JP5461200B2 - 抗がん剤感受性判定マーカー - Google Patents

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Description

本発明は、対象となる患者のがんが、抗がん剤に治療反応性を有するか否かを判定するために用いる抗がん剤感受性判定マーカー及びその応用に関する。
抗がん剤には、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、抗がん性植物アルカロイド等の種類がある。そしてこれらの抗がん剤にはがんの種類によって効果を示す場合と効果を示さない場合がある。しかし、有効であると認められている種類のがんであっても、個々の患者によって効果を示す場合と効果を示さない場合があることが知られている。このような個々の患者のがんに対して抗がん剤が効果を示すか否かを抗がん剤感受性という。
塩酸イリノテカン(CPT−11)は日本で開発されたtopoisomeraseI阻害という作用機序を有する抗がん剤である。日本において、CPT−11は、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸癌、卵巣癌に有効な薬剤として1994年1月に認可され、さらに1995年7月に胃癌、結腸・直腸癌、乳癌、有棘細胞癌、悪性リンパ腫に対する適応が認められている。CPT−11は特に大腸癌の領域で多剤併用療法のfirst line drugあるいはsecond line drugとして世界的な標準治療薬の位置を占め、その有用性が認められている(非特許文献1〜6)。
進行性・転移大腸癌に対する化学療法は、1990年代に登場したCPT−11、オキサリプラチンなどのkey drugと、それまで大腸癌治療の中心的薬剤であったフルオロウラシル(5−FU)を中心とするフッ化ピリミジン製剤とを併用することにより、生存率をはじめとする臨床成績が劇的に改善された。しかしそれでもなお奏効率はおよそ50%程度であり、重篤な副作用という高リスクを冒して抗がん剤が投与された患者の半分では効果が得られていないのが現状であり、個々の治療反応性(レスポンダー・ノンレスポンダー)を判別する抗がん剤感受性予測マーカーの確立は急務である。
一般的に、がん化学療法の治療スケジュールは長期に渡り、副作用の発現を見ながら何クールか繰り返し治療を行った後で、効果が得られているか、そのまま投与を続けるべきか判断するが、それまでには長い時間と高額な医療費がかかり、副作用の発現も起こっているのが事実である。よって、個々の患者に対し、効果が得られるかどうかを治療早期に予測できる手段があれば、患者の負担や副作用の発現を軽減し、医療費を削減することができる。
CPT−11はそれ自体抗腫瘍活性を有するものの、体内でCarboxyl esteraseにより活性化され、CPT−11に比べおよそ100〜数千倍強い抗腫瘍活性を有する7−ethyl−10−hydroxycamptothecin(SN−38)へと変換される。CPT−11とSN−38が同時に体内に存在することで抗腫瘍効果を呈すると考えられている。SN−38は肝細胞内でUDP−グルクロン酸転移酵素(UGT:UDP−glucuronosyltransferase)によりグルクロン酸抱合を受け、細胞毒性のないSN−38グルクロン酸抱合体(SN−38G)となり、おもに胆汁中に排泄され腸管へと移行し、その後は便中に排泄される。腸管に排泄されたSN−38Gの一部は、腸内細菌が有するβ−グルクロニダーゼにより脱抱合され再び活性型のSN−38となり、腸管上皮のトランスポーターを介し再吸収され腸肝循環、腸上皮細胞内でのUGTによるグルクロン酸抱合化などのステップを経ながら代謝・排泄を受ける(非特許文献7)。この際に、SN−38が腸管粘膜を障害し、下痢を誘発すると考えられている。また、細胞分裂の活発な骨髄にも影響をおよぼし、赤血球減少・白血球減少・血小板減少を引き起こすことが認められている。
重篤な下痢や好中球減少症などの副作用は、UGT1A1遺伝多型がもたらすSN−38体内曝露量の変化が一因であることが示されている。しかし治療効果に関しては、プロドラッグであるCPT−11から活性代謝物SN−38への変換とその解毒、さらに腸管循環の過程におけるSN−38の再生成や、CPT−11自体の代謝と代謝物からのSN−38の生成といった体内動態の複雑性により、薬物動態により治療効果を予測できるとする報告は未だなされていない。末梢血単核球細胞のカルボキシルエステラーゼmRNA発現量がSN−38とSN−38GのAUC比とは相関するものの腫瘍縮小効果とは相関がなかったとする報告もなされている(非特許文献8)。
また一方で、CPT−11感受性もしくは耐性に関与する因子として、SN−38の標的であるtopoisomeraseIの変異の有無や発現量、CPT−11からSN−38への変換に関与するカルボキシルエステラーゼ活性(非特許文献9)、CPT−11やSN−38の細胞内蓄積量に影響するトランスポーター(multidrug resistance protein(MRP)−1、MRP−2、Breast cancer resistant protein(BCRP)/ABCG2)の関与が報告されており、その他、細胞増殖抗原Ki−67、がん抑制遺伝子p53などもCPT−11を用いた治療への反応性との関連が検討されている。ごく最近、in vitroにおいて抗がん剤感受性データとマイクロアレイのデータを組み合わせることで体系的に抗癌剤感受性を予測しようとする試みがなされており、カンプトテシン類ではトポテカンについて検討されている(非特許文献10)。臨床研究においては、抗アポトーシス作用をもつTissue inhibitor of metalloproteinase−1 (TIMP−1)の血漿中レベルが、転移結腸・直腸癌に対するCPT−11+5−FU併用療法の臨床予後と有意に相関することが最近報告されている(非特許文献11)。このようにCPT−11感受性予測バイオマーカーの必要性が認識され多くの研究がなされているが、標的であるtopoisomeraseIについても、5−FU感受性予測因子とされるチミジル酸合成酵素とともに5−FU+CPT−11併用療法の治療反応性との間に明確な関連性を見出せなかったとする報告もあるなど(非特許文献12)、治療反応性を予測し得る明確なバイオマーカーは確立されていない。
先行技術文献
J Clin Oncol 1993;11:909−913. Semin Oncol 1999;26(1 Suppl 5):6−12. Lancet 1998;352:1407−1412. Pro ASCO 2005;Abstract #3506. N Engl J Med 2000;343:905−914. Lancet 2000;355:1041−1047. Cancer Res 1991;51:4187−4191. Clin Cancer Res 2005;11:6901−6907. Pharmacogenet Genomics 2007;17:1−10. Nat Med 2006;12:1294−1300. Clin Cancer Res 2007;13:4117−4122. Int J Cancer 2004;111:252−258.
本発明の目的は、個々の患者の治療反応性を判別できる抗がん剤感受性判定マーカー及びそれを利用する新たながん治療手段を提供することにある。
そこで本発明者らは、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計(CE−TOFMS)を用いて、in vivo担癌マウスにおける血清中のメタボローム(全代謝物質の総体)を網羅的に解析することにより、抗がん剤感受性判定マーカーの探索を行った。SN−38に対する感受性の異なるヒト由来大腸癌細胞株2種類をそれぞれヌードマウスに移植し、検討した結果、癌移植マウス群で特異的に上昇する代謝物質が、CPT−11治療により、高感受性群でのみコントロール群まで減少することを見出し、さらにその代謝物質はL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンであることを見出した。かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中のL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンが関与する代謝系上の物質の濃度を測定すれば、当該がん患者のがんが抗がん剤感受性か否かを判定できること、また、この物質の発現抑制を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンが関与する代謝系上の物質からなる抗がん剤感受性判定マーカーを提供するものである。
また、本発明は、検体中のL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンが関与する代謝系上の物質を測定することを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、検体中のL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンが関与する代謝系上の物質を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を実施するためのキットを提供するものである。
さらに本発明は、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンが関与する代謝系上の物質の発現抑制を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法を提供するものである。
さらにまた本発明は、上記のスクリーニング方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せてなるがん治療用組成物を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤との組み合せの、がん治療薬製造のための使用を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と、感受性亢進の対象となる抗がん剤とを投与することを特徴とするがん治療方法を提供するものである。
本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いれば、個々の患者の抗がん剤治療反応性が抗がん剤投与前、或いは抗がん剤投与開始後早期に適確に判定できる結果、より治療効果の高い抗がん剤の選択が可能となり、その結果として治療効果の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行、副作用の増大を防止でき、さらには患者の負担軽減、医療費の削減も期待できる。また、このマーカーを用いれば、抗がん剤感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となった抗がん剤と抗がん剤感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。
各群における担癌マウス腫瘍サイズの経時的変化を示す図である。 がん細胞を移植していないコントロール群(Cont)、SN−38低感受性であるヒト培養大腸癌細胞HT−29移植群(HT)、SN−38高感受性であるヒト培養大腸癌細胞HCT−116移植群(HCT)におけるCPT−11投与後24時間後のヌードマウス血清中フェニルアラニン濃度(m/z 166.086)を示す図である。 がん細胞を移植していないコントロール群(Cont)、SN−38低感受性であるヒト培養大腸癌細胞HT−29移植群(HT)、SN−38高感受性であるヒト培養大腸癌細胞HCT−116移植群(HCT)におけるCPT−11投与後12時間後のヌードマウス血清中N,N−ジメチルグリシン濃度(m/z 104.070)を示す図である。
発明を実施するための形態
本発明における抗がん剤感受性判定マーカーの一つは、L−フェニルアラニンが関与する代謝系上の物質(L−フェニルアラニン代謝系物質ともいう)であり、当該物質としてはL−フェニルアラニンの他、代謝系においてL−フェニルアラニンの濃度を上昇させるすべての物質が含まれ、L−フェニルアラニンへの代謝を亢進する物質、L−フェニルアラニンからの代謝を阻害する物質が挙げられる。ここで、L−フェニルアラニンへの代謝を亢進する物質としては、タンパク質やペプチドからL−フェニルアラニンまでの代謝系における中間体、その代謝に関与する酵素、補酵素、その酵素の発現量や活性を変化させる物質等が含まれる。またL−フェニルアラニンからの代謝を阻害する物質としては、L−フェニルアラニン代謝酵素の阻害物質、L−フェニルアラニン代謝酵素の発現量や活性を低下させる物質、L−フェニルアラニン代謝酵素の補酵素等が挙げられる。これらのうち、L−フェニルアラニンが特に好ましい。
本発明におけるもう一つの抗がん剤感受性判定マーカーは、N,N−ジメチルグリシンが関与する代謝系上の物質(N,N−ジメチルグリシン代謝系物質ともいう)であり、当該物質としてはN,N−ジメチルグリシンの他、代謝系においてN,N−ジメチルグリシンの濃度を上昇させるすべての物質が含まれ、N,N−ジメチルグリシンへの代謝を亢進する物質、N,N−ジメチルグリシンからの代謝を阻害する物質が挙げられる。ここで、N,N−ジメチルグリシンへの代謝を亢進する物質としては、リン脂質からN,N−ジメチルグリシンまでの代謝系における中間体、その代謝に関与する酵素、補酵素、その酵素の発現量や活性を変化させる物質等が含まれる。またN,N−ジメチルグリシンからの代謝を阻害する物質としては、N,N−ジメチルグリシン代謝酵素の阻害物質、N,N−ジメチルグリシン代謝酵素の発現量や活性を低下させる物質、N,N−ジメチルグリシン代謝酵素の補酵素等が挙げられる。これらのうち、N,N−ジメチルグリシンが特に好ましい。
L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンは、後記実施例に示すように、がん細胞を移植されたマウスの血清中濃度が、がん細胞非移植群に比べて上昇していた。また、SN−38低感受性がん細胞であるHT−29を移植された群では、CPT−11投与後もL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン濃度は低下しなかった。これに対し、SN−38高感受性がん細胞であるHCT−116を移植された群では、CPT−11投与によりL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン濃度はコントロール群と同程度まで低下した。従ってL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンは、CPT−11、SN−38等の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの対象となる抗がん剤としては、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンの代謝系に影響を与えるがんであれば特に限定されないが、例えばCPT−11、SN−38、オキサリプラチン、シクロフォスファミド(cyclophosphamide)、イフォスファミド(ifosfamide)、チオテパ(thiotepa)、メルファラン(melphalan)、ブスルファン(busulfan)、ニムスチン(nimustine)、ラニムスチン(ranimustine)、ダカルバジン(dacarbazine)、プロカルバジン(procarbazine)、テモゾロミド(temozolomide)、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、ネダプラチン(nedaplatin)、メトトレキサート(methotrexate)、ペメトレキセド(pemetrexed)、フルオロウラシル(fluorouracil)、テガフール/ウラシル(tegaful・uracil)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、テガフール/ギメラシル/オテラシル(tegaful・gimeracil・oteracil)、カペシタビン(capecitabine)、シタラビン(cytarabine)、エノシタビン(enocitabine)、ゲムシタビン(gemcitabine)、6−メルカプトプリン(6−mercaptopurine)、フルダラビン(fludarabin)、ペントスタチン(pentostatin)、クラドリビン(cladribine)、ヒドロキシウレア(hydroxyurea)、ドキソルビシン(doxorubicin)、エピルビシン(epirubicin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、イダルビシン(idarubicine)、ピラルビシン(pirarubicin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、アムルビシン(amurubicin)、アクチノマイシンD(actinomycin D)、ブレオマイシン(bleomycine)、ペプレオマイシン(pepleomycin)、マイトマイシンC(mytomycin C)、アクラルビシン(aclarubicin)、ジノスタチン(zinostatin)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンデシン(vindesine)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビノレルビン(vinorelbine)、パクリタキセル(paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、ノギテカン(nogitecan、topotecan)、エトポシド(etoposide)、プレドニゾロン(prednisolone)、デキサメタゾン(dexamethasone)、タモキシフェン(tamoxifen)、トレミフェン(toremifene)、メドロキシプロゲステロン(medroxyprogesterone)、アナストロゾール(anastrozole)、エキセメスタン(exemestane)、レトロゾール(letrozole)、リツキシマブ(rituximab)、イマチニブ(imatinib)、ゲフィチニブ(gefitinib)、ゲムツズマブ・オゾガマイシン(gemtuzumab ozogamicin)、ボルテゾミブ(bortezomib)、エルロチニブ(erlotinib)、セツキシマブ(cetuximab)、ベバシズマブ(bevacizumab)、スニチニブ(sunitinib)、ソラフェニブ(sorafenib)、ダサチニブ(dasatinib)、パニツムマブ(panitumumab)、アスパラギナーゼ(asparaginase)、トレチノイン(tretinoin)、三酸化ヒ素(arsenic trioxide)、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられ、このうち植物アルカロイド系抗がん剤、例えばCPT−11、SN−38又はそれらの塩が好ましい。
本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いて抗がん剤感受性を判定するには、検体中のL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質を測定すればよい。ここで、検体としては、がんを有する被験者(がん患者)由来の生体試料、例えば血液、血清、血漿、尿、腫瘍組織・細胞、腹水、胸水、脳脊髄液、便、喀痰等が挙げられるが、血清が特に好ましい。
また、本発明の対象となるがんとしては、咽頭がんを代表とする口唇、口腔及び咽頭がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がんなどを代表とする消化器がん、肺がんを代表とする呼吸器及び胸腔内臓器がん、骨及び関節軟骨がん、皮膚の悪性黒色腫、有棘細胞がん及びその他の皮膚のがん、中皮腫を代表とする中皮及び軟部組織がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がんを代表とする女性性器がん、前立腺がんを代表とする男性性器がん、膀胱がんを代表とする尿路がん、脳腫瘍を代表とする眼、脳及び中枢神経系がん、甲状腺及びその他の内分泌腺がん、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病を代表とするリンパ組織、造血組織及び関連組織がん、及びこれらを原発巣とする転移組織のがん等が挙げられるが、特に非小細胞肺がん、小細胞肺がん、子宮頸がん、卵巣がん、胃がん、結腸・直腸がん、有棘細胞がん、悪性リンパ腫に対して好適に利用できる。
検体中のL−フェニルアラニン、N,N−ジメチルグリシン代謝系物質の測定手段は、被測定対象物質により適宜決定すればよく、例えばCE−TOFMS、Gas chromatography−mass spectrometry(GC−MS)、HPLC、免疫学的測定法、生化学的測定法等により測定可能である。L−フェニルアラニンの場合には、CE−TOFMS、HPLC、生化学的測定法等により定量的に測定可能であり、特に酵素法を利用した蛍光強度による定量測定が簡便である。N,N−ジメチルグリシンの場合には、CE−TOFMS、HPLC、GC−MS等により定量的に測定可能である。
対象とする抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質濃度を測定し、抗がん剤投与前後におけるL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の濃度が変化しなければそのがんは抗がん剤感受性ではなく、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の濃度が低下した場合には、そのがんは抗がん剤感受性であると判定できる。
また、抗がん剤投与前あるいは投与後初期の段階において、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴う副作用の増大を防ぐことにも大きく貢献する。
本発明の抗がん剤感受性の判定方法を実施するには、検体中のL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質を測定するためのプロトコールを含むキットを用いるのが好ましい。当該キットには、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質測定試薬、測定試薬の使用方法、及び抗がん剤感受性の有無を判定するための基準等が含まれる。当該基準には、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の標準濃度、高いと判断される濃度、低いと判断される濃度、測定結果に影響を与える要因とその影響の程度等が含まれ、これらの濃度は対象とする抗がん剤ごとに設定することが可能である。当該基準を用いて、前記のように判定することができる。
L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の発現抑制を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、in vitro又はin vivoにおいてL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の発現を抑制する物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、担癌動物における抗がん剤投与前後において、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の濃度の低下を亢進させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質(抗がん剤感受性亢進剤)である。また、in vitroでは、各種がん細胞株において抗がん剤の存在下でL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の濃度を低下させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質(抗がん剤感受性亢進剤)である。
さらに、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質を指標とすれば、抗がん剤がスクリーニングできる。すなわち、in vitro又はin vivoにおいて、ある物質によりL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の濃度が低下すれば、その物質は抗がん剤である。例えば、担癌動物にある物質を投与した後、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の濃度が低下すれば、その物質は抗がん剤である。また、in vitroでは、ある物質を各種がん細胞株に曝露後、曝露前に比べてL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の濃度が低下すれば、その物質は抗がん剤である。薬効が期待できる抗がん剤であれば、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質の濃度低下は腫瘍の縮小あるいは殺細胞効果よりも早く現れるため、L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシン代謝系物質を指標としたスクリーニングにより、より短時間の検討で当該物質が抗がん剤として有用であるかどうかを判定することができる。抗がん剤開発に伴う労力や費用の削減という面からも大きな効果が期待できる。
かくして得られた抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上する。抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せた形態としては、それらの成分の両方を含む一の組成物であってもよく、それぞれ別個の製剤の組み合せであってもよい。また、それらの成分はそれぞれ別の投与経路であってもよい。ここで用いられる対象となる抗がん剤としては、前記と同様であり、CPT−11、SN−38、オキサリプラチン、シクロフォスファミド(cyclophosphamide)、イフォスファミド(ifosfamide)、チオテパ(thiotepa)、メルファラン(melphalan)、ブスルファン(busulfan)、ニムスチン(nimustine)、ラニムスチン(ranimustine)、ダカルバジン(dacarbazine)、プロカルバジン(procarbazine)、テモゾロミド(temozolomide)、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、ネダプラチン(nedaplatin)、メトトレキサート(methotrexate)、ペメトレキセド(pemetrexed)、フルオロウラシル(fluorouracil)、テガフール/ウラシル(tegaful・uracil)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、テガフール/ギメラシル/オテラシル(tegaful・gimeracil・oteracil)、カペシタビン(capecitabine)、シタラビン(cytarabine)、エノシタビン(enocitabine)、ゲムシタビン(gemcitabine)、6−メルカプトプリン(6−mercaptopurine)、フルダラビン(fludarabin)、ペントスタチン(pentostatin)、クラドリビン(cladribine)、ヒドロキシウレア(hydroxyurea)、ドキソルビシン(doxorubicin)、エピルビシン(epirubicin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、イダルビシン(idarubicine)、ピラルビシン(pirarubicin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、アムルビシン(amurubicin)、アクチノマイシンD(actinomycin D)、ブレオマイシン(bleomycine)、ペプレオマイシン(pepleomycin)、マイトマイシンC(mytomycin C)、アクラルビシン(aclarubicin)、ジノスタチン(zinostatin)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンデシン(vindesine)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビノレルビン(vinorelbine)、パクリタキセル(paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、ノギテカン(nogitecan、topotecan)、エトポシド(etoposide)、プレドニゾロン(prednisolone)、デキサメタゾン(dexamethasone)、タモキシフェン(tamoxifen)、トレミフェン(toremifene)、メドロキシプロゲステロン(medroxyprogesterone)、アナストロゾール(anastrozole)、エキセメスタン(exemestane)、レトロゾール(letrozole)、リツキシマブ(rituximab)、イマチニブ(imatinib)、ゲフィチニブ(gefitinib)、ゲムツズマブ・オゾガマイシン(gemtuzumab ozogamicin)、ボルテゾミブ(bortezomib)、エルロチニブ(erlotinib)、セツキシマブ(cetuximab)、ベバシズマブ(bevacizumab)、スニチニブ(sunitinib)、ソラフェニブ(sorafenib)、ダサチニブ(dasatinib)、パニツムマブ(panitumumab)、アスパラギナーゼ(asparaginase)、トレチノイン(tretinoin)、三酸化ヒ素(arsenic trioxide)、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうち、植物アルカロイド系抗がん剤、例えばCPT−11、SN−38又はそれらの塩が特に好ましい。
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例1
(1)方法
(a)動物
日本クレア社から購入したヌードマウス(BALB/cAJcl−nu/nu)、6週齢の雄性マウスを使用し、恒温室で自由に摂食可能な状態で通常の餌と飲水を与えた。本検討は慶應義塾大学医学部動物実験ガイドラインに沿ったプロトコルを申請し、承認を得て愛護的に行った。
(b)ヒト培養大腸癌細胞
SN−38高感受性であるヒト培養大腸癌細胞HCT−116とSN−38低感受性であるヒト培養大腸癌細胞HT−29は、株式会社ヤクルト本社より入手した。
(c)薬剤
CPT−11の製剤であるカンプトTMとカンプト溶解剤は、株式会社ヤクルト本社より入手した。
(d)担癌マウスの作製とサンプル採取
6週齢のヌードマウスの後背部に、SN−38低感受性であるヒト培養大腸癌細胞HT−29とSN−38高感受性であるヒト培養大腸癌細胞HCT−116を200万個/100μL/マウスで皮下移植した。移植後、腫瘍サイズを長径×短径/2の式を用いて測定し、腫瘍サイズが300−400mmとなった時点でCPT−11投与群と溶解剤投与群に無作為に割り付け、day0とし、CPT−11投与群には、CPT−11の製剤であるカンプトTMを4.5mL/kg(CPT−11量として90mg/kg)、CPT−11非投与群としては、カンプトTMの溶解剤(D−ソルビトール、乳酸、pH調節剤)を尾静脈より、緩徐に投与した。day0、投与12時間後、24時間後、72時間後、7日後に腫瘍サイズを測定し、解剖後採血を行った。採取した血液は、10,000rpmにて10分間遠心分離後、血清画分を液体窒素にて凍結し、メタボローム用サンプルの調製に使用するまで−80℃で保存した。コントロール群として癌細胞非移植群も作製し、同様の処置を施した。
(e)メタボロームサンプルの調製
マウス解剖後−80℃で保存してある血清に、内部標準物質(IS)を添加したメタノール溶液を加え、タンパク質を変性させた後、クロロホルムとミリQ水を加え液―液抽出を行い、夾雑成分を除去した。代謝物を含む水―メタノール層を採取し、分画分子量5000kDaの遠心限外ろ過フィルターを用いて除タンパクを行った後、ろ液を減圧乾燥し、−80℃に保存した。測定直前にミリQ水に溶解させ、メタボローム測定に供した。
(f)メタボローム測定
血清中代謝物の網羅的測定はAgilent Technologies社のキャピラリー電気泳動―飛行時間型質量分析計(CE−TOFMS)にて行った。本検討では、キャピラリーの出口が陰極となるように電圧を印加し、陽イオン性の代謝物を網羅的に測定した。
(g)解析方法
得られたピークは、ピーク自動抽出ソフトであるMolecular Feature Extratcor(Agilent technologies,Inc.)を用いて、m/z 50−1000、RT 0−50分、S/N比2以上の条件でピークを自動抽出させ、Microsoft excelTM上にて横軸にm/z、縦軸にピーク強度のIS ratioをプロットさせた。解析方法としては、Microsoft excelTM上に横軸m/zを細かくプロットし、一つずつピークの発現量の差を確認して行った。
(2)結果
ヌードマウスの後背部に、SN−38高感受性であるヒト培養大腸癌細胞HCT−116とSN−38低感受性であるヒト培養大腸癌細胞HT−29を移植した後、腫瘍サイズを、長径×短径2/2の式を用いて測定を行った。腫瘍サイズが300−400mm3となった時点でCPT−11投与群と溶解剤投与群に無作為に割り付け、day0と投与12時間後、24時間後、72時間後、及び7日後の腫瘍サイズを測定し、その結果を図1に示した。投与後7日後において、SN−38高感受性であるヒト培養大腸癌細胞HCT−116を移植し、CPT−11を投与した群と、溶解剤を投与した群において有意な差が認められた(p=0.01319)。また、SN−38高感受性であるヒト培養大腸癌細胞HCT−116を移植し、CPT−11を投与した群と、SN−38低感受性であるヒト培養大腸癌細胞HT−29を移植し、CPT−11を投与した群においても有意な差が認められた(p=0.04979)。よって、本検討で使用したヒト培養大腸癌細胞HCT−116はヒト培養大腸癌細胞HT−29と比較して、CPT−11に対する感受性が高く、逆に、ヒト培養大腸癌細胞HT−29はヒト培養大腸癌細胞HCT−116と比較して、CPT−11に対する感受性が低いことを確認することができた。
1サンプルあたり検出されたピーク数は平均263個であった。各ピークの変化パターンの解析を目視で個別に進めたところ、CPT−11薬剤反応性を示すバイオマーカーとなりうる候補ピークが得られた。その候補ピークは、CPT−11又は溶解剤投与24時間後の血清中代謝物を測定したm/z 166.086のピーク(図2)と、CPT−11又は溶解剤投与後12時間後の血清中代謝物を測定したm/z 104.070のピーク(図3)であった。
m/z 166.086のピークについては、SN−38低感受性であるヒト培養大腸癌細胞HT−29を移植した担癌マウスにおいて、薬剤投与24時間後ではCPT−11投与群と溶解剤投与群で血清中の発現量が同程度であった。しかし、SN−38高感受性であるヒト培養大腸癌細胞HCT−116を移植した担癌マウスにおいて、薬剤投与24時間後ではCPT−11投与群で、癌細胞を移植していないcontrol群と同程度まで血清中のピーク発現量が低下した。よって、CPT−11無効群とCPT−11有効群に分けることができ、薬剤反応性を示すマーカーと考えられた。このピークに関して、解析ソフトAnalystTM QS(Applied Biosystems,Inc.)を用いて、分子式の推定を進めた。親ピークに対するアイソトープの割合、精密質量等の情報から分子式を特定した結果、候補ピークとしたm/z 166.086の分子式はC12NOであった。京都大学が作製したKEGG:生命システム情報統合データベース(http://www.kegg.jp/)の代謝データベースを用いて、この分子式から推定される物質を検索したところ、このピークがL−フェニルアラニンであることが判明した。
m/z 104.070のピークについては、SN−38低感受性であるヒト培養大腸癌細胞HT−29を移植した担癌マウスにおいて、薬剤投与12時間後ではCPT−11投与群と溶解剤投与群では血清中の発現量が同程度であった。しかし、SN−38高感受性であるヒト培養大腸癌細胞HCT−116を移植した担癌マウスにおいて、薬剤投与12時間後ではCPT−11投与群で、癌細胞を移植していないcontrol群と同程度まで血清中のピーク発現量が低下した。よって、CPT−11無効群とCPT−11有効群に分けることができ、薬剤反応性を示すマーカーと考えられた。このピークに関して、解析ソフトAnalystTM QS(Applied Biosystems,Inc.)を用いて、分子式の推定を進めた。親ピークに対するアイソトープの割合、精密質量等の情報から分子式を特定した結果、候補ピークとしたm/z 104.070の分子式はCNOであった。京都大学が作製したKEGG:生命システム情報統合データベース(http://www.kegg.jp/)の代謝データベースを用いて、この分子式から推定される物質を検索したところ、4種類の候補化合物が得られた。標品を用いた添加試験により、このピークがN,N−ジメチルグリシンであることが判明した。

Claims (6)

  1. L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンからなる、イリノテカン、SN−38及びそれらの塩から選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性判定マーカー。
  2. イリノテカン、SN−38及びそれらの塩から選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性を判定する目的で、検体中のL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンを測定する方法。
  3. 検体が、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項2記載の測定方法。
  4. 検体が、抗がん剤を投与された、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項2又は3記載の測定方法。
  5. 検体中のL−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンを測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項2〜4のいずれか1項記載の測定方法を実施するためのキット。
  6. L−フェニルアラニン及び/又はN,N−ジメチルグリシンの発現抑制を指標とする、イリノテカン、SN−38及びこれらの塩から選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性亢進剤のスクリーニング方法。
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