CN112816287A - 一种磷酸化蛋白质富集和分析方法 - Google Patents

一种磷酸化蛋白质富集和分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112816287A
CN112816287A CN202110015072.3A CN202110015072A CN112816287A CN 112816287 A CN112816287 A CN 112816287A CN 202110015072 A CN202110015072 A CN 202110015072A CN 112816287 A CN112816287 A CN 112816287A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enrichment
phosphorylated
analysis
certain
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202110015072.3A
Other languages
English (en)
Inventor
姚亚婷
范崇远
张潇
刘兵洁
江秉华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University
Original Assignee
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN202110015072.3A priority Critical patent/CN112816287A/zh
Publication of CN112816287A publication Critical patent/CN112816287A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其具体步骤包括：制备一定浓度含镉离子Cd2+的水溶液，其浓度记为C1；向一定体积V2的蛋白质混合物中加入一定体积V1的含镉离子Cd2+水溶液，使溶液中Cd2+的终浓度为C2；将上述混合溶液在一定温度T下孵育一定时间t，以使沉淀完全；通过一定方式分离并收集沉淀；洗涤沉淀；溶解沉淀，得到磷酸化蛋白质溶液；和通过一定的检测方法分析上述得到的磷酸化蛋白质溶液的组成。该方法是在蛋白质层次实现磷酸化蛋白质的高选择性富集，其受含有天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)等酸性氨基酸的非磷酸化肽段的干扰较小，操作简单，省时省力，为复杂样品的磷酸化蛋白质组分析提供新的思路和技术支持。

Description

一种磷酸化蛋白质富集和分析方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种磷酸化蛋白质富集和分析方法。
背景技术
作为最常见和最重要的翻译后修饰之一，蛋白质的磷酸化参与和调控包括信号转导、基因表达、细胞周期等几乎所有的生物过程。异常的磷酸化修饰与许多疾病过程息息相关，例如恶性肿瘤等。为了系统性地理解复杂多变的细胞行为，深入研究蛋白质磷酸化已经成为了蛋白质组学研究的重要任务。
由于磷酸化修饰的高度动态范围、磷酸化蛋白质的低丰度以及磷酸化肽段较差的离子化效率，对磷酸化蛋白质组学样品进行高特异性的富集是至关重要的一步。当前发展的高效富集方法如固定金属离子亲和色谱法IMAC、MOAC等多是基于肽段层次的富集，但是这些方法的上样和洗脱条件比较苛刻，分别是在强酸和强碱的条件下，容易造成蛋白质的降解，从而在一定程度上限制了它们在蛋白质层次上的应用。
有研究表明，Ca2+可以在磷酸根存在的条件下通过共沉淀的方法从复杂体系中分离出磷酸化肽段/蛋白，但是Ca2+沉淀的方式和IMAC方法一样，容易受到含有天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)等酸性氨基酸的非磷酸化肽段的干扰。Cd2+和Ca2+具有相似的物理化学性质，二者相近的离子半径和电荷/半径比率决定了Cd2+和Ca2+一样对生物大分子具有比较强的静电引力，另外有研究发现Cd2+比Ca2+更容易靶向一些磷酸酶如PPM1A的M1位点的活性，我们推测Cd2+比Ca2+更适合作为一种磷酸化蛋白质沉淀剂来实现蛋白质层次的磷酸化富集。因此本发明基于Cd2+对磷酸根的高选择性发展一种蛋白质层次的磷酸化富集新方法，为复杂样品的磷酸化蛋白质组分析提供新的思路和技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质层次的磷酸化蛋白质富集和分析方法，为复杂样品的磷酸化蛋白质组分析提供新的思路和技术支持。
一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备一定浓度含镉离子Cd2+的水溶液，其浓度记为C1；
(2)向一定体积V2的蛋白质混合物中加入一定体积V1的含镉离子Cd2+的水溶液，使溶液中Cd2+的终浓度为C2；
(3)将上述混合溶液在一定温度T下孵育一定时间t，以使沉淀完全；
(4)通过一定方式分离并收集沉淀；
(5)洗涤沉淀；
(6)溶解沉淀，得到磷酸化蛋白质溶液；和
(7)通过一定的检测方法分析上述得到的磷酸化蛋白质溶液的组成。
步骤(1)中所述含镉离子Cd2+的水溶液，其阴离子包括但不限于Cl-、SO4 2-等。
步骤(2)中所述蛋白质混合物，是用缓冲溶液溶解商品化的蛋白质或从细胞、组织中提取的蛋白质而获得。
步骤(1)所述C1优选为10～1000mM。
步骤(2)所述C2优选为0.1～100mM。
步骤(3)所述一定温度T优选为：0～100℃，所述一定时间t优选为5～60min。
步骤(4)所述的一定方式，包括但不限于离心、静置、过滤等。
步骤(5)所述的洗涤沉淀其具体操作方式如下：
a.加入细胞裂解液，涡旋震荡后离心分离弃去上层清液，得到沉淀；
b.加入10mM 2,5-二羟基苯甲酸水溶液，涡旋震荡后离心分离弃去上层清液，得到沉淀；
c.加入0.9％NaCl水溶液，涡旋震荡后离心分离弃去上层清液，得到沉淀。
步骤(6)所述的溶解沉淀，其所用的溶液应根据具体的分析手段而确定。
步骤(7)所述检测方法包括但不限于质谱检测、SDS-PAGE和Western Blotting检测等。
所述细胞裂解液包括：缓冲溶液、(非离子型、离子型)表面活性剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂中的一种或几种。
该发明是在蛋白质层次实现磷酸化蛋白质的高选择性富集，其受含有天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)等酸性氨基酸的非磷酸化肽段的干扰较小，操作简单，省时省力，为复杂样品的磷酸化蛋白质组分析提供新的思路和技术支持。
附图说明
本发明的上述及其它方面和特征将从以下结合附图对实施例的说明清楚呈现，其中：
图1为本发明所述的磷酸化蛋白质富集和分析方法的流程示意图；
图2显示采用图1所示的流程所获得的蛋白质SDS-PAGE结果图。
具体实施方式
下面参照附图详细描述本发明的说明性、非限制性实施例，对根据本发明的磷酸化蛋白质富集和分析方法进行进一步说明。
一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其流程示意图如图1所示，所述方法包括以下步骤：
(1)制备一定浓度含镉离子Cd2+的水溶液，其浓度记为C1；
所述含镉离子Cd2+的水溶液，其阴离子包括但不限于Cl-、SO4 2-、NO3 -等；
所述C1优选为10～1000mM。
(2)向一定体积V2的蛋白质混合物中加入一定体积V1的含镉离子Cd2+的水溶液，使溶液中Cd2+的终浓度为C2；
所述蛋白质混合物，是用细胞裂解液溶解商品化的蛋白质或从细胞、组织中提取的蛋白质而获得；
所述C2优选为0.1～100mM。
(3)将上述混合溶液在一定温度T下孵育一定时间t，以使沉淀完全；
所述一定温度T优选为：0～100℃，所述一定时间t优选为5～60min。
(4)通过一定方式分离并收集沉淀；
所述的一定方式，包括但不限于离心、静置、过滤等。
(5)洗涤沉淀；
所述的洗涤沉淀其具体操作方式如下：a.加入细胞裂解液，涡旋震荡后离心分离弃去上层清液，得到沉淀；b.加入10mM 2,5-二羟基苯甲酸水溶液，涡旋震荡后离心分离弃去上层清液，得到沉淀；c.加入0.9％NaCl水溶液，涡旋震荡后离心分离弃去上层清液，得到沉淀。
(6)溶解沉淀，得到磷酸化蛋白质溶液；
所述的溶解沉淀，其所用的溶液应根据具体的分析手段而确定。和
(7)通过一定的检测方法分析上述得到的磷酸化蛋白质溶液的组成；
所述检测方法包括但不限于质谱检测、SDS-PAGE和Western Blotting检测等。
所述细胞裂解液包括：缓冲溶液、(非离子型、离子型)表面活性剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂中的一种或几种。
实施例一：
制备浓度为100mM的CdCl2溶液；
将商品化的BSA、α-casein、β-casein按物质的量比为5：1：1或10:1:1溶解于细胞裂解液(PBS(pH 7.4)+0.4％NP-40+1％蛋白酶抑制剂)中获得蛋白质混合物；
将一定体积的CdCl2溶液加入上述蛋白质混合物，使得Cd2+的终浓度为3mM；
将上述混合溶液在25℃下孵育20min，使沉淀完全；
通过离心的方式分离出沉淀；
分别用细胞裂解液、10mM 2,5-二羟基苯甲酸水溶液和0.9％NaCl水溶液洗涤沉淀。
实施例二：
使用含有90％50mM HEPES(pH 7.4)和10％loading buffer的溶液将实施例一中所述沉淀溶解得到磷酸化蛋白质溶液，选择SDS-PAGE的检测方法对所得到的磷酸化蛋白质溶液进行分析。
上述步骤得到的SDS-PAGE结果如图2所示，没有加入Cd2+水溶液的蛋白质混合物中是BSA、α-casein、β-casein三种蛋白质，加入Cd2+孵育后，对得到沉淀进行洗涤和溶解，可以看出与未处理的样品中非磷酸化蛋白质BSA占的比例非常大相比，沉淀中BSA的干扰非常小，大部分都是磷酸化蛋白质α-casein和β-casein。
由此说明，该方法可以高效富集并分析磷酸化蛋白质。
尽管对本发明的示例性实施例进行了说明，但是显然本领域技术人员可以理解，在不背离本发明的精神和原理的情况下可以对这些实施例进行改变，本发明的保护范围在权利要求书及其等效形式中进行了限定。

Claims (11)

1.一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备一定浓度含镉离子Cd2+的水溶液，其浓度记为C1；
(2)向一定体积V2的蛋白质混合物中加入一定体积V1的含镉离子Cd2+的水溶液，使溶液中Cd2+的终浓度为C2；
(3)将上述混合溶液在一定温度T下孵育一定时间t，以使沉淀完全；
(4)通过一定方式分离并收集沉淀；
(5)洗涤沉淀；
(6)溶解沉淀，得到磷酸化蛋白质溶液；和
(7)通过一定的检测方法分析上述得到的磷酸化蛋白质溶液的组成。
2.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，步骤(1)中所述含镉离子Cd2+的水溶液，其阴离子包括但不限于Cl-、SO4 2-、NO3 -等。
3.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述蛋白质混合物，是用细胞裂解液溶解商品化的蛋白质或从细胞、组织中提取的蛋白质而获得。
4.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，步骤(1)所述C1优选为10～1000mM。
5.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，步骤(2)所述C2优选为0.1～100mM。
6.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，步骤(3)所述一定温度T优选为：0～100℃，所述一定时间t优选为5～60min。
7.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，步骤(4)所述的一定方式，包括但不限于离心、静置、过滤等。
8.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，步骤(5)所述的洗涤沉淀其具体操作方式如下：
a.加入细胞裂解液，涡旋震荡后离心分离弃去上层清液，得到沉淀；
b.加入10mM 2,5-二羟基苯甲酸水溶液，涡旋震荡后离心分离弃去上层清液，得到沉淀；
c.加入0.9％NaCl水溶液，涡旋震荡后离心分离弃去上层清液，得到沉淀。
9.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，步骤(6)所述的溶解沉淀，其所用的溶液应根据具体的分析手段而确定。
10.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，步骤(7)所述检测方法包括但不限于质谱检测、SDS-PAGE和Western Blotting检测等。
11.根据权利要求3和8所述的一种磷酸化蛋白质富集和分析方法，其特征在于，所述细胞裂解液包括：缓冲溶液、(非离子型、离子型)表面活性剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂中的一种或几种。
CN202110015072.3A 2021-01-06 2021-01-06 一种磷酸化蛋白质富集和分析方法 Withdrawn CN112816287A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110015072.3A CN112816287A (zh) 2021-01-06 2021-01-06 一种磷酸化蛋白质富集和分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110015072.3A CN112816287A (zh) 2021-01-06 2021-01-06 一种磷酸化蛋白质富集和分析方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112816287A true CN112816287A (zh) 2021-05-18

Family

ID=75857979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110015072.3A Withdrawn CN112816287A (zh) 2021-01-06 2021-01-06 一种磷酸化蛋白质富集和分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112816287A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115356421A (zh) * 2022-08-12 2022-11-18 嘉华药锐科技(北京)有限公司 富集和测试酪氨酸磷酸化肽段的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115356421A (zh) * 2022-08-12 2022-11-18 嘉华药锐科技(北京)有限公司 富集和测试酪氨酸磷酸化肽段的方法
CN115356421B (zh) * 2022-08-12 2023-05-30 嘉华药锐科技(北京)有限公司 富集和测试酪氨酸磷酸化肽段的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210033505A1 (en) Methods of membrane-based proteomic sample preparation
JP2010133971A (ja) リン酸化タンパク質のプロテオーム解析方法
Mahboob et al. Is isolation of comprehensive human plasma peptidomes an achievable quest?
Hedrick et al. Digestion, purification, and enrichment of protein samples for mass spectrometry
EP1346229A2 (en) Inverse labeling method for the rapid identification of marker/target proteins
AU2002240866A1 (en) Inverse labeling method for the rapid identification of marker/target proteins
JP2024113021A (ja) 無傷のタンパク質レベルでのＬＣ－ＭＳに基づくＨｂＡ１ｃ測定の自動化試料ワークフロー
CN113777178A (zh) 基于混合谱图库的蛋白质组学背景库、其构建方法及应用
Boschetti et al. Combinatorial peptides: A library that continuously probes low‐abundance proteins
CN112816287A (zh) 一种磷酸化蛋白质富集和分析方法
EP1748297B1 (en) Method for analysing naturally occuring peptides and small proteins using mass spectrometry
Fertin et al. Strategy for purification and mass spectrometry identification of SELDI peaks corresponding to low-abundance plasma and serum proteins
Wang et al. Sample preparation for the analysis of membrane proteomes by mass spectrometry
Štěpánová et al. CE–MS Approaches for Peptidomics
Liu et al. Development of the C12Im-Cl-assisted method for rapid sample preparation in proteomic application
Bellei et al. Optimizing protein recovery yield from serum samples treated with beads technology
US20180188263A1 (en) Method for Analyzing Posttranslational Modifications Using GEL IEF and Mass Spectrometry
JP6742235B2 (ja) 質量分析を用いたタンパク質の検出方法
Ross Identification of histidine phosphorylations in proteins using mass spectrometry and affinity‐based techniques
JP2022517413A (ja) ＬＣ－ＭＳに基づくＨｂＡ１ｃ測定の高速試料ワークフロー
CN111024867A (zh) 一类基于稳定同位素的高通量蛋白质组学定量试剂
Cheon et al. Low-molecular-weight plasma proteome analysis using top-down mass spectrometry
Li et al. Highly efficient enrichment of intact phosphoproteins by a cadmium ion‐based co‐precipitation strategy
WO2024127796A1 (ja) ペプチド含有試料の調製方法
Hao et al. Application of electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography to the characterization of proteome, glycoproteome, and phosphoproteome using nano LC–MS/MS

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20210518