CN113252814A - 一种大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法 - Google Patents

一种大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，采用蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解；基于LC‑MS/MS分析进行蛋白水解物中多肽结构的鉴定；基于I‑TASSER在线建模服务器进行苦味受体同源建模并验证其可靠性；利用DS软件进行配体构建、LibDock对接及CROCKER对接，精确得到苦味肽；人工合成苦味肽；苦味肽的感官评价，并确定其阈值。本发明通过质谱技术、分子模拟技术及感官评价筛选出大豆分离蛋白水解物中的苦味肽，通过分析多肽‑苦味受体间的相互作用模式和对接构象来筛选苦味肽，克服了传统的分离纯化的复杂性，节约了人力，物力以及时间，为大豆分离蛋白水解物中苦味肽的筛选提供一个新方法。

Description

一种大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，属于分析检测技术领域。
背景技术
苦味肽是风味肽的一种，主要来源于产品的发酵、老化过程或食物的水解过程。苦味肽一般由几个带有疏水侧链的氨基酸组成，这些疏水性基团通常隐藏在蛋白质的内部，通过酶解暴露出来后与苦味受体相互作用进而产生苦味。苦味肽中的疏水性氨基酸通常有3种，分别为亮氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。关于多肽疏水性与苦味形成之间的联系，目前广泛采纳的是Ney提出的著名假设Q规则。Q值是多肽的平均疏水性，被定义为氨基酸侧链从乙醇溶液转移至水中其自由能改变量的总和与氨基酸残基数量的比值。根据肽段的氨基酸序列和氨基酸侧链基团的疏水性，可以计算出多肽的平均疏水性，从而预判它们是否产生苦味。当多肽的平均疏水性高于5855J/mol时，会产生苦味；而低于5436J/mol时，肽没有苦味：介于5855-5436J/mol之间时，是否具有苦味要视情况而定。
味觉从味觉活性分子(物质)与位于细胞膜水平上味蕾上的专门受体之间的相互作用开始。一旦发生相互作用，味觉受体细胞就能够将化学刺激的信息变为神经信号传递到大脑。我们之所以可以尝出苦味，是因为在舌头表面密集着许多小的突起，在每个凸起的表面长着由味觉受体细胞(taste receptors cell,TRCs)形成的味蕾。人类G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCRs)是目前人类基因组中最大的跨膜受体，已知的受体约有800个。苦味受体与甜味、鲜味这三种味觉受体同属于G蛋白偶联大家族，分别被T2Rs受体、T1R2/T1R3异源二聚体、T1R1/T1R3异源二聚体所识别。近年来国内外研究者关于苦味肽的鉴定方法较多，但都较为繁琐。而综合利用仪器分析及计算机计算，通过分析多肽-苦味受体间的相互作用模式和对接构象来筛选苦味肽，很大程度上节约了人力，物力以及时间，为大豆蛋白水解物中苦味肽的筛选提供一个新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何通过LC-MS/MS分析得到大豆蛋白水解物中的小肽；以及如何通过分子模拟技术快速筛选出蛋白水解物中的苦味肽。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1)：采用蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解；
步骤2)：基于LC-MS/MS分析进行蛋白水解物中多肽结构的鉴定；
步骤3)：基于I-TASSER在线建模服务器进行苦味受体同源建模并验证其可靠性；
步骤4)：利用DS软件进行配体构建，受体与配体的前期准备；
步骤5)：利用DS软件进行LibDock对接，筛选苦味肽；
步骤6)：利用DS软件进行CROCKER对接，精确得到苦味肽；
步骤7)：苦味肽的人工合成；
步骤8)：苦味肽的感官评价，并确定其阈值。
优选地，所述步骤1)具体为：质量浓度为5-10％的大豆分离蛋白溶液，搅拌均匀，在90-95℃下灭酶5-10min，冷却至40-65℃，用氢氧化钠将pH值调节至6-10，加入蛋白酶，酶解2-4h，然后调节pH值至6-7、温度为50-55℃，加入风味蛋白酶(安占美风味蛋白酶FF104)，继续酶解3-5h，90-95℃下灭酶5-10min，8000r/min下离心，取上清液备用冷冻干燥成粉末，密封保存。
优选地，所述步骤1)的蛋白酶为木瓜蛋白酶或碱性蛋白酶。
优选地，所述步骤2)具体为：每例样品取肽段使用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统进行色谱分离；缓冲液包括A液：0.1wt％甲酸水溶液、B液：0.1wt％甲酸、乙腈及水，其中，乙腈的质量浓度为80％；色谱柱以100％的A液平衡，样品进样到Trap Column(100μm×20mm，5μm，C18，Dr.Maisch GmbH)后经过色谱分析柱(75μm×150mm，3μm，C18，Dr.MaischGmbH)进行梯度分离，流速为300NL/min；液相分离梯度如下：0分钟-2分钟，B液线性梯度从2％到8％；2分钟-42分钟，B液线性梯度从8％到28％；42分钟-50分钟，B液线性梯度从28％到40％；50分钟-51分钟，B液线性梯度从40％到100％；51分钟-60分钟，B液维持在100％；肽段分离后用Q-Exactive HF-X质谱仪(Thermo Scientific)进行DDA(数据依赖采集)质谱分析，分析时长为60min，检测模式：正离子，母离子扫描范围：300-1500m/z，一级质谱分辨率：60,000@m/z 200，AGC target：3e6，一级Maximum IT：50ms；肽段二级质谱分析按照下列方法采集：
每次全扫描后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱(MS2 scan)，二级质谱分辨率：15,000@m/z 200，AGC target:1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2ActivationType:HCD，Isolation window：1.6m/z，Normalized collision energy：28。
优选地，所述步骤3)具体为：首先在uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中，对苦味受体目标序列进行搜索，将目标蛋白质的序列Blast格式导入I-TASSER在线建模服务器(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)进行建模。
优选地，所述步骤4)具体为：新建一个Molecule Window，在Build and EditProtein工作中按配体氨基酸序列点击相应氨基酸进行配体构建；将同源建模得到的hT2R1受体导入DS软件中，利用最小化模块(Minimization)对模型结构进行能量最小化处理，能量优化所使用的力场是CHARMm36力场，设置优化算法为Smart Minimizer，受体与配体步数分别为10000、20000步。
优选地，所述步骤5)具体为：在Libdock对接程序中输入预处理后的配体结构、受体蛋白、活性域坐标与范围等信息；LibDock对接的参数为Number of Hotspots设为100；Docking Tolerance设为0.25，其余参数均为默认。
优选地，所述步骤6)具体为：在CDOCKER对接程序中输入预处理后的配体结构、受体蛋白、活性域坐标与范围等信息；CDOCKER对接的参数设置为Top Hits设置为100；TopHits下Pose Cluster Radius设置为0.5，其余设置为默认。
优选地，所述步骤8)具体为：将合成的短肽按体积比逐步稀释，感官评价员采用三点检验法在常温下对每个稀释水平进行鉴评，直到某个稀释倍数时尝不到该滋味为止，记录此时的稀释倍数，即稀释因子；每个评价员做三次平行试验，最终结果取各个鉴评员评定结果的平均值，评定结果之间的差异应低于或等于一个稀释水平。
本发明基于LC-MS/MS分析结合Uniprot Protein Database数据库鉴定出10肽以下的短肽2856条；基于I-TASSER在线建模服务器进行苦味受体同源建模；利用DiscoveryStudio软件将苦味受体的同源性建模与小肽进行LibDock分子对接快速筛选苦味肽，得到52条；将筛选出来的苦味肽再进行CDOCKER精确对接得到蛋白水解物中苦味肽46条。选取其中FAPEF肽对其进行合成后通过感官评价验证，得到此苦味肽的阈值为0.082mmol/L。本发明通过质谱技术、分子模拟技术及感官评价筛选出大豆分离蛋白水解物中的苦味肽，通过分析多肽-苦味受体间的相互作用模式和对接构象来筛选苦味肽，克服了传统的分离纯化的复杂性，节约了人力，物力以及时间，为大豆分离蛋白水解物中苦味肽的筛选提供一个新方法。
附图说明
图1为大豆水解物质谱Base peak图；
图2为I-TASSER选用模板与苦味受体T2R1目标序列的对比结果图；
图3为苦味受体hT2R1的同源模型图；
图4为苦味受体hT2R1的同源模型拉氏图；
图5为准备对接的苦味受体hT2R1图；
图6为肽FAPEF与苦味受体hT2R1 3D对接构象图；
图7为肽FAPEF与苦味受体hT2R1 2D对接构象；
图8为肽FAPEF的质谱图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例
一种大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1)大豆分离蛋白的酶解
底物浓度为6％的大豆分离蛋白溶液，搅拌均匀，在95℃下灭酶5min，冷却至50℃，用6M氢氧化钠将pH值调节至8，加入碱性蛋白酶(诺维信2.4L碱性蛋白酶A0021)，58℃酶解3h，然后调节pH值至6.5、温度为50℃，加入风味蛋白酶(安占美风味蛋白酶FF104)，继续酶解4h，95℃下灭酶5min，8000r/min下离心15min，取上清液备用冷冻干燥成粉末，密封保存。
步骤2)：基于LC-MS/MS分析进行蛋白水解物中多肽结构鉴定
取部分样品置于EP管中，加入200μL 0.1％三氟乙酸(Trifluoroacetic Acid,TFA)复溶完全，并用TFA原液将样品酸化。酸化后的肽段使用C18 Stage Tip脱盐，真空干燥，以备LC-MS分析。
每例样品取适量肽段使用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统(ThermoScientific)进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1wt％甲酸水溶液，B液为0.1wt％甲酸、乙腈和水混合溶液(其中乙腈为80％)。色谱柱以100％的A液平衡。样品进样到Trap Column(100μm×20mm，5μm，C18，Dr.Maisch GmbH)后经过色谱分析柱(75μm×150mm，3μm，C18，Dr.MaischGmbH)进行梯度分离，流速为300NL/min。液相分离梯度如下：0分钟-2分钟，B液线性梯度从2％到8％；2分钟-42分钟，B液线性梯度从8％到28％；42分钟-50分钟，B液线性梯度从28％到40％；50分钟-51分钟，B液线性梯度从40％到100％；51分钟-60分钟，B液维持在100％。肽段分离后用Q-Exactive HF-X质谱仪(Thermo Scientific)进行DDA(数据依赖采集)质谱分析。分析时长为60min，检测模式：正离子，母离子扫描范围：300-1500m/z，一级质谱分辨率：60,000@m/z 200，AGC target：3e6，一级Maximum IT：50ms。肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱(MS2scan)，二级质谱分辨率：15,000@m/z 200，AGC target:1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2 ActivationType:HCD，Isolation window：1.6m/z，Normalized collision energy：28。
采用的质谱数据库检索软件为MaxQuant1.6.1.0；使用蛋白质数据库来源于Uniprot Protein Database，物种为Glycine max(大豆)，共85014条蛋白质序列，下载于2020年7月13日。其中MaxQuant搜库软件分析参数设置为Min.peptide length：2、Max.peptide mass[Da]：1500、Min.peptide length for：2、Max.peptide length for：8、Precursor Tolerance(Main search)：4.5ppm、Precursor Tolerance(First search)：20ppm、MS/MS Tolerance：20ppm、Fixed modifications：Carbamidomethyl(C)、Variablemodifications：Oxidation(M),Acetyl(Protein N-term)、Database：uniprot-Glycinemax-85014-20200713、Database pattern：Target-Reverse和PSM FDR：0.01。
结合图1质谱图结果以及质谱数据库总共检测出了2856条10肽以下的短肽。
步骤2)：基于I-TASSER在线建模服务器进行苦味受体hT2R1同源建模并验证其可靠性
在uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中对hT2R1目标序列进行搜索，将目标蛋白质的序列Blast格式导入I-TASSER在线建模服务器(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)进行建模。如图2所示，根据提交的苦味受体序列，I-TASSER共选择了7个模板(4djhA，6me2A，6d26，5zbh，4bv0A，6m9tA和6bd4A)进行序列对比，I-TASSER切割出模板中一致性较高的片段并对其进行结构预测，然后组装成完整的苦味受体模型。如图3所示，hT2R1模型由7根氨基酸螺旋构成，螺旋中央的空隙处存在较大空腔。
通过TM-Score和拉氏图评价分数评价所建hT2R1模型的质量。其中I-TASSER使用TM-Score来评价建模质量，TM-Score＞0.5则代表模型与天然蛋白质结构较为相似。根据拉氏图可知所建模型中构象不合理的氨基酸残基占比，越少则模型质量越高，hT2R1同源模型的TM-Score为0.69±0.12＞0.5，hT2R1的拉氏图如图4所示，有91.0％的氨基酸残基处于合理区域，8％处于允许区域，1％处于异常区域，处于较高水平，证明大部分氨基酸残基处于合理构象，模型可靠性较高。
步骤4)：配体构建及配体受体前期准备
新建一个Molecule Window，在Build and Edit Protein工作中按配体氨基酸序列点击相应氨基酸进行配体构建。将同源建模得到的hT2R1受体导入DS软件中，利用最小化模块(Minimization)对模型结构进行能量最小化处理，能量优化所使用的力场是CHARMm36力场，设置优化算法为Smart Minimizer，受体与配体步数分别为10000和20000步。
使用Define Selected Molecule as Receptor功能将hT2R1受体蛋白模型定义为受体，然后以Define and Edit Binding Site功能来确定结合位点的位置，最后以DefineSphere from Selection功能在位点上定义活性域，确定分子对接发生的范围。如图5所示，红色球体区域是hT2R1受体蛋白的结合腔，绿色部分是结合腔内的活性位点。
步骤5)：利用DS软件进行LibDock对接，快速筛选苦味肽
在Libdock对接程序中输入预处理后的配体结构、受体蛋白、活性域坐标与范围等信息。LibDock对接的参数为Number of Hotspots设为100；Docking Tolerance设为0.25，其余参数均为默认。
总共对接成功52个配体，将其整理到一张Molecule Window上。
步骤6)：利用DS软件进行CROCKER对接，精确得到苦味肽
在CDOCKER对接程序中输入预处理后的配体结构、受体蛋白、活性域坐标与范围等信息。CDOCKER对接的参数设置为Top Hits设置为100；Top Hits下Pose Cluster Radius设置为0.5，其余设置默认。
CDOCKER采用能量匹配原则来评价配体与受体间的结合能力，计算出受体与配体间结合能的绝对值(-CDOCKER Interaction Energy，IE)，IE数值越大，说明受体-配体对接体系在对接过程中越稳定，配体对受体有更强的结合能力，总共对接成功52个配体，打分最高的配体FPAEF与受体hT2R1对接构象如图6、图7所示。选择其中一种配体FPAEF进行人工合成，验证其是否具有苦味。
步骤7)：肽FPAEF人工合成
取Fmoc-Phe-Wang Resin(取代度约0.3mmol/g，共约3.3mmol反应位点)11g，用DCM溶胀20分钟。加3倍树脂体积的20wt％Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，抽干。脱除Fmoc基团得到H2N-Phe-Wang Resin。2倍树脂体积的DMF洗涤5次上一步骤的树脂。取9.9mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH氨基酸，6.6mmol DIPEA，6.1mmol HBTU。适量溶剂DMF反应30分钟。得到Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-Wang Resin。氨基酸：DIPEA:树脂＝3：2：1.85(摩尔比)2倍树脂体积的DMF洗涤3次上一步骤的树脂。加3倍树脂体积的20％Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，抽干。脱除Fmoc基团得到H2N-Glu(OtBu)-Phe-Wang Resin。2倍树脂体积的DMF洗涤5次上一步骤的树脂。重复上述步骤，得到H2N-Phe-Ala-Pro-Glu(OtBu)-Phe-Wang Resin。甲醇洗涤树脂3次，并抽干树脂。(为切割做好准备)切割：6倍树脂体积的切割液(97.5％TFA+2.5％H2O)，摇床摇晃2小时，过滤掉树脂，用无水乙醚沉淀滤液，并用无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小时，得到粗品H2N-Phe-Ala-Pro-Glu-Phe-OH。
用高效液相色谱对粗肽产物进行分离纯化。色谱条件：采用ZORBAX SB-C18(4.6×250MM，5μm)制备柱；检测波长220nm；流动相A为0.1％三氟醋酸的乙腈溶液，流动相B为0.1％三氟醋酸的水溶液；流速1mL/min。收集溶液，脱去乙腈后，再对其冷冻干燥脱除残留溶剂，制得纯肽。
纯肽的质谱图鉴定结果如图8所示，验证得到纯肽的序列为Phe-Ala-Pro-Glu-Phe。
步骤8)：短肽FPAEF感官评价
为了对样品的苦味进行科学的感官评价，参考ISO 8589-2007标准，感官实验在标准感官实验室进行(上海应用技术大学感官实验室)。选取20名人员组成感官小组(10名男性和10名女性，年龄20-30岁)，这个小组接受6小时的培训，包括在2周内进行的3次2小时的培训。
培训环节如下：
(1)根据苦味对应的参照物来训练感官小组，使小组成员熟悉苦味属性且达成共识，苦-硫酸奎宁水溶液；
(2)感官小组对不同浓度参照物感官评定，使其对强度达成共识，以0、2.9×10-3、5.8×10-3、1.2×10-2、2.4×10-2mmol/L硫酸奎宁作为参比溶液，通过5点强度等级从1到5评估苦味强度；“1”表示无，“5”表示最强。
培训结束后，感官小组在感官实验室对样品的苦味进行感官评定。将合成的FAPEF短肽按体积比逐步稀释，感官评价员(20人，10男10女)采用三点检验法在常温下对每个稀释水平进行鉴评，感官评价员评价前用蒸馏水漱口，将2-3mL样品液含在口中10s，让样品溶液能够充分分散于整个口腔，吐掉后用蒸馏水漱口进行评定，直到某个稀释倍数时尝不到苦味为止。记录此时的稀释倍数，即稀释因子。每个评价员做三次平行试验，最终结果取各个鉴评员评定结果的平均值，评定结果之间的差异应低于或等于一个稀释水平。
结果如表1所示。
表1感官评价结果
Figure BDA0003082669930000081
Figure BDA0003082669930000091
由如表1可见，当FAPEF稀释到0.025mg/mL时尝不到苦味，最终计算出苦味肽FAPEF的阈值为0.082mmol/L。

Claims (9)

1.一种大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：采用蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解；
步骤2)：基于LC-MS/MS分析进行蛋白水解物中多肽结构的鉴定；
步骤3)：基于I-TASSER在线建模服务器进行苦味受体同源建模并验证其可靠性；
步骤4)：利用DS软件进行配体构建，受体与配体的前期准备；
步骤5)：利用DS软件进行LibDock对接，筛选苦味肽；
步骤6)：利用DS软件进行CROCKER对接，精确得到苦味肽；
步骤7)：苦味肽的人工合成；
步骤8)：苦味肽的感官评价，并确定其阈值。
2.如权利要求1所述的大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：质量浓度为5-10％的大豆分离蛋白溶液，搅拌均匀，在90-95℃下灭酶5-10min，冷却至40-65℃，用氢氧化钠将pH值调节至6-10，加入蛋白酶，酶解2-4h，然后调节pH值至6-7、温度为50-55℃，加入风味蛋白酶，继续酶解3-5h，90-95℃下灭酶5-10min，8000r/min下离心，取上清液备用冷冻干燥成粉末，密封保存。
3.如权利要求1所述的大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)的蛋白酶为木瓜蛋白酶或碱性蛋白酶。
4.如权利要求1所述的大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：每例样品取肽段使用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统进行色谱分离；缓冲液包括A液：0.1wt％甲酸水溶液、B液：0.1wt％甲酸、乙腈及水，其中，乙腈的质量浓度为80％；色谱柱以100％的A液平衡，样品进样到Trap Column后经过色谱分析柱进行梯度分离，流速为300NL/min；液相分离梯度如下：0分钟-2分钟，B液线性梯度从2％到8％；2分钟-42分钟，B液线性梯度从8％到28％；42分钟-50分钟，B液线性梯度从28％到40％；50分钟-51分钟，B液线性梯度从40％到100％；51分钟-60分钟，B液维持在100％；肽段分离后用Q-Exactive HF-X质谱仪进行DDA质谱分析，分析时长为60min，检测模式：正离子，母离子扫描范围：300-1500m/z，一级质谱分辨率：60,000@m/z 200，AGC target：3e6，一级Maximum IT：50ms；肽段二级质谱分析按照下列方法采集：
每次全扫描后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱，二级质谱分辨率：15,000@m/z 200，AGC target:1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2ActivationType:HCD，Isolation window：1.6m/z，Normalized collision energy：28。
5.如权利要求1所述的大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：首先在uniprot数据库中，对苦味受体目标序列进行搜索，将目标蛋白质的序列Blast格式导入I-TASSER在线建模服务器进行建模。
6.如权利要求1所述的大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：新建一个Molecule Window，在Build and Edit Protein工作中按配体氨基酸序列点击相应氨基酸进行配体构建；将同源建模得到的hT2R1受体导入DS软件中，利用最小化模块对模型结构进行能量最小化处理，能量优化所使用的力场是CHARMm36力场，设置优化算法为Smart Minimizer，受体与配体步数分别为10000、20000步。
7.如权利要求1所述的大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，其特征在于，所述步骤5)具体为：在Libdock对接程序中输入预处理后的配体结构、受体蛋白、活性域坐标与范围等信息；LibDock对接的参数为Number of Hotspots设为100；Docking Tolerance设为0.25，其余参数均为默认。
8.如权利要求1所述的大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，其特征在于，所述步骤6)具体为：在CDOCKER对接程序中输入预处理后的配体结构、受体蛋白、活性域坐标与范围等信息；CDOCKER对接的参数设置为Top Hits设置为100；Top Hits下Pose Cluster Radius设置为0.5，其余设置为默认。
9.如权利要求1所述的大豆蛋白水解物苦味肽的鉴定方法，其特征在于，所述步骤8)具体为：将合成的短肽按体积比逐步稀释，感官评价员采用三点检验法在常温下对每个稀释水平进行鉴评，直到某个稀释倍数时尝不到该滋味为止，记录此时的稀释倍数，即稀释因子；每个评价员做三次平行试验，最终结果取各个鉴评员评定结果的平均值，评定结果之间的差异应低于或等于一个稀释水平。
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