appears faster than the tumor shrinkage or cell killing effect, so screening using the ratio of asparagine and aspartic acid as an index is more effective.
  • the substance is useful as an anticancer agent can be determined by a short examination. A significant effect can be expected from the viewpoint of reducing labor and costs associated with the development of anticancer drugs.
  • a ratio of asparagine and aspartic acid concentration a value calculated by dividing the ratio of asparagine to aspartic acid when the test substance is exposed by the ratio of asparagine to aspartic acid when the test substance is not exposed may be used.
  • anticancer agents can be screened with high sensitivity and sensitivity.
  • the combined form of the anticancer agent sensitivity-enhancing agent and the anticancer agent targeted for sensitivity enhancement may be a single composition containing both of these components. There may be. In addition, these components may be different administration routes.
  • Anticancer agents to be used here are the same as those described above, and include CPT-11, SN-38, oxaliplatin, cyclophosphamide, ifosfamide, thiotepa, melamine.
  • Example 1 (1) Method (a) Cells used Two types of human colon cancer cell lines (HCT-116, HT-29) were used. These cells were obtained from Yakult Honsha. The culture was performed in a medium (Doulbecco's modified Eagle's Medium, 10% Fetal Bovine Serum) at 37 ° C., 5% CO 2 with ⁇ 100 mm / Tissue Culture Dish (IWAKI). (B) Drug SN-38 bulk powder was obtained from Yakult Honsha Co., Ltd. SN-38 was dissolved in DMSO and diluted in each experiment so that the concentration of DMSO in the medium was 0.1% or less.
  • a Cells used Two types of human colon cancer cell lines (HCT-116, HT-29) were used. These cells were obtained from Yakult Honsha. The culture was performed in a medium (Doulbecco's modified Eagle's Medium, 10% Fetal Bovine Serum) at 37 ° C., 5% CO 2 with ⁇ 100 mm / Tissue Culture
  • composition estimation was advanced using analysis software Analyst TM QS (Applied Biosystems, Inc.).
  • KEGG Life System Information Integrated Database (http://www.kegg.jp/) prepared by Kyoto University
  • this peak was found to be glycerol 3-phosphorus. It was found to be an acid.
  • the examination using the glycerol triphosphate preparation also confirmed the coincidence of the migration time of capillary electrophoresis.
  • the estimation of the composition was advanced using CE-QTOFMS.
  • a substance estimated from this ionic composition was searched using Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca/), it was found that this peak was dihydrobiopterin.
  • a study using dihydrobiopterin preparations also confirmed the coincidence of capillary electrophoresis migration times.
  • the estimation of the composition was advanced using the analysis software Analyst TM QS (Applied Biosystems, Inc.).
  • KEGG Life System Information Integration Database (http://www.kegg.jp/) created by Kyoto University, a substance estimated from this ionic composition was searched, and this peak was lactic acid. It has been found. Examination using a lactic acid sample confirmed that the migration times of capillary electrophoresis were consistent.
  • both cells were compared for the control group, and a peak with a large difference was extracted.
  • a characteristic change was shown, which was considered to be a metabolite associated with SN-38 sensitivity (FIG. 8).
  • the estimation of the composition was advanced using analysis software Analyst TM QS (Applied Biosystems, Inc.).
  • the ion composition of m / z 104.070 as the candidate peak was C 4 H 10 NO 2 .
  • KEGG Life System Information Integrated Database
  • this peak was found to be ⁇ -aminobutyric. It was found to be acid (GABA). Examination using the GABA standard confirmed that the migration time of capillary electrophoresis was consistent.
  • the estimation of the composition was advanced using analysis software Analyst TM QS (Applied Biosystems, Inc.).
  • KEGG Life System Information Integrated Database
  • the estimation of the composition was advanced using analysis software Analyst TM QS (Applied Biosystems, Inc.).
  • KEGG Life System Information Integration Database (http://www.kegg.jp/) created by Kyoto University, we searched for substances estimated from this ion composition. It turned out to be.
  • aspartic acid preparations it was confirmed that the migration times of capillary electrophoresis coincided.
  • Example 2 (1) Method (a) Cells used Eight kinds of human colon cancer cell lines (HCT-116, HT-29, HCT-15, Lovo, LS174T, SW480, SW620, WiDr) were used. HCT-116 and HT-29 from Yakult Honsha Co., Ltd., Lovo, SW480 and WiDr from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd., HCT-15 and LS174T from Tohoku University Institute of Aging Medicine, SW620 for Sumisho Obtained from Pharma International Co., Ltd. (B) Drug SN-38 bulk powder was obtained from Yakult Honsha Co., Ltd. SN-38 was dissolved in DMSO and diluted in each experiment so that the concentration of DMSO in the medium was 0.1% or less.
  • HCT-116 and HT-29 from Yakult Honsha Co., Ltd.
  • Lovo, SW480 and WiDr from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
  • HCT-15 and LS174T from To
  • Example 3 (1) Method The experiment similar to Example 2 was repeated once again, and further detailed analysis was performed on the data obtained from a total of three experiments. The peak detected by CE-TOFMS from each cell sample was compared with 278 sample data whose m / z and migration time had already been confirmed, and 146 metabolisms confirmed to be detected in any cell. The thing was identified. With respect to these 146 metabolites, the relationship between the intracellular amount of each of the eight types of human colon cancer cells and the Log [IC 50 ] of each cell was examined by single regression analysis.

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Abstract

　個々の患者の治療反応性を判別できる抗がん剤感受性判定マーカー及びそれを利用する新たながん治療手段を提供する。　質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ＝１４９．０５～１４９．０６の陰イオンとして検出される分子、ｍ／ｚ＝１５２．９９～１５３．００の陰イオンとして検出される分子、ｍ／ｚ＝７２４．３４～７２４．３５の陽イオンとして検出される分子、グリセロール３リン酸、ジヒドロビオプテリン、ＧＡＢＡ、乳酸、アスパラギン、アスパラギン酸、２－メチルブチロイルカルニチン及び１－メチルアデノシン、グルタチオンから選ばれる１以上の分子、及び／又はそれら分子が関与する代謝系上の物質からなる抗がん剤感受性判定マーカー。

Description

抗がん剤の感受性判定マーカー
　本発明は、対象となる患者のがんが、抗がん剤に治療反応性を有するか否かを判定するために用いる抗がん剤感受性判定マーカー及びその応用に関する。
　抗がん剤には、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、抗がん性植物アルカロイド等の種類がある。そしてこれらの抗がん剤にはがんの種類によって効果を示す場合と効果を示さない場合がある。しかし、有効であると認められている種類のがんであっても、個々の患者によって効果を示す場合と効果を示さない場合があることが知られている。このような個々の患者のがんに対して抗がん剤が効果を示すか否かを抗がん剤感受性という。
　塩酸イリノテカン（ＣＰＴ－１１）は日本で開発されたｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩ阻害という作用機序を有する抗がん剤である。日本において、ＣＰＴ－１１は、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸癌、卵巣癌に有効な薬剤として１９９４年１月に認可され、さらに１９９５年７月に胃癌、結腸・直腸癌、乳癌、有棘細胞癌、悪性リンパ腫に対する適応が認められている。ＣＰＴ－１１は特に大腸癌の領域で多剤併用療法のｆｉｒｓｔ　ｌｉｎｅ　ｄｒｕｇあるいはｓｅｃｏｎｄ　ｌｉｎｅ　ｄｒｕｇとして世界的な標準治療薬の位置を占め、その有用性が認められている（非特許文献１～６）。
　進行性・転移大腸癌に対する化学療法は、１９９０年代に登場したＣＰＴ－１１、オキサリプラチンなどのｋｅｙ　ｄｒｕｇと、それまで大腸癌治療の中心的薬剤であったフルオロウラシル（５－ＦＵ）を中心とするフッ化ピリミジン製剤とを併用することにより、生存率をはじめとする臨床成績が劇的に改善された。しかしそれでもなお奏効率はおよそ５０％程度であり、重篤な副作用という高リスクを冒して抗がん剤が投与された患者の半分では効果が得られていないのが現状であり、個々の治療反応性（レスポンダー・ノンレスポンダー）を判別する抗がん剤感受性予測マーカーの確立は急務である。
　一般的に、がん化学療法の治療スケジュールは長期に渡り、副作用の発現を見ながら何クールか繰り返し治療を行った後で、効果が得られているか、そのまま投与を続けるべきか判断するが、それまでには長い時間と高額な医療費がかかり、副作用の発現も起こっているのが事実である。よって、個々の患者に対し、効果が得られるかどうかを治療前あるいは治療早期に予測できる手段があれば、患者の負担や副作用の発現を軽減し、医療費を削減することができる。
　ＣＰＴ－１１はそれ自体抗腫瘍活性を有するものの、体内でＣａｒｂｏｘｙｌ　ｅｓｔｅｒａｓｅにより活性化され、ＣＰＴ－１１に比べおよそ１００～数千倍強い抗腫瘍活性を有する７－ｅｔｈｙｌ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ（ＳＮ－３８）へと変換される。ＣＰＴ－１１とＳＮ－３８が同時に体内に存在することで抗腫瘍効果を呈すると考えられている。ＳＮ－３８は肝細胞内でＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ：ＵＤＰ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によりグルクロン酸抱合を受け、細胞毒性のないＳＮ－３８グルクロン酸抱合体（ＳＮ－３８Ｇ）となり、おもに胆汁中に排泄され腸管へと移行し、その後は便中に排泄される。腸管に排泄されたＳＮ－３８Ｇの一部は、腸内細菌が有するβ－グルクロニダーゼにより脱抱合され再び活性型のＳＮ－３８となり、腸管上皮のトランスポーターを介し再吸収され腸肝循環、腸上皮細胞内でのＵＧＴによるグルクロン酸抱合化などのステップを経ながら代謝・排泄を受ける（非特許文献７）。この際に、ＳＮ－３８が腸管粘膜を障害し、下痢を誘発すると考えられている。また、細胞分裂の活発な骨髄にも影響をおよぼし、赤血球減少・白血球減少・血小板減少を引き起こすことが認められている。
　重篤な下痢や好中球減少症などの副作用は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝多型がもたらすＳＮ－３８体内曝露量の変化が一因であることが示されている。しかし治療効果に関しては、プロドラッグであるＣＰＴ－１１から活性代謝物ＳＮ－３８への変換とその解毒、さらに腸管循環の過程におけるＳＮ－３８の再生成や、ＣＰＴ－１１自体の代謝と代謝物からのＳＮ－３８の生成といった体内動態の複雑性により、また、抗腫瘍効果が腫瘍側の要因により規定されることが多いため、薬物動態により治療効果を予測できるとする報告は未だなされていない。末梢血単核球細胞のカルボキシルエステラーゼｍＲＮＡ発現量がＳＮ－３８とＳＮ－３８ＧのＡＵＣ比とは相関するものの腫瘍縮小効果とは相関がなかったとする報告もなされている（非特許文献８）。
　ＣＰＴ－１１感受性もしくは耐性に関与する腫瘍側の因子としては、ＳＮ－３８の標的であるｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩの変異の有無や発現量、ＣＰＴ－１１からＳＮ－３８への変換に関与するカルボキシルエステラーゼ活性（非特許文献９）、ＣＰＴ－１１やＳＮ－３８の細胞内蓄積量に影響するトランスポーター（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＲＰ）－１、ＭＲＰ－２、Ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＣＲＰ）／ＡＢＣＧ２）の関与が報告されており、その他、細胞増殖抗原Ｋｉ－６７、がん抑制遺伝子ｐ５３などもＣＰＴ－１１を用いた治療への反応性との関連が検討されている。ごく最近、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて抗がん剤感受性データとマイクロアレイのデータを組み合わせることで体系的に抗癌剤感受性を予測しようとする試みがなされており、カンプトテシン類ではトポテカンについて検討されている（非特許文献１０）。臨床研究においては、抗アポトーシス作用をもつＴｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１　（ＴＩＭＰ－１）の血漿中レベルが、転移結腸・直腸癌に対するＣＰＴ－１１＋５－ＦＵ併用療法の臨床予後と有意に相関することが最近報告されている（非特許文献１１）。このようにＣＰＴ－１１感受性予測バイオマーカーの必要性が認識され多くの研究がなされているが、標的であるｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩについても、５－ＦＵ感受性予測因子とされるチミジル酸合成酵素とともに５－ＦＵ＋ＣＰＴ－１１併用療法の治療反応性との間に明確な関連性を見出せなかったとする報告もあるなど（非特許文献１２）、治療反応性を予測し得る明確なバイオマーカーは確立されていない。
Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ　１９９３；１１：９０９－９１３． Ｓｅｍｉｎ　Ｏｎｃｏｌ　１９９９；２６（１　Ｓｕｐｐｌ　５）：６－１２． Ｌａｎｃｅｔ　１９９８；３５２：１４０７－１４１２． Ｐｒｏ　ＡＳＣＯ　２００５；Ａｂｓｔｒａｃｔ　＃３５０６． Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　２０００；３４３：９０５－９１４． Ｌａｎｃｅｔ　２０００；３５５：１０４１－１０４７． Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　１９９１；５１：４１８７－４１９１． Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２００５；１１：６９０１－６９０７． Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２００７；１７：１－１０． Ｎａｔ　Ｍｅｄ　２００６；１２：１２９４－１３００． Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２００７；１３：４１１７－４１２２． Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　２００４；１１１：２５２－２５８．
　本発明の目的は、個々の患者の治療反応性を判別できる抗がん剤感受性判定マーカー及びそれを利用する新たながん治療手段を提供することにある。
　そこで本発明者らは、ヒトがん細胞株を培養し、ＳＮ－３８曝露後の細胞内代謝変動についてキャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）を用いて網羅的に解析し、抗がん剤感受性判定マーカーの探索を行ったところ、ＳＮ－３８低感受性細胞でＳＮ－３８曝露後細胞内レベルの顕著な上昇が認められるピーク或いはＳＮ－３８高感受性細胞でＳＮ－３８曝露後細胞内レベルの顕著な上昇が認められるピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ＝１４９．０５～１４９．０６の陰イオンとして検出される分子、ｍ／ｚ＝１５２．９９～１５３．００の陰イオンとして検出される分子、ｍ／ｚ＝７２４．３４～７２４．３５の陽イオンとして検出される分子、グリセロール３リン酸、ジヒドロビオプテリン（Ｄｉｈｙｄｒｏｂｉｏｐｔｅｒｉｎ；ＢＨ2）、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、乳酸、２－メチルブチロイルカルニチンであることを見出した。また、ＳＮ－３８高感受性細胞或いはＳＮ－３８低感受性細胞でＳＮ－３８曝露後コントロール群と異なる細胞内レベルの変動をアスパラギン、アスパラギン酸が示すことを見出し、ＳＮ－３８曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比をＳＮ－３８非曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比で除することによって算出される値が抗がん剤の感受性判定マーカーとなることを見出した。さらにまた、本発明者らは、８種類のヒトがん細胞株を培養し、それらの細胞内代謝物についてＣＥ－ＴＯＦＭＳを用いて抗がん剤感受性判定マーカーの探索を行ったところ、抗がん剤に対する感受性の低下に伴い細胞内レベルが上昇する代謝物を見出し、その代謝物がＧＡＢＡ、１－メチルアデノシン、グルタチオン（ＧＳＨ）が関与する代謝系上の物質であることを見出した。かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中のこれら代謝物の濃度や上記代謝物濃度の比を指標とすれば、当該がん患者のがんが抗がん剤に対する感受性を有するか否かを判定できること、また、これら代謝物の濃度や変動、上記代謝物濃度の比を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ＝１４９．０５～１４９．０６の陰イオンとして検出される分子（以下、代謝物Ａという）、ｍ／ｚ＝１５２．９９～１５３．００の陰イオンとして検出される分子（以下、代謝物Ｂという）、ｍ／ｚ＝７２４．３４～７２４．３５の陽イオンとして検出される分子（以下、代謝物Ｄという）、グリセロール３リン酸、ジヒドロビオプテリン、ＧＡＢＡ、乳酸、アスパラギン、アスパラギン酸、２－メチルブチロイルカルニチン、１－メチルアデノシン、グルタチオン及びそれら分子が関与する代謝系上の物質から選ばれる１以上の分子からなる抗がん剤感受性判定マーカーを提供するものである。
　また、本発明は、検体中の上記の物質を測定することを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を提供するものである。
　また、本発明は、上記の物質を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を実施するためのキットを提供するものである。
　さらに本発明は、上記の物質の発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法を提供するものである。
　さらにまた本発明は、上記のスクリーニング方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤を提供するものである。
　さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せてなるがん治療用組成物を提供するものである。
　さらに本発明は、抗がん剤感受性を判定するための上記の物質を提供するものである。
　本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いれば、個々の患者の抗がん剤治療反応性が抗がん剤投与前、或いは抗がん剤投与開始後早期に適確に判定できる結果、より治療効果の高い抗がん剤の選択が可能となり、その結果として治療効果の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行、副作用の増大を防止でき、さらには患者の負担軽減、医療費の削減も期待できる。また、このマーカーを用いれば、抗がん剤感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となった抗がん剤と抗がん剤感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの測定試薬は、抗がん剤感受性判定試薬として有用である。
５０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＳＮ－３８曝露時におけるＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６細胞の平均生存率の経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後の代謝物Ａの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後の代謝物Ｂの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後の２－メチルブチロイルカルニチンの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後のＢＨ2の細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後の代謝物Ｄの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後のグリセロール３リン酸の細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後のＧＡＢＡの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後の乳酸の細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後のアスパラギンの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露後のアスパラギン酸の細胞内レベルの経時的変化を示す図である。 ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６におけるＳＮ－３８曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比をＳＮ－３８非曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比で除することによって算出される値（［アスパラギン／アスパラギン酸］SN-38／［アスパラギン／アスパラギン酸］Control）の経時的変化を示す図である。 定常状態におけるＧＡＢＡの細胞内レベルと各がん細胞株におけるＳＮ－３８感受性との関係を示す図である。 ８種類のヒト大腸癌細胞株のＳＮ－３８に対する感受性を示す図である。 定常状態における１－メチルアデノシン、ＧＡＢＡ、ヒポタウリン、グルタチオン、１－メチルニコチンアミドの細胞内レベルと各がん細胞株におけるＳＮ－３８感受性との関係を示す図である。 定常状態におけるグルタチオン代謝系上の物質の細胞内レベルと各がん細胞株におけるＳＮ－３８感受性との関係を示す図である。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、代謝物Ａ、Ｂ、Ｄ、グリセロール３リン酸、ジヒドロビオプテリン、ＧＡＢＡ、乳酸、アスパラギン、アスパラギン酸、２－メチルブチロイルカルニチン、１－メチルアデノシン、グルタチオン、及びこれらの分子が関与する代謝系上の物質から選ばれる分子（以下、「代謝系物質」ということもある。）である。このうち、代謝物Ａ、Ｂ、Ｄとしては、キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ＝１４９．０５～１４９．０６の陰イオンとして検出される分子、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ＝１５２．９９～１５３．００の陰イオンとして検出される分子、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ＝７２４．３４～７２４．３５の陽イオンとして検出される分子である。また、これらの分子の濃度を変動させる代謝系上のすべての物質が含まれ、当該物質としては、これらの分子への代謝を亢進する物質、阻害する物質、これらの分子からの代謝を促進する物質、阻害する物質などが挙げられる。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーの一つは、グリセロール３リン酸又はこれが関与する代謝系上の物質（グリセロール３リン酸代謝系物質ともいう）であり、当該物質としてはグリセロール３リン酸の他、代謝系においてグリセロール３リン酸の濃度を変動させるすべての物質が含まれ、グリセロール３リン酸への代謝を亢進する物質、阻害する物質、グリセロール３リン酸からの代謝を促進する物質、阻害する物質などが挙げられる。これらのうち、グリセロール３リン酸が特に好ましい。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーの一つは、ジヒドロビオプテリン（ＢＨ2）又はこれが関与する代謝系上の物質（ＢＨ2代謝系物質ともいう）であり、当該物質としてはＢＨ2の他、代謝系においてＢＨ2の濃度を変動させるすべての物質が含まれ、ＢＨ2への代謝を亢進する物質、阻害する物質、ＢＨ2からの代謝を促進する物質、阻害する物質などが挙げられる。これらのうち、ＢＨ2が特に好ましい。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーの一つは、ＧＡＢＡ又はこれが関与する代謝系上の物質（ＧＡＢＡ代謝系物質ともいう）であり、当該物質としてはＧＡＢＡの他、代謝系においてＧＡＢＡの濃度を変動させるすべての物質が含まれ、ＧＡＢＡへの代謝を亢進する物質、阻害する物質、ＧＡＢＡからの代謝を促進する物質、阻害する物質などが挙げられる。これらのうち、ＧＡＢＡが特に好ましい。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーの一つは、乳酸又はこれが関与する代謝系上の物質（乳酸代謝系物質ともいう）であり、当該物質としては乳酸の他、代謝系において乳酸の濃度を変動させるすべての物質が含まれ、乳酸への代謝を亢進する物質、阻害する物質、乳酸からの代謝を促進する物質、阻害する物質などが挙げられる。これらのうち、乳酸が特に好ましい。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーの一つは、アスパラギン、アスパラギン酸又はこれらが関与する代謝系上の物質である。アスパラギン及びアスパラギン酸の場合にはこれらの比が重要であり、具体的にはアスパラギンとアスパラギン酸の濃度から算出されるアスパラギンの対アスパラギン酸比、より具体的には抗がん剤曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比を抗がん剤非曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比で除することによって算出される値
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が挙げられる。当該比の算出に使用される物質としてはアスパラギン、アスパラギン酸の他、アスパラギン、アスパラギン酸が関与する代謝系上の物質（アスパラギン代謝系物質、アスパラギン酸代謝系物質ともいう）を使用することができ、代謝系においてアスパラギン、アスパラギン酸の濃度を変動させるすべての物質が含まれ、アスパラギン、アスパラギン酸への代謝を亢進する物質、阻害する物質、アスパラギン、アスパラギン酸からの代謝を促進する物質、阻害する物質などが挙げられる。これらのうち、アスパラギン、アスパラギン酸が特に好ましい。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーの一つは、２－メチルブチロイルカルニチン又はこれが関与する代謝系上の物質（２－メチルブチロイルカルニチン代謝系物質ともいう）であり、当該物質としては２－メチルブチロイルカルニチンの他、代謝系において２－メチルブチロイルカルニチンの濃度を変動させるすべての物質が含まれ、２－メチルブチロイルカルニチンへの代謝を亢進する物質、阻害する物質、２－メチルブチロイルカルニチンからの代謝を促進する物質、阻害する物質などが挙げられる。これらのうち、２－メチルブチロイルカルニチンが特に好ましい。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーの一つは、１－メチルアデノシン又はこれが関与する代謝系上の物質（１－メチルアデノシン代謝系物質ともいう）であり、当該物質としては１－メチルアデノシンの他、代謝系において１－メチルアデノシンの濃度を変動させるすべての物質が含まれ、１－メチルアデノシンへの代謝を亢進する物質、阻害する物質、１－メチルアデノシンからの代謝を促進する物質、阻害する物質などが挙げられる。これらのうち、１－メチルアデノシンが特に好ましい。
　本発明における抗がん剤感受性判定マーカーの一つは、グルタチオン又はこれが関与する代謝系上の物質（グルタチオン代謝系物質ともいう）であり、当該物質としてはグルタチオンの他、代謝系においてグルタチオンの濃度を変動させるすべての物質が含まれ、グルタチオンへの代謝を亢進する物質、阻害する物質、グルタチオンからの代謝を促進する物質、阻害する物質などが挙げられる。これらのうち、グルタチオン、ヒポタウリン、１－メチルニコチンアミド、タウリン、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、Ｓ－アデノシルホモシステイン、ニコチンアミド、γ－グルタミルシステイン（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ）、スペルミンが好ましく、特にグルタチオン、ヒポタウリン、１－メチルニコチンアミドが好ましい。
　代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチンは、後記実施例に示すように、ＳＮ－３８曝露後、ＳＮ－３８低感受性であるＨＴ－２９で細胞内レベルの顕著な上昇が認められた。一方、ＳＮ－３８高感受性であるＨＣＴ－１１６では細胞内レベルの顕著な変動は認められなかった。従って、これらの物質は、特にＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８等の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
　代謝物Ｄ、グリセロール３リン酸、ＢＨ2、乳酸は、後記実施例に示すように、ＳＮ－３８曝露後、ＳＮ－３８高感受性であるＨＣＴ－１１６で細胞内レベルの顕著な上昇が認められた。一方、ＳＮ－３８低感受性であるＨＴ－２９では細胞内レベルの顕著な変動は認められなかった。従って、これらの物質は、特にＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８等の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
　ＧＡＢＡは、後記実施例に示すように、ＳＮ－３８曝露後、ＳＮ－３８低感受性であるＨＴ－２９で細胞内レベルの顕著な上昇が認められた。一方、ＳＮ－３８高感受性であるＨＣＴ－１１６では細胞内レベルの顕著な変動は認められなかった。また、もともとの代謝物レベルとして、ＳＮ－３８低感受性であるＨＴ－２９で細胞内レベルが高く、ＳＮ－３８高感受性であるＨＣＴ－１１６で細胞内レベルが低かった。さらに、８種類のヒトがん細胞株を用いて検討したところ、ＳＮ－３８に対する感受性の低下に伴い細胞内ＧＡＢＡレベルが上昇した。従って、ＧＡＢＡは、特にＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８等の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
　アスパラギンは、後記実施例に示すように、ＳＮ－３８高感受性であるＨＣＴ－１１６でＳＮ－３８曝露後コントロール群と異なる細胞内レベルの変動を示したが、ＳＮ－３８低感受性であるＨＴ－２９ではＳＮ－３８曝露群とコントロール群で細胞内レベルに差は認められなかった。また、アスパラギン酸は、後記実施例に示すように、ＳＮ－３８低感受性であるＨＴ－２９でＳＮ－３８曝露後コントロール群と異なる細胞内レベルの変動を示したが、ＳＮ－３８高感受性であるＨＣＴ－１１６ではＳＮ－３８曝露群とコントロール群で細胞内レベルに差は認められなかった。ＳＮ－３８曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比をＳＮ－３８非曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比で除することによって算出される値（［アスパラギン／アスパラギン酸］SN-38／［アスパラギン／アスパラギン酸］Control）は、ＳＮ－３８高感受性であるＨＣＴ－１１６で顕著な上昇が認められ、一方でＳＮ－３８低感受性であるＨＴ－２９では顕著な減少が認められた。従って、当該アスパラギンとアスパラギン酸濃度の比は、特にＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８等の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
　１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質は、後記実施例に示すように、８種類のヒトがん細胞株を用いて検討したところ、ＳＮ－３８に対する感受性の低下に伴い細胞内のこれらの物質のレベルが上昇した。従って、１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質は、特にＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８等の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
　本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの対象となる抗がん剤としては特に限定されないが、例えばＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８、オキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ　ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ　ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられ、このうち植物アルカロイド系抗がん剤、例えばＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８又はそれらの塩が好ましい。
　本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いて抗がん剤感受性を判定するには、検体中のこれら代謝系物質を測定すればよい。ここで、検体としては、がんを有する被験者（がん患者）由来の生体試料、例えば血液、血清、血漿、尿、腫瘍組織・細胞、腹水、胸水、脳脊髄液、便、喀痰等が挙げられるが、血清が特に好ましい。
　また、本発明の対象となるがんとしては、咽頭がんを代表とする口唇、口腔及び咽頭がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がんなどを代表とする消化器がん、肺がんを代表とする呼吸器及び胸腔内臓器がん、骨及び関節軟骨がん、皮膚の悪性黒色腫、有棘細胞がん及びその他の皮膚のがん、中皮腫を代表とする中皮及び軟部組織がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がんを代表とする女性性器がん、前立腺がんを代表とする男性性器がん、膀胱がんを代表とする尿路がん、脳腫瘍を代表とする眼、脳及び中枢神経系がん、甲状腺及びその他の内分泌腺がん、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病を代表とするリンパ組織、造血組織及び関連組織がん、及びこれらを原発巣とする転移組織のがん等が挙げられるが、特に非小細胞肺がん、小細胞肺がん、子宮頸がん、卵巣がん、胃がん、結腸・直腸がん、有棘細胞がん、悪性リンパ腫に対して好適に利用できる。
　検体中のこれら代謝系物質の測定手段は、被測定対象物質により適宜決定すればよく、例えばＣＥ－ＴＯＦＭＳ、Ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ）等の各種質量分析装置、ＨＰＬＣ、免疫学的測定法、生化学的測定法等により測定可能である。
　代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチンについて、対象とする抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のこれら代謝系物質濃度を測定し、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるこれら代謝系物質の濃度が上昇すればそのがんは抗がん剤感受性ではなく、抗がん剤投与前後におけるこれら代謝系物質の濃度が変化しなければそのがんは抗がん剤感受性であると判定できる。
　また、抗がん剤投与後初期の段階において、これら代謝系物質の濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性がないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴う副作用の増大を防ぐことにも大きく貢献する。
　代謝物Ｄ、グリセロール３リン酸、ＢＨ2、乳酸について、対象とする抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のこれら代謝系物質濃度を測定し、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるこれら代謝系物質の濃度が上昇すればそのがんは抗がん剤感受性であり、抗がん剤投与前後におけるこれら代謝系物質の濃度が変化しなければそのがんは抗がん剤感受性ではないと判定できる。
　また、抗がん剤投与後初期の段階において、これら代謝系物質の濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性がないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴う副作用の増大を防ぐことにも大きく貢献する。
　ＧＡＢＡについて、対象とする抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のこれら代謝系物質濃度を測定し、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるこれら代謝系物質の濃度が上昇すればそのがんは抗がん剤感受性ではなく、抗がん剤投与前後におけるこれら代謝系物質の濃度が変化しなければそのがんは抗がん剤感受性であると判定できる。
　また、抗がん剤投与前あるいは投与後初期の段階において、これら代謝系物質の濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性がないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴う副作用の増大を防ぐことにも大きく貢献する。
　アスパラギン、アスパラギン酸の濃度の比について、対象とする抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のアスパラギンとアスパラギン酸の濃度を測定し、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるアスパラギンの対アスパラギン酸比が上昇すればそのがんは抗がん剤感受性であり、抗がん剤投与前後においてアスパラギンの対アスパラギン酸比が減少すればそのがんは抗がん剤感受性ではないと判定できる。
　また、抗がん剤投与後初期の段階において、アスパラギンの対アスパラギン酸比が所定の基準より低いと判断される数値を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性がないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴う副作用の増大を防ぐことにも大きく貢献する。
　１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質について、対象とする抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前の段階において、これら代謝系物質の濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性がないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴う副作用の増大を防ぐことにも大きく貢献する。
　本発明の抗がん剤感受性の判定方法を実施するには、検体中のこれら代謝系物質を測定するためのプロトコールを含むキットを用いるのが好ましい。当該キットには、これら代謝系物質測定試薬、測定試薬の使用方法、及び抗がん剤感受性の有無を判定するための基準等が含まれる。当該基準には、これら代謝系物質の標準濃度や標準比、高いと判断される濃度や比、低いと判断される濃度や比、測定結果に影響を与える要因とその影響の程度等が含まれ、これらの濃度は対象とする抗がん剤ごとに設定することが可能である。当該基準を用いて、前記のように判定することができる。
　抗がん剤曝露後における代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチン、ＧＡＢＡ、１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質の発現変動、具体的には変動の抑制或いは濃度の低下を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチン、ＧＡＢＡ、１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質の抗がん剤曝露前における濃度を低下させる物質、抗がん剤曝露後における変動を抑制或いは濃度を低下させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、抗がん剤曝露前に各種がん細胞株をある物質で処理した時、細胞内における代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチン、ＧＡＢＡ、１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質の濃度を低下させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、各種がん細胞株における抗がん剤曝露後の細胞内における代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチン、ＧＡＢＡ、１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質の変動を抑制する物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。また、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいては、担癌動物における抗がん剤曝露前の代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチン、ＧＡＢＡ、１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質の濃度を低下させる物質、抗がん剤曝露後の代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチン、ＧＡＢＡ、１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質の変動を抑制或いは濃度を低下させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
　また、抗がん剤曝露後における代謝物Ｄ、グリセロール３リン酸、ＢＨ2、乳酸の発現変動、具体的には変動の促進或いは濃度の上昇を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて代謝物Ｄ、グリセロール３リン酸、ＢＨ2、乳酸の抗がん剤曝露後における変動を促進或いは濃度を上昇させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、各種がん細胞株における抗がん剤曝露後の細胞内における代謝物Ｄ、グリセロール３リン酸、ＢＨ2、乳酸の変動を促進する物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。また、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいては、担癌動物における抗がん剤曝露後の代謝物Ｄ、グリセロール３リン酸、ＢＨ2、乳酸の変動を促進或いは濃度を上昇させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
　また、抗がん剤曝露後におけるアスパラギンの対アスパラギン酸比の変動、具体的には比の上昇を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、抗がん剤曝露後におけるアスパラギンとアスパラギン酸濃度の比を上昇させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、各種がん細胞株における抗がん剤曝露後の細胞内におけるアスパラギンとアスパラギン酸濃度の比を上昇させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。また、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいては、担癌動物における抗がん剤曝露後のアスパラギンとアスパラギン酸濃度の比を上昇させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。なお、これらの濃度の比として、抗がん剤曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比を抗がん剤非曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比で除することによって算出される値を用いてもよく、この値を用いた場合、感度よく鋭敏に抗がん剤感受性亢進剤をスクリーニングすることができる。
　また、代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチン、ＧＡＢＡ、１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質を指標とすれば、抗がん剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ある物質によりこれら代謝系物質の濃度が変動すれば、その物質は抗がん剤である。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、ある物質を各種がん細胞株に曝露後、曝露前に比べて代謝物Ａ、Ｂ、２－メチルブチロイルカルニチン、ＧＡＢＡ、１－メチルアデノシン、グルタチオン代謝系物質の濃度が変動すれば、その物質は抗がん剤である。また、担癌動物にある物質を投与した後、これら代謝系物質の濃度が変動すれば、その物質は抗がん剤である。薬効が期待できる抗がん剤であれば、これら代謝系物質の濃度変動は腫瘍の縮小あるいは殺細胞効果よりも早く現れるため、これら代謝系物質を指標としたスクリーニングにより、より短時間の検討で当該物質が抗がん剤として有用であるかどうかを判定することができる。抗がん剤開発に伴う労力や費用の削減という面からも大きな効果が期待できる。
　また、代謝物Ｄ、グリセロール３リン酸、ＢＨ2、乳酸を指標とすれば、抗がん剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ある物質によりこれら代謝系物質の濃度が上昇すれば、その物質は抗がん剤である。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、ある物質を各種がん細胞株に曝露後、曝露前に比べて代謝物Ｄ、グリセロール３リン酸、ＢＨ2、乳酸代謝系物質の濃度が上昇すれば、その物質は抗がん剤である。また、担癌動物にある物質を投与した後、これら代謝系物質の濃度が上昇すれば、その物質は抗がん剤である。薬効が期待できる抗がん剤であれば、これら代謝系物質の濃度上昇は腫瘍の縮小あるいは殺細胞効果よりも早く現れるため、これら代謝系物質を指標としたスクリーニングにより、より短時間の検討で当該物質が抗がん剤として有用であるかどうかを判定することができる。抗がん剤開発に伴う労力や費用の削減という面からも大きな効果が期待できる。
　また、アスパラギンの対アスパラギン酸比を指標とすれば、抗がん剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ある物質によりアスパラギンとアスパラギン酸濃度の比が上昇すれば、その物質は抗がん剤である。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、ある物質を各種がん細胞株に曝露後、曝露前に比べてアスパラギンとアスパラギン酸濃度の比が上昇すれば、その物質は抗がん剤である。また、担癌動物にある物質を投与した後、アスパラギンとアスパラギン酸濃度の比が上昇すれば、その物質は抗がん剤である。薬効が期待できる抗がん剤であれば、アスパラギンとアスパラギン酸濃度の比の上昇は腫瘍の縮小あるいは殺細胞効果よりも早く現れるため、アスパラギンとアスパラギン酸濃度の比を指標としたスクリーニングにより、より短時間の検討で当該物質が抗がん剤として有用であるかどうかを判定することができる。抗がん剤開発に伴う労力や費用の削減という面からも大きな効果が期待できる。
　なお、アスパラギンとアスパラギン酸濃度の比として、被検査物質曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比を被検査物質非曝露時のアスパラギンの対アスパラギン酸比で除することによって算出される値を用いてもよく、この値を用いた場合、感度よく鋭敏に抗がん剤をスクリーニングすることができる。
　かくして得られた抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上する。抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せた形態としては、それらの成分の両方を含む一の組成物であってもよく、それぞれ別個の製剤の組み合せであってもよい。また、それらの成分はそれぞれ別の投与経路であってもよい。ここで用いられる対象となる抗がん剤としては、前記と同様であり、ＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８、オキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ　ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ　ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち、植物アルカロイド系抗がん剤、例えばＣＰＴ－１１、ＳＮ－３８又はそれらの塩が特に好ましい。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
（１）方法
（ａ）使用細胞
　２種類のヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９）を用いた。これらの細胞は株式会社ヤクルト本社より入手した。
　培養は、φ１００ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）にて、培地（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ、１０％　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）、３７℃、５％ＣＯ2の条件下にて行った。
（ｂ）薬剤
　ＳＮ－３８原末は、株式会社ヤクルト本社より入手した。ＳＮ－３８はＤＭＳＯに溶解し、各実験で培地中のＤＭＳＯの濃度が０．１％以下となるように希釈して使用した。
（ｃ）ＳＮ－３８に対する感受性の評価
　両細胞について、５０ｎｍｏｌ／ＬのＳＮ－３８に２４、４８、７２時間曝露後の細胞生存率をＭＴＳ　ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６TMＡＱueous　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にて評価した。感受性の評価は異なる継代数の細胞にてｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで３回行い、その平均値と標準偏差を算出した。
（ｄ）ＳＮ－３８の曝露と細胞内代謝物の採取
　両細胞に対して、５０ｎｍｏｌ／ＬのＳＮ－３８を含む培地に交換することにより抗がん剤曝露を開始した（ＳＮ－３８のみを除いた培地を用いたものをコントロール群とした）。０ｈｒ、３ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒ曝露後に氷上にて５％マンニトール（４℃）で細胞を洗浄後、素早くメタノール（４℃、内部標準物質含有）を添加することにより酵素を失活させ、－８０℃で保存した。なお、細胞数算出用の細胞を代謝物抽出用の細胞とは別に準備し、同様の処理を行った後セルカウントを行い、細胞数補正に用いた。
（ｅ）メタボロームサンプルの調製
　－８０℃保存メタノール溶液に、クロロホルムとミリＱ水を加え液―液抽出を行い、夾雑成分を除去した。代謝物を含む水―メタノール層を採取し、分画分子量５０００Ｄａの遠心限外ろ過フィルターを用いて除タンパクを行った後、ろ液を減圧乾燥し、－８０℃にて保存した。測定直前にミリＱ水に溶解させ、メタボローム測定に供した。
（ｆ）メタボローム測定
　細胞内代謝物の網羅的測定はＡｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のキャピラリー電気泳動―飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）にて行った。陽イオン性代謝物の網羅的測定ではキャピラリーの出口が陰極となるように電圧を印加し、また、陰イオン性代謝物の網羅的測定ではキャピラリーの出口が陽極となるように電圧を印加し、ｍ／ｚ＝５０～１０００の代謝物を一斉に定量分析した。
（２）結果
　ＭＴＳ ａｓｓａｙにより５０ｎｍｏｌ／ＬのＳＮ－３８曝露後の経時的な細胞生存率について検討したところ、各細胞の生存率は２４ｈｒ曝露後においてはほとんど差が認められなかった。しかし、曝露時間が長くなるにつれて各細胞の生存率は低下し、その差は経時的に拡大した。７２ｈｒ曝露後における細胞生存率はＨＴ－２９で約８５％、ＨＣＴ－１１６で約３５％となり、ＨＴ－２９がＨＣＴ－１１６に比べＳＮ－３８低感受性であることが確認された（図１）。
　ＣＥ－ＴＯＦＭＳを用いた網羅的メタボローム解析手法により、ＳＮ－３８曝露に伴う細胞内メタボローム変動を網羅的に解析した。両細胞について、ＳＮ－３８に２４時間曝露した群とコントロール群を比較し、両群で差の大きいピークを抽出した。それらのピークについてＳＮ－３８曝露後の経時的変動をグラフ化し、特徴的な変動を示す以下の代謝物を見出した（図２～７、９～１１）。
（１）ＳＮ－３８曝露後、ＨＴ－２９で細胞内レベルの顕著な上昇が認められた代謝物・ｍ／ｚ＝１４９．０５～１４９．０６（陰イオン）
・ｍ／ｚ＝１５２．９９～１５３．００（陰イオン）
・ｍ／ｚ＝２４６．１６～２４６．１７（陽イオン）
（２）ＳＮ－３８曝露後、ＨＣＴ－１１６で細胞内レベルの顕著な上昇が認められた代謝物
ｍ／ｚ＝１７１．００（陰イオン）
ｍ／ｚ＝２４０．１０～２４０．１１（陽イオン）
ｍ／ｚ＝７２４．３４～７２４．３５（陽イオン）
ｍ／ｚ＝８９．０２（陰イオン）
（３）ＨＣＴ１１６でＳＮ－３８曝露後コントロール群と異なる細胞内レベルの変動を示すピーク
ｍ／ｚ＝１３３．０６（陽イオン）
（４）ＨＴ－２９でＳＮ－３８曝露後コントロール群と異なる細胞内レベルの変動を示すピーク
ｍ／ｚ＝１３４．０４（陽イオン）
　ｍ／ｚ＝１７１．００のピークに関して、解析ソフトＡｎａｌｙｓｔTM　ＱＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、組成の推定を進めた。親ピークに対するアイソトープの割合、精密質量等の情報から組成を特定した結果、候補ピークとしたｍ／ｚ＝１７１．００のイオン組成はＣ3Ｈ8Ｏ6Ｐであった。京都大学が作製したＫＥＧＧ：生命システム情報統合データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／）の代謝データベースを用いて、このイオン組成から推定される物質を検索したところ、このピークがグリセロール３リン酸であることが判明した。グリセロール３リン酸標品を用いた検討により、キャピラリー電気泳動の移動時間の一致も確認された。
　ｍ／ｚ＝１４９．０５～１４９．０６（陰イオン）のピークに関して、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＣＥ－ＱＴＯＦＭＳ）を用いて組成の推定を進めた。その結果、ｍ／ｚ＝１４９．０５～１４９．０６のイオン組成はＣ5Ｈ9Ｏ5と考えられた。
　また、ｍ／ｚ＝１５２．９９～１５３．００（陰イオン）のピークに関して、ＣＥ－ＱＴＯＦＭＳを用いて組成の推定を進めた。その結果、ｍ／ｚ＝１５２．９９～１５３．００のイオン組成はＣ3Ｈ6Ｏ5Ｐと考えられた。
　また、ｍ／ｚ＝２４６．１６～２４６．１７（陽イオン）のピークに関して、ＣＥ－ＱＴＯＦＭＳを用いて組成の推定を進めた。その結果、ｍ／ｚ＝２４６．１６～２４６．１７のイオン組成はＣ12Ｈ24ＮＯ4であった。Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｈｍｄｂ.ｃａ／）を用いて、このイオン組成から推定される物質を検索したところ、このピークが２－メチルブチロイルカルニチンであることが判明した。２－メチルブチロイルカルニチン標品を用いた検討により、キャピラリー電気泳動の移動時間の一致も確認された。
　また、ｍ／ｚ＝２４０．１０～２４０．１１（陽イオン）のピークに関して、ＣＥ－ＱＴＯＦＭＳを用いて組成の推定を進めた。その結果、ｍ／ｚ＝２４０．１０～２４０．１１のイオン組成はＣ9Ｈ14Ｎ5Ｏ3であった。Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｈｍｄｂ.ｃａ／）を用いて、このイオン組成から推定される物質を検索したところ、このピークがジヒドロビオプテリンであることが判明した。ジヒドロビオプテリン標品を用いた検討により、キャピラリー電気泳動の移動時間の一致も確認された。
　ｍ／ｚ＝８９．０２のピークに関して、解析ソフトＡｎａｌｙｓｔＴＭ　ＱＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、組成の推定を進めた。親ピークに対するアイソトープの割合、精密質量等の情報から組成を特定した結果、候補ピークとしたｍ／ｚ＝８９．０２のイオン組成はＣ3Ｈ5Ｏ3であった。京都大学が作製したＫＥＧＧ：生命システム情報統合データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／）の代謝データベースを用いて、このイオン組成から推定される物質を検索したところ、このピークが乳酸であることが判明した。乳酸標品を用いた検討により、キャピラリー電気泳動の移動時間の一致も確認された。
　また、コントロール群について両細胞を比較し、差の大きいピークを抽出した。そのうち、ｍ／ｚ＝１０４．０７０のピークについて、ＳＮ－３８低感受性であるＨＴ－２９で細胞内レベルが高く、ＳＮ－３８高感受性であるＨＣＴ－１１６で細胞内レベルが低かった。また、ＳＮ－３８曝露後の経時的変動をグラフ化したところ、特徴的な変動を示したことから、ＳＮ－３８感受性と関連する代謝物と考えられた（図８）。このピークに関して、解析ソフトＡｎａｌｙｓｔTM　ＱＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、組成の推定を進めた。親ピークに対するアイソトープの割合、精密質量等の情報から組成を特定した結果、候補ピークとしたｍ／ｚ　１０４．０７０のイオン組成はＣ4Ｈ10ＮＯ2であった。京都大学が作製したＫＥＧＧ：生命システム情報統合データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／）の代謝データベースを用いて、このイオン組成から推定される物質を検索したところ、このピークがγ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）であることが判明した。ＧＡＢＡ標品を用いた検討により、キャピラリー電気泳動の移動時間の一致も確認された。
　ｍ／ｚ＝１３３．０６のピークに関して、解析ソフトＡｎａｌｙｓｔＴＭ　ＱＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、組成の推定を進めた。親ピークに対するアイソトープの割合、精密質量等の情報から組成を特定した結果、候補ピークとしたｍ／ｚ＝１３３．０６のイオン組成はＣ4Ｈ9Ｎ2Ｏ3であった。京都大学が作製したＫＥＧＧ：生命システム情報統合データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／）の代謝データベースを用いて、このイオン組成から推定される物質を検索したところ、このピークがアスパラギンであることが判明した。アスパラギン標品を用いた検討により、キャピラリー電気泳動の移動時間の一致も確認された。
　また、ｍ／ｚ＝１３４．０４のピークに関して、解析ソフトＡｎａｌｙｓｔＴＭ　ＱＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、組成の推定を進めた。親ピークに対するアイソトープの割合、精密質量等の情報から組成を特定した結果、候補ピークとしたｍ／ｚ＝１３４．０４のイオン組成はＣ4Ｈ8ＮＯ4であった。京都大学が作製したＫＥＧＧ：生命システム情報統合データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／）の代謝データベースを用いて、このイオン組成から推定される物質を検索したところ、このピークがアスパラギン酸であることが判明した。アスパラギン酸標品を用いた検討により、キャピラリー電気泳動の移動時間の一致も確認された。
　さらに、アスパラギンの対アスパラギン酸比（［アスパラギン／アスパラギン酸］）を算出し、ＳＮ－３８曝露時の［アスパラギン／アスパラギン酸］をＳＮ－３８非曝露時の［アスパラギン／アスパラギン酸］で除した（［アスパラギン／アスパラギン酸］SN-38／［アスパラギン／アスパラギン酸］Control）。その結果、ＳＮ－３８高感受性であるＨＣＴ－１１６では上記の値に顕著な上昇が認められた。一方、ＳＮ－３８低感受性であるＨＴ－２９では上記の値に顕著な減少が認められた（図１２）。
実施例２
（１）方法
（ａ）使用細胞
　８種類のヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１５、Ｌｏｖｏ、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＷｉＤｒ）を用いた。ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９は株式会社ヤクルト本社より、Ｌｏｖｏ、ＳＷ４８０、ＷｉＤｒは大日本住友製薬株式会社より、ＨＣＴ－１５、ＬＳ１７４Ｔは東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより、ＳＷ６２０は住商ファーマインターナショナル株式会社より入手した。
（ｂ）薬剤
　ＳＮ－３８原末は、株式会社ヤクルト本社より入手した。ＳＮ－３８はＤＭＳＯに溶解し、各実験で培地中のＤＭＳＯの濃度が０．１％以下となるように希釈して使用した。
（ｃ）ＳＮ－３８に対する感受性の評価
　各細胞について、０ｎｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／ＬのＳＮ－３８に７２時間曝露後の細胞生存率をＭＴＳ　ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６TMＡＱueous　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にて評価し、ＩＣ50値（ＳＮ－３８未処理ｗｅｌｌに対して細胞数を５０％抑制する濃度）を算出して各細胞におけるＳＮ－３８感受性とした。実験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで２回行った。
（ｄ）細胞内代謝物の採取
　定常状態における各細胞に対して、培地を除去し氷上にて５％マンニトール（４℃）で細胞を洗浄後、素早くメタノール（４℃、内部標準物質含有）を添加することにより酵素を失活させ、－８０℃で保存した。なお、細胞数算出用の細胞を代謝物抽出用の細胞とは別に準備し、同様の処理を行った後セルカウントを行い、細胞数補正に用いた。実験はtriplicateで２回行った。
（ｅ）メタボロームサンプルの調製
　－８０℃保存メタノール溶液に、クロロホルムとミリＱ水を加え液―液抽出を行い、夾雑成分を除去した。代謝物を含む水―メタノール層を採取し、分画分子量５０００Ｄａの遠心限外ろ過フィルターを用いて除タンパクを行った後、ろ液を減圧乾燥し、－８０℃にて保存した。測定直前にミリＱ水に溶解させ、メタボローム測定に供した。
（ｆ）メタボローム測定
　細胞内代謝物の網羅的測定はＡｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のキャピラリー電気泳動―飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）にて行った。陽イオン性代謝物の網羅的測定ではキャピラリーの出口が陰極となるように電圧を印加し、陰イオン性代謝物の網羅的測定ではキャピラリーの出口が陽極となるように電圧を印加し、ｍ／ｚ＝５０～１０００の代謝物を一斉に定量分析した。
（ｇ）ＧＡＢＡとＳＮ－３８感受性との相関分析
　各細胞サンプルからＣＥ－ＴＯＦＭＳにより検出されたＧＡＢＡを示すピークについて、ピークエリアと各細胞のＩＣ50値（５０％細胞増殖抑制濃度）の関係について相関分析を行った。
（２）結果
（ａ）８種類のヒト大腸癌細胞株におけるＳＮ－３８感受性の評価
　各細胞におけるＩＣ50値は０．７４±０．２３～６８．９４±６．８３ｎｍｏｌ／Ｌであり、その感受性には大きな幅が認められた（図１３）。
（ｂ）ＧＡＢＡとＳＮ－３８感受性との相関分析
　ＣＥ－ＴＯＦＭＳにより検出されたＧＡＢＡを示すピークについて、ピークエリアと各細胞のＩＣ50値の関係について相関分析を行ったところ、高い正の相関が認められた（図１３）。
実施例３
（１）方法
　実施例２と同様の実験をもう一度ずつ繰り返し、それぞれ合計３回の実験から得られたデータについて、さらに詳細な解析を進めた。各細胞サンプルからＣＥ－ＴＯＦＭＳにより検出されたピークについて、既にｍ/ｚ及び移動時間が明らかとなっている２７８の標品データとの照合により、いずれかの細胞で検出が確認された１４６の代謝物を同定した。この１４６の代謝物について、８種類のヒト大腸癌細胞における細胞内量とそれぞれの細胞のＬｏｇ［ＩＣ50］との関係を単回帰分析により検討した。
（２）結果
（ａ）８種類のヒト大腸癌細胞株におけるＳＮ－３８感受性の評価
　８種類のヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１５、Ｌｏｖｏ、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＷｉＤｒ）における感受性はＭＴＳ　ａｓｓａｙによって算出されるＩＣ50を指標として評価した。その結果、ＷｉＤｒのＩＣ50(６３．２７±１０．９５ｎＭ)が最も高く、ＳＮ－３８低感受性を示した。一方、ＬＳ１７４ＴのＩＣ50(０．７１±０．１８ｎＭ)が最も低く、ＳＮ－３８高感受性を示した(図１４)。
（ｂ）細胞内代謝物量とＳＮ－３８感受性との関係
　８種類のヒト大腸癌細胞から細胞内代謝物を抽出し、ＣＥ－ＴＯＦＭＳにて一斉分析した。得られたデータについて、当研究室で所有する２７８の標品データと照合し、いずれかの細胞で検出が確認され、同定できた１４６の代謝物について、８種類のヒト大腸癌細胞における細胞内量とそれぞれの細胞のＬｏｇ［ＩＣ50］との関係を単回帰分析により検討した。その結果、細胞内量とＬｏｇ［ＩＣ50］との間に有意な関連が認められた代謝物として（ｐ＜０．０１、Ｒ2≧０．７）、１－メチルアデノシン、ＧＡＢＡ、ヒポタウリン、グルタチオン（ＧＳＨ）、１－メチルニコチンアミドが得られた（図１５）。これらの代謝物はいずれもＳＮ－３８高感受性細胞で細胞内レベルが低く、ＳＮ－３８低感受性細胞で細胞内レベルが高かった。
　さらに、ヒポタウリン、グルタチオン、１－メチルニコチンアミドといったグルタチオン代謝系の物質の細胞内量とＳＮ－３８感受性との間に有意な関連が認められたことから、グルタチオン代謝系に属するその他の物質の細胞内レベルとＳＮ－３８感受性の関係について調べてみると、ヒポタウリン、グルタチオン、１－メチルニコチンアミドに加えて、タウリン（Ｒ2＝０．６８８）、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ、Ｒ2＝０．６３４）、Ｓ－アデノシルホモシステイン（Ｒ2＝０．４９６）、ニコチンアミド（Ｒ2＝０．３５７）、γ－グルタミルシステイン（γ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ、Ｒ2＝０．３１９）、スペルミン（Ｒ2＝０．２９５）についてもその細胞内代謝物レベルとＳＮ－３８に対する感受性との間に関連が認められた（図１６）。

Claims (22)

  1. 　質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ＝１４９．０５～１４９．０６の陰イオンとして検出される分子、ｍ／ｚ＝１５２．９９～１５３．００の陰イオンとして検出される分子、ｍ／ｚ＝７２４．３４～７２４．３５の陽イオンとして検出される分子、グリセロール３リン酸、ジヒドロビオプテリン、ＧＡＢＡ、乳酸、アスパラギン、アスパラギン酸、２－メチルブチロイルカルニチン、１－メチルアデノシン、グルタチオン及びそれら分子が関与する代謝系上の物質から選ばれる１以上の分子からなる抗がん剤感受性判定マーカー。
  2. 　アスパラギン及びアスパラギン酸の比を測定するものである請求項１記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
  3. 　グルタチオンが関与する代謝系上の物質が、グルタチオン、ヒポタウリン、１－メチルニコチンアミド、タウリン、グルタチオンジスルフィド、Ｓ－アデノシルホモシステイン、ニコチンアミド、γ－グルタミルシステイン及びスペルミンから選ばれる１以上の分子である請求項１記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
  4. 　抗がん剤が、植物アルカロイド系抗がん剤である請求項１～３のいずれか１項記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
  5. 　抗がん剤が、イリノテカン、ＳＮ－３８及び／又はそれらの塩である請求項１～３のいずれか１項記載の抗がん剤感受性判定マーカー。
  6. 　検体中の請求項１～３のいずれか１項記載の物質を測定することを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法。
  7. 　検体が、がんを有する被験者由来の生体試料である請求項６記載の判定方法。
  8. 　検体が、抗がん剤を投与された、がんを有する被験者由来の生体試料である請求項６又は７記載の判定方法。
  9. 　抗がん剤が、植物アルカロイド系抗がん剤である請求項６～８のいずれか１項記載の判定方法。
  10. 　抗がん剤が、イリノテカン、ＳＮ－３８及び／又はそれらの塩である請求項６～８のいずれか１項記載の判定方法。
  11. 　検体中の請求項１～３のいずれか１項記載の物質を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項６～１０のいずれか１項記載の判定方法を実施するためのキット。
  12. 　検体が、がんを有する被験者由来の生体試料である請求項１１記載のキット。
  13. 　検体が、抗がん剤を投与された、がんを有する被験者由来の生体試料である請求項１１又は１２記載のキット。
  14. 　抗がん剤が、植物アルカロイド系抗がん剤である請求項１１～１３のいずれか１項記載のキット。
  15. 　抗がん剤が、イリノテカン、ＳＮ－３８及び／又はそれらの塩である請求項１１～１３のいずれか１項記載のキット。
  16. 　請求項１～３のいずれか１項記載の物質の発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法。
  17. 　抗がん剤が、植物アルカロイド系抗がん剤である請求項１６記載のスクリーニング方法。
  18. 　抗がん剤が、イリノテカン、ＳＮ－３８及び／又はそれらの塩である請求項１６記載のスクリーニング方法。
  19. 　請求項１６～１８のいずれか１項記載の方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤。
  20. 　請求項１９記載の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せてなるがん治療用組成物。
  21. 　抗がん剤が、植物アルカロイド系抗がん剤である請求項２０記載のがん治療用組成物。
  22. 　抗がん剤が、イリノテカン、ＳＮ－３８及び／又はそれらの塩である請求項２０記載のがん治療用組成物。
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