CN101788541B - 一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生化分析领域，涉及一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法。本发明利用低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶作为电泳支持介质，联和应用凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离-电喷雾质谱鉴定的分析路线和固相梯度pH干胶条等电聚焦结合所述凝胶垂直电泳分离-基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线，分离鉴定大分子量蛋白质。所提供的凝胶孔径大、机械强度大、分辨率高、重现性好、及质谱兼容性好，可同时根据组分的不同比例调整合适的大分子量分离范围。能选择性地分离100kDa以上分子量区间的蛋白质，重现性达RSD 7.6％，明显提高鉴定率。本方法为分离大分子量蛋白质提供有效工具，可应于蛋白质组学研究领域。
Description
技术领域
本发明属生化分析领域，涉及一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法。具体涉及一种利用低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶(AgPAGE)作为电泳支持介质分离大分子量蛋白质的方法。
背景技术
蛋白质组是研究发现临床重大疾病的生物靶标的一个有力的工具。目前，蛋白质组研究正日益受到国内外科研工作者的密切关注。时间显示，为了减少实际样品的复杂性，蛋白质的分离是至关重要的。现有技术公开了大规模的蛋白质分离主要依赖于凝胶电泳技术和液相色谱技术。前者由于其成熟的技术和良好的分离能力，仍是当今分离复杂蛋白质样品的首选，并得到生物质谱的技术支持得以大规模分析鉴定。但是低丰度蛋白、极酸极碱性区蛋白、高分子量蛋白和疏水性蛋白等的分析和鉴定仍是蛋白质组学研究的重点和难点内容。其中，大分子量蛋白质(分子量大于100kDa)由于其和很多重大疾病相关，如迪谢纳-贝克肌肉萎缩症、原发性心肌炎等，越来越受到重视。一般分离采用的聚丙烯酰胺水凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂(过硫酸铵)，四甲基乙二胺(TEMED)作为加速剂催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应，通过蛋白质的分子量差异对蛋白进行分离。但是，分离大分子量蛋白所需要的聚丙烯酰胺凝胶单体浓度太低(小于5％w/v)，这样的聚丙烯酰胺凝胶易碎，不易于操作。因此很多学者将另一种水凝胶——琼脂糖凝胶引入蛋白质分离系统中，以期具有相对大孔径且机械强度较大的琼脂糖凝胶可以实现大分子蛋白的分离。但是无论是将琼脂糖胶作为等电聚焦介质还是分子筛作用的垂直电泳介质，都面临了很多问题，包括其凝固点高不利于室温操作和胶的重现性，染色方法与质谱鉴定不兼容等。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术大分子量蛋白分离分析困难的问题，提供一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法。本发明以水凝胶作为电泳支持介质，尤其是利用低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶(AgPAGE)作为电泳支持介质分离大分子量蛋白质。
本发明所述的新型凝胶是一种低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺的混合凝胶，其特点在于既具有琼脂糖凝胶平均孔径大、分辨率高、机械强度好的特点，又具有聚丙烯酰胺凝胶质谱兼容型的特点，最重要的是采用了低熔点琼脂糖代替普通琼脂糖，熔点和凝固点都大大低于普通琼脂糖，便于操作和充分混匀，适用于普通薄板垂直电泳，可形成均一的、重现性好的混合凝胶。
本发明中，联和应用新型凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离-电喷雾质谱鉴定的分析路线(AgPAGE-LC-ESI-MS/MS)和固相梯度pH干胶条等电聚焦结合新型凝胶垂直电泳分离-基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线(IEF-AgPAGE-MALDI-MS)。
所述MALDI-MS鉴定的路线中，采用纳米核壳复合材料对酶解的蛋白进行快速、高效富集除盐，使得大分子量蛋白质的鉴定率大大提高。。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
1.采用低熔点琼脂糖(凝固点接近或低于室温)和聚丙烯酰胺混合凝胶(AgPAGE)作为电泳支持介质来分离分子量大于100kDa的蛋白质。
2.根据低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺两个组分的不同比例调整合适的大分子量分离范围。
3.利用与质谱兼容的银染方法进行蛋白质显色且进行胶内酶解提肽。
4.ESI-MS鉴定路线中，先用新型凝胶将大分子量蛋白从其他蛋白中得到初分离，酶解后的肽段再进入LC分离，简化了分离体系。
5.MALDI-MS鉴定的路线中，采用纳米核壳复合材料对酶解的蛋白进行快速、高效富集除盐。
本发明中，通过下述方法制备低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶：
低熔点琼脂糖(凝固点接近或低于室温)溶于含有pH 7～9的缓冲溶液中，在高于熔点的水浴中充分溶解，然后冷却至室温，制成低熔点琼脂糖溶液；另一方面，制备低浓度的丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺交联剂的质量比范围为25～40，然后将以上两种溶液按照丙烯酰胺与低熔点琼脂糖的质量比在35～2的范围内混合，再加入TEMED加速催化剂，倒入垂直电泳玻璃板槽，引发自由基聚合反应，形成均匀的薄板凝胶。
表1为几种典型的低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶的制备步骤。
表1
本发明中，采用质谱兼容的染色方法，如考马斯亮蓝染色和硝酸银染色法，染色过程中无需干胶步骤。
联用新型凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离-电喷雾质谱鉴定的分析路线(AgPAGE-LC-ESI-MS/MS)和固相梯度pH干胶条等电聚焦结合新型凝胶垂直电泳分离-基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线(IEF-AgPAGE-MALDI-MS)。其中，AgPAGE-LC-ESI-MS/MS路线中，由于LC系统有在线除盐系统，所以凝胶电泳后的蛋白条带酶解产物可直接在线LC-MS联用；IEF-AgPAGE-MALDI-MS路线中，采用纳米核壳复合材料酶解的单个蛋白点进行快速、高效富集除盐，实现离线富集除盐，然后进入质谱分析。该纳米核壳复合材料是一类含有无机纳米内核的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球，直径在100～500纳米范围。将此材料加入多肽或蛋白质样品的溶液富集，富集时间在10-12分钟之间，富集温度在25-37摄氏度之间，离心去除上清后，可直接与基质均匀混合，形成均匀细致的结晶，进行基质辅助激光解析离子化质谱分析。
本发明使用的混合凝胶结合了两种常用于生物大分子电泳的凝胶的优势：低熔点琼脂糖凝胶平均孔径大，可以使大分子量蛋白质得到有效分离；低熔点琼脂糖相对普通琼脂糖便于操作和充分混匀的优势，适用于普通薄板垂直电泳，可形成均一的、重现性好的混合凝胶；聚丙烯酰胺的存在，使得该凝胶适用于与质谱相兼容的染色和酶解提肽方法。该新型凝胶具有孔径大、机械强度大、分辨率高、重现性好、及质谱兼容性好的特点，同时可以根据两个组分的不同比例来调整合适的大分子量分离范围，是分离大分子量蛋白质的有效工具。本发明新型凝胶与基于质谱鉴定的两条蛋白质组学技术路线联用方法的建立，为大分子量蛋白的分离分析提供了新的方法学。本发明可以选择性地分离100kDa以上分子量区间的蛋白质，重现性可达RSD 7.6％，与纳米核壳复合材料富集法联用可使得鉴定率大大提高。本发明可以广泛应用于蛋白质组学研究领域，开拓了大分子量蛋白质的组学研究方法。
附图说明
图1为标准分子量标示蛋白的一维薄板垂直电泳图。(a)为7％SDS-PAGE；(b)为SDS-lmpAgPAGE 1(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/3，v/v)；(c)为SDS-lmpAgPAGE 2(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/2，v/v)；(d)为SDS-lmpAgPAGE 3(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/1，v/v)。
图2为各种凝胶的蛋白相对迁移率-蛋白分子量关系图。蛋白相对迁移率是蛋白在胶上的移动距离和溴酚兰指示带移动距离的比值。(a)为7％SDS-PAGE；(b)为SDS-lmpAgPAGE 1(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/3，v/v)；(c)为SDS-lmpAgPAGE 2(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/2，v/v)；(d)为SDS-lmpAgPAGE 3(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/1，v/v)。
图3为SD-rat GST-Pulldown纯化后的脑组织蛋白提取物的一维凝胶图，
(a)为SDS-lmpAgPAGE 2(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/2，v/v)，(b)7％SDS-PAGE；
胶上标示的阿拉伯数字和罗马数字均代表表观分子量150kDa以上的蛋白条带。
图4为SD-rat大肠组织蛋白提取物的二维凝胶图，其中，
第一维均采用的是固相梯度Ph干胶条等电聚焦，第二维采用的是混合凝胶或普通聚丙烯酰胺凝胶：(a)为SDS-lmpAgPAGE 1(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/3，v/v)；(b)为7％SDS-PAGE。
图5为MALDI-TOF MS鉴定到的蛋白肽段亲疏水性分布柱状图，
(a)为采用冻干法鉴定成功的7个蛋白被检测到的142条肽段亲疏水性分布；(b)为同样这7个蛋白用氧化锌-聚甲基丙烯酸甲酯核壳材料富集除盐后鉴定到的被检测到的197条肽段亲疏水性分布；
(c)为所有26个被核壳材料富集除盐法鉴定成功的蛋白的501条肽段亲疏水性分布。
图6为SD-rat大肠组织蛋白提取物的二维凝胶的三次平行实验。
具体实施方式
下面的实例是对本发明提出的基于低熔点琼脂糖/聚丙烯酰胺混合凝胶大分子量蛋白质的电泳分离和质谱鉴定的方法的进一步说明。
实施例1低熔点琼脂糖/聚丙烯酰胺混合凝胶的蛋白高分子量端最佳分离分子量范围的研究
采用标准分子量标示蛋白质(分子量范围10-250kDa)作为标准样品，考察不同比例的低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶混合物的分离分子量范围。图1显示0.8％lmpAg的比例从0到1/2增加的凝胶电泳结果。随着lmpAg的比例上升，混合凝胶的平均孔径增大，可分离的分子量范围趋近更高。由Ferguson定律可计算出每种凝胶的分离分子量范围，如图2所示：7％SDS-PAGE，35-270kDa；SDS-lmpAgPAGE 1(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/3，v/v)，60-330kDa；SDS-lmpAgPAGE 2(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/2，v/v)，75-360kDa；SDS-lmpAgPAGE 3(0.8％SDS-lmpAg/7％SDS-PAGE gel：1/1，v/v)，125-420kDa。
实施例2AgPAGE-LC-ESI-MS/MS路线的应用实例
采用GST-Pulldown纯化的SD-rat脑组织蛋白提取物进行一维混合凝胶电泳，且与常规低浓度的聚丙烯酰胺凝胶比较，。图3显示了，使用lmpAgPAGE作为电泳介质使得高分子量端分离效果明显优于普通凝胶，并且很好地分离了Spectrin isoforms，质谱鉴定支持了这一结果，见表2。
表2为收缩蛋白异构体(Spectrin isoforms)的ESI-MS/MS鉴定结果列表。结果显示，所述的收缩蛋白异构体来源于经过谷胱甘肽-S-转移酶亲和层析试验(GST-Pulldown)纯化的斯普拉格-道利大鼠(SD-rat)脑组织蛋白提取物。该纯化后的脑组织蛋白提取物先经过低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶分离，切蛋白条带酶解提取肽段，再结合高效液相色谱分离多肽段，最后ESI-MS/MS鉴定。
表2
实施例3IEF-AgPAGE-MALDI-TOF MS/MS路线的应用实例
采用SD-rat大肠组织全蛋白进行二维凝胶电泳，第一维均采用的是固相梯度Ph干胶条等电聚焦，第二维采用的是混合凝胶或普通低浓度聚丙烯酰胺凝胶，如图4所示。ImageMaster 2-D软件分析出，使用混合凝胶的分子量高于100kDa的蛋白个数明显高于使用普通凝胶，分别为298个蛋白点和224个蛋白点。对于凝胶上任选的26个点用两种富集方法处理：纳米核壳复合物富集除盐法和离心冻干法。通过质谱数据表明，材料富集法对这26个点的鉴定率达到了100％，而离心冻干法只鉴定到了7个蛋白点，鉴定率为27％。(表3和表4)通过对这些成功鉴定点的肽段进行GRAVY亲疏水性分析发现，材料富集法对疏水性肽段具有优于冻干法的富集除盐效果，因此可使得鉴定率大大提高，如图5所示。
表3为二维凝胶上26个蛋白点使用氧化锌-聚甲基丙烯酸甲酯核壳材料富集法得到的MALDI-TOF MS鉴定结果。
其中，蛋白来源于SD-rat大肠组织，经过固相梯度Ph干胶条等电聚焦和低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶二维凝胶电泳分离，切蛋白点酶解提取肽段，采用氧化锌-聚甲基丙烯酸甲酯核壳材料富集法富集除盐，最后用MALDI-TOF MS鉴定。
表4为二维凝胶上26个蛋白点冻干法富集得到的MALDI-TOF MS成功鉴定到的蛋白结果。
其中样本和分离条件与表3一致，富集方法采用离心冻干法，最后仍用MALDI-TOF MS鉴定。
表3
表4
实施例4低熔点琼脂糖/聚丙烯酰胺混合凝胶的重现性研究
采用SD-rat大肠组织蛋白提取物进行三次平行二维凝胶电泳实验。第一维均采用的是固相梯度Ph干胶条等电聚焦，第二维采用的是低熔点琼脂糖/聚丙烯酰胺混合凝胶。如图6所示，ImageMaster 2-D软件分析出，使用混合凝胶的分子量高于100kDa的蛋白个数分别为268，258和298，RSD为7.6％；同时，图4所选的26个蛋白点在所述的三张凝胶中都可以清楚地被找到。结果充分的显示了该凝胶良好的重现性。
Claims (7)
1.一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是利用低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶作为电泳支持介质，联和应用所述凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离-电喷雾质谱鉴定的分析路线和固相梯度pH干胶条等电聚焦结合所述凝胶垂直电泳分离-基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线，分离大分子量蛋白质，其包括下述步骤：
1)通过下述步骤制备低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶：
(1)低熔点琼脂糖溶于含有pH 7～9的缓冲溶液中，在高于熔点的水浴中充分溶解后，冷却至室温，制成低熔点琼脂糖溶液，其中低熔点琼脂糖凝固点接近或低于室温；
(2)制备低浓度的丙烯酰胺溶液，其中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺交联剂的质量比范围为25～40；
(3)将以上两种溶液混合，其中丙烯酰胺与低熔点琼脂糖的质量比为35～2，再加入TEMED加速催化剂，倒入垂直电泳玻璃板槽，引发自由基聚合反应，形成均匀的薄板凝胶；
2)采用质谱兼容的染色；
3)采用上述混合凝胶垂直电泳将大分子量蛋白从全蛋白中分离出来后，酶解肽段进入LC分离体系分离，进行ESI-MS鉴定；
4)采用纳米核壳复合材料对二维凝胶电泳后胶粒酶解的单个大分子量蛋白点进行
快速、高效富集除盐，实现离线富集除盐，然后进入MALDI-MS质谱分析。
2.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的纳米核壳复合材料为含有无机纳米内核的聚甲基丙烯酸甲酯微球，直径为100～500纳米。
3.按权利要求2所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的纳米核壳复合材料加入多肽或蛋白质样品的溶液富集，富集时间为10-12分钟，富集温度为25-37摄氏度，离心除上清，与基质均匀混合，形成结晶，进行基质辅助激光解析离子化质谱分析。
4.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述质谱兼容的染色为考马斯亮蓝染色或硝酸银染色法，染色过程中无需干胶步骤。
5.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的聚丙烯酰胺和低熔点琼脂糖在35～2的质量比范围内调整大分子量分离范围。
6.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的低熔点琼脂糖粉末的溶解体系是PH 7～9的缓冲溶液体系。
7.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶电泳使用的平板垂直电泳体系。
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