CN113325057B - 提高聚丙烯酰胺凝胶预混液稳定性的方法、预混液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高聚丙烯酰胺凝胶预混液稳定性的方法、预混液及其应用。本发明提供了优化的聚丙烯酰胺凝胶预混液配方，添加N,N‑二甲基甘氨酸和D‑谷氨酸以增强预混液的稳定性，使其有效期由约90天延长至约450天或更久；采用本预混液制备的聚丙烯酰胺凝胶具有成本低、操作简便、电泳速度快、分辨率高、兼容通用型Tris‑Glycine电泳液等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种提高聚丙烯酰胺凝胶预混液稳定性的方法、预混液及其应用。
背景技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，简称PAGE)，最初由Laemmli,U.K.(Nature227：680,1970)提出，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳技术，聚丙烯酰胺凝胶的网状结构具有分子筛效应，常用于分离蛋白质和小片段核酸等。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶。非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳的过程中，蛋白质三级结构保持完整，依据蛋白质的分子量大小、形状及其所带的电荷量梯度分离。而变性聚丙烯酰胺凝胶中含有强还原剂巯基乙醇(或二硫苏糖醇等)，能断裂蛋白质中的氢键和二硫键，破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白解聚和变性，随后暴露的蛋白质氨基酸侧链和聚丙烯酰胺凝胶中的SDS结合，从而消除了蛋白质的结构和电荷差异，在电泳过程中依据蛋白质的分子量大小进行分离。
目前使用最广泛的电泳体系是不连续体系聚丙烯酰胺凝胶电泳，包含浓缩胶、分离胶和凝胶缓冲液。浓缩胶具有较低的聚丙烯酰胺浓度、孔径较大，凝胶缓冲液为Tris-HClpH 6.8，样品经过浓缩胶被浓缩为一个狭窄的区带后进入分离胶。分离胶具有较高的聚丙烯酰胺浓度、孔径较小，凝胶缓冲液为Tris-HCl pH 8.8，样品进入分离胶后离子涌动速率变大，因样品分子量差异导致其通过分离胶时受到的阻力不同，样品分子量小的电泳速度更快，从而样品根据分子量的差异而被分离。
传统的不连续体系聚丙烯酰胺凝胶需要现用现配：先将分离胶各组分混匀后灌铸，等待凝固后，再将浓缩胶各组分混匀后灌铸，等待凝固后才制备完成，该过程操作繁琐、等待时间过长不利于实验快速进行。虽然市场上有聚丙烯酰胺凝胶制备用预混液产品，提前将分离胶和浓缩胶各组分混合好，但由于聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中分离胶pH较高，很容易使丙烯酰胺发生水解，预混液的稳定性较差无法长期保存。而且配制好的凝胶在长时间保存后聚丙烯酰胺也很容易发生水解，降低了样品电泳时蛋白质条带的分辨率，造成条带模糊。专利CN 102292633B在预混液中加入三乙醇胺，专利CN108627564A在预混液中加入牛磺酸和HEPES，适当了延长保存时间，但依旧限制了产品的有效期，而且原料成本较高。还有的预混液产品无法兼容实验室常备的Tris-Glycine电泳液，需要额外购买配套的电泳缓冲液，不具有通用性。
因此，有聚丙烯酰胺凝胶制备用预混液亟待进一步的技术改进，以期提供稳定性高、成本低、操作简便、电泳速速快、分辨率高和兼顾通用型Tris-Glycine电泳液的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性高、成本低、操作简便、电泳速度快、分辨率高和兼顾通用型Tris-Glycine电泳液的聚丙烯酰胺凝胶制备用预混液、其制备方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种提高聚丙烯酰胺凝胶预混液的稳定性的方法，包括：在用于制备聚丙烯酰胺凝胶的分离胶预混液和/或浓缩胶预混液中，添加N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸。
在一个优选例中，所述预混液中含有丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺(作为交联剂)，作为形成凝胶的基础。
在另一优选例中，丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺的比例为25～35:1(如26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、3:1、34:1)。
在另一优选例中，丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺在预混液中的浓度为5～15％(如6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％或4％)。
在另一优选例中，所述的预混液中还含有：十二烷基硫酸钠(SDS)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，HCl。
在另一优选例中，在制备所述聚丙烯酰胺凝胶预混液时，包括步骤：将N,N-二甲基甘氨酸、D-谷氨酸、十二烷基硫酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷与丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺混合，在水中混匀，以HCl调整pH 6～7(较佳地pH6.2～6.8；更佳地pH6.3～6.7；如pH6.4、pH6.5、pH6.6)。
在另一优选例中，所述浓缩胶预混液中，所述的丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的量低于所述分离胶预混液中的量；较佳地低20％～70％(如低25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％)；较佳地低30％～55％或35％～50％。
在另一优选例中，所述的预混液中，各个组分的用量为：
N,N-二甲基甘氨酸：100～300mM，较佳地150～250mM；D-谷氨酸：30～50mM，较佳地35～45mM；十二烷基硫酸钠：0.03～0.1％(w/v)，较佳地0.04～0.06％(w/v)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸：10～30mM，较佳地15～25mM；和/或三羟甲基氨基甲烷：50～200mM，较佳地80～150mM。
在本发明的另一方面，提供一种高稳定性的聚丙烯酰胺凝胶预混液，其中含有丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺(作为交联剂)，作为形成凝胶的基础；以及N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸。
在一个优选例中，所述的预混液中还含有：十二烷基硫酸钠(SDS)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
在另一优选例中，各个组分的用量为：
N,N-二甲基甘氨酸：100～300mM，较佳地150～250mM；D-谷氨酸：30～50mM，较佳地35～45mM；十二烷基硫酸钠：0.03～0.1％(w/v)，较佳地0.04～0.06％(w/v)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸：10～30mM，较佳地15～25mM；和/或三羟甲基氨基甲烷：50～200mM，较佳地80～150mM。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的高稳定性的聚丙烯酰胺凝胶预混液的应用，用于制备聚丙烯酰胺凝胶。
在本发明的另一方面，提供一种制备聚丙烯酰胺凝胶的方法，包括：(1)利用前面任一所述的方法制备聚丙烯酰胺凝胶预混液，所述预混液包括分离胶预混液和/或浓缩胶预混液；(2)在(1)的预混液中加入：过硫酸铵，四甲基乙二胺(TEMED)。
在另一优选例中，过硫酸铵或四甲基乙二胺的添加量为：
过硫酸铵：0.02～0.2％(v/v)，较佳地0.05～0.15％(v/v)；和/或四甲基乙二胺：0.02～0.2％(v/v)，较佳地0.05～0.15％(v/v)。
在另一优选例中，所述的四甲基乙二胺(TEMED)在浓缩胶预混液中的添加量高于分离胶预混液中的添加量；较佳地高1.5～3倍(如高1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.5、2.6、2.8倍)。
在另一优选例中，所述凝胶是不连续的凝胶，或是连续的凝胶；较佳地，所述凝胶是不连续的凝胶，所述方法包括：制备分离胶预混液，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺并混匀后，加入到制胶装置(如制胶玻璃板/塑料板等)中，获得分离胶凝胶；以及，制备浓缩胶预混液，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺并混匀后，与制胶装置中的分离胶凝胶整合，获得所述不连续的凝胶；较佳地，蛋白的上样孔位于浓缩胶凝胶中。
在本发明的另一方面，提供一种聚丙烯酰胺凝胶，其由前面任一所述的方法制备获得；较佳地，其是分离胶、浓缩胶、或其组合。
在另一优选例中，所述的聚丙烯酰胺凝胶是不连续的凝胶，或是连续的凝胶。
在本发明的另一方面，提供一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的试剂盒，其中包括选自下组的试剂：
(i)N,N-二甲基甘氨酸、D-谷氨酸、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷；或
(ii)前面任一所述的高稳定性的聚丙烯酰胺凝胶预混液；较佳地该预混液为分离胶预混液和/或浓缩胶预混液；或
(iii)前面所述的聚丙烯酰胺凝胶；
在一个优选例中，当含有(i)或(ii)项的试剂时，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：过硫酸铵，四甲基乙二胺。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括(但不限于)选自下组的试剂、溶液或组件：超纯水，pH调节剂(如HCl)，电泳缓冲液，电泳梳子，使用说明书。
在另一优选例中，所述试剂盒中的各个试剂被置于分离或组合的容器中。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A、实施例1中8％的传统Tris-HCl PAGE胶和8％的预混液配方A配制凝胶电泳考染结果。
图1B、实施例1中基于预混液配方A配制的凝胶与8％的传统凝胶的电泳跑胶时间对比。
图2A、实施例2中10％的传统Tris-HCl PAGE胶和10％的预混液配方A配制凝胶电泳考染结果。
图2B、实施例2中基于预混液配方A配制的凝胶与8％的传统凝胶的电泳跑胶时间对比。
图3、实施例3中10％的传统Tris-HCl PAGE胶和8％的预混液配方A配制凝胶电泳考染结果。
图4、实施例3中12％的传统Tris-HCl PAGE胶和10％的预混液配方A配制凝胶电泳考染结果。
图5、新配制和37℃老化6、9、12、15天后10％预混液配方A制备凝胶电泳结果。每张图中Marker的顺序是1、2、3、4。
图6、10％的传统Tris-HCl凝胶预混液37℃老化3天制备凝胶电泳结果。每张图中Marker的顺序是1、2、3、4。
图7A、10％预混液配方A、B、C制备的凝胶电泳结果。每张图中Marker的顺序是1、2、3、4。
图7B、10％预混液配方A、B、C制备的凝胶的电泳跑胶时间对比。
图8A、12％预混液配方A、B、C制备的凝胶电泳结果。每张图中Marker的顺序是1、2、3、4。
图8B、12％预混液配方A、B、C制备的凝胶的电泳跑胶时间对比。
图9、不同电压下10％配方A凝胶的电泳时间。
具体实施方式
本发明人致力于稳定而高效的聚丙烯酰胺凝胶电泳的研究，在广泛而深入研究的基础上，提供了优化的聚丙烯酰胺凝胶预混液，其中添加N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸作为凝胶缓冲液的组分，所述组分进一步混合其他组分(如SDS、HEPES、Tris)所构成的预混液稳定性增强，有效期延长至约450天或更久；采用本预混液制备的聚丙烯酰胺凝胶成本低、操作简便、电泳速度快、分辨率高、兼容通用型Tris-Glycine电泳液。
针对传统的基于Tris-HCl制备的聚丙烯酰胺凝胶不稳定、不能长期保存需要现用现配的缺点，本发明人通过对多种多样的化合物、电解质材料、它们的多种多样的组合及其浓度进行筛选、优化，发现在预混液中添加适当用量的N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸，在提高预混液的稳定性方面发挥了积极的作用，由该预混液制备的聚丙烯酰胺凝胶的成本低、操作简便、电泳速度快、分辨率高、兼容通用型Tris-Glycine电泳液。
本发明人的研究工作显示，通过加入N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸，预混液可以长期稳定保存，4℃条件下保存约450天仍可以正常使用；操作简便，使用时只需要加入过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED)即可灌铸制胶，无需繁琐的配制过程；该预混液制备的聚丙烯酰胺凝胶在可兼顾常规的Tris-Glycine电泳体系，相比于传统方法配制的聚丙烯酰胺凝胶，并且在相同条件下，预混液制备的聚丙烯酰胺凝胶电泳速度更快、分辨率更高，有效节省了电泳时间；本发明制备的聚丙烯酰胺凝胶可以在更低的浓度的丙烯酰胺凝用量下，做到传统方法配制的聚丙烯酰胺凝胶同样好的电泳效果，有效节省聚丙烯酰胺凝胶配制时所需原料的用量，降低生产成本。预混液的成分对比测试表明配方中N,N-二甲基甘氨酸对凝胶电泳速度的提高具有重要作用，其效果优于其他一些化合物如N,N-二羟乙基甘氨酸，并且N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸联合使用的效果优于单独使用N,N-二甲基甘氨酸。
如本文所用，术语“带清晰度”是用于比较当它们在各种凝胶配制品上出现时迁移的带的清晰度的相对术语。特别是当比较在各种凝胶配制品中的两种或更多种之间的相对带清晰度时，使用所述术语。多种方法可以用于确定带清晰度。例如，根据得到的拆分程度，可以通过目测确定带清晰度或者带清晰度改善到的程度。为了得到带清晰度的更定量的估计，使用者可以使用凝胶成像软件。可以通过测量凝胶中的每个拆分的带的面积，且通过每个孔的宽度(其通常是恒定的)划分所述面积而确定带清晰度。确定带清晰度的另一种方法可以是直接测量通过凝胶分析算法检测的各个峰的宽度。
本发明所述的预混液中，含有丙烯酰胺(Acr)和作为交联剂的亚甲基双丙烯酰胺(Bis)，两者形成凝胶的基础，以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。PAGE可广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备，还可测定分子量和等电点等。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物(例如预混液为一种组合物)中，除了含有必要成分或必要组分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。
在Acr和Bis的混合物中，Bis一般是少量的，例如Acr:Bis可以是25～35:1；而其中29:1为本领域相对较常用的配比。两者在催化剂(如过硫酸铵)作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。
PAGE根据有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。因此，如本发明中所用，所述聚丙烯凝胶可以是不连续的凝胶，或是连续的凝胶；从而，所述的“预混液”可以是分离胶预混液或浓缩胶预混液，或可以是它们的组合。也即，分离胶预混液和浓缩胶预混液可共同运用于制备不连续的凝胶。
浓缩胶通常可以设置为较短的跑胶距离、而分离胶设置为较长的跑胶距离。浓缩胶与分离胶的长度比可以是约0.5:9.5～约1:1；更具体例如约1:9、约1.5:8.5、约2:8、约2.5:7.5、约3:7、约3.5:6.5、约4:6、约4.5:5.5等。应理解，根据实际需要，也可以设置为在此范围之外。
所述的分离胶预混液与浓缩胶预混液一般在凝胶浓度上存在不同，较佳地，所述浓缩胶预混液中，所述的丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺(Acr-Bis)的量低于所述分离胶预混液中的量。Acr-Bis浓度的不同，使得凝胶的孔径不同，浓缩胶浓度小、孔径大，而分离胶浓度大、孔径小。当蛋白样品在所述不连续的凝胶中进行电泳时，首先其被上样于浓缩胶，经过大孔径凝胶的迁移作用，蛋白样品可以被浓缩，以及一些分子量相对大的分子被去除，这有利于提高整体电泳过程的灵敏度；进一步地，蛋白样品进入到分离胶，样品中的不同蛋白组分被分离开来。所述的分离胶预混液与浓缩胶预混液也可以设置为pH值不同；例如，浓缩胶预混液的pH值可以是大于分离胶预混液的。
除了以N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸作为预混液的必要组分，所述的预混液中还含有：SDS，HEPES，Tris，HCl。SDS作为变性剂和助溶试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。HEPES作为预混液体系中的缓冲物质起作用。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。HCl在一定pH条件下易解离出Cl-，它在电场中迁移率大，可走在最前面。
在本发明的优选方式中，上述各组分以适合的比例被运用于制备所述的预混液。各个组分的用量如表1所示。
表1
作为本发明的一种实施方式，N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸的浓度比大于3是较佳的，更佳地约为4～6。
作为本发明的一种最为优选的实施方式，提供了一种预混液配方(含N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸，简称配方A)：Acr-Bis(29：1)的浓度为5-15％、N,N-二甲基甘氨酸200mM、D-谷氨酸40mM、0.05％十二烷基硫酸钠(SDS)、HEPES 20mM、Tris 100mM，超纯水溶解后用HCl调整pH至6.5。
本发明的由所述组分组合而获得的预混液，可进一步添加过硫酸铵、TEMED后，进行凝胶的制作。其中过硫酸铵可作为催化剂，其在水溶液中能够产生游离基硫酸根，使得丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，有助于Acr和Bis聚合成凝胶。其中TEMED可作为加速剂，其能促进过硫酸铵的硫酸根的产生。
作为一种优选方式，本发明所述的凝胶是不连续的凝胶，所述凝胶的制备方法包括：制备分离胶预混液，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺并混匀后，加入到制胶装置(如制胶玻璃板/塑料板等)中，获得分离胶凝胶；以及，制备浓缩胶预混液，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺并混匀后，与制胶装置中的分离胶凝胶整合，获得所述不连续的凝胶；较佳地，蛋白的上样孔位于浓缩胶凝胶中。
作为一些可选的方式，构成凝胶的基础成分如Acr-Bis可以先行制备后，再浸泡于含有N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸等的混合液中；优选的，Acr-Bis与N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸等一起配制、充分混匀。
本发明也包括了利用所述方法制备获得的聚丙烯酰胺凝胶，由于运用了含有特定组分的预混液，故所获得的聚丙烯酰胺凝胶也是一种新型的凝胶。所述的凝胶可以是分离胶、浓缩胶、或两者的组合。所述的凝胶可以是不连续的凝胶，或是连续的凝胶。
根据实际需要，本发明所述的聚丙烯酰胺凝胶可以制作为应用于单向电泳的形式，也可以制作为应用于双向电泳的形式。
本发明也提供了应用于本发明的方法的试剂组合，它们可构成试剂盒。
作为一种优选方式，所述试剂盒中包括：N,N-二甲基甘氨酸、D-谷氨酸、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷；它们可被独立地包含于容器中。本领域技术人员可利用该试剂盒中的试剂配制获得所述的预混液。较佳地，为了实现凝胶的配制，所述试剂盒中还包括过硫酸铵，四甲基乙二胺。
作为另一种优选方式，所述试剂盒中包括：利用本发明的方法预先配制的聚丙烯酰胺凝胶预混液；该预混液为分离胶预混液和/或浓缩胶预混液。由于本发明的预混液具有高稳定性，其可以被预先配制并储存很长的时间。较佳地，为了实现凝胶的配制，所述试剂盒中还包括过硫酸铵，四甲基乙二胺。
作为另一种优选方式，所述试剂盒中包括：利用本发明的方法预先制备好的凝胶，其也具有稳定性高的特点。
所述的试剂盒中还可含有其他各种电泳用的试剂、溶液或组件，例如但不限于：超纯水，pH调节剂(如HCl)，电泳缓冲液，电泳梳子。
此外，所述的试剂盒中还可含有使用说明书，以便于本领域技术人员正确实施本发明的方法或正确使用本发明的优选试剂。
本发明也提供了一种电泳系统或电泳装置，其中含有本发明制备的聚丙烯酰胺凝胶，以及有效量的电泳缓冲液。所述的电泳系统或电泳装置，还包括为电泳提供适当的电场/电压的组件等。应理解，本发明制备的聚丙烯酰胺凝胶兼容于多种多样的电泳系统或电泳装置中。
本发明的技术方案的主要有益效果在于：
(1)本发明的预混液通过加入N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸成功提高了聚丙烯酰胺凝胶配制用预混液的稳定性，维持聚丙烯酰胺凝胶分子筛的功能。同时也平衡了电泳离子，保证了电荷效应，使得蛋白电泳时配合氨基酸的两性离子的相互作用，能够按照分子量的大小实现正常分离。
(2)本发明的预混液保存时间长，在4℃条件下保存约450天后仍然可以正常使用。
(3)本发明的预混液无需配制复杂的凝胶各组分，只需要在使用前加入过硫酸铵和TEMED即可进行凝胶灌铸。
(4)本发明的预混液制成的凝胶分辨率更高，在更低的丙烯酰胺浓度下即可达到和传统Tris-HCl凝胶相同的电泳效果，降低生产成本。
(5)本发明的预混液可以兼容通用型Tris-Glycine电泳液，无需额外配制或购买其它电泳液缓冲液试剂。
(6)本发明制备的的聚丙烯酰胺凝胶可以在保证电泳效果的前提下，耐受200V-250V电压，缩短了电泳的时间至30分钟，节约电泳时间。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的分子克隆实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料
30％Acr-Bis(29：1)、十二烷基硫酸钠(SDS)、HEPES、Tris为商品化试剂。
D-谷氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸购自Adamas。
制胶和电泳所用的MiniProGelTM蛋白制胶电泳系统、蛋白分子量标准样品和考马斯亮蓝染色液为常规商品化产品。
传统的Tris-HCl PAGE胶由浓缩胶和分离胶组成，浓缩胶成分为30％Acr-Bis(29:1)、1M Tris-HCl pH6.8、10％SDS，10％过硫酸铵或过硫酸铵替代物和TEMED催化聚合；分离胶成分为30％Acr-Bis(29:1)、1M Tris-HCl pH8.8、10％SDS，10％过硫酸铵或过硫酸铵替代物和TEMED催化聚合(配制如表2)。
表2
实施例1、基于配方A的8％Acr-Bis(29：1)预混液配制及凝胶电泳
本实施例中，基于配方A的8％Acr-Bis(29：1)预混液配制及凝胶电泳，主要步骤如下：
(1)配制分离胶预混液，取下列试剂，置于1000ml烧杯中：30％Acr-Bis(29：1)267ml、N,N-二甲基甘氨酸20.6g、D-谷氨酸5.88g、SDS 0.5g、HEPES4.77g、Tris粉末12.1g。向烧杯中加入约600ml的超纯水，充分搅拌混匀，加入1M HCl调整溶液pH到6.5，定容到1L；上述配制后获得的溶液中，各组分含量：N,N-二甲基甘氨酸200mM、D-谷氨酸40mM、0.05％十二烷基硫酸钠(SDS)、HEPES 20mM、Tris 100mM；
(2)取10ml的(1)配制的预混液，加入0.1ml 10％的过硫酸铵(也可为过硫酸铵替代物)溶液，6μl TEMED，充分混匀加入到1.5mm的垂直制胶玻璃板中，加入适量的超纯水进行压线，静置10分钟待其凝固；
(3)配制浓缩胶预混液，取下列试剂，置于1000ml烧杯中：30％Acr-Bis(29：1)167ml、N,N-二甲基甘氨酸20.6g、D-谷氨酸5.88g、SDS 0.5g、HEPES4.77g、Tris粉末12.1g。向烧杯中加入约600ml的超纯水，充分搅拌混匀，加入1M HCl调整溶液pH到6.5，定容到1L；上述配制后获得的溶液中，各组分含量：N,N-二甲基甘氨酸200mM、D-谷氨酸40mM、0.05％十二烷基硫酸钠(SDS)、HEPES 20mM、Tris 100mM。
(4)取10ml的(3)配制的预混液，加入0.1ml 10％的过硫酸铵溶液，10μlTEMED。对于(2)中制备的凝胶，除去压线的超纯水，用吸水纸吸干残留的液体，进一步加入配好的浓缩胶溶液，然后在浓缩胶距离分离胶一定距离的位置插入梳子，静置10分钟等待凝胶凝固；
(5)将蛋白分子量标准加入到上述的凝胶的上样孔中，电泳缓冲液使用Tris-Glycine电泳体系，MiniProGelTM蛋白制胶电泳系统，电压设定200V。电泳至溴酚蓝到达凝胶底部并记录电泳时间，将凝胶取出考马斯亮蓝染色进行观察。配制8％的传统Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶作为对照。
8％的传统Tris-HCl PAGE胶和8％的预混液配方A配制的凝胶电泳考染结果实验结果如图1A。根据该图可见，传统的8％的Tris-HCl凝胶可以分辨37kD大小的蛋白条带，而本实施例中8％的预混液制成的凝胶可以分辨16kD大小大的蛋白条带。与非预染分子量标准比较，预染分子量标准没有变化。
并且，本发明人在实验中观察到，该预混液配方A配制的凝胶的跑胶速度也显著加快，其与8％的传统凝胶的电泳时间对比见图1B，其跑胶所需时间显著减少约29％。
实施例2、基于配方A的10％Acr-Bis(29：1)预混液配制及凝胶电泳
本实施例中，基于配方A的10％Acr-Bis(29：1)预混液配制及凝胶电泳，主要步骤如下：
(1)配制分离胶预混液，取下列试剂，置于1000ml烧杯中：30％Acr-Bis(29：1)333ml、N,N-二甲基甘氨酸20.6g、D-谷氨酸5.88g、SDS 0.5g、HEPES4.77g、Tris粉末12.1g。向烧杯中加入约600ml的超纯水，充分搅拌混匀，加入1M HCl调整溶液pH到6.5，定容到1L；上述配制后获得的溶液中，各组分含量：N,N-二甲基甘氨酸200mM、D-谷氨酸40mM、0.05％十二烷基硫酸钠(SDS)、HEPES 20mM、Tris 100mM；
(2)取10ml的(1)配制的预混液，加入0.1ml 10％的过硫酸铵溶液，5μlTEMED，充分混匀加入到1.5mm的垂直制胶玻璃板中，加入适量的超纯水进行压线，静置10分钟待其凝固；
(3)配制浓缩胶预混液，取下列试剂，置于1000ml烧杯中：30％Acr-Bis(29：1)167ml、N,N-二甲基甘氨酸20.6g、D-谷氨酸5.88g、SDS 0.5g、HEPES4.77g、Tris粉末12.1g。向烧杯中加入约600ml的超纯水，充分搅拌混匀，加入1M HCl调整溶液pH到6.5，定容到1L；上述配制后获得的溶液中，各组分含量：N,N-二甲基甘氨酸200mM、D-谷氨酸40mM、0.05％十二烷基硫酸钠(SDS)、HEPES 20mM、Tris 100mM；
(4)取10ml的(3)配制的预混液加入0.1ml 10％的过硫酸铵溶液，10μlTEMED。对于(2)中制备的凝胶，除去压线的超纯水，用吸水纸吸干残留的液体，进一步加入刚配好的浓缩胶溶液，然后在浓缩胶距离分离胶一定距离的位置插入梳子，静置10分钟等待凝胶凝固。
(5)将蛋白分子量标准加入到上述的凝胶的上样孔中，电泳缓冲液使用Tris-Glycine电泳体系，MiniProGelTM蛋白制胶电泳系统，电压设定200V。电泳至溴酚蓝到达凝胶底部并记录电泳时间，将凝胶取出考马斯亮蓝染色后进行观察。配制10％的传统Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶作为对照。
实验结果如图2A。根据该图可见，传统的10％的Tris-HCl凝胶可以分辨16kD大小的蛋白条带，而10％的预混液制成凝胶可以分辨6.5kD大小大的蛋白条带。与非预染分子量标准比较，预染分子量标准没有变化。
并且，本发明人在实验中观察到，该预混液配方A配制的凝胶的跑胶速度也显著快，其与8％的传统凝胶的电泳时间对比见图2B，其跑胶所需时间显著减少约28％。
实施例3、预混液分辨率对比实验
依照配方A配制8％、10％的聚丙烯酰胺凝胶；同时配制10％、12％的传统Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶。将蛋白分子量标准加入到上述的凝胶的上样孔中，电泳缓冲液使用Tris-Glycine电泳体系，MiniProGelTM蛋白制胶电泳系统，电压设定200V。电泳完毕之后，将凝胶取出考马斯亮蓝染色后进行观察。
10％的传统Tris-HCl PAGE胶和8％的预混液配方A配制凝胶电泳考染结果如图3。上述对比显示，本发明配制的8％凝胶电泳效果相当于传统的10％的Tris-HCl凝胶，甚至蛋白条带更为清晰。
12％的传统Tris-HCl PAGE胶和10％的预混液配方A配制凝胶电泳考染结果如图4。可见，本发明配制的10％凝胶电泳效果相当于传统的12％的Tris-HCl凝胶，甚至蛋白条带更为清晰。
实施例1-3的结果表明，本发明的预混液所制成凝胶和传统Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶的电泳结果相比，分辨率明显更为优异，可以分辨出显著更小的蛋白条带。所以，本发明可以用更低浓度的丙烯酰胺达到传统Tris-HCl凝胶的电泳效果，有效节省了配制凝胶所需的丙烯酰胺用量，同时电泳时间也更短，缩短时间高于约25％。
实施例4、10％预混液稳定性测试实验
根据研究人员的在先实验结果(参考专利CN 102138073B)，聚丙烯酰胺预混液保质期的加速测试，在37℃保存1天相当于4℃保存1个月。
按照配方A配制浓缩胶和10％分离胶预混液，放置于37℃条件下分别保存6、9、12、15天，也即相当于4℃保存6、9、12、15个月。同时，按传统Tris-HCl聚丙烯酰胺配方配制的浓缩胶和10％分离胶的预混液分别放置于37℃条件下保存3天，也即相当于4℃保存3个月。
分别取出制胶，将BeyoColorTM彩色预染蛋白分子量标准加入到上述的凝胶的上样孔中，然后进行电泳实验。电泳缓冲液使用Tris-Glycine电泳体系，电压设定200V，电泳完毕之后，将凝胶取出，在不同的时间点进行观察。
新配制和37℃老化6、9、12、15天后10％预混液配方A制备凝胶电泳结果如图5。
10％的传统Tris-HCl凝胶预混液37℃老化3天制备凝胶电泳结果如图6。
根据图5和图6的结果，前12天的结果中蛋白Marker条带的位置基本没有发生变化，到15天后才出现略微的向下迁移，但仍然是基本准确可信的，且蛋白条带清晰、分辨率高。而传统的Tris-HCl配方的预混液37℃保存3天虽然可以正常配制凝胶，但Marker条带位置已经出现明显变化，蛋白条带不清晰、拖尾或扭曲现象严重。
根据上述，预混液的加速老化实验，在37℃保存15天相当于4℃保存15个月(约450天)，本发明的预混液仍然可以正常配制凝胶，电泳后蛋白条带清晰没有模糊和变形，表明了其极其优异的稳定性。
因此，本发明的预混液可以在长时间保存后仍然保持性质稳定。
实施例5、预混液成分对比测试
本实施中，利用不同的化合物进行预混液成分对比测试。第一种为含N,N-二甲基甘氨酸的预混液，简称配方B；第二种为含N,N-二羟乙基甘氨酸的预混液，简称配方C。具体步骤如下：
(1)配制基于配方B和配方C的10％分离胶预混液。配方B：30％Acr-Bis(29：1)333ml、N,N-二甲基甘氨酸20.6g、HEPES 4.77g、SDS 0.5g、Tris粉末12.1g。向烧杯中加入约600ml的超纯水，充分搅拌混匀，加入1M HCl调整溶液pH到6.5，定容到1L；配方C：30％Acr-Bis(29：1)333ml、N,N-二羟乙基甘氨酸33g、HEPES 4.77g、SDS 0.5g、Tris粉末12.1g。向烧杯中加入约600ml的超纯水，充分搅拌混匀，加入1M HCl调整溶液pH到6.5，定容到1L；
(2)取上述(1)配制的2种预混液各10ml，加入0.1ml 10％的过硫酸铵溶液，6μlTEMED，充分混匀加入到1.5mm的垂直制胶玻璃板中，加入适量的超纯水进行压线，静置10分钟待其凝固；
(3)配制基于配方B和配方C的浓缩胶预混液。配方B：30％Acr-Bis(29：1)167ml、N,N-二甲基甘氨酸20.6g、HEPES 4.77g、SDS 0.5g、Tris粉末12.1g。向烧杯中加入约600ml的超纯水，充分搅拌混匀，加入1M HCl调整溶液pH到6.5，定容到1L。配方C：30％Acr-Bis(29：1)167ml、N,N-二羟乙基甘氨酸33g、HEPES 4.77g、SDS 0.5g、Tris粉末12.1g。向烧杯中加入约600ml的超纯水，充分搅拌混匀，加入1M HCl调整溶液pH到6.5，定容到1L；
(4)取上述(3)配制的2种预混液各10ml，加入0.1ml 10％的过硫酸铵溶液，10μlTEMED。对于(2)中制备的凝胶，除去压线的超纯水，用吸水纸吸干残留的液体，进一步加入配好的浓缩胶溶液，然后在浓缩胶距离分离胶一定距离的位置插入梳子，静置10分钟等待凝胶凝固。
(5)将蛋白分子量标准加入到上述的凝胶的上样孔中，电泳缓冲液使用Tris-Glycine电泳体系，MiniProGelTM蛋白制胶电泳系统，电压设定200V。电泳结束后记录时间。10％预混液配方A作为对照。
(6)再按上述两种配方配制12％的预混液B、C，随后制胶电泳并记录时间。12％预混液配方A作为对照。
10％预混液配方A、B、C凝胶电泳结果如图7A。图7B为三种配方的预混液(10％)所制备的凝胶的跑胶速度比较，可见配方A具有显著最短的时间。
12％预混液配方A、B、C凝胶电泳结果如图8A。图8B为三种配方的预混液(12％)所制备的凝胶的跑胶速度比较，可见配方A具有显著最短的时间。
成分对比实验表明，配方B的电泳速度和配方A的电泳速度相比显著降低，约减慢了10％左右。配方C电泳速度和传统Tris-HCl凝胶基本一致，同时凝胶的蛋白分辨效果产生变化。10％浓度的配方A可以分辨出15kD的蛋白Marker条带，而10％浓度的配方C只能分辨出25kD的蛋白Marker条带。表明D-谷氨酸和N,N-二甲基甘氨酸联合使用不但显著提高电泳速度，还可以优化凝胶对低分子量蛋白的电泳分辨效果。
实施例6、不同电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳效果测试
按照配方A配制10％的聚丙烯酰胺凝胶，将BeyoColorTM彩色预染蛋白分子量标准加入到上述的凝胶的上样孔中，然后进行电泳实验。电泳缓冲液使用Tris-Glycine电泳体系，电压设定150V、200V、300V、400V，电泳完毕之后，记录电泳时间将凝胶取出进行观察。
不同电压下10％配方A凝胶的电泳时间如图9。400V电压下电泳速度最快，仅需10min就可以结束电泳，但电泳后电泳液温度最高，凝胶的小分子条带出现模糊，同时Marker条带弯曲不如低电压下凝胶条带平整锐利。凝胶最佳的电压为200V-300V。可以快速完成电泳，同时保证蛋白条带清晰锐利。各电压下的Marker条带都能清楚分开，位置基本一致。通过提高电压可有效缩短电泳时间，同时不改变凝胶分辨率，也不会干扰凝胶的分离效果。
实施例7、N,N-二甲基甘氨酸/D-谷氨酸配方变化的电泳结果
1、N,N-二甲基甘氨酸
配制10％的配方A预混液，N,N-二甲基甘氨酸浓度分别为50、100、200、300mM，除了N,N-二甲基甘氨酸配方改变、其它组分及配方同实施例2中。制成凝胶后加入蛋白分子量标准，电泳缓冲液使用Tris-Glycine电泳体系，MiniProGelTM蛋白制胶电泳系统，电压设定200V。电泳至溴酚蓝到达凝胶底部并记录电泳时间。电泳时间为23-50min。
结果如表3。
表3
根据表3可见，几种凝胶都可以电泳，但50mM N,N-二甲基甘氨酸条带扭曲、不理想。其中，200mM N,N-二甲基甘氨酸的凝胶蛋白条带最清晰平整。
2、D-谷氨酸
配制10％的配方A预混液，D-谷氨酸浓度分别为20、40、80mM，除了D-谷氨酸配方改变、其它组分及配方同实施例2中。37℃保存12天。快速老化后取出制胶加入蛋白分子量标准，电泳缓冲液使用Tris-Glycine电泳体系，MiniProGelTM蛋白制胶电泳系统，电压设定200V。电泳至溴酚蓝到达凝胶底部并记录电泳时间。电泳时间为29-35min。
结果如表4。
表4
根据表4可见，所有凝胶中D-谷氨酸浓度在20mM时电泳时间长，保存时间短；80mM虽然电泳时间最短，保存时间长，但条带扭曲不平整，电泳结果不够清晰锐利。40mM的D-谷氨酸可以在缩短电泳时间的同时延长预混液的保存时间。并保持凝胶蛋白条带清晰平整。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (26)
1.一种提高聚丙烯酰胺凝胶预混液的稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括：在用于制备聚丙烯酰胺凝胶的分离胶预混液和/或浓缩胶预混液中，添加N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预混液中含有丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺，作为形成凝胶的基础。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预混液中，丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺的比例为25～35:1。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预混液中，丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺在预混液中的浓度为5～15％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的预混液中还含有：十二烷基硫酸钠，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，三羟甲基氨基甲烷，HCl。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在制备所述聚丙烯酰胺凝胶预混液时，包括步骤：将N,N-二甲基甘氨酸、D-谷氨酸、十二烷基硫酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷与丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺混合，在水中混匀，以HCl调整pH 6～7。
7.如权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，所述的预混液中，各个组分的用量为：
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的预混液中，各个组分的用量为：
9.一种高稳定性的聚丙烯酰胺凝胶预混液，其特征在于，其中含有丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺，作为形成凝胶的基础；以及N,N-二甲基甘氨酸和D-谷氨酸。
10.如权利要求9所述的高稳定性的聚丙烯酰胺凝胶预混液，其特征在于，所述的预混液中还含有：十二烷基硫酸钠，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，三羟甲基氨基甲烷。
11.如权利要求10所述的高稳定性的聚丙烯酰胺凝胶预混液，其特征在于，各个组分的用量为：
12.如权利要求11所述的高稳定性的聚丙烯酰胺凝胶预混液，其特征在于，各个组分的用量为：
13.权利要求9～12任一所述的高稳定性的聚丙烯酰胺凝胶预混液的应用，用于制备聚丙烯酰胺凝胶。
14.一种制备聚丙烯酰胺凝胶的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)利用权利要求1～8任一所述的方法制备聚丙烯酰胺凝胶预混液，所述预混液包括分离胶预混液和/或浓缩胶预混液；(2)在(1)的预混液中加入：过硫酸铵，四甲基乙二胺。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，过硫酸铵或四甲基乙二胺的添加量为：
过硫酸铵：0.02～0.2％(v/v)；和/或
四甲基乙二胺：0.02～0.2％(v/v)。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，过硫酸铵或四甲基乙二胺的添加量为：
过硫酸铵：0.05～0.15％(v/v)；和/或
四甲基乙二胺：0.05～0.15％(v/v)。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝胶是不连续的凝胶，或是连续的凝胶。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述凝胶是不连续的凝胶，所述方法包括：制备分离胶预混液，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺并混匀后，加入到制胶装置中，获得分离胶凝胶；以及，制备浓缩胶预混液，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺并混匀后，与制胶装置中的分离胶凝胶整合，获得所述不连续的凝胶。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，蛋白的上样孔位于浓缩胶凝胶中。
20.一种聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，其由权利要求14～19任一所述的方法制备获得。
21.如权利要求20所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，其是分离胶、浓缩胶、或其组合。
22.如权利要求20所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，其是不连续的凝胶，或是连续的凝胶。
23.一种用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的试剂盒，其特征在于，其中包括选自下组的试剂：
(i)N,N-二甲基甘氨酸、D-谷氨酸、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷；或
(ii)权利要求9～12任一所述的高稳定性的聚丙烯酰胺凝胶预混液；或
(iii)权利要求20～22任一所述的聚丙烯酰胺凝胶。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，(ii)中，所述预混液为分离胶预混液和/或浓缩胶预混液。
25.如权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，当含有(i)或(ii)项的试剂时，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：过硫酸铵，四甲基乙二胺。
26.如权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂、溶液或组件：超纯水，pH调节剂，电泳缓冲液，电泳梳子，使用说明书。
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