CN114380943B - 一种聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，本发明提供了一种聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法和应用，本发明所述的聚丙烯酰胺凝胶包括分离胶和浓缩胶，分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分，分离胶原料主要为丙烯酰胺混合液、三羟基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵和四甲基乙二胺；浓缩胶原料主要为丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵和四甲基乙二胺；本发明制备得到的聚丙烯酰胺凝胶能够针对大小分子量蛋白的分离有更好的效果，更均匀，分辨率高，并且用时短。另外，本发明提供的制备方法简单易操作。
Description
技术领域：
本发明涉及生物医药或生物化学-蛋白质分析技术领域，具体涉及一种聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法和应用。
背景技术：
聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺单体与交联剂甲叉丙烯酰胺，在催化剂过硫酸铵的存在下，形成网状三维结构的高聚物，聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种以聚丙烯酰胺凝胶为介质，用于生物大分子如蛋白质、核酸的分离检测的技术。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。十二烷基硫酸钠(SDS)可使电荷因素消除，电泳迁移率取决于分子的大小，向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原，掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，由于蛋白质-SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶；进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)大多在不连续缓冲液系统进行，电泳所用的浓缩胶、分离胶也采用不同的浓度。一般SDS-PAGE，对应蛋白质的分离范围是10-100kDa(分离胶浓度为8-16％)；而更小分子量的蛋白的分离，常使用Tricine-SDS-PAGE，对应的有效分离范围1-10kDa，通常分离1-5KDa小肽所采用的分离胶还需要添加尿素、甘油，以增加分离效果，小分子量蛋白所用的电泳凝胶和常规凝胶不可通用，配制也相对困难。
在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白时，想要兼顾1-250kDa的分子量大小，需要购置梯度混合仪进行梯度胶的制作，其效果一般较差，大分子条带不易分开，想要分离的话，小分子蛋白往往要迁移出分离胶，而市售商品化梯度胶由于价格昂贵以及购买周期长不方便实验室高通量进行电泳操作。现有技术中大多使用手工配制的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，现有的聚丙烯酰胺凝胶包括分离胶和浓缩胶，但是现有技术中蛋白质分离中，具有电泳分离度不够，分离时间长，高分离度凝胶配置不便的缺点。
发明内容：
为了改善上述技术问题，本发明提供一种聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法和应用。本发明制备得到的聚丙烯酰胺凝胶针对大小分子量蛋白的分离有更好的效果，更均匀，分辨率高，并且用时短。
本发明一方面提供了一种聚丙烯酰胺凝胶，所述的聚丙烯酰胺凝胶包括分离胶和浓缩胶；所述的分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分，体积比为1:1:1；
其中，第一组分包括：丙烯酰胺混合液15-35％(v/v)、三羟基氨基甲烷20-35％(v/v)、十二烷基硫酸钠1％3％(v/v)、过硫酸铵1-3％(v/v)和四甲基乙二胺0.04-0.2％(v/v)，用去离子水补足至100％(v/v)；
第二组分包括：丙烯酰胺混合液25-50％(v/v)、三羟基氨基甲烷20-35％(v/v)、十二烷基硫酸钠1-3％(v/v)、过硫酸铵1-3％(v/v)和四甲基乙二胺0.04-0.2％(v/v)，用去离子水补足至100％(v/v)；
第三组分包括：丙烯酰胺混合液45-65％(v/v)、三羟基氨基甲烷20-35％(v/v)、十二烷基硫酸钠1-3％(v/v)、过硫酸铵1-3％(v/v)和四甲基乙二胺0.04-0.2％(v/v)，用去离子水补足至100％(v/v)；
所述的浓缩胶包括：丙烯酰胺混合液10-25％(v/v)、磷酸盐缓冲液55-65％(v/v)，十二烷基硫酸钠1-3％(v/v)、过硫酸铵1-3％(v/v)和四甲基乙二胺0.1-0.4％(v/v)，用去离子水补足至100％(v/v)；
所述的丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1；
所述的分离胶与浓缩胶的体积比为3:1-3.5:1。
优选地，所述的第一组分中丙烯酰胺的浓度为6-9％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为11-13％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为15-18％(w/v)。
优选地，所述的浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为4-6％(w/v)。
优选地，所述的三羟基氨基甲烷的pH为8.8，三羟基氨基甲烷的浓度为100-500mM。
优选地，所述的磷酸盐缓冲液的pH为6.8，磷酸盐缓冲液的浓度为100-200mM。
本发明另一方面提供了上述聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)制备分离胶：将第三组分、第二组分和第一组分依次按照1:1:1的比例加入到胶板中，第三组分与第二组分的加入方向相反，第三组分与第一组分的加入方向相同，再加入无水乙醇覆盖其表面，待其凝固，使无水乙醇挥发，即为制备好的分离胶；
(2)制备聚丙烯酰胺凝胶：将浓缩胶的各组分按比例混合后，加入到步骤(1)制备好的分离胶的上层，插入梳子，待其凝固后形成聚丙烯酰胺凝胶。
优选地，步骤(1)中所述的凝固所用温度为15-30℃，时间为20-60min。
本发明另一方面还提供了上述聚丙烯酰胺凝胶的应用，具体是所述的聚丙烯酰胺凝胶在分离蛋白质中的应用。
优选地，所述的蛋白质的分子量为1-250kDa。
本发明还提供了上述的聚丙烯酰胺凝胶在分离蛋白质时的方法，包括以下步骤：
(S0)：在电泳内槽固定制好的胶板，加入电泳缓冲液，溢出内槽到外槽，没过胶板底部；
(S1)拔掉聚丙烯酰胺凝胶中的梳子，将蛋白质样品点入梳子拔出后留下的胶孔中，接通电源，开始电泳，电泳为恒压200V，电泳时间为30-40min；
(S2)电泳结束后，取胶、置于蛋白凝胶固定液中固定、染色、煮沸、再用清水煮至背景能够清晰反应条带为止、显影；
所述的蛋白凝胶固定液为质量体积浓度为6-12％的三氯乙酸溶液。
本发明的有益效果：
本发明提供一种聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法和应用，集现有凝胶的基础配方的通用性、梯度胶的广谱性、小分子蛋白胶的高分辨率于一身，针对大小分子量蛋白的分离有更好的效果，并且用时短，具体而言：
(1)相比于现有的SDS-PAGE以及Tricine-SDS-PAGE，以及添加尿素或甘油的聚丙烯酰胺凝胶，本发明的聚丙烯酰胺凝胶条带分离效果更好，更均匀，小分子量蛋白条带变得更细窄。
(2)本申请的蛋白质分离方法价格低廉，简便高效，对于蛋白质电泳，在40min之内即可完成1-250kDa蛋白的良好分离。
(3)通过浓缩胶中磷酸盐缓冲液(pH6.8)代替现有方法的Tris(pH6.8)，增加了聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，三种不同浓度的分离胶靠重力形成梯度，提高了蛋白质的分离效果，电泳条带基本上呈均匀分布的状态。
附图说明
图1为对比例1中现有聚丙烯酰胺凝胶的电泳结果。
图2为本发明实施例1中梯度胶中聚丙烯酰胺凝胶的电泳结果。
图3为对比例1中现有聚丙烯酰胺凝胶在分离小分子蛋白中的测试结果图。
图4为本申请实施例1中梯度胶聚丙烯酰胺凝胶在分离小分子蛋白中的测试结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例，所采用的电泳仪为Biorad-Power supply HV，电泳槽为Biorad-MiniProtein Tetra，胶板为Biorad原厂玻璃制胶板，胶厚为1.0mm，凝胶体积约5mL。
实施例1-9中聚丙烯酰胺凝胶的配制具体如下：
聚丙烯酰胺凝胶由分离胶和浓缩胶构成，分离胶与浓缩胶的体积比为3:1-3.5:1，先制备下层分离胶，分离胶由第一组分、第二组分和第三组分组成，第一组分、第二组分和第三组分的体积比例为1:1:1，分离胶的具体组分如下实施例1-9中的表1-9配制；
分离胶中，按照丙烯酰胺混合液的含量，由高含量至低含量依次添加至胶板中，先由右至左的方式加入第三组分，以由左至右的方式加入第二组分；最后，由右至左的方式加入第一组分，不用混合，直接加入无水乙醇封胶面使胶面压平，丙烯酰胺凝胶在室温下，60min形成凝胶的聚合物，即分离胶；
在分离胶凝固后，倒转制胶架，使压胶面的乙醇挥发。分别按照实施例1-9中的浓缩胶的组分配比，配制浓缩胶；浓缩胶添加比例为整体凝胶体积的1/4，配制结束后灌入胶板，插入梳子，配胶结束，形成聚丙烯酰胺凝胶。
实施例1-9中的蛋白质分离方法按照以下步骤进行：
1.玻璃板清洁后装入制胶板；
2.在制胶板上分别配制聚丙烯酰胺凝胶；
3.制样：取蛋白样品，加入5×蛋白样品缓冲液混匀，95℃加热5min；
所述5×蛋白样品缓冲液为以下组分：125mM MOPS(pH6.8)、5％SDS、0.2％溴酚蓝、50体积％甘油、5体积％β-巯基乙醇。
4.电泳：电泳内槽固定上述步骤2中的制胶板，加入电泳缓冲液，使其溢出内槽到外槽，没过胶板底部即可。拔掉上述聚丙烯酰胺凝胶中的梳子，将蛋白质样品点入梳子拔出后留下的胶孔中，点样结束后，接通电源，开始电泳，电泳为恒压200V，电泳的时间为30-40min。
所述电泳液的组分包含50mM 2-吗啉乙磺酸，50mM三羟基氨基甲烷，0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠，1mM乙二胺四乙酸，10mM磷酸氢二钠。
5.固定：电泳结束后拆开制胶板，取出凝胶，将凝胶置于蛋白凝胶固定液中固定20min。所述蛋白凝胶固定液，为质量体积浓度12％三氯乙酸溶液。
6.染色脱色与成像：固定结束后，将凝胶取出放于染色液中，煮沸2min，在用清水煮至背景能够清晰反应条带为止，拍照成像。
实施例1-9中采用的磷酸盐为磷酸氢二钠；pH为8.8的三羟基氨基甲烷的初始浓度为1.5M；pH为6.8的磷酸盐缓冲液的初始浓度为0.3M。
实施例1
实施例1中分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分；第一组分中丙烯酰胺的浓度为6％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为11％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为15％(w/v)。
各组分的添加量如下表1所示。
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为4％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表添加量配制。
丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1。
表1实施例1中分离胶的组分含量
实施例2
实施例2中分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分；第一组分中丙烯酰胺的浓度为7％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为12％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为17％(w/v)。
各组分的添加量如下表2所示。
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为4％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表添加量配制。
丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1。
表2实施例2中分离胶的组分含量
实施例3
实施例3中分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分；第一组分中丙烯酰胺的浓度为9％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为13％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为18％(w/v)。各组分的添加量如下表3所示。
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为4％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表添加量配制。
丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1。
表3实施例3中分离胶的组分含量
实施例4
实施例4中分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分；第一组分中丙烯酰胺的浓度为6％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为11％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为15％(w/v)。各组分的添加量如下表4所示。
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为5％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表添加量配制。
丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1。
表4实施例4中分离胶的组分含量
实施例5
实施例5中分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分；第一组分中丙烯酰胺的浓度为7％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为12％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为17％(w/v)。
各组分的添加量如下表5所示。
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为5％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表添加量配制。
丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1。
表5实施例5中分离胶的组分含量
实施例6
实施例6中分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分；第一组分中丙烯酰胺的浓度为9％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为13％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为18％(w/v)。
各组分的添加量如下表6所示。
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为5％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表添加量配制。
丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1。
表6实施例6中分离胶的组分含量
实施例7
实施例7中分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分；第一组分中丙烯酰胺的浓度为6％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为11％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为15％(w/v)。
各组分的添加量如下表7所示。
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为6％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表添加量配制。
丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1。
表7实施例7中分离胶的组分含量
实施例8
实施例8中分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分；第一组分中丙烯酰胺的浓度为7％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为12％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为17％(w/v)。
各组分的添加量如下表8所示。
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为6％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表添加量配制。
丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1。
表8实施例8中分离胶的组分含量
实施例9
实施例9中分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分；第一组分中丙烯酰胺的浓度为9％(w/v)；第二组分中丙烯酰胺的浓度为13％(w/v)；第三组分中丙烯酰胺的浓度为18％(w/v)。
各组分的添加量如下表9所示。
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为6％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表添加量配制。
丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1。
表9实施例9中分离胶的组分含量
对比例1：
聚丙烯酰胺凝胶的配制具体如下：
对比例1为现有聚丙烯酰胺凝胶(参考《分子克隆实验指南(第四版)》下册第1329页)，由分离胶和浓缩胶构成，先制备下层分离胶，分离胶的具体组分按如下表10配制；
分离胶中，按照表10中添加量，混匀添加至胶板中，加入无水乙醇封胶面使胶面压平，丙烯酰胺凝胶在室温下，60min形成凝胶的聚合物；
在分离胶凝固后，倒转制胶架，使压胶面的乙醇挥发。按照对比例1中的浓缩胶的组分配比，配制浓缩胶；浓缩胶添加比例为整体凝胶体积的1/4，配制结束后灌入胶板，插入梳子，配胶结束。
其中，丙烯酰胺混合液中单体丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺质量比为29:1。
分离胶中丙烯酰胺的浓度为15％(w/v)；
浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为5％(w/v)，具体包括：丙烯酰胺混合液、Tris缓冲液、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺；按下表10添加量配制。
表10对比例中分离胶的组分含量
| 分离胶添加量(mL) | 浓缩胶添加量(mL) | ||
| 去离子水 | 0.398 | 去离子水 | 0.31 |
| 丙烯酰胺混合液 | 1 | 丙烯酰胺混合液 | 0.33 |
| 1.5M Tris,pH8.8 | 0.5 | 0.3M磷酸盐,pH6.8 | 1.25 |
| 10％SDS | 0.05 | 10％SDS | 0.05 |
| 10％APS | 0.05 | 10％APS | 0.05 |
| TEMED | 0.002 | TEMED | 0.006 |
对比例1中的蛋白质分离方法按照以下步骤进行：
1.玻璃板清洁后装入制胶板；
2.在制胶板上配制聚丙烯酰胺凝胶；
3.制样：取蛋白样品，加入5x蛋白样品缓冲液混匀，95℃加热5min；
所述5×蛋白样品缓冲液为以下组分：125mM MOPS(pH6.8)、5％SDS、0.2％溴酚蓝、50％甘油、5％的β-巯基乙醇。
4.电泳：电泳内槽固定制胶板，加入电泳缓冲液，溢出内槽到外槽，没过胶板底部即可。拔掉上述聚丙烯酰胺凝胶中的梳子，将蛋白质样品点入梳子拔出后留下的胶孔中，点样结束后，接通电源，开始电泳，电泳为恒压200V，电泳的时间为45min。
所述电泳液的组分包含25mM Tris-HCl，250mM甘氨酸，0.1％(W/V)十二烷基硫酸钠。
5.固定：电泳结束后拆开制胶板，取出凝胶，凝胶置于蛋白凝胶固定液中固定20min。所述蛋白凝胶固定液，为质量体积浓度为12％三氯乙酸溶液。
6.染色脱色与成像：固定结束后，将凝胶取出放于染色液中，煮沸2min，在用清水煮至背景能够清晰反应条带为止，拍照成像。
图1为对比例1中现有胶的电泳结果。从图1上可以看出，采用对比例1中现有的聚丙烯酰胺凝胶，在45min后，对大分子、小分子蛋白质分离的效果都不是很理想，大分子蛋白想要到很好的分离效果，需要将电泳时间增加。
图2为本发明实施例1梯度聚丙烯酰胺凝胶的电泳结果。实施例梯度中采用的蛋白的标准分子量为250、150、100、75、50、37、25、20、15和10kDa，中间的小分子蛋白分子量约为6kDa。从图2中可以看出，采用本发明的聚丙烯酰胺凝胶具有很好的分离效果，用时短，约35min，分离范围6-250kDa，且条带细窄；
图3为对比例1中聚丙烯酰胺凝胶在分离小分子蛋白的测试结果，蛋白的标准分子量为250、150、100、75、50、37、25、20、15和10kDa，小分子量蛋白标准为40、25、15、10、4.6和1.7kDa，小分子蛋白为大小约为6kDa。从图3中可以看出，小分子蛋白marker条带未完全分离开。
图4为本发明实施例1中梯度聚丙烯酰胺凝胶在分离小分子蛋白的测试结果，蛋白质的标准分子量为250、150、100、75、50、37、25、20、15和10kDa，小分子量蛋白的标准分子量为40、25、15、10、4.6和1.7kDa，小分子蛋白为大小约为6kDa。从图4中可以看出，小分子蛋白marker条带分离效果良好，相比现有配方，小分子蛋白的分离更优。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶包括分离胶和浓缩胶；所述的分离胶包括第一组分、第二组分和第三组分，体积比为1:1:1；
其中，第一组分包括：丙烯酰胺混合液15-35v/v％、三羟基氨基甲烷20-35v/v％、十二烷基硫酸钠1-3v/v％、过硫酸铵1-3v/v％和四甲基乙二胺0.04-0.2v/v％，用去离子水补足至100v/v％；
第二组分包括：丙烯酰胺混合液25-50v/v％、三羟基氨基甲烷20-35v/v％、十二烷基硫酸钠1-3v/v％、过硫酸铵1-3v/v％和四甲基乙二胺0.04-0.2v/v％，用去离子水补足至100v/v％；
第三组分包括：丙烯酰胺混合液45-65v/v％、三羟基氨基甲烷20-35v/v％、十二烷基硫酸钠1-3v/v％、过硫酸铵1-3v/v％和四甲基乙二胺0.04-0.2v/v％，用去离子水补足至100v/v％；
所述的浓缩胶包括：丙烯酰胺混合液10-25v/v％、磷酸盐缓冲液55-65v/v％、十二烷基硫酸钠1-3v/v％、过硫酸铵1-3v/v％和四甲基乙二胺0.1-0.4v/v％，用去离子水补足至100v/v％；
所述的丙烯酰胺混合液中，丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺的质量比为29:1；
所述的分离胶与浓缩胶的体积比为3:1-3.5:1；
所述的第一组分中丙烯酰胺的浓度为6-9w/v％；第二组分中丙烯酰胺的浓度为11-13w/v％；第三组分中丙烯酰胺的浓度为15-18w/v％；
所述的浓缩胶中丙烯酰胺的浓度为4-6w/v％；
所述的磷酸盐缓冲液的pH为6.8，磷酸盐缓冲液的浓度为100-200mM；
所述聚丙烯酰胺凝胶的制备方法包括以下步骤：
(1)制备分离胶：将第三组分、第二组分和第一组分依次按照1:1:1的比例加入到胶板中，第三组分与第二组分的加入方向相反，第三组分与第一组分的加入方向相同，再加入无水乙醇覆盖其表面，待其凝固，使无水乙醇挥发，即为制备好的分离胶；
(2)制备聚丙烯酰胺凝胶：将浓缩胶的各组分按比例混合后，加入到步骤(1)制备好的分离胶的上层，插入梳子，待其凝固后形成聚丙烯酰胺凝胶。
2.根据权利要求1所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述的三羟基氨基甲烷的pH为8.8，三羟基氨基甲烷的浓度为100-500mM。
3.根据权利要求1或2所述的聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)制备分离胶：将第三组分、第二组分和第一组分依次按照1:1:1的比例加入到胶板中，第三组分与第二组分的加入方向相反，第三组分与第一组分的加入方向相同，再加入无水乙醇覆盖其表面，待其凝固，使无水乙醇挥发，即为制备好的分离胶；
(2)制备聚丙烯酰胺凝胶：将浓缩胶的各组分按比例混合后，加入到步骤(1)制备好的分离胶的上层，插入梳子，待其凝固后形成聚丙烯酰胺凝胶。
4.根据权利要求3所述的聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的凝固所用温度为15-30℃，时间为20-60min。
5.权利要求1或2所述的聚丙烯酰胺凝胶的应用，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶在分离蛋白质中的应用。
6.根据权利要求5所述的聚丙烯酰胺凝胶的应用，其特征在于，所述的蛋白质的分子量为1-250kDa。
7.根据权利要求5所述的聚丙烯酰胺凝胶的应用，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶在分离蛋白质时的方法，包括以下步骤：
(S0)：在电泳内槽固定制好的胶板，加入电泳缓冲液，溢出内槽到外槽，没过胶板底部；
(S1)拔掉聚丙烯酰胺凝胶中的梳子，将蛋白质样品点入梳子拔出后留下的胶孔中，接通电源，开始电泳，电泳为恒压200V，电泳时间为30-40min；
(S2)电泳结束后，取胶、置于蛋白凝胶固定液中固定、染色、煮沸、再用清水煮至背景能够清晰反应条带为止、显影；所述的蛋白凝胶固定液为质量体积浓度为6-12％的三氯乙酸溶液。
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