CN103575792A

CN103575792A - 梯度凝胶及其制备方法

Info

Publication number: CN103575792A
Application number: CN201210271189.9A
Authority: CN
Inventors: 王继华
Original assignee: Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
Priority date: 2012-08-01
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2014-02-12

Abstract

本发明公开了一种梯度凝胶及其制备方法，其特征在于，将水、丙烯酰胺分离胶贮备液、分离胶缓冲液、SDS、过硫酸铵按比例分别调配成浓度为8％-15％的2种或2种以上分离胶，再迅速将调配出来的2种或2种以上不同浓度的分离胶依次按浓度从大到小灌入垂直板电泳的玻璃板夹缝中，加水，待分离胶凝固后，加入浓缩胶，等待浓缩胶凝固。该方法有利于加快电泳速度，加强蛋白分子的穿透能力，提高蛋白转印率和蛋白转印质量。

Description

梯度凝胶及其制备方法

技术领域

本发明公开了一种梯度凝胶及其制备方法。

背景技术

自身抗体指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。人体的生长、发育和生存有完整的自身免疫耐受机制的维持，正常的免疫反应有保护性防御作用，即对自身组织、成分不发生反应。一旦自身耐受的完整性遭到破坏，则机体视自身组织、成分为“异物”，而发生自身免疫反应，产生自身抗体。在特定情况下，免疫系统对机体自身物质识别失效，把它们认为是外来入侵物，从而产生针对这些物质的抗体(即自身抗体)，引发自身免疫。这些自身抗体会攻击机体自身细胞、组织、器官，引起炎症反应，对机体造成伤害。常见的自身免疫疾病包括有结缔组织疾病类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、神经肌肉疾病多发性硬化症、重症肌无力、脱髓鞘疾病、内分泌性疾病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、青少年型糖尿病、消化系统疾病慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎缩性胃炎、泌尿系统疾病自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合症、血液系统疾病自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症等。据相关调查表明，自身抗体疾病患者多为边远贫困地区，用于自身抗体检测的试剂盒等检测工具的购买者都为这些地区的基层医疗机构，其有限的经济购买能力决定了自身抗体检测产品必须价格低廉，经济实用。

目前，市面上较为普遍的产品有两种，一种是直接将纯抗原包被到膜条上，将膜条与孵育盘、洗涤液、样本稀释液、碱性磷酸酶标记的抗人IgG、显色剂(BCIP/NBT)、阴性和阳性对照血清及使用说明书组成一个商品化的试剂盒，按操作说明书一步一步对人体待测血清进行相应抗体检测。另一种则是采用免疫印迹法技术，通过凝胶电泳对混合抗原进行蛋白分子分离，再将分离出来的蛋白分子转印到膜上，将膜晾干，切成条，制作成检测膜条，再跟试剂盒的其他组成成分配合使用。两种产品各有优缺点。第一种采用纯抗原，免去了凝胶电泳和转印的麻烦，无需特殊仪器，便于操作，然而由于采用了纯抗原，该产品价格相对较高。相反，第二种采用混合抗原的产品，虽然制作工艺较为繁杂，但其凭借可一次性同时检测多种自身抗体疾病及低廉的价格等优点，受到了经济能力相对有限的地区基层医疗机构及患者的欢迎。

然而，针对第二种产品，采用免疫印迹法技术对混合抗原进行凝胶电泳转印的过程中，电泳和转印的等待时间较长，其中电泳通常需要4.5小时，过程较为费时，效率较低。另外，均一凝胶的设置，若浓度过大会阻碍蛋白分子电泳的速度，影响转印率；浓度太小，蛋白分子电泳速度快了，不同分子量大小的蛋白分子则不能在电泳过程中被清晰分离开来，致使蛋白转印无效，可能造成整个免疫印迹过程失去意义。同时，由于采用了浓度均一的凝胶，无论是凝胶电泳还是蛋白转印，不同分子量大小的蛋白分子都必须统一穿过同一浓度的凝胶，电泳速度慢，效率低，同时转印不够彻底，等待时间长。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种梯度凝胶及其制备方法，可加快电泳速度，加强蛋白分子的穿透能力，提高蛋白转印率和蛋白转印质量，同时，工艺简单，易于操作。

解决上述问题的技术方案是：将水、丙烯酰胺贮备液、分离胶缓冲液、一定浓度SDS、过硫酸铵分别调配成浓度为8％-15％的2种或2种以上分离胶，再迅速将调配出来的2种或2种以上不同浓度的分离胶依次按浓度从大到小灌入垂直板电泳的玻璃板夹缝中，加水，待分离胶凝固后，加入浓缩胶，等待浓缩胶凝固，制成浓度递增的梯度凝胶。其中，调配出来用于制成梯度凝胶的分离胶浓度越多种，梯度凝胶的浓度阶梯便越密集，制成的梯度凝胶越适于分离分子量相差不大或分子量相近的蛋白分子，转印率也愈佳。因此，可根据实际需要调配2种或2种以上不同浓度的分离胶制作梯度凝胶。

其中，所述分离胶由水、丙烯酰胺分离胶贮备液、分离胶缓冲液、SDS、过硫酸铵等调配而成；所述浓缩胶由水、丙烯酰胺浓缩胶贮备液、浓缩胶缓冲液、SDS、过硫酸铵调配而成。所述浓缩胶由水、丙烯酰胺浓缩胶贮备液、浓缩胶缓冲液、SDS、过硫酸铵等成分调配而成。所述分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液的主要成分为Tris-HCl，其中，分离胶的PH值小于7，浓缩胶缓冲液的PH值大于7。所述丙烯酰胺分离胶贮备液由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺调配而成。所述丙烯酰胺浓缩胶贮备液由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按调配而成。根据这一方法制成的梯度凝胶的浓度变化范围为8％至15％。

与现有技术相比，本发明的优点是：采用浓度递增的梯度凝胶，使用逐步筛选的方式对不同分子量大小的蛋白分子进行分离，有利于加快电泳速度，加强蛋白分子的穿透能力，提高蛋白转印率和蛋白转印质量。

由于不同浓度的凝胶适合于分子量范围不同的蛋白分子，如5％的胶适合于25-200kD的蛋白；10％的胶适合于10-70kD的蛋白；15％的胶适合于10-50kD的蛋白，因此，对不同分子量区段的蛋白采用不同浓度的凝胶进行分离，可弥补均一胶的缺陷，取得均一胶所不能达到的效果。该方法不仅加快了电泳的效率，同时，在蛋白转印环节，梯度凝胶依蛋白分子量大小而设，使不同分子量蛋白能够得以较好电泳分离。同时也在一定程度上加强了蛋白分子在凝胶中的穿透能力。

附图说明

图1为运用本发明实施例1的方法转印出来的蛋白膜条进行包被后滴加带有抗SSA、抗SSB抗原的血清的试验结果。其中，抗SSA阳性结果对应分子量为45、47kD的蛋白分子检测显色条带；抗SSB阳性结果对应分子量为52kD的蛋白分子检测显色条带。

图2为运用本发明实施例3的方法转印出来的蛋白膜条进行包被后滴加带有抗SSA、抗SSB抗原的血清的试验结果。其中，抗SSA阳性结果对应分子量为45、47kD的蛋白分子检测显色条带；抗SSB阳性结果对应分子量为52kD的蛋白分子检测显色条带。

具体实施方式

下面结合自身抗体检测的实施例，对本发明做进一步描述。

由于用于检测抗Sm、抗U1RNP、抗SSA、抗SSB、抗rRNP、抗Scl-70、抗Jo-1抗体的相应抗原的分子量范围为13.5kD-86kD，因此，采用8％-15％的梯度凝胶最为合适。配备这一梯度凝胶的方法如下：

实施例1：

1、调配分离胶：将H₂O、丙烯酰胺贮备液、分离胶缓冲液、10％SDS、过硫酸铵按一定比例调成8％、10％、13％、15％浓度的分离胶。下面是这两种不同浓度分离胶的配方：

(1)浓度为8％的分离胶：7.8mL H₂O，3.3mL丙烯酰胺分离胶贮备液，7.01mL分离胶缓冲液，0.19mL10％SDS，0.42mL16mL/mL的过硫酸铵；

(2)浓度为15％的分离胶：0.78mL H₂O，9.5mL丙烯酰胺分离胶贮备液，7.01mL分离胶缓冲液，0.19mL10％SDS，0.42mL16mL/mL的过硫酸铵。

2、调配浓缩胶：将13.3mL H₂O，1.8mL丙烯酰胺浓缩胶贮备液，2.3mL浓缩胶缓冲液，0.19mL10％SDS，0.42mL16mL/mL的过硫酸铵调配成浓缩胶。

3、取2支试管，命名为A、B，分别加入8％浓度的分离胶7mL(A试管)，15％浓度的分离胶9.5mL(D试管)，将B、A2支试管按分离胶的浓度从高到低依次快速灌入垂直板电泳的玻璃板夹缝中，加水用以平齐分离胶胶面，待分离胶凝固后，灌注浓缩胶，浓缩胶凝固后，即为制备好的，浓度为8％至15％的梯度凝胶。

实施例2：

1、调配分离胶：将H₂O、丙烯酰胺贮备液、分离胶缓冲液、10％SDS、过硫酸铵按一定比例调成8％、11％、15％浓度的分离胶。下面是这三种不同浓度分离胶的配方：

(2)浓度为11％的分离胶：3.2mL H₂O，7.68mL丙烯酰胺分离胶贮备液，7.01mL分离胶缓冲液，0.19mL10％SDS，0.42mL16mL/mL的过硫酸铵；

(3)浓度为15％的分离胶：0.78mL H₂O，9.5mL丙烯酰胺分离胶贮备液，7.01mL分离胶缓冲液，0.19mL10％SDS，0.42mL16mL/mL的过硫酸铵。

3、取3支试管，命名为A、B、C，分别加入8％浓度的分离胶5mL(A试管)，11％浓度的分离胶5.5mL(B试管)，13％浓度的分离胶6mL(C试管)，15％浓度的分离胶6.6mL(D试管)，将C、B、A3支试管按分离胶的浓度从高到低依次快速灌入垂直板电泳的玻璃板夹缝中，加水用以平齐分离胶胶面，待分离胶凝固后，灌注浓缩胶，浓缩胶凝固后，即为制备好的，浓度为8％、11％、15％逐渐变化的梯度凝胶。

实施例3：

1、调配分离胶：将H₂O、丙烯酰胺贮备液、分离胶缓冲液、10％SDS、过硫酸铵按一定比例调成8％、10％、13％、15％浓度的分离胶。下面是这四种不同浓度分离胶的配方：

(2)浓度为10％的分离胶：3.8mL H₂O，6.65mL丙烯酰胺分离胶贮备液，7.01mL分离胶缓冲液，0.19mL10％SDS，0.42mL16mL/mL的过硫酸铵；

(3)浓度为13％的分离胶：1.2mL H₂O，9.5mL丙烯酰胺分离胶贮备液，7.01mL分离胶缓冲液，0.19mL10％SDS，0.42mL16mL/mL的过硫酸铵。

(4)浓度为15％的分离胶：0.78mL H₂O，9.5mL丙烯酰胺分离胶贮备液，7.01mL分离胶缓冲液，0.19mL10％SDS，0.42mL16mL/mL的过硫酸铵。

3、取4支试管，命名为A、B、C、D，分别加入8％浓度的分离胶1.65mL(A试管)，10％浓度的分离胶3.3mL(B试管)，13％浓度的分离胶4.95mL(C试管)，15％浓度的分离胶6.6mL(D试管)，将D、C、B、A4支试管按分离胶的浓度从高到低依次快速灌入垂直板电泳的玻璃板夹缝中，加水用以平齐分离胶胶面，待分离胶凝固后，灌注浓缩胶，浓缩胶凝固后，即为制备好的，浓度为8％、10％、13％、15％逐渐变化的梯度凝胶。

以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。

Claims

1.一种梯度凝胶及其制备方法，其特征在于，将水、丙烯酰胺分离胶贮备液、分离胶缓冲液、SDS、过硫酸铵调配成浓度为8％-15％的2种或2种以上分离胶，再迅速将调配出来的2种或2种以上不同浓度的分离胶依次按浓度从大到小灌入垂直板电泳的玻璃板夹缝中，加水，待分离胶凝固后，加入浓缩胶，等待浓缩胶凝固。

2.根据权利要求1所述的梯度凝胶及其制备方法，其特征在于，所述分离胶由水、丙烯酰胺分离胶贮备液、分离胶缓冲液、SDS、过硫酸铵等成分调配而成。

3.根据权利要求1所述的梯度凝胶及其制备方法，其特征在于，所述浓缩胶由水、丙烯酰胺浓缩胶贮备液、浓缩胶缓冲液、SDS、过硫酸铵等成分调配而成。

4.根据权利要求1或2所述的梯度凝胶及其制备方法，其特征在于，所述分离胶缓冲液的主要成分是Tris-HCl，PH值小于7。

5.根据权利要求3所述的梯度凝胶及其制备方法，其特征在于，所述浓缩胶缓冲液的主要成分是Tris-HCl，PH值大于7。

6.根据权利要求2所述的梯度凝胶及其制备方法，其特征在于，所述丙烯酰胺分离胶贮备液由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺调配而成。

7.根据权利要求3所述的梯度凝胶及其制备方法，其特征在于，所述丙烯酰胺浓缩胶贮备液由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按调配而成。

8.根据权利要求1所述的梯度凝胶及其制备方法，其特征在于，梯度凝胶的浓度变化范围为8％至15％。