CN103512997B

CN103512997B - 一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法

Info

Publication number: CN103512997B
Application number: CN201210210614.3A
Authority: CN
Inventors: 秦钧; 钱小红; 丁琛; 应万涛; 张养军; 卫军营; 宋雷; 江静; 张姣; 贺福初
Original assignee: BEIJING PROTEOME RESEARCH CENTER
Current assignee: Beijing Proteome Research Center; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2032-06-20
Also published as: CN103512997A

Abstract

本发明公开了一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定技术。本发明的蛋白质组分离鉴定方法，包括以下步骤：1）从离体的细胞或组织中提取蛋白质混合物；2）采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶切成肽段混合物；3）将酶切获得的肽段混合物进行高温高pH短梯度反相色谱分离，反相色谱采用的柱温为30℃-80℃，采用流动相pH为7-12，有效梯度时间仅为26分钟；收集馏分，并对馏分进行干燥浓缩；4）将步骤3）获得的干燥浓缩样本复溶后，采用低pH短梯度反相色谱-质谱联用技术进行鉴定，反相色谱采用的流动相的pH值为2-5，有效梯度时间仅为30分钟。本发明的方法在6-24小时内，假阳性率低于1％条件下，实现对6000-9000个蛋白质的分析鉴定。

Description

一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法。

背景技术

蛋白质组学不仅研究特定细胞、组织、体液及亚结构中蛋白质的组成和表达变化，而且还研究蛋白质异构体、翻译后修饰及其相互作用及功能等，其中蛋白质组与基因组的对接是一项重要研究内容，但其前提之一是实现对蛋白质组的高覆盖率鉴定，而采用何种蛋白质组学分析策略是实现上述研究的关键。目前，有两种蛋白质组学分析策略：一是基于凝胶电泳分离-质谱鉴定的技术策略；二是高效液相色谱分离-质谱鉴定的技术策略。随着蛋白质组技术的发展，基于多维液相色谱-串联质谱联用的技术已经成为蛋白质组研究中的主流技术，广泛应用于蛋白质组表达、修饰及蛋白复合物等的研究中。这种分析技术的改进有助于提高蛋白质组的鉴定覆盖率。

由于生物样本中蛋白质组成的高度复杂性，在多维液相色谱-串联质谱联用技术应用过程中，质谱分析时的离子抑制效应和质谱扫描速度的限制，致使许多肽段不能被检出，严重影响了蛋白质组的鉴定覆盖率。为了解决这个问题，已经发展了多种提高蛋白质/多肽分离和质谱检测效率的方法。例如，在分离部分采用离子交换-反相液相色谱分离技术、超长梯度分离技术和超长色谱柱分离等；在质谱鉴定部分采用高雾化效率离子源、多次重复实验和质谱分段扫描等。虽然这些方法可有效提高蛋白质组鉴定的覆盖率，但它们存在一个共同的缺点，就是需要较长的分析时间，严重影响了生物样本分析的通量和效率。因此有必要建立一种快速高效的蛋白质组分离鉴定技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高效蛋白质组分离鉴定技术。

本发明所提供的蛋白质组分离鉴定方法，如图1所示，包括以下步骤：

1）从离体的细胞或组织中提取蛋白质混合物；

2）采用蛋白酶将待分离鉴定的蛋白质混合物酶切成肽段混合物；

3）将酶切获得的肽段混合物进行高温高pH短梯度反相色谱分离，收集馏分，并对馏分进行干燥浓缩；

4）将步骤3）获得的干燥浓缩样本复溶后，采用低pH短梯度反相色谱-质谱联用技术进行鉴定。

所述步骤1）从细胞或组织中提取蛋白质混合物的提取方法为：利用6～8M尿素溶液将细胞或组织混悬后，在冰浴上超声提取蛋白质混合物；

所述步骤2）蛋白酶切方法为：使用Trypsin、GluC或Lys-c中的一种或两种以上蛋白酶任意组合对蛋白质混合物进行酶切。

所述步骤3）中，所述高温高pH短梯度反相色谱分离的流动相pH值为pH 7-12；所述柱温为30℃-80℃，优选为60℃。

具体的，所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流动相A为pH 7-12的2%乙腈水溶液（体积百分比浓度，下同；用氨水调节pH值），具体可以为pH 10的2%的乙腈水溶液，流动相B为pH 7-12的98%乙腈水溶液（用氨水调节pH值），具体可以为pH 10的98%的乙腈水溶液。

反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5μm，填料孔径为10-50nm，反相色谱分离柱长度为50-500mm。

有效梯度时间最低为26分钟，具体设置为：1）流动相B的起始含量为（0～5）％，终止含量为（8～10）％，梯度时间为2～5分钟；2）流动相B的起始含量为（8～10）％，终止含量为（18～25）％，梯度时间为11～14分钟；3）流动相B的起始含量为(18～25)％，终止含量为(32～45)％，梯度时间为9～12分钟；4）流动相B的起始含量为(32～45)％，终止含量为95％，梯度时间为1～4分钟；5）流动相B的含量始终为95％，梯度时间为1～4分钟；6）流动相B的起始含量为95％，终止含量为5％，梯度时间为2～5分钟；所述%表示体积百分比浓度。

所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流速为0.2-1.5mL/min，紫外检测波长为214nm。

所述步骤4）中，所述低pH短梯度反相色谱分离采用的流动相A为pH 2-5的2%乙腈水溶液（用甲酸调节pH值），流动相B为pH 2-5的98%乙腈水溶液（用甲酸调节pH值）。

反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5μm，填料孔径为10-50nm，反相色谱分离柱长度为50-500mm。流速为100-500nL/min。

根据第一维馏分的收集先后顺序，如图2所示，进行针对性梯度设置，根据步骤3）获得的馏分集先后顺序，每四个馏分分成一组，即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分，……以此类推；采用的梯度设置为：在第0-4分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量均为0，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推；在第4-25分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推；在第25-30分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推，流动相B的终止含量均为30%；所述%表示体积百分比浓度。有效梯度时间仅为30分钟。如图3所示，所述质谱鉴定系采用电喷雾质谱仪进行分析鉴定。

本发明方法的特征在于对复杂生物蛋白质组的仪器分析效率达到6-24小时内实现在假阳性率低于1％时，对6000-9000个蛋白质的分析鉴定。

附图说明

图1为本发明方法的技术路线图

图2为实施例1获得的样品的梯度设置示意图和总离子流色谱图

图3为实施例2获得的样品的总离子流色谱图

图4为实施例3获得的样品的总离子流色谱图

具体实施方式

实施例1

将Hela细胞混悬于8M尿素溶液，在冰浴上超声提取蛋白质混合物，并使用Trypsin进行酶切，得到其肽段混合物。

将从Hela细胞中提取的400μg蛋白混和物酶切后，进行一维反相色谱分离，采用的流动相A为pH 10的2%乙腈水溶液（用氨水调节pH值），流动相B为pH 10的98%乙腈水溶液（用氨水调节pH值）。Durashell反相色谱分离柱购自Agela公司，反相色谱分离柱填料粒径为5μm，填料孔径为15nm，反相色谱分离柱为4.6×250mm。梯度设置为第一梯度：流动相B的初始含量为5％，终止含量为8％，梯度时间为2分钟；第二梯度：流动相B的初始含量为8％，终止含量为18％，梯度时间为11分钟；第三梯度：流动相B的初始含量为18％，终止含量为32％，梯度时间为9分钟；第四梯度：流动相B的初始含量为32％，终止含量为95％，梯度时间为1分钟；第五梯度：流动相B的含量始终为95％，梯度时间为1分钟；第六梯度：流动相B的初始含量为95％B，终止含量为5％，梯度时间为2分钟。流速为1.5mL/min，紫外检测波长为214nm，柱温为60℃。从第2分钟开始收集馏分，共得到24个馏分。并用Savant SPD 2010真空离心干燥机（Thermo公司）对馏分进行浓缩干燥，干燥温度设置为45℃，至馏分完全干燥。上述%表示体积百分比浓度。

将获得的干燥浓缩馏分用pH 3的2%乙腈水溶液复溶后，依次进行低pH反相色谱分离-电喷雾串联质谱采集和分析。低pH反相色谱分离采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液（用甲酸调节pH值），流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液（用甲酸调节pH值）。反相色谱分离柱采用C18反相硅胶填料，反相色谱分离柱填料粒径为3μm，填径为30nm，反相色谱分离柱为75μm×150mm。流速为380nL/min。根据上述馏分的收集先后顺序，进行针对性梯度设置（如图2所示），每四个馏分分成一组，即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分，……以此类推；采用的梯度设置为：在第0-4分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量均为0，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推；在第4-25分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推；在第25-30分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推，流动相B的终止含量均为30%；上述%表示体积百分比浓度。质谱采集系统为5600Q-TOF质谱仪(美国AppliedBiosystems公司)，扫描采用数据依赖模式：进行一个全扫描(扫描范围m/z 350-1250)，选择最强的50个母离子进行二级扫描(信号阈值为120cps)。电喷雾电压1800V，正离子模式。得到的总离子流色谱图如图2所示。24个馏分经采集分析后，在假阳性率低于1％时，12小时（30分钟*24个馏分）共鉴定到8035个蛋白质。

实施例2

C57小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。将从小鼠肝脏得到的细胞核提取物混悬于8M尿素溶液，在冰浴上超声提取其蛋白质混合物，并使用Trypsin进行酶切，得到其肽段混合物。

将鼠肝细胞核提取的400μg蛋白混和物酶切后，进行一维反相色谱分离，采用的流动相A为pH 10的2%乙腈水溶液（用氨水调节pH值），流动相B为pH 10的98%乙腈水溶液（用氨水调节pH值）。Durashell反相色谱分离柱购自Agela公司，反相色谱分离柱填料粒径为5μm，填料孔径为15nm，反相色谱分离柱为4.6×250mm。梯度设置为第一梯度：流动相B的初始含量为5％，终止含量为8％，梯度时间为2分钟；第二梯度：流动相B的初始含量为8％，终止含量为18％，梯度时间为11分钟；第三梯度：流动相B的初始含量为18％，终止含量为32％，梯度时间为9分钟；第四梯度：流动相B的初始含量为32％，终止含量为95％，梯度时间为1分钟；第五梯度：流动相B的含量始终为95％，梯度时间为1分钟；第六梯度：流动相B的初始含量为95％，终止含量为5％，梯度时间为2分钟。流速为1.5mL/min，紫外检测波长为214nm，柱温为60℃。从第2分钟开始收集馏分，共得到24个馏分。并用SavantSPD 2010真空离心干燥机（Thermo公司）对馏分进行浓缩干燥，干燥温度设置为45℃，至馏分完全干燥。上述%表示体积百分比浓度。

将获得的干燥浓缩馏分用pH 3的2%乙腈水溶液复溶后，依次进行低pH反相色谱分离-电喷雾串联质谱采集和分析。低pH反相色谱分离采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液（用甲酸调节pH值），流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液（用甲酸调节pH值）。反相色谱分离柱采用C18反相硅胶填料，填料粒径为3μm，填料孔径为30nm，反相色谱分离柱为75μm×150mm。流速为300nL/min。根据上述馏分的收集先后顺序，进行针对性梯度设置，即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分，……以此类推；采用的梯度设置为：在第0-4分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量均为0，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推；在第4-25分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推；在第25-30分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推，流动相B的终止含量均为30%；上述%均表示体积百分比浓度。质谱采集系统为线性轨道离子阱质谱仪(LTQ-Orbitrap-Velos,Thermo公司)，扫描采用数据依赖模式：进行一个全扫描(扫描范围m/z 350-2000)，选择最强的20个母离子进行二级扫描(信号阈值为1000)。电喷雾电压1700V，正离子模式。得到的总离子流色谱图如图3所示。24个馏分经采集分析后，在假阳性率低于1％时，12小时（30分钟*24个馏分）共鉴定到6684个蛋白质。

实施例3

将从Hela细胞中提取的400μg蛋白混和物酶切后，进行一维反相色谱分离，采用的流动相A为pH 10的2%乙腈水溶液（用氨水调节pH值），流动相B为pH 10的98%乙腈水溶液（用氨水调节pH值）。Durashell反相色谱分离柱购自Agela公司，反相色谱分离柱填料粒径为5μm，填料孔径为15nm，反相色谱分离柱为4.6×250mm。梯度设置为第一梯度：流动相B的初始含量为5％，终止含量为8％，梯度时间为2分钟；第二梯度：流动相B的初始含量为8％，终止含量为18％，梯度时间为11分钟；第三梯度：流动相B的初始含量为18％，终止含量为32％，梯度时间为9分钟；第四梯度：流动相B的初始含量为32％，终止含量为95％，梯度时间为1分钟；第五梯度：流动相B的含量始终为95％，梯度时间为1分钟；第六梯度：流动相B的初始含量为95％B，终止含量为5％，梯度时间为2分钟。流速为1.5mL/min，紫外检测波长为214nm，柱温为60℃。从第2分钟开始收集馏分，共得到24个馏分。并用Savant SPD 2010真空离心干燥机（Thermo公司）对馏分进行浓缩干燥，干燥温度设置为45℃，至馏分完全干燥。上述%均表示体积百分比浓度。

将获得的每个干燥浓缩馏分用pH 3的2%乙腈水溶液复溶后，分为等量的两份样品，依次进行低pH反相色谱分离-电喷雾串联质谱采集和分析。低pH反相色谱分离采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液（用甲酸调节pH值），流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液（用甲酸调节pH值）。反相色谱分离柱采用C18反相硅胶填料，反相色谱分离柱填料粒径为3μm，填径为30nm，反相色谱分离柱为75μm×150mm。流速为380nL/min。根据上述馏分的收集先后顺序，进行针对性梯度设置（如图2所示），每四个馏分分成一组，即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分，……以此类推；采用的梯度设置为：在第0-4分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量均为0，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推；在第4-25分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推；在第25-30分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推，流动相B的终止含量均为30%；上述%均表示体积百分比浓度。质谱采集系统为Q Exactive质谱仪(Thermo公司)，扫描采用数据依赖模式：进行一个全扫描(扫描范围m/z 400-1400)，选择最强的75个母离子进行二级扫描(信号阈值为6300)。电喷雾电压1900V，正离子模式。得到的总离子流色谱图如图4所示。所有馏分经采集分析后，在假阳性率低于1％时，24小时（24个馏分*30分钟=12小时，重复进行一次实验）共鉴定到9032个蛋白质。

Claims

1.一种蛋白质组分离鉴定方法，其特征包括以下步骤：

1）从离体的细胞或组织中提取蛋白质混合物；

4）将步骤3）获得的干燥浓缩样本复溶后，采用低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法进行鉴定；

所述步骤3）中，所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为pH 7-12的2%的乙腈水溶液，流动相B为pH 7-12的98%的乙腈水溶液；

高温高pH短梯度反相色谱采用的梯度范围设置为：1）流动相B的起始含量为（0～5）％，终止含量为（8～10）％，梯度时间为2～5 分钟；2）流动相B的起始含量为（8～10）％，终止含量为（18～25）％，梯度时间为11～14分钟；3）流动相B的起始含量为(18～25)％，终止含量为(32～45)％，梯度时间为9～12分钟；4）流动相B的起始含量为(32～45)％，终止含量为95％，梯度时间为1～4分钟；5）流动相B的含量始终为95％，梯度时间为1～4分钟；6）流动相B的起始含量为95％，终止含量为5％，梯度时间为2～5分钟；

所述步骤4）中，所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法中低pH短梯度反相色谱采用的流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为pH 2-5的2%乙腈水溶液，流动相B为pH 2-5的98%乙腈水溶液；所述%表示体积百分比浓度；

根据步骤3）获得的馏分集先后顺序，每四个馏分分成一组，即第1-4馏分、5-8馏分、9-12馏分，……以此类推；采用的梯度设置为：在第0-4分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量均为0，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推；在第4-25分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为4%、6%、8%……以此类推，流动相B的终止含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推；在第25-30分钟的梯度时间内，流动相B的初始含量按照分组顺序依次为14％、16％、18%……以此类推，流动相B的终止含量均为30%；从第2分钟开始收集馏分，共得到24个馏分；所述%表示体积百分比浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述高温高pH短梯度反相色谱所述柱温为30℃-80℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述柱温为60℃。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流动相A为pH 10的2%的乙腈水溶液，流动相B为pH10的98%的乙腈水溶液；

所述%表示体积百分比浓度；

和/或所述步骤3）中，所述高温高pH短梯度反相色谱分离采用的流速为0.2-1.5 mL/min，紫外检测波长为214 nm。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述高温高pH短梯度反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5 μm，填料孔径为10-50 nm，反相色谱分离柱长度为50-500 mm。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述从细胞或组织中提取蛋白质混合物的提取方法为利用6-8 M尿素溶液将细胞或组织混悬后，在冰浴上超声提取蛋白质混合物。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，所述蛋白酶切方法为使用Trypsin、GluC或Lys-c中的一种或两种以上蛋白酶任意组合对蛋白质混合物进行酶切。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤4）中，所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法中低pH短梯度反相色谱采用的流动相A为pH 3的2%乙腈水溶液，流动相B为pH 3的98%乙腈水溶液；

所述%表示体积百分比浓度。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤4）中，所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法采用反相色谱分离柱填料粒径为1.9-5 μm，填料孔径为10 -50 nm，反相色谱分离柱长度为50-500 mm；

和/或，所述步骤4）中，所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法中反相色谱流速为100-500 nL/min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述低pH短梯度反相色谱-质谱联用方法使用电喷雾串联质谱技术鉴定。