CN108314707B - 抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗肿瘤活性肽物质及其制备方法和应用，所述抗肿瘤活性肽物质包括氨基酸序列如Seq ID No.1～4所示的活性肽中的一种或几种。所述的抗肿瘤活性肽物质的制备方法，包括以下步骤：1)将豌豆蛋白水溶液热变性处理获得变性豌豆蛋白水溶液；2)酶解所述变性豌豆蛋白水溶液获得豌豆蛋白酶解液；3)超滤分级分离所述获得的豌豆蛋白酶解液，分别收集不同分子量组分；4)将所述收集到的组分中具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；5)将所述步骤4)中收集的层析峰组分经RP‑HPLC进一步分离获得抗肿瘤活性肽物质。所述抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用甚微。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤活性肽技术领域，具体涉及抗肿瘤活性肽物质及其制备方法和应用。
背景技术
在全球范围内，癌症的发病率和死亡率一直居高不下。大多数癌症患者的病情隐匿、潜伏期长、肿瘤生长迅速导致早期诊断困难；并且目前对于癌症的治疗主要是以手术切除为主、辅助化疗、热疗等综合治疗。经治疗后，癌症患者的病情能暂时得到控制，然而手术治疗后肿瘤的耐药、复发和转移等情况经常发生，往往成为患癌人群死亡的主要原因。因此，开发出一种安全无毒的适合癌症病人日常食用及手术等治疗后用于保健的功能性食品或针对于肿瘤病人的高效无毒的临床药物能在一定程度上缓解癌症病情和减轻患者痛苦。
现代营养学研究发现，人体对蛋白质的消化吸收主要是以低肽的形式吸收。据报导，肽的吸收机制优于蛋白质和氨基酸。当前关于肽的活性研究主要集中于其抗氧化、抑菌和降血压等发面。抗肿瘤活性肽作为一种新型的治疗癌症的药物，对肿瘤细胞具有选择性、不易引起耐药性，正越来越受到人们的关注。当前关于抗肿瘤多肽的研究，主要来源是海洋生物类，制备成本高，种类少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效、低成本的抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种抗肿瘤活性肽，包括氨基酸序列如Seq ID No.1～4所示的活性肽中的一种或几种，所述抗肿瘤活性肽来源于豌豆蛋白酶解产物。
本发明还提供了所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，包括以下步骤：1)将豌豆蛋白水溶液在70℃～90℃热变性处理10min～30min，获得变性豌豆蛋白水溶液；2)酶解所述步骤1)中获得的变性豌豆蛋白水溶液，获得豌豆蛋白酶解液；3)超滤分级分离所述步骤2)获得的豌豆蛋白酶解液，分别收集分子量大于等于60KDa，[6～60)KDa，[1～6)KDa，小于1KDa的组分；4)检测上述收集到的组分的抗肿瘤活性，筛选具有抗肿瘤活性的组分；5)将步骤4)中获得的具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；6)检测步骤5)中收集的层析峰组分的抗肿瘤活性，筛选抗肿瘤活性最强的组分经反相高效液相RP-HPLC分离，收集所有出峰产物获得抗肿瘤活性肽。
优选的，步骤1)中所述豌豆蛋白水溶液的质量浓度为2～8％。
优选的，步骤2)中所述酶解使用的酶为碱性蛋白酶。
优选的，所述碱性蛋白酶相对于变性豌豆蛋白的用量为14000～18000U/g。
优选的，步骤2)中所述酶解的温度为45℃-60℃。
优选的，步骤2)中所述酶解的时间为4～6h。
本发明还提供了所述的抗肿瘤活性肽在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤功能性食品中的应用。
优选的，所述肿瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、结肠癌或宫颈癌。
本发明的有益效果：本发明提供的抗肿瘤活性肽，来源于豌豆蛋白，包括氨基酸序列如Seq ID No.1～4所示的活性肽中的一种或几种；所述抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用甚微，对癌细胞的抑制率可达50％，而对正常细胞的抑制率在10％以下。本发明提供的抗肿瘤活性肽的制备方法以豌豆蛋白为原料，工艺简单，成本低廉，应用范围广泛；对开发利用含有所述抗肿瘤活性肽的临床药物奠定了理论基础；为开发利用含有所述抗肿瘤活性肽的功能性食品的生产具有指导意义。
附图说明
图1为本发明所述抗肿瘤活性肽中IPVNRPGQLQ的质谱图；
图2为本发明所述抗肿瘤活性肽中YGPTPVRDGFK的质谱图；
图3为本发明所述抗肿瘤活性肽中VTPGATDDQIMDGVRK的质谱图；
图4为本发明所述抗肿瘤活性肽中GQTPLFPR的质谱图；
图5为实施例2和3中四个抗肿瘤活性肽对四株人源癌细胞和一株人正常肝细胞作用的抑制率。
具体实施方式
本发明提供了一种抗肿瘤活性肽，包括氨基酸序列如Seq ID No.1～4所示的活性肽中的一种或几种。在本发明中所述抗肿瘤活性肽中活性肽的氨基酸序列分别为Seq IDNo.1：IPVNRPGQLQ、Seq ID No.2：YGPTPVRDGFK、Seq ID No.3：VTPGATDDQIMDGVRK和SeqIDNo.4：GQTPLFPR。
在本发明中所述抗肿瘤活性肽优选来源于豌豆蛋白，所述抗肿瘤活性肽优选的为豌豆蛋白酶解产物；所述酶解优选的为碱性蛋白酶酶解。在本发明中所述抗肿瘤活性肽中具体的氨基酸序列如SeqID No.1～4所示的活性肽的纯度优选的大于95％。本发明中所述活性肽可以通过豌豆蛋白酶解后分离纯化获得，也可以采用化学合成的方法获得；所述化学合成优选的委托生物公司进行，在本发明具体实施过程中优选的委托苏州强耀生物科技有限公司。
本发明还提供了所述的抗肿瘤活性肽的制备方法，为酶解豌豆蛋白的方法，包括以下步骤：包括以下步骤：1)将豌豆蛋白水溶液在70℃～90℃热变性处理10min～30min，获得变性豌豆蛋白水溶液；2)酶解所述步骤1)中获得的变性豌豆蛋白水溶液，获得豌豆蛋白酶解液；3)超滤分级分离所述步骤2)获得的豌豆蛋白酶解液，分别收集分子量大于等于60KDa，[6～60)KDa，[1～6)KDa，小于1KDa的组分；4)检测上述收集到的组分的抗肿瘤活性，筛选具有抗肿瘤活性的组分；5)将步骤4)中获得的具有抗肿瘤活性的组分经分子筛层析，按峰收集各层析峰组分；6)检测步骤5)中收集的层析峰组分的抗肿瘤活性，筛选抗肿瘤活性最强的组分经反相高效液相RP-HPLC分离，收集所有出峰产物获得抗肿瘤活性肽。
在本发明中，首先将豌豆蛋白水溶液在70℃～90℃热变性处理10min～30min获得变性豌豆蛋白水溶液。在本发明中，所述豌豆蛋白优选的为豌豆蛋白粉；所述豌豆蛋白粉优选的为市售豌豆蛋白粉产品；在本发明具体实施过程中，所述豌豆蛋白粉购于兰州百禾生物科技有限公司，产品名称：豌豆蛋白粉。在本发明中优选的将去离子水与所述豌豆蛋白粉混合配制豌豆蛋白水溶液；所述豌豆蛋白水溶液的质量浓度优选的为2～8％，更优选的为4～6％。
本发明在获得豌豆蛋白水溶液后，对所述豌豆蛋白水溶液进行热变性处理；所述热变性处理的温度优选的为75～85℃，更优选的为78～82℃；所述热变性处理的时间优选的为15～25min，更优选的为17～23min。在本发明中所述热变性处理的目的为使豌豆蛋白水溶液中的豌豆蛋白变性，更利于提高后续酶解效率。
本发明在获得变性豌豆蛋白水溶液后，酶解所述变性豌豆蛋白水溶液获得豌豆蛋白酶解液。在本发明中所述酶解使用的酶优选的为碱性蛋白酶；本发明中所述碱性蛋白酶采用市售的碱性蛋白酶即可，对厂家和货号无特殊要求。在本发明酶解过程中所述碱性蛋白酶相对于变性豌豆蛋白的用量优选的为14000～18000U/g，更优选的为15000～17000U/g。在本发明中所述酶解的温度优选的为45℃-60℃，更优选的为50～55℃；所述酶解的时间优选为4～6h，更优选的为4.5～5.5h。本发明中所述酶解优选的采用水浴的方式进行。本发明中所述酶解将所述变性豌豆蛋白分解为小分子多肽。
本发明在所述酶解结束后，优选的将所述获得的豌豆蛋白酶解液进行沸水浴加热处理。在本发明中，所述沸水浴的温度优选为90℃～100℃；所述沸水浴的时间优选为10～15min。在本发明中，所述沸水浴加热通过高温加热灭活残留在豌豆蛋白酶解液中的碱性蛋白酶。
本发明在获得所述豌豆蛋白水解液后，超滤分级分离所述豌豆蛋白酶解液，分别收集分子量大于等于60KDa，[6～60)KDa，[1～6)KDa，小于1KDa的组分。本发明在超滤分级分离前，优选的将所述的豌豆蛋白水解液进行稀释；所述稀释后的溶液的固形物含量优选的小于2％。
本发明中所述超滤分级分离优选的将所述豌豆蛋白酶解液分为分子量大于等于60KDa，[6～60)KDa，[1～6)KDa，小于1KDa，小于1KDa这4个组分。在本发明中所述超滤优选的采用中空纤维膜超滤装置和高效离心超滤装置实现，在本发明中所述中空纤维膜超滤装置优选的采用天津膜天膜科技有限公司生产的中空纤维膜超滤装置；所述中空纤维膜超滤装置的截留分子量为60KDa，6KDa；所述高效离心超滤装置优选的采用美国Millipore公司生产的高效离心超滤装置，所述高效离心超滤装置的型号为Modle 2000，所述高效离心超滤装置优选的使用截留分子量大小为1KDa的超滤膜。
在本发明中，优选的使用蠕动泵将所述稀释后的豌豆蛋白酶解液输送入所述中空纤维膜超滤装置进行超滤分级分离。
本发明优选将收集到不同分子量组分的滤过液并经旋转蒸发仪浓缩后冻干成肽粉；检测所述肽粉的抑癌活性。在本发明中，所述旋转蒸发仪浓缩的温度优选的为35～45℃，更优选的为40℃；转速优选的为50～70rpm，更优选的为60rpm。所述旋转蒸发仪优选的上海亚荣生化仪器厂生产的型号为RE-3000的旋转蒸发仪。在本发明中，所述冻干的温度优选的为-45～-55℃，更优选的为50℃；所述冻干的时间优选的为10～14h；更优选的为12h。在本发明中所述冻干优选的采用德国CHIRST公司生产的Alpha1-2LD真空冷冻干燥机型号。在本发明中，所述检测不同分子量的组分对癌细胞生长的抑制作用为将所述不同分子量的组分加到细胞培养液DMEM中，检测细胞生长情况，本发明中优选的采用MTT法检测本发明中所述肽粉的抑癌活性。
本发明在获得抗肿瘤活性组分，将步骤3)所述抗肿瘤活性组分经分子筛层，按峰收集各层析峰组分。在本发明中所述分子筛层析优选的为葡聚糖凝胶层析；所述葡聚糖凝胶层析的填料优选的为Sephadex G-15。在本发明具体实施过程中，所述葡聚糖凝胶层析的柱体积优选的为85mL，上样量优选的为50mg(1mL)，流动相优选的为超纯水，流速优选的为0.8mL/min，检测波长优选的为280nm；所述检测器为紫外检测器。
本发明在所述的葡聚糖凝胶层析后，按峰收集各层析液，将所述收集到的各层析峰组分冷冻干燥获得各层析峰干粉，保存备用；所述冷冻干燥的条件与上述冻干条件一致，在此不再赘述。
本发明将各层析峰干粉加到细胞培养液DMEM中，检测各个峰的层析液对癌细胞的抑制作用。本发明中优选的采用MTT法检测各个峰的抑癌活性。
本发明将所述各层析峰组分中抗肿瘤活性最强的层析峰组分经反相高效液相RP-HPLC分离获得抗肿瘤活性肽。在本发明中所述反相高效液相RP-HPLC进一步分离的条件优选的为：分析柱为Waters Bondapak C18(5m，250mm×4.6mm i.d.)；进样量10μL，流速1.0mL/min，检测波长214nm，检测温度为25℃，流动相A为含0.1％质量浓度的甲酸水溶液，流动相B为0.1％质量浓度的甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脱。本发明中具体的梯度洗脱程序见表1。
本发明收集所述反相高效液相RP-HPLC分离后的所有出峰产物获得本发明所述的抗肿瘤活性肽。
本发明在所述反相高效液相RP-HPLC分离后，优选的将收集到的分离后的组分分别进行多肽氨基酸结构鉴定。在本发明中所述氨基酸结构鉴定优选的采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法LC-ESI-MS/MS。在本发明中所述分离后组分的氨基酸序列分别为IPVNRPGQLQ、YGPTPVRDGFK、VTPGATDDQIMDGVRK和GQTPLFPR。
本发明还提供了一种所述的抗肿瘤活性肽在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤功能性食品中的应用。在本发明中所述肿瘤优选的包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、结肠癌或宫颈癌。在本发明中所述抗肿瘤活性肽在应用过程中各个活性肽的纯度优选的大于95％。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白制备抗肿瘤活性肽，步骤如下：
(1)蛋白酶解液的制备：准确称取6g豌豆蛋白粉，加入到100mL去离子水中混匀，70℃下热处理豌豆蛋白15min，按照酶与底物比为10000U/g加入碱性蛋白酶，调节pH值为8.5，在55℃水浴锅中反应5h后，90℃沸水浴灭酶10min,测定水解度为18.18％；
(2)将水解后得到的豌豆蛋白水解液进行冷冻干燥，冻干条件：温度-50℃；时间：12h。将干燥粉溶解在细胞培养液DMEM中，制备成含豌豆肽的细胞培养液用于测定对癌细胞生长的抑制作用；
(3)将用碱性蛋白酶酶解得到的豌豆蛋白酶解液通过中空纤维膜超滤装置和搅拌式超滤装置分离成分子量(>60KDa，6KDa-60KDa，1KDa-6KDa，<1KDa)的各个组分，操作步骤如下：
a.安装超滤装置
b.清洗超滤膜
c.将豌豆蛋白酶解液用蒸馏水稀释至固形物含量为2％后，用蠕动泵输送进中空纤维中，调节蠕动泵的转速和出液口的流速，使装置的压力维持在一个安全范围内，待进豌豆蛋白酶解液全部进入中空纤维后，将浓液口的截留液进行稀释重新超滤，重复多次，直至浓液口截留液的固形物含量基本保持不变，在此期间收集截留液和滤过液，并经旋转蒸发仪浓缩后冻干成肽粉用于检测对癌细胞生长的抑制作用；
(4)采用分子筛层析Sephadex G-15分离抗肿瘤活性高的活性肽组分；将经超滤分离得到的抑制癌细胞生长活性最强的组分通过葡聚糖凝胶色谱继续分离纯化，根据实验结果选择Sephadex G-15(分离范围：分子量<1KDa)为填料，柱体积为85mL，上样量为50mg(1mL)，流动相为超纯水，流速为0.8mL/min，每3min收集一管，共收集100管，检测波长为280nm。按峰收集各组分冷冻干燥，保存备用。
(5)采用反相高效液相色谱分离抗肿瘤活性高的活性肽组分；
将经Sephadex G-15分离得到的抑制癌细胞生长活性最强的组分通过高效液相色谱继续分离纯化。色谱条件：Waters Bondapak C18(5m，250mm×4.6mm i.d.)分析柱，进样量20L，流速1.0mL/min，检测波长214nm，检测温度为25℃，流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)，采用梯度洗脱，洗脱条件如下表1所示。
表1梯度洗脱程序
(6)将抗肿瘤活性高的活性肽组分经LC-ESI-MS/MS鉴定得到抗肿
瘤活性肽序列。
对液相分离得到的活性较高的两个组分中活性肽的结构进行鉴定，将需要鉴定的样品过C18固相萃取小柱除去杂质，用真空浓缩仪抽干洗脱液得到肽段。将肽段用液相的洗脱液A(2％乙腈，0.1％甲酸)重新溶解，20000g离心后上清转移至样品瓶中，取10μL样品通过超高效液相色谱(UPLC，戴安，Ultimate 3000nanoUPLC)的进样阀上样到C18捕集柱上(Dionex，Acclaim PepMap 100，75μm×2cm)，并通过分析柱(Dionex，AcclaimPepMap RSLC，75μm×25cm)进行梯度洗脱。梯度洗脱程序：8-40％B液(80％乙腈，0.1％甲酸)，35min；40-80％B，7min；80％B，3min；流速：300nL/min。
超高效液相色谱通过纳升级电喷雾离子源(nESI)连接到四级杆-轨道阱质谱(Quadrupole-Orbitrap)，离子源电压2.0kV，温度320℃。质谱一级进行肽段母离子质量的扫描(MS1)，分辨率70000px，扫描范围300-2000Da。通过数据依赖分析(data-dependentanalysis)方式选择强度最高的20个肽段进行高能碰撞碎裂(high-energy collisiondissociation)，并对子离子碎片质量进行二级扫描(MS2)。母离子阈值为1×105，动态排除15s，碎裂能量是27％，二级分辨率17500，扫描范围质荷比从100开始。通过自动增益控制(auto gain control)限制一级质谱离子个数3×106，二级质谱离子个数是1×105。
将质谱分析产生的原始数据(.raw文件)导入MaxQuant软件(v1.3.0.5)进行肽段序列的鉴定。参数设定如下：蛋白序列数据库，uniprot soybean(66296条序列)+uniprotgardenpeas(1655条序列)；一级容错，预搜索20ppm，主搜索6ppm，二级容错0.02Da；酶解非特异性(unspecific)，最大漏切0；固定修饰无，可变修饰甲硫氨酸氧化；其他参数设定为软件默认值。
鉴定获得抗肿瘤活性肽的氨基酸序列分别为IPVNRPGQLQ、YGPTPVRDGFK、VTPGATDDQIMDGVRK和GQTPLFPR。
实施例2
MTT法检测抗肿瘤活性肽对人源癌细胞的抑制率，步骤如下：
将抗肿瘤活性肽以一定浓度加到细胞培养液DMEM中，用于检测抗肿瘤活性肽对癌细胞体外生长的抑制作用，操作步骤如下：
a.将处于对数期的细胞用胰酶消化成单细胞悬液，计数后，调整细胞密度为5×104个/mL，以每孔100mL接种到96孔板中，在37℃，5％CO2培养箱中培养48小时；
b.向实验组细胞中每孔加200μL含相应浓度抗肿瘤活性肽的细胞培养液，空白对照组加200μLDMEM培养液，以含相同浓度豌豆蛋白粉的培养液为阴性对照和含相同浓度5-FU的培养液为阳性对照，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养24小时；
c.吸出旧培养液，每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL和细胞培养液180μL，37℃再培养4小时后，小心吸出培养上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡15分钟，使紫色洁净物充分溶解；
d.用酶标仪在490nm或570nm处测定每孔的吸光度值(A值)，以空白孔调零，记录实验结果，计算抑制率，具体结果如表2所示。
表2不同浓度豌豆肽对不同癌细胞的抑制率
实施例3
MTT法检测抗肿瘤活性肽对人正常细胞的抑制率，步骤如下：
将抗肿瘤活性肽以一定浓度加到细胞培养液1640中，用于检测抗肿瘤活性肽对人正常细胞体外生长的抑制作用，操作步骤如下：
a.将处于对数期的细胞用胰酶消化成单细胞悬液，计数后，调整细胞密度为5×104个/mL，以每孔100mL接种到96孔板中，在37℃，5％CO2培养箱中培养48小时；
b.向实验组细胞中每孔加200μL含相应浓度抗肿瘤活性肽的细胞培养液，空白对照组加200μL1640培养液，以含相同浓度豌豆蛋白粉的培养液为阴性对照和含相同浓度5-FU的培养液为阳性对照，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养24小时；
c.吸出旧培养液，每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL和细胞培养液180μL，37℃再培养4小时后，小心吸出培养上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡15分钟，使紫色洁净物充分溶解；
d.用酶标仪在490nm或570nm处测定每孔的吸光度值(A值)，以空白孔调零，记录实验结果，计算抑制率，结果如表3所示。
表3不同浓度豌豆肽对不人正常细胞的抑制率
实施例4
化学合成法制备抗肿瘤活性肽IPVNRPGQLQ、YGPTPVRDGFK、VTPGATDDQIMDGVRK和GQTPLFPR。委托苏州强耀生物科技有限公司完成。
合成原料及相关试剂、仪器：
1、树脂：取代度为1.03mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin(天津市南开合成科技有限公司)
2、氨基酸：
Fmoc-Arg(pbf)-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Pro-OH(成都诚诺，>99％)，Fmoc-Phe-OH(成都诚诺，>99％)等
3、特殊原料：
无
4、合成试剂：
DMF(原产地韩国)，DCM(原产地韩国)，MEOH(原产地日本)，DIEA(新德化工，99％)，HBTU(昊帆生物科技，99％)
5、脱保护试剂：
哌啶(国药集团上海化学试剂公司，99％)
6、检测试剂：
苯酚试剂(自配)，吡啶试剂(自配)，茚三酮试剂(自配)
7、裂解试剂：
95％切割液：TFA(J.T.Baker，99％)，TIS(上海达瑞精细化工，98％)，EDT(上海达瑞精细化工，98％)，无水乙醚(上海实验，实测99.7％)
8、氮气：(新联气体)
9、仪器：
1.十二通道半自动多肽合成仪上海强耀生物科技有限公司自主设计并申请专利的半自动多肽合成仪，专利号为201020226529.2
2.SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.SevialSystem，厂商：SHIMADZU)
3.LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO)
4.离心机(上海安亭科学仪器厂型号：TDL-40B)
多肽合成步骤如下：以多肽04010027755为例
合成顺序：从C端到N端。
一.树脂溶涨
将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min.
二.接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Arg(pbf)-OH氨基酸，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA,，振荡60min。用甲醇封闭。
三.脱保护
去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min.
四.检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。
五.洗
DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
六.缩合
保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应30min.
七.检测
取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃－110℃加热5min,无色为阴性反应。
八.洗
DMF(10ml/g)一次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
九.重复三至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
十.抽干，按照下列方法洗树脂。
DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min。
十一.从树脂上切割多肽
配制切割液(10/g)TFA 95％；水1％；EDT 2％；TIS 2％
切割时间：120min
十二.吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
十三.分析提纯：
用高效液相色谱将粗品提纯。
十四.冻干
收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
产品纯度检测结果如表4所示。
表4抗肿瘤活性肽的纯度规格
| 编号 | 氨基酸序列 | 纯度 | 规格(mg) |
| CJE160711066 | GQTPLFPR | 95％ | 10 |
| CJE160711066 | VTPGATDDQIMDGVRK | 95％ | 10 |
| CJE160711066 | YGPTPVRDGFK | 95％ | 10 |
| CJE160711066 | IPVNRPGQLQ | 95％ | 10 |
由上述实施例可知，本发明提供的抗肿瘤活性肽能高效抑制癌细胞生长且对正常细胞毒性作用甚微，对癌细胞的抑制率可达50％，而对正常细胞的抑制率在10％以下。本发明提供的抗肿瘤活性肽的制备方法以豌豆蛋白为原料，工艺简单，成本低廉，应用范围广泛。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.抗肿瘤活性肽，其特征在于，所述抗肿瘤活性肽为氨基酸序列如Seq ID No.1~4所示的活性肽中的一种或几种；
所述抗肿瘤活性肽物质来源于豌豆蛋白酶解产物。
2.权利要求1所述的抗肿瘤活性肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌或胃癌。
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