CN110346479A - 一种牡蛎内源肽的提取和鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明主要公开一种牡蛎内源肽的提取和鉴定方法。该方法根据肽组学技术对牡蛎进行前处理并提取牡蛎中的内源肽,获得待测多肽滤液;通过超高相液相色谱‑质谱法测定所获得的多肽滤液;对得到的质谱数据进行在线数据库比对,鉴定肽段;通过合成部分肽段并使用液相色谱‑三重四级杆质谱建立的多反应监测分析方法,验证肽段序列的正确性以及用做常规液质分析的适用性。本发明针对性的提出牡蛎内源肽的提取与鉴定方法,并首次利用质谱技术分离鉴定了多种牡蛎内源性肽,完善了牡蛎天然物质数据库,为牡蛎内源肽的进一步研究提供了基础。
Description
技术领域
本发明属于食品科学领域,具体涉及一种基于质谱技术鉴定牡蛎内源肽的方法。
背景技术
牡蛎, 属软体动物门, 瓣鳃纲, 牡蛎目, 牡蛎科。是世界上第一大养殖贝类,也是我国四大养殖贝类之一,资源丰富,有着很高的经济地位。牡蛎肉肥爽滑,味道鲜美,营养丰富,素有“海洋牛奶”之美称。同时,也是一种营养价值高的天然保健食品。从历史上看,牡蛎在中国是一种古老的食品,我国祖先很早就认识到牡蛎的营养和药用价值。唐代就有牡蛎肉可生津、解乏、滋补的记载。明代李时珍的《本草纲目》记载牡蛎肉“多食之,能细洁皮肤,补肾壮阳,并能治虚,解丹毒”。它作为一味中药,具有敛阴谦阳、止汗、涩精、化痰软坚的作用。牡蛎肉治热病伤津烦热失眠,妇人血亏,生食治丹毒。现代医学还认为牡蛎肉具有降血压和滋阴养血的功能。从营养和药学角度上看, 牡蛎含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙、铁、磷、碘、维生素、氨基酸和牛磺酸等多种成分。其氨基酸组成完善,这些氨基酸多以游离形式存在于牡蛎的组织和器官中,具有重要的生理活性。牡蛎含脂类虽少,但多为具有生理活性的复合磷脂、磷酸肌醇、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等。这些成分都有防止动脉硬化、抗血栓以及抗衰老作用,并有增强免疫功能和防癌作用。因为牡蛎含有的多种生理活性成分,其在营养及药用方面也存在巨大潜在价值,我国卫生部已批准将牡蛎列为第一批既是食品又可作为药材的保健疗效品。
生物活性肽也是牡蛎一种重要的活性物质,但关于牡蛎生物活性肽的研究尚不完善。牡蛎生物活性肽分为两大类,一类是自然存在于牡蛎生物中的活性肽,另一类是牡蛎蛋白质酶解产生的活性肽。两大类生物活性肽都具有不同的生理活性,例如易消化吸收(比氨基酸、蛋白质易吸收)、抗肿瘤、抗氧化、抑制衰老、降血压、降胆固醇、促进伤口愈合及免疫调节等。经过酶解产生的外源肽,目前研究主要有ACE抑制肽、抗菌肽、抗氧化肽、抗肿瘤肽和神经肽等等,对其制备和功能活性等的研究较为成熟。例如,抗肿瘤肽,李鹏等从牡蛎匀浆液中分离得到的小分子活性肽可以明显抑制胃腺癌和肺腺癌细胞的生长和分裂增殖,使癌细胞形态发生改变,失去原有的恶性表型,细胞周期检测出现凋亡峰等。但由于天然贝类活性肽的含量较低,提取纯化等较难,鲜有研究,且业界对牡蛎内源肽普遍重视不够,对于天然肽的结构尚未有明确鉴定。
随着高分辨质谱制造技术的成熟,高分辨质谱制造在分析性能方面有了突破性提升,可以在高分辨率甚至超高分辨率、高质量准确度的条件下,进行全质荷比范围无间隔扫描采集,理论上实现了对监测质荷比范围内的所有组分进行分析,像一条“条形码阅读器”一样提供被分析对象的指纹信息,而相关数据处理软件的研发升级,提高了数据处理能力,进一步提高了对未知样品的鉴定能力。但目前尚未有利用高分辨质谱的手段对牡蛎的内源肽进行检测与鉴定。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为克服现有技术的不足,本发明提供一种从牡蛎中提取与鉴定内源肽的方法。
为达到上述目的,本发明的具体技术方案是:
一种牡蛎内源肽的提取和鉴定方法,包括如下步骤:
(1) 对牡蛎进行前处理并提取牡蛎中的内源肽,获得待测多肽滤液;
(2) 通过超高相液相色谱-质谱法测定所获得的多肽滤液;
(3) 对步骤(2)得到的质谱数据进行比对处理,鉴定肽段;
(4)通过合成部分肽段并使用液相色谱-三重四级杆质谱建立的多反应监测分析方法,验证肽段序列的正确性以及用做常规液质分析的适用性。
在上述检测内源肽的方法中,所述的步骤(1)质谱前处理包括如下步骤:
(1) 牡蛎去壳取可食部位进行液氮速冻后均质,并将粉末装入离心管中,灭酶,待用;向灭酶后的牡蛎粉末样品加入碳酸氢铵溶液,比例为:1g:1~5ml,4℃15000 r/min离心15min,收集上清,得肽粗提液;
(2)向上述肽粗提液中加入1mol/L的二硫基苏糖醇(Dithiothreotol,DTT),体积比为1:200,60℃ 水浴振摇反应30 min,然后冷却至室温;
(3)向上述溶液中加入现配的1 mol/L碘代乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)溶液,体积比为1:20,室温避光反应1 h;
(4)将上述提取液使用固相萃取小柱脱盐处理;
(5)对除盐后的溶液进行冻干处理,得到肽段;
(6)冻干后的粉末状样品复溶;
(7)在进一步上机分析之前,将反应液转移到超滤膜的离心管,室温8000 r/min 超滤离心20 min,收集下层的肽段滤液,待上机检测。
在上述步骤(2)检测内源肽的方法中,所述的质谱法检测为:采用AB SCIEXTripleTOF® 5600检测。
进一步的,上述步骤(3)使用ProteinPilot软件,检索NCBI中牡蛎的蛋白数据库,对质谱检测结果进行比对分析。
进一步的,在上述步骤(4)验证内源肽结构的方法中,所述的质谱法检测为:采用AB SCIEX 5500三重四级杆检测。
本发明的技术效果和优点:
本发明针对性的提出牡蛎内源肽的提取与鉴定方法,并首次利用质谱技术分离鉴定了多种牡蛎内源肽,完善了牡蛎天然物质数据库,为牡蛎内源肽的进一步研究提供了基础。
附图说明
图1, 本发明实施例1中牡蛎有代表性的总离子流色谱图。
图2, 本发明实施例2中牡蛎有代表性的总离子流色谱图。
图3, 本发明实施例3中牡蛎有代表性的总离子流色谱图。
图4, 本发明实施例4中牡蛎有代表性的总离子流色谱图。
图5, SSSTGEVGTYSGTTN合成肽段质谱图。
图6, SSSTGEVGTYSGTTN在牡蛎样品中质谱图。
图7, TARNEANVNI合成肽段质谱图。
图8, TARNEANVNI在牡蛎样品中质谱图。
图9, VGIIKGSSSEEA合成肽段质谱图。
图10, VGIIKGSSSEEA在牡蛎样品中质谱图。
图11, TARNEANVNIY合成肽段质谱图。
图12, TARNEANVNIY在牡蛎样品中质谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例并结合附图对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例 1一种基于肽组学技术从牡蛎中提取与鉴定内源肽的方法:
(一) 样品信息:
牡蛎采集于山东省荣成市某养殖场,冰藏条件下当日运至实验室,对新鲜的牡蛎进行处理。
(二)样本前处理步骤:
(1) 牡蛎去壳取可食部位进行液氮速冻后均质,称取均质成粉末状态的牡蛎样品5g,95℃加热灭酶10min,加入25ml的碳酸氢铵溶液, 4℃15000 r/min离心15 min,收集上清,得肽粗提液;
(2)取1 mol/L的二硫基苏糖醇(Dithiothreotol,DTT)125µL加入到上述蛋白溶液中,60℃ 水浴振摇反应30 min,然后冷却至室温;
(3)取1 mol/L现配的碘代乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)溶液1250µL,室温避光反应1h;
(4)将上述溶液使用固相萃取小柱除盐;
(5)在进一步上机分析之前,将反应液转移到配有10 kDa 超滤膜的离心管(Millipore,爱尔兰)中,室温8000 r/min 超滤离心20 min,收集下层的肽段滤液,待上机检测;
(三)上机检测:
采用AB SCIEX TripleTOF® 5600检测,
流动相A:0.1% 甲酸-水,流动相B:0.1%甲酸-乙腈,流速:0.25mL/min,
梯度洗脱:
时间 | A | B |
0 | 95% | 5% |
2 | 95% | 5% |
27 | 80% | 35% |
37 | 65% | 95% |
39 | 20% | 95% |
42 | 20% | 5% |
46 | 95% | 5% |
TOF扫描范围:350-1500Da,
正离子反应模式,GS1:35,GS2:45,Curtain Gas:35,ISVF:5500,TEM:500,DP:100,CE:10。
图1为例1该条件下的总离子流色谱图,显示了质谱峰的保留时间及离子强度等信息,从图中可以看出响应值差,该条件不适合肽段鉴定。
(四)肽段鉴定:
使用ProteinPilot软件,检索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)牡蛎的蛋白数据库。主要鉴定参数设置如下:半胱氨酸(Cys)烷基化试剂:Iodoacetic acid;水解酶:None;允许生物学修饰和氨基酸替代;搜索设置:Thorough ID;可信阈值:Unused Protscore(Conf)>1.3(95%);假阳性错误率(False Discovery Rate,FDR):<1%。
肽段鉴定结果如表1所示。
表1肽段鉴定结果
蛋白鉴定数目 | 肽段鉴定数目 | |
例1 | 0 | 0 |
例2 | 34 | 206 |
例3 | 134 | 696 |
例4 | 605 | 8526 |
实施例 2 一种基于肽组学技术从牡蛎中提取与鉴定内源肽的方法
(一) 样品信息:
牡蛎采集于山东省荣成市某养殖场,冰藏条件下当日运至实验室,对新鲜的牡蛎进行处理。
(二)样本前处理步骤:
(1) 牡蛎去壳取可食部位进行液氮速冻后均质,称取均质成粉末状态的牡蛎样品5g,95℃加热灭酶10min,加入10ml的碳酸氢铵溶液4℃15000 r/min离心15 min,收集上清,得肽粗提液;
(2)取1 mol/L的二硫基苏糖醇(Dithiothreotol,DTT)50µL加入到上述蛋白溶液中,60℃ 水浴振摇反应30 min,然后冷却至室温;
(3)取1 mol/L现配的碘代乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)溶液500µL,室温避光反应1h;
(4)将上述溶液使用固相萃取小柱除盐;
(5)在进一步上机分析之前,将反应液转移到配有10 kDa 超滤膜的离心管(Millipore,爱尔兰)中,室温8000 r/min 超滤离心20 min,收集下层的肽段滤液,待上机检测;
(三)上机检测:
采用AB SCIEX TripleTOF® 5600检测,
流动相A:0.1% 甲酸-水,流动相B:0.1%甲酸-乙腈,流速:0.25mL/min,
梯度洗脱:
时间 | A | B |
0 | 95% | 5% |
2 | 95% | 5% |
27 | 80% | 35% |
37 | 65% | 95% |
39 | 20% | 95% |
42 | 20% | 5% |
46 | 95% | 5% |
TOF扫描范围:350-1500Da,
正离子反应模式,GS1:35,GS2:45,Curtain Gas:35,ISVF:5500,TEM:500,DP:100,CE:10。
图2为例2该条件下的总离子流色谱图,显示了质谱峰的保留时间及离子强度等信息,从图中可以看出响应值差,该条件不适合肽段鉴定。
(四)肽段鉴定:
使用ProteinPilot软件,检索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)牡蛎的蛋白数据库。主要鉴定参数设置如下:半胱氨酸(Cys)烷基化试剂:Iodoacetic acid;水解酶:None;允许生物学修饰和氨基酸替代;搜索设置:Thorough ID;可信阈值:Unused Protscore(Conf)>1.3(95%);假阳性错误率(False Discovery Rate,FDR):<1%。
肽段鉴定结果如表1所示。
实施例 3 一种基于肽组学技术从牡蛎中提取与鉴定内源肽的方法:
(一) 样品信息:
牡蛎采集于山东省荣成市某养殖场,冰藏条件下当日运至实验室,对新鲜的牡蛎进行处理。
(二)样本前处理步骤:
(1) 牡蛎去壳取可食部位进行液氮速冻后均质,称取均质成粉末状态的牡蛎样品20g,95℃加热灭酶10min,加入20ml的碳酸氢铵溶液4℃15000 r/min离心15 min,收集上清,得肽粗提液;
(2)取1 mol/L的二硫基苏糖醇(Dithiothreotol,DTT)100µL加入到上述蛋白溶液中,60℃ 水浴振摇反应30 min,然后冷却至室温;
(3)取1 mol/L现配的碘代乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)溶液1000µL,室温避光反应1h;
(4)将上述溶液使用固相萃取小柱除盐;
(5)在进一步上机分析之前,将反应液转移到配有10 kDa 超滤膜的离心管(Millipore,爱尔兰)中,室温8000 r/min 超滤离心20 min,收集下层的肽段滤液,待上机检测;
(三)上机检测:
采用AB SCIEX TripleTOF® 5600检测,
流动相A:0.1% 甲酸-水,流动相B:0.1%甲酸-乙腈,流速:0.25mL/min,
梯度洗脱:
时间 | A | B |
0 | 95% | 5% |
2 | 95% | 5% |
27 | 80% | 35% |
37 | 65% | 95% |
39 | 20% | 95% |
42 | 20% | 5% |
46 | 95% | 5% |
TOF扫描范围:350-1500Da,
正离子反应模式,GS1:35,GS2:45,Curtain Gas:35,ISVF:5500,TEM:500,DP:100,CE:10。
图3为例3该条件下的总离子流色谱图,显示了质谱峰的保留时间及离子强度等信息,从图中可以谱峰的响应值较之前有所提高。
(四)肽段鉴定:
使用ProteinPilot软件,检索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)牡蛎的蛋白数据库。主要鉴定参数设置如下:半胱氨酸(Cys)烷基化试剂:Iodoacetic acid;水解酶:None;允许生物学修饰和氨基酸替代;搜索设置:Thorough ID;可信阈值:Unused Protscore(Conf)>1.3(95%);假阳性错误率(False Discovery Rate,FDR):<1%。
肽段鉴定结果如表1所示。
实施例 4 一种基于肽组学技术从牡蛎中提取与鉴定内源肽的方法:
(一) 样品信息:
牡蛎采集于山东省荣成市某养殖场,冰藏条件下当日运至实验室,对新鲜的牡蛎进行处理。
(二)样本前处理步骤:
(1) 牡蛎去壳取可食部位进行液氮速冻后均质,称取均质成粉末状态的牡蛎样品20g,95℃加热灭酶10min,加入20ml的碳酸氢铵溶液4℃15000 r/min离心15 min,收集上清,得肽粗提液;
(2)取1 mol/L的二硫基苏糖醇(Dithiothreotol,DTT)100µL加入到上述蛋白溶液中,60℃ 水浴振摇反应30 min,然后冷却至室温;
(3)取1 mol/L现配的碘代乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)溶液1000µL,室温避光反应1h;
(4)将上述溶液使用固相萃取小柱除盐;
(5)对除盐后的溶液进行冻干处理;
(6)对冻干后粉末复溶到200µL;
(7)在进一步上机分析之前,将反应液转移到配有10 kDa 超滤膜的离心管中,室温8000 r/min 超滤离心20 min,收集下层的肽段滤液,待上机检测;
(三)上机检测:
采用AB SCIEX TripleTOF® 5600检测,
流动相A:0.1% 甲酸-水,流动相B:0.1%甲酸-乙腈,流速:0.25mL/min,
梯度洗脱:
时间 | A | B |
0 | 95% | 5% |
2 | 95% | 5% |
27 | 80% | 35% |
37 | 65% | 95% |
39 | 20% | 95% |
42 | 20% | 5% |
46 | 95% | 5% |
TOF扫描范围:350-1500Da,
正离子反应模式,GS1:35,GS2:45,Curtain Gas:35,ISVF:5500,TEM:500,DP:100,CE:10。
图4为例4该条件下的总离子流色谱图,图中显示了质谱峰的保留时间及离子强度等信息,从图中可以看出谱峰比较尖锐,峰形较为对称,样本的保留时间重现性好,分析系统稳定性好,这为后续分析打下了良好的基础。
(四) 肽段鉴定:
使用ProteinPilot软件,检索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)牡蛎的蛋白数据库。主要鉴定参数设置如下:半胱氨酸(Cys)烷基化试剂:Iodoacetic acid;水解酶:None;允许生物学修饰和氨基酸替代;搜索设置:Thorough ID;可信阈值:Unused Protscore(Conf)>1.3(95%);假阳性错误率(False Discovery Rate,FDR):<1%。
肽段鉴定结果如表1所示。
实施例 5 实际样品验证
(一)样品信息:
样品来源于市场上随机购买的牡蛎。
(二)样本前处理步骤:
(1)牡蛎分别去壳取可食部位进行液氮速冻后均质,称取均质成粉末状态的牡蛎样品20g,95℃加热灭酶10min,加入20ml的碳酸氢铵溶液4℃15000 r/min离心15 min,收集上清,得肽粗提液;
(2)取1 mol/L的二硫基苏糖醇(Dithiothreotol,DTT)100µL加入到上述蛋白溶液中,60℃ 水浴振摇反应30 min,然后冷却至室温;
(3)取1 mol/L现配的碘代乙酰胺(Iodoacetamide,IAA)溶液1000µL,室温避光反应1h;
(4)将上述溶液使用固相萃取小柱除盐;
(5)对除盐后的溶液进行冻干处理;
(6)对冻干后粉末复溶到200μL;
(7)在进一步上机分析之前,将反应液转移到配有10 kDa 超滤膜的离心管中,室温8000 r/min 超滤离心20 min,收集下层的肽段滤液,待上机检测;
(三)上机检测:
采用AB SCIEX 5500 三重四级杆检测,
流动相A:0.1% 甲酸-水,流动相B:0.1%甲酸-乙腈,流速:0.35 mL/min,梯度洗脱:
时间 | A | B |
0 | 95% | 5% |
0.5 | 95% | 5% |
17 | 65% | 35% |
17.5 | 5% | 95% |
20 | 5% | 95% |
20.1 | 95% | 5% |
25 | 95% | 5% |
电喷雾离子源,正离子反应模式,检测方式:MRM,喷雾电压:5500V,离子传输管温度:475℃;鞘气压力:40;辅助气压力:6。
经过质谱分析,牡蛎样品中多肽质谱分析结果如图6,8,10,12。图6是多肽SSSTGEVGTYSGTTN在牡蛎样品中质谱图;图8是多肽TARNEANVNI在牡蛎样品中质谱图;图10是多肽VGIIKGSSSEEA在牡蛎样品中质谱图,图12是多肽TARNEANVNIY在牡蛎样品中质谱图。
实施例 6 合成肽段质谱检测步骤:
(一)经第三方公司合成部分肽段,所述多肽对应的m/z值及子离子分别为:
肽段1:SSSTGEVGTYSGTTN ;
肽段2:TARNEANVNI ;
肽段3:VGIIKGSSSEEA ;
肽段4:TARNEANVNIY ;
(二)将粉末状肽段复溶,在进一步上机分析之前,将反应液转移到配有10 kDa 超滤膜的离心管中,室温8000 r/min 超滤离心20 min,收集下层的肽段滤液,待上机检测;
(三)上机检测:
采用AB SCIEX 5500 三重四级杆检测,
流动相A:0.1% 甲酸-水,流动相B:0.1%甲酸-乙腈,流速:0.35 mL/min,梯度洗脱:
时间 | A | B |
0 | 95% | 5% |
0.5 | 95% | 5% |
17 | 65% | 35% |
17.5 | 5% | 95% |
20 | 5% | 95% |
20.1 | 95% | 5% |
25 | 95% | 5% |
电喷雾离子源,正离子反应模式,检测方式:MRM,喷雾电压:5500V,离子传输管温度:475℃;鞘气压力:40;辅助气压力:6。
经过质谱分析,合成多肽质谱分析结果如图5,7,9,11。图5是合成多肽SSSTGEVGTYSGTTN质谱图;图8是合成多肽TARNEANVNI质谱图;图9是合成多肽VGIIKGSSSEEA质谱图,图11是合成多肽TARNEANVNIY质谱图。
将待测样品的质谱结果对比所述合成多肽的标准质谱谱图,可以看出合成肽段与样品中上述肽段保留时间、离子比率均位于鉴定分析的容许范围内,可以说明该肽段的序列鉴定结果的正确性。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种牡蛎内源肽的提取和鉴定方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
对牡蛎进行前处理并提取牡蛎中的内源肽,获得待测多肽滤液;
通过超高相液相色谱-质谱法测定所获得的多肽滤液;
对步骤(2)得到的质谱数据进行在线数据库比对,鉴定肽段;
通过合成部分肽段并使用液相色谱-三重四级杆质谱建立的多反应监测分析方法,验证肽段序列的正确性以及用做常规液质分析的适用性。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤(1)前处理包括如下步骤:
(1) 牡蛎去壳取可食部位进行液氮速冻后均质,灭酶,待用;向灭酶后的牡蛎粉末样品加入碳酸氢铵溶液,离心,收集上清,得肽粗提液;
(2)向上述肽粗提液中加入二硫基苏糖醇,水浴振摇反应,然后冷却至室温;
(3)向步骤(2)反应后的溶液中加入碘代乙酰胺溶液,室温避光反应;
(4)将步骤(3)反应后的溶液使用固相萃取小柱脱盐处理;
(5)对除盐后的溶液进行冻干处理,得到肽段;
(6)冻干后的粉末状样品复溶;
(7)在进一步上机分析之前,将反应液转移到超滤膜的离心管,超滤离心,收集下层的待测多肽滤液,待上机检测。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在上述步骤(2)中超高相液相色谱-质谱法采用AB SCIEX TripleTOF® 5600检测。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,上述步骤(3)使用ProteinPilot软件,检索NCBI中牡蛎的蛋白数据库,对质谱检测结果进行比对分析。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,上述步骤(4)验证内源肽结构的方法中,所述的质谱法检测为:采用AB SCIEX 5500三重四级杆检测。
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