CN114720601A - 三条特征性肽段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及三条特征性肽段及其应用。其氨基酸序列为GPPGPAGPA、GPPGKPGP和SGPAGPR，其中，P代表羟脯氨酸。本发明的特征性肽段能够基于高效液相色谱‑质谱联用技术定量检测牡蛎肽粉中的掺假物，具有较好的灵敏度。

Description

三条特征性肽段及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及三条特征性肽段及其应用。
背景技术
牡蛎(Oyster)素有“海洋牛奶”的美称，是我国卫生部批准的第一批具有药用价值兼保健功效的食品之一。牡蛎肽粉是以牡蛎肉为原料，经酶解、分离纯化、干燥等加工过程制成的以小分子活性肽为主，同时富含微量元素锌硒、牛磺酸、精氨酸等多种功效成分的水解产物。牡蛎肽易于被人体消化吸收且具有多种生物活性，具有提高男性血清睾酮水平、保护肝脏、增强人体免疫力、改善高血糖症状、抗肿瘤等功能。
随着消费者健康意识的提高，对功能性和营养性食品的需求增加，推动了牡蛎蛋白水解物市场的增长。然而蛋白水解物生产成本高，因此受经济利益驱使，市场上越来越多的假冒伪劣肽粉产品出现。牡蛎肽粉可能存在的掺假类型有故意添加廉价成分如明胶以提高产品的蛋白含量，过量添加加工助剂如麦芽糊精冒充糖原。此外，一种更复杂的掺假形式是以低价值原料水解制备的肽粉替代高价值的肽粉。因此亟需开发一种灵敏度高、重现性好的肽粉中特定掺假物的真伪鉴别方法。
特征性肽段的挖掘是蛋白质组学技术的经典应用之一，不仅可以用来定性，还可以用来精准定量。多反应监测(MRM)是基于三重四极杆串联质谱的一种灵敏度高的靶向扫描方式，在MRM扫描的同时可以数据依赖地触发增强子离子扫描，能够大大减小定性检测的假阳性率，提高鉴定结果的准确度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是蛋白水解物生产成本高，因此受经济利益驱使，市场上越来越多的假冒伪劣肽粉产品出现，亟需开发一种灵敏度高、重现性好的肽粉中特定掺假物的真伪鉴别方法。
为解决上述问题，本发明旨在提供三条用于检测牡蛎肽粉中掺假物明胶的特征性肽段，以及建立一种基于该三条特征性肽段的质谱多反应监测(MRM)定量牡蛎肽粉中掺假物含量的方法。
三条特征性肽段，其氨基酸序列为GPPGPAGPA、GPPGKPGP和SGPAGPR，其中，P代表羟脯氨酸。
上述三条特征性肽段在定量检测牡蛎肽粉中掺假物中的应用。上述三条肽段来源于猪、牛、鸡、鱼等动物的胶原蛋白，不存在于牡蛎的蛋白中。明胶是利用猪、牛、鸡以及鱼等动物的皮、骨、筋、腱等结缔组织中的胶原通过变性降解加工而成。因此，上述三条肽段可作为牡蛎肽粉中明胶掺假物的特征性肽段。
上述三条特征性肽段的筛选方法，包括以下步骤：
(1)利用胰蛋白酶对掺假牡蛎肽粉样品进行酶解；
(2)步骤(1)酶解得到的多肽样品通过LC-MS/MS高通量鉴定肽段序列；
(3)进行质谱数据分析，筛选出掺假牡蛎肽粉中非牡蛎蛋白来源的特征性肽段。
表1牡蛎肽粉中掺假物定量检测的特征性肽段
Figure BDA0003591668880000021
注：P代表羟脯氨酸。
用上述方法筛选出的肽段特异性强，仅存在于非牡蛎来源的胶原蛋白中。
进一步的，步骤(1)为将牡蛎肽粉用碳酸氢铵溶液配制成肽粉溶液，取样品溶液，加入胰蛋白酶，37℃酶解8-24h。随后添加乙腈，离心，过微孔滤膜，取上清液干燥，用TFA溶液复溶。将牡蛎肽粉在该反应条件下进行酶解后，可以使掺假明胶进一步水解成合适长度和酶切位点的肽段，从而有效保障特异性掺假肽段的筛选和检出。
进一步的，步骤(2)LC-MS/MS仪器参数设置如下：
色谱条件：流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为乙腈溶液，色谱柱为C18柱；液相的梯度洗脱程序：5％-100％B；
质谱条件：ESI离子源；离子化方式：正离子模式；数据采集方式：Full MS-ddMS2；质荷比(m/z)扫描范围：300至1500；碰撞能量：20-40％。
以上参数可以保障牡蛎及掺假明胶酶解肽段的有效检出，提高肽段的检出效率，从而获得更为丰富的牡蛎和掺假明胶来源肽段，进一步保障特异性掺假肽段的筛选和检出。
进一步的，步骤(3)包括：
采用Proteome Discoverer软件或类似软件进行搜库，Proteome Discoverer软件检索参数设置如下：最多允许漏切位点数为2个；前体离子的容差范围设置为10ppm；碎片离子的容差范围设定为0.02Da；
从肽段中筛选出掺假牡蛎肽粉中存在的其它物种蛋白来源的特征性肽段。使用Proteome Discoverer软件检查特征性肽段在掺假样品中的丰度，最终筛选出三条高丰度的特征性肽段作为掺假标志物。所筛选三条特征性掺假肽段在上述检测条件下均表现为较高的丰度，从而可以提高掺假物的检出限。
一种基于上述三条特征性肽段的质谱多反应监测(MRM)定量牡蛎肽粉中掺假物的方法，是采用高效液相色谱串联三重四级杆对筛选的肽段进行相对定量分析，在LC-QQQ上建立的一种定量牡蛎肽粉中掺假物的方法，包括下列步骤：
(1)液相色谱-三重四级杆质谱MRM参数的优化；
(2)绘制混合肽段标准品的标准曲线，分别计算三条特征性肽段的定量限及检测限；
(3)依据标准曲线，定量检测牡蛎肽中掺假特征性肽段的含量。
通过优化MRM参数条件，可以保障三条特征性掺假肽段的有效检出，提高三条特征性掺假肽段的信噪比和检出限；在此基础上通过分别绘制三条特征性掺假肽段的标准曲线，可以获得牡蛎肽中掺假特征肽段的含量。
进一步的，步骤(1)液相色谱-三重四级杆质谱优化MRM参数时的条件如下：
流动相A为0.1％的甲酸-水溶液，流动相B为0.1％的甲酸-乙腈溶液；优化由母离子与子离子组成的离子对信息，优化后的参数如下表2。依据本条件中所列的三条特征性肽段的母离子-子离子离子对信息，可以实现三条特征性肽段的特异性检出，不受其他肽段的干扰，同时，本条件中所列的离子对响应高且稳定性强，从而可以保障牡蛎肽中掺假物的有效检出。
表2牡蛎肽粉中掺假物定量检测的离子对列表
Figure BDA0003591668880000031
注：*表示定量离子，其余为定性离子。
进一步的，步骤(2)为将人工合成的三条特征肽段配制成不同质量浓度的特征肽段混合标准溶液，以特征肽段的峰面积为纵坐标，肽段混合物的质量浓度为横坐标绘制线性标准曲线；分别以信噪比为3和10时所对应的多肽浓度作为方法的检出限和定量限。
具体为配制8个不同质量浓度的特征肽段混合标准溶液，分别为10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL，以特征肽段的峰面积(y)为纵坐标，肽段混合物的质量浓度(x,μg/mL)为横坐标绘制线性标准曲线。每个浓度的特征肽段混合标准溶液检测三个平行。
进一步的，步骤(3)为对掺假牡蛎肽进行LC-MRM-MS/MS分析，并根据标准曲线计算样品中三条特征性肽段的含量。分析参数如下：色谱柱C18分析柱。流动相A为0.1％甲酸-水溶液，流动相B为0.1％甲酸-乙腈溶液。流动相洗脱梯度为：5-90％B。在这个条件下，三条特征性肽段既可以同时检出，且相互之间不存在干扰，从而有效保障牡蛎肽中三条特征性掺假肽段的检出和定量。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过高分辨质谱筛选得到的三条特征性肽段，可以实现牡蛎肽粉中明胶掺假的定量检测，为牡蛎肽粉的掺假鉴定及产品质量控制提供检测技术支持。
(2)本发明提供的检测方法具有灵敏度高、特异性强的优点。该方法的检测限低，检测结果准确，对于掺假低含量明胶的牡蛎肽粉样本也能较好的检出。
附图说明
图1是掺假牡蛎肽粉中的蛋白分布情况和掺假蛋白来源情况。
图2是三条特征肽段的标准曲线图。
图3是掺假牡蛎肽粉样品1中三条特征肽段的MRM提取色谱图。
图4是掺假牡蛎肽粉样品2中三条特征肽段的MRM提取色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：牡蛎肽粉掺假物特征肽段的筛选
1)样品的酶解：选取10个掺假牡蛎肽粉样品，分别用碳酸氢铵溶液(pH 8.0)配成2mg/mL浓度肽粉溶液；取0.1mL样品溶液，加入胰蛋白酶5μL，37℃酶解16h；加入0.6mL乙腈，12000r/min离心20min，过微孔滤膜，取上清液。
2)样品的检测：样品经LC-MS/MS高分辨率质谱分析。
3)使用采用Proteome Discoverer软件进行检索，Proteome Discoverer软件检索参数设置如下：最多允许漏切位点数为2个,前体离子的容差范围设置为10ppm；碎片离子的容差范围设定为0.02Da。
4)利用韦恩图分析掺假牡蛎肽中的特征性蛋白，如图1所示，图1-B显示10个掺假牡蛎肽粉中鱼来源的特征性蛋白有85条；鸡来源的特征性蛋白有9条；猪来源的特征性蛋白有8条；牛来源的特征性蛋白有3条。
5)在鉴定到的肽段中筛选出掺假牡蛎肽粉中存在的其它物种蛋白来源的特征性肽段。使用Proteome Discoverer软件筛选得到可用于牡蛎肽粉中掺假物定量检测的三条特征性肽段：SGPAGPR、GPPGPAGPA、GPPGKPGP，其中P代表羟脯氨酸。
实施例2：混合肽段的标准曲线绘制
运用液相色谱-三重四级杆质谱测定10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL等不同浓度的混合肽段标准品，得到三条特征肽段的标准曲线，如表3所示，三条特征肽段线性关系良好，相关性系数(R2)均达到0.99以上。分别以信噪比(S/N)为3和10时所计算得到的多肽浓度作为方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。特征性肽段GPPGKPGP的LOD和LOQ分别为0.02μg/mL和0.05μg/mL；特征性肽段SGPAGPR的LOD和LOQ分别为0.01μg/mL和0.04μg/mL；特征性肽段GPPGPAGPA的LOD和LOQ分别为0.01μg/mL和0.03μg/mL。三条特征肽段标准曲线可用于牡蛎肽粉样品中掺假物的定量分析。
表3三条掺假物特征肽段的线性方程、相关系数、检出限及定量限
Figure BDA0003591668880000051
注：P代表羟脯氨酸。
对已知的掺假明胶牡蛎肽样品进行检测：
实施例3：牡蛎肽粉样品中掺假物的定量检测
将掺假牡蛎肽粉样品进行LC-QQQ-MS/MS测定，三条特征性肽段GPPGPAGPA、GPPGKPGP和SGPAGPR在样品中均能检出。根据特征性肽段的标准曲线计算掺假牡蛎肽粉中掺假物的含量，结果如表4所示，掺假样品中三条特征性肽段的含量分别为0.17±0μg/mL、0.40±0.03μg/mL、0.26±0.03μg/mL，均高于检出限和定量限，并且掺假样品中肽段SGPAGPR的含量高于另外两条肽段。因此这三条特征性肽段可用于牡蛎肽粉中掺假物的鉴定。
表4掺假牡蛎肽粉样品中掺假物特征性肽段的含量
Figure BDA0003591668880000061
注：P代表羟脯氨酸。
实施例4：牡蛎肽粉样品中掺假物的定量检测
将掺假牡蛎肽粉样品进行LC-QQQ-MS/MS测定，三条特征性肽段GPPGPAGPA、GPPGKPGP和SGPAGPR在样品中均能检出。根据特征性肽段的标准曲线计算掺假牡蛎肽粉中掺假物的含量，结果如表4所示，掺假样品中三条特征性肽段的含量分别为0.17±0μg/mL、0.40±0.03μg/mL、0.26±0.03μg/mL，均高于检出限和定量限，并且掺假样品中肽段SGPAGPR的含量高于另外两条肽段。因此这三条特征性肽段可用于牡蛎肽粉中掺假物的鉴定。
实施例5牡蛎肽粉样品中掺假物的定量检测
将掺假牡蛎肽粉样品进行LC-QQQ-MS/MS测定，三条特征性肽段GPPGPAGPA、GPPGKPGP和SGPAGPR在样品中均能检出。根据特征性肽段的标准曲线计算掺假牡蛎肽粉中掺假物的含量，结果如表4所示，掺假样品中三条特征性肽段的含量分别为0.17±0μg/mL、0.47±0.02μg/mL、0.34±0.01μg/mL，均高于检出限和定量限，并且掺假样品中肽段SGPAGPR的含量高于另外两条肽段。因此这三条特征性肽段可用于牡蛎肽粉中掺假物的鉴定。
需要说明的是，虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员根据发明的基本思想，可以对本发明进行种修改和改进。只要不脱离本发明的基本思想，均应当在本发明的保护范围内。
Figure BDA0003591668880000071
Figure BDA0003591668880000081
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 三条特征性肽段及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 6-9 stands for Hyp
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 1
Gly Pro Xaa Gly Pro Ala Gly Pro Ala
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(9)
<223> The 'Xaa' at location 6-9 stands for Hyp
<220>
<221> UNSURE
<222> (19)..(21)
<223> The 'Xaa' at location 19-21 stands for Hyp
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 2
Gly Pro Xaa Gly Lys Xaa Gly Pro
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 3
Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg
1 5

Claims (10)

1.三条特征性肽段，其氨基酸序列为GPPGPAGPA、GPPGKPGP和SGPAGPR，其中，P代表羟脯氨酸。
2.权利要求1中三条特征性肽段在定量检测牡蛎肽粉中掺假物中的应用。
3.权利要求1中三条特征性肽段的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)利用胰蛋白酶对掺假牡蛎肽粉样品进行酶解；
(2)步骤(1)酶解得到的多肽样品通过LC-MS/MS高通量鉴定肽段序列；
(3)进行质谱数据分析，筛选出掺假牡蛎肽粉中非牡蛎蛋白来源的特征性肽段。
4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：步骤(1)为将牡蛎肽粉用碳酸氢铵溶液配制成肽粉溶液，取样品溶液，加入胰蛋白酶，37℃酶解8-24h。随后添加乙腈，离心，过微孔滤膜，取上清液干燥，用TFA溶液复溶。
5.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：步骤(2)LC-MS/MS仪器参数设置如下：
色谱条件：流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为乙腈溶液，色谱柱为C18柱；液相的梯度洗脱程序：5％-100％B；
质谱条件：ESI离子源；离子化方式：正离子模式；数据采集方式：Full MS-ddMS2；
质荷比(m/z)扫描范围：300至1500；碰撞能量：20-40％。
6.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：步骤(3)包括：
采用Proteome Discoverer软件或类似软件进行搜库，Proteome Discoverer软件检索参数设置如下：最多允许漏切位点数为2个；前体离子的容差范围设置为10ppm；碎片离子的容差范围设定为0.02Da；
从肽段中筛选出掺假牡蛎肽粉中存在的其它物种蛋白来源的特征性肽段。使用Proteome Discoverer软件检查特征性肽段在掺假样品中的丰度，最终筛选出三条高丰度的特征性肽段作为掺假标志物。
7.一种基于权利要求1的三条特征性肽段的质谱多反应监测(MRM)定量牡蛎肽粉中掺假物的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)液相色谱-三重四级杆质谱MRM参数的优化；
(2)绘制混合肽段标准品的标准曲线，分别计算三条特征性肽段的定量限及检测限；
(3)依据标准曲线，定量检测牡蛎肽中掺假特征性肽段的含量。
8.如权利要求7所述的定量牡蛎肽粉中掺假物的方法，其特征在于：步骤(1)液相色谱-三重四级杆质谱优化MRM参数时的条件如下：
流动相A为0.1％的甲酸-水溶液，流动相B为0.1％的甲酸-乙腈溶液；优化由母离子与子离子组成的离子对信息，优化后的参数如下表：
牡蛎肽粉中掺假物定量检测的离子对列表
Figure FDA0003591668870000021
注：*表示定量离子，其余为定性离子。
9.如权利要求7所述的定量牡蛎肽粉中掺假物的方法，其特征在于：步骤(2)为将人工合成的三条特征肽段配制成不同质量浓度的特征肽段混合标准溶液，以特征肽段的峰面积为纵坐标，肽段混合物的质量浓度为横坐标绘制线性标准曲线；分别以信噪比为3和10时所对应的多肽浓度作为方法的检出限和定量限。
10.如权利要求7所述的定量牡蛎肽粉中掺假物的方法，其特征在于：步骤(3)为对掺假牡蛎肽进行LC-MRM-MS/MS分析，并根据标准曲线计算样品中三条特征性肽段的含量；分析参数如下：色谱柱C18分析柱。流动相A为0.1％甲酸-水溶液，流动相B为0.1％甲酸-乙腈溶液。流动相洗脱梯度为：5-90％B。
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