KR20110003464A

KR20110003464A - 항암제 감수성 판정 마커

Info

Publication number: KR20110003464A
Application number: KR1020107016000A
Authority: KR
Inventors: 유스케 다니가와라; 미츠히로 와타나베; 에리 아리타; 아키토 니시무타; 야스코 야마요시; 다케시 마츠자키; 신지 스기모토
Original assignee: 각고호우징 게이오기주크; 가부시끼가이샤 야구르트혼샤
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2009-01-30
Publication date: 2011-01-12
Also published as: WO2009096189A1; US20110003842A1; EP2237042B1; SG192544A1; EP2237042A1; CA2712966A1; CN101932939A; EP2698637B1; JP5461200B2; JPWO2009096189A1; EP2237042A4; CN101932939B; AU2009208519A1; US8945929B2; EP2698637A1

Abstract

개개의 환자의 치료 반응성을 판별할 수 있는 항암제 감수성 판정 마커 및 그것을 이용하는 새로운 암 치료 수단을 제공한다. L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질로 이루어지는 항암제 감수성 판정 마커.

Description

항암제 감수성 판정 마커{MARKER FOR DETERMINATION OF SENSITIVITY TO ANTI-CANCER AGENT}

본 발명은 대상이 되는 환자의 암이, 항암제에 치료 반응성을 갖는지 여부를 판정하기 위해서 사용하는 항암제 감수성 판정 마커 및 그 응용에 관한 것이다.

항암제에는, 알킬화제, 백금제제, 대사 길항제, 항암성 항생 물질, 항암성 식물 알칼로이드 등의 종류가 있다. 그리고 이들 항암제에는 암의 종류에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있다. 그러나, 유효한 것으로 인정되고 있는 종류의 암이어도, 개개의 환자에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있는 것이 알려져 있다. 이와 같은 개개의 환자의 암에 대해 항암제가 효과를 나타내는지 여부를 항암제 감수성이라고 한다.

염산 이리노테칸 (CPT-11) 은 일본에서 개발된 topoisomerase I 저해라는 작용 기전을 갖는 항암제이다. 일본에서, CPT-11 은, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 자궁경암, 난소암에 유효한 약제로서 1994년 1월에 인가되었고, 또한 1995년 7월에 위암, 결장·직장암, 유방암, 유극세포암, 악성 임파종에 대한 적응이 인정되었다. CPT-11 은 특히 대장암의 영역에서 다제병용 요법의 first line drug 혹은 second line drug 로서 세계적인 표준 치료약의 위치를 차지하고, 그 유용성이 인정되었다 (비특허문헌 1 ∼ 6).

진행성·전이 대장암에 대한 화학 요법은, 1990년대에 등장한 CPT-11, 옥살리플라틴 등의 key drug 와, 그때까지 대장암 치료의 중심적 약제였던 플루오로우라실 (5-FU) 을 중심으로 하는 불화 피리미딘 제제를 병용함으로써, 생존율을 비롯한 임상 성적이 극적으로 개선되었다. 그러나 그런데도 또한 주효율은 대략 50 ％ 정도로, 심각한 부작용이라는 높은 리스크를 무릅쓰고 항암제가 투여된 환자의 절반에서는 효과가 얻어지지 않고 있는 것이 현상황으로, 개개의 치료 반응성 (응답자·무응답자) 을 판별하는 항암제 감수성 예측 마커의 확립은 급무이다.

일반적으로, 암 화학 요법의 치료 스케줄은 장기간에 걸쳐, 부작용의 발현을 보면서 몇 쿠어 반복 치료를 실시한 다음에, 효과가 얻어지고 있는지, 그대로 투여를 계속해야 할 것인지 판단하는데, 그때까지는 긴 시간과 고액의 의료비가 들고, 부작용의 발현도 일어나고 있는 것이 사실이다. 따라서, 개개의 환자에 대해, 효과가 얻어지는지 여부를 치료 조기에 예측할 수 있는 수단이 있으면, 환자의 부담이나 부작용의 발현을 경감시켜, 의료비를 삭감할 수 있다.

CPT-11 은 그 자체가 항종양 활성을 갖지만, 체내에서 카르복실에스테라아제 (Carboxyl esterase) 에 의해 활성화되어, CPT-11 에 비해 대략 100 ∼ 수천 배 강한 항종양 활성을 갖는 7-에틸-10-하이드록시캄프토테신 (7-ethyl-10-hydroxycamptothecin) (SN-38) 으로 변환된다. CPT-11 과 SN-38 이 동시에 체내에 존재함으로써 항종양 효과를 나타내는 것으로 생각되고 있다. SN-38 은 간세포 내에서 UDP-글루크론산 전이 효소 (UGT：UDP-glucuronosyltransferase) 에 의해 글루크론산 포합을 받아, 세포 독성이 없는 SN-38 글루크론산 포합체 (SN-38G) 로 되고, 주로 담즙 중에 배설되어 장관으로 이행하고, 그 후에는 변 속에 배설된다. 장관에 배설된 SN-38G 의 일부는, 장내 세균이 갖는 β-글루크로니다아제에 의해 탈포합되어 다시 활성형의 SN-38 로 되고, 장관 상피의 트랜스포터를 개재하여 재흡수되고 장간 순환, 장관 상피 세포 내에서의 UGT 에 의한 글루크론산 포합화 등의 단계를 거치면서 대사·배설을 받는다 (비특허문헌 7). 이 때에, SN-38 이 장관 점막을 장해하여, 설사를 유발하는 것으로 생각되고 있다. 또한, 세포 분열이 활발한 골수에도 영향을 미쳐, 적혈구 감소·백혈구 감소·혈소판 감소를 일으키는 것이 관찰되고 있다.

심각한 설사나 호중구 감소증 등의 부작용은, UGT1A1 유전다형이 초래하는 SN-38 체내 노출량의 변화가 한 요인인 것이 나타나 있다. 그러나 치료 효과에 관해서는, 프로드러그인 CPT-11 로부터 활성 대사물 SN-38 에 대한 변환과 그 해독, 또한 장관 순환의 과정에 있어서의 SN-38 의 재생성이나, CPT-11 자체의 대사와 대사물로부터의 SN-38 의 생성과 같은 체내 동태의 복잡성에 의해, 약물 동태에 따라 치료 효과를 예측할 수 있다는 보고는 여전히 이루어져 있지 않다. 말초혈 단핵구 세포의 카르복실에스테라아제 mRNA 발현량이 SN-38 과 SN-38G 의 AUC 비와는 상관되지만 종양 축소 효과와는 상관이 없었다는 보고도 이루어져 있다 (비특허문헌 8).

또한 한편, CPT-11 감수성 혹은 내성에 관여하는 인자로서, SN-38 의 표적인 topoisomerase I 변이의 유무나 발현량, CPT-11 로부터 SN-38 에 대한 변환에 관여하는 카르복실에스테라아제 활성 (비특허문헌 9), CPT-11 이나 SN-38 의 세포 내 축적량에 영향을 미치는 트랜스포터 (multidrug resistance protein (MRP)-1, MRP-2, Breast cancer resistant protein (BCRP)/ABCG2) 의 관여가 보고되어 있고, 그 밖에, 세포 증식 항원 Ki-67, 암 억제 유전자 p53 등도 CPT-11 을 사용한 치료에 대한 반응성과의 관련이 검토되어 있다. 매우 최근, in vitro 에 있어서 항암제 감수성 데이터와 마이크로 어레이의 데이터를 조합함으로써 체계적으로 항암제 감수성을 예측하고자 하는 시도가 이루어져 있고, 캄프토테신류에서는 토포테칸에 대해 검토되어 있다 (비특허문헌 10). 임상 연구에 있어서는, 항아포토시스 작용을 갖는 Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) 의 혈장 중 레벨이, 전이 결장·직장암에 대한 CPT-11＋5-FU 병용 요법의 임상 예후와 유의적으로 상관되는 것이 최근 보고되어 있다 (비특허문헌 11). 이와 같이 CPT-11 감수성 예측 바이오 마커의 필요성이 인식되어 많은 연구가 이루어지고 있는데, 표적인 topoisomerase I 에 대해서도, 5-FU 감수성 예측 인자로 여겨지는 티미딜산 합성 효소와 함께 5-FU＋CPT-11 병용 요법의 치료 반응성과의 사이에 명확한 관련성을 알아낼 수 없었다는 보고도 있는 등 (비특허문헌 12), 치료 반응성을 예측할 수 있는 명확한 바이오 마커는 확립되어 있지 않다.

J Clin Oncol 1993；11：909-913. Semin Oncol 1999；26 (1 Suppl5)：6-12. Lancet 1998；352：1407-1412. Pro ASCO 2005；Abstract＃3506. N Engl J Med 2000；343：905-914. Lancet 2000；355：1041-1047. Cancer Res 1991；51：4187-4191. Clin Cancer Res 2005；11：6901-6907. Pharmacogenet Genomics 2007；17：1-10. Nat Med 2006；12：1294-1300. Clin Cancer Res 2007；13：4117-4122. Int J Cancer 2004；111：252-258.

본 발명의 목적은 개개의 환자의 치료 반응성을 판별할 수 있는 항암제 감수성 판정 마커 및 그것을 이용하는 새로운 암 치료 수단을 제공하는 것에 있다.

그래서, 본 발명자들은 캐필러리 전기 영동-비행 시간형 질량 분석계 (CE-TOFMS) 를 사용하여, in vivo 담암 (擔癌) 마우스에 있어서의 혈청 중의 메타볼롬 (전체 대사 물질의 총체) 을 망라적으로 해석함으로써, 항암제 감수성 판정 마커의 탐색을 실시하였다. SN-38 에 대한 감수성이 상이한 인간 유래 대장암 세포주 2 종류를 각각 누드 마우스에 이식하고, 검토한 결과, 암 이식 마우스군에서 특이적으로 상승되는 대사 물질이, CPT-11 치료에 의해, 고감수성군에서만 컨트롤군까지 감소하는 것을 알아내었고, 또한 그 대사 물질은 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신인 것을 알아내었다. 이러한 지견에 기초하여, 거듭 검토한 결과, 암환자 유래의 생체 시료 중의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질의 농도를 측정하면, 당해 암환자의 암이 항암제 감수성인지 여부를 판정할 수 있는 것, 또한 이 물질의 발현 억제를 지표로 하면 항암제 감수성 항진제의 스크리닝이 가능해지는 것, 그리고 당해 항암제 감수성 항진제와 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 병용하면, 당해 항암제의 치료 효과가 비약적으로 향상되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질로 이루어지는 항암제 감수성 판정 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 검체 중의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 항암제 감수성의 판정 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 검체 중의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질을 측정하기 위한 프로토콜을 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제 감수성의 판정 방법을 실시하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명은 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질의 발현 억제를 지표로 하는 항암제 감수성 항진제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 얻어진 항암제 감수성 항진제를 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명은 상기 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 조합하여 이루어지는 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명은 상기 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제의 조합인, 암 치료약 제조를 위한 사용을 제공하는 것이다.

그리고, 본 발명은 상기 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 항암제 감수성 판정 마커를 사용하면, 개개의 환자의 항암제 치료 반응성이 항암제 투여 전, 혹은 항암제 투여 개시 후 조기에 확실하게 판정할 수 있는 결과, 보다 치료 효과가 높은 항암제의 선택이 가능해지고, 그 결과로서 치료 효과를 기대할 수 없는 항암제의 계속 투여에 수반하는 암의 진행, 부작용의 증대를 방지할 수 있고, 나아가서는 환자의 부담 경감, 의료비의 삭감도 기대할 수 있다. 또한, 이 마커를 사용하면, 항암제 감수성을 항진시키는 약제를 스크리닝할 수 있어, 그 대상이 된 항암제와 항암제 감수성 항진제를 병용하면, 암 치료 효과가 비약적으로 향상된다.

도 1 은 각 군에 있어서의 담암 마우스 종양 사이즈의 시간 경과적 변화를 나타내는 도면이다.
도 2 는 암 세포를 이식하지 않은 컨트롤군 (Cont), SN-38 저감수성인 인간 배양 대장암 세포 HT-29 이식군 (HT), SN-38 고감수성인 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 이식군 (HCT) 에 있어서의 CPT-11 투여 후 24 시간 후의 누드 마우스 혈청 중 페닐알라닌 농도 (m/z 166.086) 를 나타내는 도면이다.
도 3 은 암 세포를 이식하지 않은 컨트롤군 (Cont), SN-38 저감수성인 인간 배양 대장암 세포 HT-29 이식군 (HT), SN-38 고감수성인 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 이식군 (HCT) 에 있어서의 CPT-11 투여 후 12 시간 후의 누드 마우스 혈청 중 N,N-디메틸글리신 농도 (m/z 104.070) 를 나타내는 도면이다.

본 발명에 있어서의 항암제 감수성 판정 마커의 하나는, L-페닐알라닌이 관여하는 대사계 상의 물질 (L-페닐알라닌 대사계 물질이라고도 한다) 이고, 당해 물질로는 L-페닐알라닌 이외에, 대사계에 있어서 L-페닐알라닌의 농도를 상승시키는 모든 물질이 포함되고, L-페닐알라닌에 대한 대사를 항진시키는 물질, L-페닐알라닌으로부터의 대사를 저해시키는 물질을 들 수 있다. 여기서, L-페닐알라닌에 대한 대사를 항진시키는 물질로는, 단백질이나 펩티드부터 L-페닐알라닌까지의 대사계에 있어서의 중간체, 그 대사에 관여하는 효소, 보조 효소, 그 효소의 발현량이나 활성을 변화시키는 물질 등이 포함된다. 또한 L-페닐알라닌으로부터의 대사를 저해시키는 물질로는, L-페닐알라닌 대사 효소의 저해 물질, L-페닐알라닌 대사 효소의 발현량이나 활성을 저하시키는 물질, L-페닐알라닌 대사 효소의 보조 효소 등을 들 수 있다. 이들 중, L-페닐알라닌이 특히 바람직하다.

본 발명에 있어서의 다른 하나의 항암제 감수성 판정 마커는, N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질 (N,N-디메틸글리신 대사계 물질이라고도 한다) 이고, 당해 물질로는 N,N-디메틸글리신 이외에, 대사계에 있어서 N,N-디메틸글리신의 농도를 상승시키는 모든 물질이 포함되고, N,N-디메틸글리신에 대한 대사를 항진시키는 물질, N,N-디메틸글리신으로부터의 대사를 저해시키는 물질을 들 수 있다. 여기서, N,N-디메틸글리신에 대한 대사를 항진시키는 물질로는, 인 지질부터 N,N-디메틸글리신까지의 대사계에 있어서의 중간체, 그 대사에 관여하는 효소, 보조 효소, 그 효소의 발현량이나 활성을 변화시키는 물질 등이 포함된다. 또한 N,N-디메틸글리신으로부터의 대사를 저해시키는 물질로는, N,N-디메틸글리신 대사 효소의 저해 물질, N,N-디메틸글리신 대사 효소의 발현량이나 활성을 저하시키는 물질, N,N-디메틸글리신 대사 효소의 보조 효소 등을 들 수 있다. 이들 중, N,N-디메틸글리신이 특히 바람직하다.

L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신은, 후기하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 암 세포가 이식된 마우스의 혈청 중 농도가, 암 세포 비이식군에 비해 상승되어 있었다. 또한, SN-38 저감수성 암 세포인 HT-29 가 이식된 군에서는, CPT-11 투여 후에도 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 농도는 저하되지 않았다. 이것에 대해, SN-38 고감수성 암 세포인 HCT-116 이 이식된 군에서는, CPT-11 투여에 의해 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 농도는 컨트롤군과 동일한 정도까지 저하되었다. 따라서 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신은, CPT-11, SN-38 등의 항암제 감수성 판정 마커로서 유용하다.

본 발명의 항암제 감수성 판정 마커의 대상이 되는 항암제로는, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신의 대사계에 영향을 미치는 암이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 CPT-11, SN-38, 옥살리플라틴, 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 티오테파 (thiotepa), 멜파란 (melphalan), 부설판 (busulfan), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine), 다카르바진 (dacarbazine), 프로카르바진 (procarbazine), 테모졸로마이드 (temozolomide), 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 네다플라틴 (nedaplatin), 메토트렉사트 (methotrexate), 페메트렉시드 (pemetrexed), 플루오로우라실 (fluorouracil), 테가풀/우라실 (tegaful·uracil), 독시플루리딘 (doxifluridine), 테가풀/기메라실/오테라실 (tegaful·gimeracil·oteracil), 카페시타빈 (capecitabine), 시타라빈 (cytarabine), 에노시타빈 (enocitabine), 겜시타빈 (gemcitabine), 6-메르캅토푸린 (6-mercaptopurine), 플루다라빈 (fludarabin), 펜토스타틴 (pentostatin), 클라드리빈 (cladribine), 하이드록시우레아 (hydroxyurea), 독소루비신 (doxorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicine), 피라루비신 (pirarubicin), 마이토잔트론 (mitoxantrone), 암루비신 (amurubicin), 악티노마이신 D (actinomycin D), 블레오마이신 (bleomycine), 페플레오마이신 (pepleomycin), 마이토마이신 C (mytomycin C), 아클라루비신 (aclarubicin), 지노스타틴 (zinostatin), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 빈블라스틴 (vinblastine), 비노렐빈 (vinorelbine), 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 노기테칸 (nogitecan, topotecan), 에토포시드 (etoposide), 프레드니솔론 (prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone), 타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 아나스트로졸 (anastrozole), 엑세메스탄 (exemestane), 레트로졸 (letrozole), 리툭시마브 (rituximab), 이마티니브 (imatinib), 게피티니브 (gefitinib), 겜투주마브·오조가마이신 (gemtuzumab ozogamicin), 보르테조미브 (bortezomib), 엘로티니브 (erlotinib), 세툭시마브 (cetuximab), 베바시주마브 (bevacizumab), 수니티니브 (sunitinib), 소라페니브 (sorafenib), 다사티니브 (dasatinib), 파니투무마브 (panitumumab), 아스파라기나아제 (asparaginase), 트레티노인 (tretinoin), 삼산화비소 (arsenic trioxide), 또는 그들의 염, 또는 그들의 활성 대사 물질 등을 들 수 있고, 이 중 식물 알칼로이드계 항암제, 예를 들어 CPT-11, SN-38 또는 그들의 염이 바람직하다.

본 발명의 항암제 감수성 판정 마커를 사용하여 항암제 감수성을 판정하기 위해서는, 검체 중의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질을 측정하면 된다. 여기서, 검체로는, 암을 가진 피험자 (암환자) 유래의 생체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 종양 조직·세포, 복수, 흉수, 뇌척수액, 변, 객담 등을 들 수 있는데, 혈청이 특히 바람직하다.

또한, 본 발명의 대상이 되는 암으로는, 인두암을 대표로 하는 입술, 구강 및 인두암, 식도암, 위암, 결장·직장암 등을 대표로 하는 소화기암, 폐암을 대표로 하는 호흡기 및 흉강 내장기암, 뼈 및 관절 연골암, 피부의 악성 흑색종, 유극세포암 및 그 밖의 피부의 암, 중피종을 대표로 하는 중피 및 연부 조직암, 유방암, 자궁암, 난소암을 대표로 하는 여성 성기암, 전립선암을 대표로 하는 남성 성기암, 방광암을 대표로 하는 요로암, 뇌종양을 대표로 하는 눈, 뇌 및 중추 신경계암, 갑상선 및 그 밖의 내분비선암, 비호지킨 림프종이나 림프성 백혈병을 대표로 하는 림프 조직, 조혈 조직 및 관련 조직암, 및 이들을 원발소로 하는 전이 조직의 암 등을 들 수 있는데, 특히 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 자궁경암, 난소암, 위암, 결장·직장암, 유극세포암, 악성 림프종에 대해 바람직하게 이용할 수 있다.

검체 중의 L-페닐알라닌, N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 측정 수단은, 피측정 대상 물질에 의해 적절히 결정하면 되고, 예를 들어 CE-TOFMS, Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), HPLC, 면역학적 측정법, 생화학적 측정법 등에 의해 측정할 수 있다. L-페닐알라닌의 경우에는, CE-TOFMS, HPLC, 생화학적 측정법 등에 의해 정량적으로 측정할 수 있고, 특히 효소법을 이용한 형광 강도에 의한 정량 측정이 간편하다. N,N-디메틸글리신의 경우에는, CE-TOFMS, HPLC, GC-MS 등에 의해 정량적으로 측정할 수 있다.

대상으로 하는 항암제에 대한 감수성을 판정하기 위해서는, 항암제 투여 전 및 투여 후의 암환자 유래의 생체 시료 중의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질 농도를 측정하고, 항암제 투여 전후에 있어서의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 농도가 변화하지 않으면 그 암은 항암제 감수성이 아니고, 항암제 투여 전에 비해 투여 후에 있어서의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 농도가 저하된 경우에는, 그 암은 항암제 감수성인 것으로 판정할 수 있다.

또한, 항암제 투여 전 혹은 투여 후 초기의 단계에 있어서, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 농도가 소정의 표준 농도보다 높은 것으로 판단되는 농도를 갖는 경우에는, 그 암은 대상으로 하는 항암제에 대해 감수성은 아닌 것으로 판정할 수 있다. 대상으로 하는 항암제에 대해 감수성을 갖지 않는 경우에는, 그 약효를 기대할 수 없고, 이와 같은 약효를 기대할 수 없는 항암제의 투여가 계속된 경우, 암의 진행, 부작용의 증대가 위구 (危懼) 된다. 이와 같이, 본 발명에 있어서의 항암제 감수성 판정 마커는, 항암제 치료 반응성의 판정뿐만 아니라, 약효를 기대할 수 없는 항암제의 계속 투여에 수반되는 부작용의 증대를 방지하는 것에도 크게 공헌한다.

본 발명의 항암제 감수성의 판정 방법을 실시하기 위해서는, 검체 중의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질을 측정하기 위한 프로토콜을 함유하는 키트를 사용하는 것이 바람직하다. 당해 키트에는, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질 측정 시약, 측정 시약의 사용 방법, 및 항암제 감수성의 유무를 판정하기 위한 기준 등이 포함된다. 당해 기준에는, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 표준 농도, 높은 것으로 판단되는 농도, 낮은 것으로 판단되는 농도, 측정 결과에 영향을 미치는 요인과 그 영향의 정도 등이 포함되고, 이들 농도는 대상으로 하는 항암제마다 설정할 수 있다. 당해 기준을 이용하여, 상기와 같이 판정할 수 있다.

L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 발현 억제를 지표로 하면, 항암제 감수성 항진제를 스크리닝할 수 있다. 즉, in vitro 또는 in vivo 에 있어서 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 발현을 억제하는 물질은, 항암제 감수성을 항진시킨다. 예를 들어, 담암 동물에 있어서의 항암제 투여 전후에 있어서, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 농도의 저하를 항진시키는 물질은, 당해 항암제의 감수성을 항진시키는 물질 (항암제 감수성 항진제) 이다. 또한, in vitro 에서는, 각종 암 세포주에 있어서 항암제의 존재 하에서 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 농도를 저하시키는 물질은, 당해 항암제의 감수성을 항진시키는 물질 (항암제 감수성 항진제) 이다.

그리고, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질을 지표로 하면, 항암제를 스크리닝할 수 있다. 즉, in vitro 또는 in vivo 에 있어서, 어떠한 물질에 의해 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 농도가 저하되면, 그 물질은 항암제이다. 예를 들어, 담암 동물에 있는 물질을 투여한 후, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 농도가 저하되면, 그 물질은 항암제이다. 또한, in vitro 에서는, 어떠한 물질을 각종 암 세포주에 노출 후, 노출 전에 비해 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 농도가 저하되면, 그 물질은 항암제이다. 약효를 기대할 수 있는 항암제이면, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질의 농도 저하는 종양의 축소 혹은 살세포 효과보다 빨리 나타나기 때문에, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신 대사계 물질을 지표로 한 스크리닝에 의해, 보다 단시간의 검토에 의해 당해 물질이 항암제로서 유용한지 여부를 판정할 수 있다. 항암제 개발에 수반되는 노력이나 비용의 삭감이라는 면에서도 큰 효과를 기대할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 항암제 감수성 항진제와 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 병용하면, 당해 항암제의 치료 효과가 비약적으로 향상된다. 항암제 감수성 항진제와 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 조합한 형태로는, 그들의 성분의 양방을 포함하는 하나의 조성물이어도 되고, 각각 별개의 제제의 조합이어도 된다. 또한, 그들 성분은 각각 별개의 투여 경로이어도 된다. 여기서 사용되는 대상이 되는 항암제로서는, 상기와 동일하고, CPT-11, SN-38, 옥살리플라틴, 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 티오테파 (thiotepa), 멜파란 (melphalan), 부설판 (busulfan), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine), 다카르바진 (dacarbazine), 프로카르바진 (procarbazine), 테모졸로마이드 (temozolomide), 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 네다플라틴 (nedaplatin), 메토트렉사트 (methotrexate), 페메트렉시드 (pemetrexed), 플루오로우라실 (fluorouracil), 테가풀/우라실 (tegaful·uracil), 독시플루리딘 (doxifluridine), 테가풀/기메라실/오테라실 (tegaful·gimeracil·oteracil), 카페시타빈 (capecitabine), 시타라빈 (cytarabine), 에노시타빈 (enocitabine), 겜시타빈 (gemcitabine), 6-메르캅토푸린 (6-mercaptopurine), 플루다라빈 (fludarabin), 펜토스타틴 (pentostatin), 클라드리빈 (cladribine), 하이드록시우레아 (hydroxyurea), 독소루비신 (doxorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicine), 피라루비신 (pirarubicin), 마이토잔트론 (mitoxantrone), 암루비신 (amurubicin), 악티노마이신 D (actinomycin D), 블레오마이신 (bleomycine), 페플레오마이신 (pepleomycin), 마이토마이신 C (mytomycin C), 아클라루비신 (aclarubicin), 지노스타틴 (zinostatin), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 빈블라스틴 (vinblastine), 비노렐빈 (vinorelbine), 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 노기테칸 (nogitecan, topotecan), 에토포시드 (etoposide), 프레드니솔론 (prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone), 타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 아나스트로졸 (anastrozole), 엑세메스탄 (exemestane), 레트로졸 (letrozole), 리툭시마브 (rituximab), 이마티니브 (imatinib), 게피티니브 (gefitinib), 겜투주마브·오조가마이신 (gemtuzumab ozogamicin), 보르테조미브 (bortezomib), 엘로티니브 (erlotinib), 세툭시마브 (cetuximab), 베바시주마브 (bevacizumab), 수니티니브 (sunitinib), 소라페니브 (sorafenib), 다사티니브 (dasatinib), 파니투무마브 (panitumumab), 아스파라기나아제 (asparaginase), 트레티노인 (tretinoin), 삼산화비소 (arsenic trioxide), 또는 그들의 염, 또는 그들의 활성 대사 물질 등을 들 수 있다. 이 중 식물 알칼로이드계 항암제, 예를 들어 CPT-11, SN-38 또는 그들의 염이 특히 바람직하다.

실시예

다음으로 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1

(1) 방법

(a) 동물

일본 쿠레아사로부터 구입한 누드 마우스 (BALB/cAJcl-nu/nu), 6 주령의 웅성 마우스를 사용하여, 항온실에서 자유롭게 섭식 가능한 상태에서 통상적인 먹이와 음료수를 주었다. 본 검토는 케이오 기쥬쿠 대학 의학부 동물 실험 가이드 라인을 따른 프로토콜을 신청하고, 승인을 얻어 애호적으로 실시하였다.

(b) 인간 배양 대장암 세포

SN-38 고감수성인 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 과 SN-38 저감수성인 인간 배양 대장암 세포 HT-29 는, 주식회사 야쿠르트 본사에서 입수하였다.

(c) 약제

CPT-11 의 제제인 캄프토^TM 과 캄프토 용해제는, 주식회사 야쿠르트 본사에서 입수하였다.

(d) 담암 마우스의 제조과 샘플 채취

6 주령의 누드 마우스의 후배부에, SN-38 저감수성인 인간 배양 대장암 세포 HT-29 와 SN-38 고감수성인 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 을 200 만개/100㎕/마우스에 피하 이식하였다. 이식 후, 종양 사이즈를 장경 × 단경²/2 의 식을 이용하여 측정하고, 종양 사이즈가 300-400 ㎣ 로 된 시점에서 CPT-11 투여군과 용해제 투여군으로 무작위로 할당하여 day 0 으로 하고, CPT-11 투여군에는, CPT-11 의 제제인 캄프토^TM 을 4.5 ㎖/kg (CPT-11 량으로서 90 mg/kg), CPT-11 비투여군으로는, 캄프토^TM 의 용해제 (D-소르비톨, 락트산, pH 조절제) 를 꼬리 정맥으로부터, 느리고 천천히 투여하였다. day 0, 투여 12 시간 후, 24 시간 후, 72 시간 후, 7 일 후에 종양 사이즈를 측정하여, 해부 후 채혈을 실시하였다. 채취한 혈액은 10,000 rpm 으로 10 분간 원심 분리 후, 혈청 획분을 액체 질소로 동결시켜, 메타볼롬용 샘플의 조제에 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 보존하였다. 컨트롤군으로서 암 세포 비이식군도 제조하여, 동일한 처치를 실시하였다.

(e) 메타볼롬 샘플의 조제

마우스 해부 후 -80 ℃ 에서 보존되어 있는 혈청에, 내부 표준 물질 (IS) 을 첨가한 메탄올 용액을 첨가하고, 단백질을 변성시킨 후, 클로로포름과 밀리 Q 수 (水) 를 첨가하여 액-액 추출을 실시하여, 협잡 성분을 제거하였다. 대사물을 함유하는 물-메탄올층을 채취하고, 분획 분자량 5000 kDa 의 원심 한외 여과 필터를 사용하여 단백 제거를 실시한 후, 여과액을 감압 건조시켜 -80 ℃ 로 보존하였다. 측정 직전에 밀리 Q 수에 용해시켜, 메타볼롬 측정에 제공하였다.

(f) 메타볼롬 측정

혈청 중 대사물의 망라적 측정은 Agilent Technologies 사의 캐필러리 전기 영동-비행 시간형 질량 분석계 (CE-TOFMS) 로 실시하였다. 본 검토에서는, 캐필러리의 출구가 음극으로 되도록 전압을 인가하여, 양이온성의 대사물을 망라적으로 측정하였다.

(g) 해석 방법

얻어진 피크는, 피크 자동 추출 소프트인 Molecular Feature Extratcor (Agilent technologies, Inc.) 를 사용하여, m/z 50-1000, RT 0-50 분, S/N 비 2 이상의 조건에서 피크를 자동 추출시켜, Microsoft excel^TM 상에서 가로축에 m/z, 세로축에 피크 강도의 IS ratio 를 플롯시켰다. 해석 방법으로는, Microsoft excel^TM 상에 가로축 m/z 를 세세하게 플롯하여, 하나씩 피크의 발현량의 차이를 확인해 갔다.

(2) 결과

누드 마우스의 후배부에, SN-38 고감수성인 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 과 SN-38 저감수성인 인간 배양 대장암 세포 HT-29 를 이식한 후, 종양 사이즈를, 장경 × 단경²/2 의 식을 이용하여 측정을 실시하였다. 종양 사이즈가 300-400 ㎣ 로 된 시점에서 CPT-11 투여군과 용해제 투여군으로 무작위로 할당하고, day 0 과 투여 12 시간 후, 24 시간 후, 72 시간 후, 및 7 일 후의 종양 사이즈를 측정하여, 그 결과를 도 1 에 나타내었다. 투여 후 7 일 후에 있어서, SN-38 고감수성인 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 을 이식하고, CPT-11 을 투여한 군과, 용해제를 투여한 군에 있어서 유의적인 차가 관찰되었다 (p = 0.01319). 또한, SN-38 고감수성인 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 을 이식하고, CPT-11 을 투여한 군과, CPT-11 저감수성인 인간 배양 대장암 세포 HT-29 를 이식하고, CPT-11 을 투여한 군에 있어서도 유의적인 차가 관찰되었다 (p = 0.04979). 따라서, 본 검토에서 사용한 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 은 인간 배양 대장암 세포 HT-29 와 비교하여, CPT-11 에 대한 감수성이 높고, 반대로, 인간 배양 대장암 세포 HT-29 는 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 과 비교하여, CPT-11 에 대한 감수성이 낮은 것을 확인할 수가 있었다.

1 샘플당 검출된 피크 수는 평균 263 개였다. 각 피크의 변화 패턴의 해석을 육안으로 개별적으로 진행한 결과, CPT-11 약제 반응성을 나타내는 바이오 마커가 될 수 있는 후보 피크가 얻어졌다. 그 후보 피크는, CPT-11 또는 용해제 투여 24 시간 후의 혈청 중 대사물을 측정한 m/z 166.086 의 피크 (도 2) 와, CPT-11 또는 용해제 투여 후 12 시간 후의 혈청 중 대사물을 측정한 m/z 104.070 의 피크 (도 3) 였다.

m/z 166.086 의 피크에 대해서는, SN-38 저감수성인 인간 배양 대장암 세포 HT-29 를 이식한 담암 마우스에 있어서, 약제 투여 24 시간 후에는 CPT-11 투여군과 용해제 투여군에서 혈청 중의 발현량이 동일한 정도였다. 그러나, SN-38 고감수성인 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 을 이식한 담암 마우스에 있어서, 약제 투여 24 시간 후에는 CPT-11 투여군에서, 암 세포를 이식하지 않은 control 군과 동일한 정도까지 혈청 중의 피크 발현량이 저하되었다. 이로써, CPT-11 무효군과 CPT-11 유효군으로 나눌 수 있고, 약제 반응성을 나타내는 마커인 것으로 생각되었다. 이 피크에 관하여, 해석 소프트 Analyst^TM QS (Applied Biosystems, Inc.) 를 사용하여, 분자식의 추정을 진행시켰다. 친 (親) 피크에 대한 아이소토프의 비율, 정밀 질량 등의 정보로부터 분자식을 특정한 결과, 후보 피크로 한 m/z 166.086 의 분자식은 C₉H₁₂NO₂ 였다. 쿄토 대학이 제조한 KEGG：생명 시스템 정보 통합 데이터베이스 (http：//www.kegg.jp/) 의 대사 데이터베이스를 이용하여, 이 분자식으로부터 추정되는 물질을 검색한 결과, 이 피크가 L-페닐알라닌인 것이 판명되었다.

m/z 104.070 의 피크에 대해서는, SN-38 저감수성인 인간 배양 대장암 세포 HT-29 를 이식한 담암 마우스에 있어서, 약제 투여 12 시간 후에는 CPT-11 투여군과 용해제 투여군에서는 혈청 중의 발현량이 동일한 정도였다. 그러나, SN-38 고감수성인 인간 배양 대장암 세포 HCT-116 을 이식한 담암 마우스에 있어서, 약제 투여 12 시간 후에는 CPT-11 투여군에서, 암 세포를 이식하지 않은 control 군과 동일한 정도까지 혈청 중의 피크 발현량이 저하되었다. 따라서, CPT-11 무효군과 CPT-11 유효군으로 나눌 수 있고, 약제 반응성을 나타내는 마커인 것으로 생각되었다. 이 피크에 관하여, 해석 소프트 Analyst^TM QS (Applied Biosystems, Inc.) 를 사용하여, 분자식의 추정을 진행시켰다. 친피크에 대한 아이소토프의 비율, 정밀 질량 등의 정보로부터 분자식을 특정한 결과, 후보 피크로 한 m/z 104.070 의 분자식은 C₄H₉NO₂ 였다. 쿄토 대학이 제조한 KEGG：생명 시스템 정보 통합 데이터베이스 (http：//www.kegg.jp/) 의 대사 데이터베이스를 이용하여, 이 분자식으로부터 추정되는 물질을 검색한 결과, 4 종류의 후보 화합물이 얻어졌다. 표품을 사용한 첨가 시험에 의해, 이 피크가 N,N-디메틸글리신인 것이 판명되었다.

Claims

L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질로 이루어지는 항암제 감수성 판정 마커.
제 1 항에 있어서,
L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질이, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신인 항암제 감수성 판정 마커.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
항암제가 식물 알칼로이드계 항암제인 항암제 감수성 판정 마커.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
항암제가 이리노테칸, SN-38 및/또는 그들의 염인 항암제 감수성 판정 마커.
검체 중의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 항암제 감수성의 판정 방법.
제 5 항에 있어서,
L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질이, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신인 판정 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
검체가 암을 가진 피험자 유래의 생체 시료인 판정 방법.
제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
검체가, 항암제가 투여된 암을 가진 피험자 유래의 생체 시료인 판정 방법.
제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
항암제가 식물 알칼로이드계 항암제인 판정 방법.
제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
항암제가 이리노테칸, SN-38 및/또는 그들의 염인 판정 방법.
검체 중의 L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질을 측정하기 위한 프로토콜을 함유하는 것을 특징으로 하는 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 판정 방법을 실시하기 위한 키트.
제 11 항에 있어서,
L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질이, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신인 키트.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
검체가 암을 가진 피험자 유래의 생체 시료인 키트.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
검체가, 항암제가 투여된 암을 가진 피험자 유래의 생체 시료인 키트.
제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
항암제가 식물 알칼로이드계 항암제인 키트.
제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
항암제가 이리노테칸, SN-38 및/또는 그들의 염인 키트.
L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질의 발현 억제를 지표로 하는 항암제 감수성 항진제의 스크리닝 방법.
제 17 항에 있어서,
L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신이 관여하는 대사계 상의 물질이, L-페닐알라닌 및/또는 N,N-디메틸글리신인 스크리닝 방법.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
항암제가 식물 알칼로이드계 항암제인 스크리닝 방법.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
항암제가 이리노테칸, SN-38 및/또는 그들의 염인 스크리닝 방법.
제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 항암제 감수성 항진제.
제 21 항에 기재된 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 조합하여 이루어지는 암 치료용 조성물.
제 22 항에 있어서,
항암제가 식물 알칼로이드계 항암제인 암 치료용 조성물.
제 22 항에 있어서,
항암제가 이리노테칸, SN-38 및/또는 그들의 염인 암 치료용 조성물.
제 21 항에 기재된 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제의 조합인, 암 치료약 제조를 위한 사용.
제 25 항에 있어서,
항암제가 식물 알칼로이드계 항암제인 사용.
제 25 항에 있어서,
항암제가 이리노테칸, SN-38 및/또는 그들의 염인 사용.
제 21 항에 기재된 항암제 감수성 항진제와, 감수성 항진의 대상이 되는 항암제를 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법.
제 28 항에 있어서,
항암제가 식물 알칼로이드계 항암제인 방법.
제 28 항에 있어서,
항암제가 이리노테칸, SN-38 및/또는 그들의 염인 방법.