CN106093244A - 一种羊特征性多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊特征性多肽及其在皮类和胶类中药羊源性成分检测中的应用，本发明所提供的特征性多肽的氨基酸序列为GFPGSDGVAGPK（3位脯氨酸羟基化），该多肽为羊皮胶原蛋白所特有。此外，本发明提供了一种羊皮的鉴别方法，包括采用胰蛋白酶处理皮，采用液相色谱‑串联质谱检测特征肽，从而鉴定皮是否是羊皮。本发明还提供了检测胶类中药中羊源性成分的方法，包括采用胰蛋白酶酶切胶类中药，使特征性多肽从胶原蛋白中游离出来，采用液相色谱‑串联质谱检测，从而判断胶类中药中是否掺入了羊源性成分。该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够准确的鉴定胶类中药中是否含有羊源成分。

Description

一种羊特征性多肽及其应用

（一）技术领域

本发明涉及检测及应用领域，特别涉及一种羊特征性多肽及其应用。

（二）背景技术

阿胶出现于先秦，至汉代已成为常用药物，具有补血益气、滋润养颜、提高机体免疫力等功能，可用于失血贫血、缺铁贫血、再生障碍贫血及年老体弱、儿童、妇女的滋补。近年来由于阿胶价格大幅度上涨，驴皮资源短缺，一些不法企业利用低价格的羊皮或者驴皮中掺入羊皮来熬制阿胶。虽然阿胶的掺假在媒体上被频频曝光，但是由于缺乏有效的掺伪的检测方法，掺假现象屡禁不止。因此非常有必要建立阿胶中非驴源性成分的专属性强、灵敏度高的检测方法，从而打击阿胶行业的掺假造假行为，保证人民群众的用药安全，促进阿胶产业的健康发展。

基于聚合酶链式反应（PCR）的DNA检测技术是食品中成分鉴定的常用方法，但是由于阿胶是经过长时间高温熬制而成，阿胶的DNA破坏严重，难以被有效的检测。胶原蛋白是动物皮类中的主要蛋白，皮类熬制的胶中含有大量胶原蛋白的多肽序列。液质联用技术测定物种特异性蛋白质的的特征肽，从而对食品药品进行物种溯源的方法已经比较成熟。已经报道很多利用液质联用方法鉴定胶类中药中的成分包括牛皮源性成分、猪皮源性成分、龟源性成分、驴源性成分、鹿源性成分，但这些方法都是通过液质联用检测不同源性胶的酶切产物，然后比较检测结果获得特征性多肽。但是由于酶切不彻底，检测到的特征性多肽可能是没有酶切完全的多肽；另外质谱扫描条件的限制不可能扫描到全部的酶切后的肽段，这样就可能造成所发现的特征性多肽并不具有特异性或者发现不了真实存在的特征性多肽。

（三）发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种羊特征性多肽及其应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种羊特征性多肽及其应用，其特征为：氨基酸序列为GFPGSDGVAGPK（3位脯氨酸羟基化）。

具体的，液质联用检测动物皮的羊源性及用于检测胶类中药中羊源性成分的内标物特征在于，氨基酸序列为GFPGSDGVAGPK（3位脯氨酸羟基化）。

具体的，所述液质联用检测动物皮的羊源性方法，包括步骤如下：将待测的皮类样品用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液加入液质联用仪，以待检测的样品为基质，加入权利2所述的内标物采用质谱MRM模式，选择母离子及其子离子对进行监测；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则鉴定该皮是羊皮。

具体的，包括驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮。

具体的，称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液（0.5MTris-HCl，2.75 mM EDTA ，0.5M Guanadine，pH8.0），进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。

具体的，将待测的胶类中药样品用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液加入液质联用仪，以待检测的胶类中药样品为基质加入权利2所述的内标物采用质谱MRM模式，选择母离子及其子离子对进行监测；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有羊源性成分。

具体的，所述的胶类中药包括驴皮胶、马皮胶、骡皮胶、牛皮胶、羊皮胶、猪皮胶。

具体的，胶类样品的处理方法为：称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。

具体的，液质联用条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25min，A 95%→80%，B5%→20%；25～40min，A 80%→50%，B 20%→50%。流速为0.3ml/min。以Waters 三重四级杆质谱仪作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 552.77（双电荷）→450.88, m/z 552.77（双电荷）→900.47作为检测离子对。

本发明通过uniprot提供的peptidemass功能模拟trypsin酶解不同物种胶原蛋白的结果，并通过将羊的胶原蛋白序列与其他物种胶原蛋白的序列比对获得羊皮胶原蛋白所特有的特征性多肽序列，并将其应用到皮类和胶类的检测或鉴定中，该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够准确的鉴定胶类中药中是否含有羊源性成分。

（四）附图说明

下面结合附图对发明作进一步的说明。

图1为羊皮处理样品中特征肽GFPGSDGVAGPK（3位羟基化）的一级质谱图；

图2 为羊皮处理样品中特征肽GFPGSDGVAGPK（3位羟基化）的二级质谱图；

（五）具体实施方式

本发明采用的仪器设备、化学试剂及实验步骤。具体如下：

Waters三重四级杆串联质谱仪，NanoLC-Ultra NanoLC-Ultra系列超高效纳升级液相色谱串联Thermo Scientific公司LTQ-Orbitrap Velos Pro高分辨质谱，碳酸氢铵，胰蛋白酶购自Sigma公司，乙腈、甲酸购自Merck公司。所有试剂均为色谱纯。

特征肽的标准品GFPGSDGVAGPK（3位羟基化）由中国上海吉尔生化有限公司合成，纯度大于98%；超纯水由Milli-Q超纯水净化系统制备获得。

皮类样品的处理方法为：

称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液（0.5MTris-HCl，2.75 mM EDTA，0.5M Guanadine，pH8.0），进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin 37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。

胶类样品的处理方法为：

称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。

nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS 的检测条件如下：

色谱条件：采用EksigentNanoLC Ultra 2D纳升液相系统分离。约1.5μg样品经0.2mmx3.5mm（5μm粒径）的ReproSil-Pur C18-AQ Trap Column脱盐富集，采用75μmx25cm（5μm粒径）的ReproSil-Pur C18-AQ纳升分析柱分离。纳升分离泵流速为300nL/min。流动相A：2%乙腈，0.1%甲酸水溶液（v/v）；流动相B：70%乙腈，0.1%甲酸水溶液（v/v）。洗脱梯度为：0-5min流动相A为300nL/min；5-20min流动相A降低到270nL/min；20-75min流动相A降低到204nL/min；75-95min流动相A降低到150nL/min；95-110min流动相A为0nL/min；110-120min流动相A为300nL/min。质谱条件：质谱系统为Thermo Scientific公司LTQ-Orbitrap VelosPro串联高分辨质谱，离子源为Nanospray Flex纳喷源。采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.1kv，离子传输毛细管温度为275℃，S-Lens传输效率为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000（m/z=400），采集范围为350-1650Th。二级质谱采用线性离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用CID模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35%。

HPLC-TQ-S MS/MS的条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25min，A 95%→80%，B 5%→20%；25～40min，A 80%→50%，B20%→50%。流速为0.3ml/min。以Waters 三重四极杆质谱作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 552.77（双电荷）→450.88, m/z 552.77（双电荷）→900.47作为检测离子对。

实施例1：

羊源性特征肽的筛选和确定：

胶原蛋白是动物真皮中的主要蛋白，因此本发明在胶原蛋白中选择合适的多肽作为羊皮胶原蛋白的特征性多肽。利用Uniport提供的PeptideMass功能模拟获得Trypsin酶解驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的结果；利用分子生物学软件MEGA5.0对驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的序列进行比对，获得一条相对于驴、马、牛、猪具有物种特异性的羊的特征性多肽，序列为GFPGSDGVAGPK。为了验证牛皮胶原蛋白的特征肽GFPGSDGVAGPK，选择了驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮，根据上文所述的样品预处理方法以及nano-LC-ESILTQ-Orbitrap MS/MS液质联用分析方法。检测结果表明，羊皮酶解产物中检测出离子m/z552.7699 (双电荷)（如图1所示），说明特征肽GFPGSDGVAGPK有一个位点发生羟基化修饰，离子m/z552.7699(双电荷)所产生的碎片离子峰与特征肽GFPGSDGVAGPK（3位脯氨酸羟基化）的理论离子碎片峰y10相吻合（如图2所示），说明羊皮样品中可以检测到特征肽GFPGSDGVAGPK（3位脯氨酸羟基化）。在驴皮、骡皮、马皮、牛皮、猪皮中特征肽GFPGSDGVAGPK（3位脯氨酸羟基化）均没有检出。以上结果可以说明GFPGSDGVAGPK（3位脯氨酸羟基化）是羊的特征肽。

利用三重四级杆液质联用对以上特征肽进行MRM参数的优化，优化后的MRM参数如表1：

表1 特征肽的MRM参数

实施例2：

多反应监测（MRM）检测皮类样品中的羊源性成分

选择了驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮，根据上文所述的样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。特征肽GFPGSDGVAGPK（3位羟基化）的一级离子和二级子离子在驴皮、马皮、骡皮、牛皮、猪皮检测不到，在羊皮中可以检测到，说明特征肽可以用于羊皮的鉴定。

实施例3：

多反应监测（MRM）检测纯品胶中的羊源性成分

胶类中药是由动物皮经过长时间的高温熬制而成，在高温熬制的过程中胶原蛋白不可避免的参与到一系列的反应中去，从而导致胶原蛋白的变性水解，为了验证本发明在检测胶类样品中羊源性成分的可行性，分别用驴皮、马皮，骡皮，牛皮，羊皮，猪皮熬制成胶。根据上文所述的胶类样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。特征肽GFPGSDGVAGPK（3位羟基化）的一级离子和二级子离子在驴皮胶、马皮胶、骡皮胶、牛皮胶、猪皮胶检测不到，在羊皮胶中可以检测到，说明特征肽GFPGSDGVAGPK（3位羟基化）是羊皮胶所特有的。

实施例4：

多反应监测（MRM）检测胶类中药中的羊源性成分；

混合胶样品由实施例3中的纯品胶混合而得分别为驴皮胶加5%（w/w）羊皮胶，骡皮胶加5%（w/w）的羊皮胶，马皮胶加5%（w/w）羊皮胶，牛皮胶加5%（w/w）羊皮胶，猪皮胶加5%（w/w）羊皮胶。根据上文所述的胶类样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。检测结果显示添加了羊皮胶的混合样品中均可以检测到特征肽GFPGSDGVAGPK（3位羟基化）。而实施例3中驴皮胶、马皮胶、骡皮胶中、牛皮胶、猪皮胶中均没有检测到相应的特征肽。因此该方法可以用来检测驴皮胶、骡皮胶、马皮胶、牛皮胶、猪皮胶中掺入的羊源性成分。

本发明不局限于上述实施方式，任何人应得知在本发明的启示下做出的与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (8)

1.一种羊特征性多肽及其应用，其特征为：氨基酸序列为GFPGSDGVAGPK（3位脯氨酸羟基化）。

2.根据权利要求1所述的一种羊特征性多肽及其应用，其特征在于：液质联用检测动物皮的羊源性及用于检测胶类中药中的羊源性成分的内标物特征在于，氨基酸序列为GFPGSDGVAGPK（3位脯氨酸羟基化）。

3.根据权利要求2所述的一种羊皮胶原蛋白特征性多肽及其应用，其特征在于：所述液质联用检测动物皮的羊源性方法，包括步骤如下：将待测的皮类样品用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液超滤后加入液质联用仪，以待检测的皮类样品为基质，加入权利2所述的内标物采用二级质谱模式，选择母离子与子离子对进行MRM检测；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则鉴定该皮是羊皮。

4.根据权利3所述的皮类样品，包括驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮。

5.根据权利要求2所述的液质联用检测胶类中药中羊源性成分的方法，其特征在于包括：将待测的胶类中药样品用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液超滤后加入液质联用仪，以待检测的胶类中药样品为基质加入权利2所述的内标物采用二级质谱模式，选择母离子与子离子对进行MRM检测；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有羊源性成分。

6.根据权利要求5所述的胶类中药包括驴皮胶、马皮胶、骡皮胶、牛皮胶、羊皮胶、猪皮胶。

7.根据权利3和权利5中所述的的液质联用条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25min，A95%→80%，B 5%→20%；25～40min，A 80%→50%，B 20%→50%，流速为0.3ml/min。

8.以质谱仪作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 552.77（双电荷）→450.88, m/z 552.77（双电荷）→900.47作为检测离子对。