CN113912673A

CN113912673A - 一种芝麻来源的低苦味ace抑制肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113912673A
Application number: CN202111319951.1A
Authority: CN
Inventors: 贾聪; 芦鑫; 孙强; 黄纪念
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-09
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-11-09
Also published as: CN113912673B

Abstract

本发明属于农副产品深加工技术领域，具体涉及一种低苦味芝麻ACE抑制肽，该多肽由4个氨基酸组成，其序列为：Trp‑Leu‑Tyr‑Arg（WLYR）。本发明低苦味芝麻多肽既可以通过蛋白酶解脱脂芝麻粉、脱苦和分离纯化获得，也可以通过化学固相合成的方法进行人工合成。本发明通过感官评价、电子舌分析和测定ACE抑制能力发现：该多肽基本无苦味，具有较强的降压活性，属于食源性降压肽，分子量小，易吸收，可以作为功能活性成分用于制备降血压药物，作为活性药物应用至保健品、食品、医药等行业领域，具有广阔的市场前景。

Description

一种芝麻来源的低苦味ACE抑制肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于农副产品深加工技术领域，具体涉及一种来源于脱脂芝麻粉的低苦味ACE抑制肽WLYR、制备方法及其在降血压药物、保健品、食品等中的应用。

背景技术

高血压是冠心病、动脉硬化、脑卒中、心力衰竭的主要发病诱因。根据流行疾病学研究，现在有超过10亿人患有高血压。因此，高血压的预防和治疗已成为全球亟待解决的公共问题。血管紧张素Ⅰ转移酶（ACE）是一种二肽羧肽酶，对血压调节起重要作用。目前治疗高血压的药物主要有沙坦类和地平类，但这些化学合成药物常会引发咳嗽、皮疹、头疼等副作用。食源性ACE抑制肽具有毒副作用小、作用平缓等优点。因此利用安全食源性蛋白制备的ACE抑制肽作为化学药物替代品具有重要的社会意义和广阔的市场价值。

受限于靶标分子（ACE）活性位点的空间位阻影响，短肽较长肽更容易与ACE活性位点结合，因此目前发现的ACE抑制肽大部分为氨基酸残基数量为2~12个的短肽。从食源性蛋白中获得小分子活性肽主要是利用生物酶法，酶水解由于高效、对蛋白质营养价值破坏小、无异味产生而被广泛采用。已有大量的动植物蛋白（如酪蛋白、鱼肉蛋白、大豆蛋白、大米蛋白、小麦胚芽蛋白等）通过蛋白酶解制备ACE抑制肽。

芝麻是我国重要的油料作物，制油后的副产物---芝麻饼粕主要成分为蛋白质（含量约50%），由于加工技术落后，芝麻饼粕中的蛋白资源未得到充分利用。研究证实：芝麻蛋白通过酶解可以产生高活性ACE抑制肽。然而ACE抑制肽在酶解制备过程中由于疏水基团的暴露，往往产生严重苦味，从而限制在食品、保健品等领域的应用。因此，制备低苦味的芝麻ACE抑制肽，可以拓展其应用范围，有效提高芝麻蛋白的附加值，推动芝麻加工副产物的资源化利用，提升市场竞争力。

发明内容

针对食源性芝麻蛋白制备的高活性ACE抑制肽具有严重苦味，制约人们的消费需求，本发明目的在于提供一种芝麻来源的低苦味ACE抑制肽，该低苦味芝麻ACE抑制肽具有抑制活性高、基本无苦味，且制备工艺简单，成本可控，可工业化规模生产等优点，在医药、食品、保健品等领域有高效的应用价值，具有广阔的市场前景。

本发明还提供了上述芝麻来源的低苦味ACE抑制肽的制备方法以及在食品、保健品、降血压药物等中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种低苦味芝麻ACE抑制肽，该肽由四个氨基酸组成，序列为：Trp-Leu-Tyr-Arg（WLYR），基本无苦味，具有较好的降血压功效。

一种从脱脂芝麻粉中制备上述低苦味ACE抑制肽的方法，其通过蛋白酶解、苦味脱除、分离纯化等步骤获取，具体包括以下步骤：

1）脱脂芝麻粉制备：

以粉碎过的芝麻或芝麻饼粕（优先使用低温的冷榨芝麻饼粕）为原料，采用亚临界萃取或索式抽提进行脱油，然后粉碎过100-200目网筛，收集筛下物，即为脱脂芝麻粉，并用凯式定氮法测定其中蛋白含量；

2）蛋白酶解：

将步骤1）所得脱脂芝麻粉，按料液比10 g：50-150 mL加蒸馏水，调节pH值至8-9，在50-55℃条件下加入碱性蛋白酶Alcalase，酶解1-1.5 h后加入风味蛋白酶（产品信息：500 MG风味蛋白酶，诺维信（中国）生物技术有限公司），继续酶解2-2.5 h，酶解结束后迅速放入85~100℃水浴中加热10-20 min，4000-8000 r/min离心20-30 min，取上清液，4-6℃低温放置，备用；

3）苦味脱除：

向步骤2）所得上清液中加入大孔树脂直至大孔树脂浓度为0.1-1 g/mL，然后调节pH值为4-8，于25-45℃条件下搅拌吸附5-25 min，过100-200目网筛，取滤液；

4）分离纯化：

将步骤3）所得滤液用截留分子量3 ~5 kDa的超滤膜进行超滤，然后采用高压层析色谱系统进一步分离纯化，收集并筛选出高活性的洗脱峰对应的组分，即收集保留时间在10.95-11.10 min的组分，浓缩后冷冻干燥，即得低苦味ACE抑制肽样品。该低苦味芝麻ACE抑制肽样品使用Nano-LC-ESI-MS/MS进行质谱鉴定，鉴定到该低苦味ACE抑制肽的氨基酸序列为：Trp-Leu-Tyr-Arg（WLYR）。

具体的，步骤2）中，碱性蛋白酶Alcalase添加量为9000-9500 U/g_原料蛋白，风味蛋白酶添加量为4000-4500 U/g_原料蛋白。调节pH所用酸碱优先选用盐酸和氢氧化钠。

进一步的，步骤3）中，所述大孔树脂可以为D201型、D301型和D001型的一种或两种以上的组合。

进一步的，步骤4）中，高压层析色谱系统的条件为：流动相A为含0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；洗脱梯度：0~30%流动相B洗脱时间3 min，30%~65% 流动相B洗脱时间5 min，65%~60% 流动相B洗脱时间25 min，60%~0%流动相B洗脱时间5 min；流速6 mL/min，检测波长为220 nm，色谱柱为Shim-pack GIS C₁₈柱。

本发明还提供了一种上述芝麻来源的低苦味ACE抑制肽的制备方法，其可以通过人工化学合成制备，如其采用化学固相合成法按照本领域常规技术人工合成低苦味ACE抑制肽。

本发明还提供了上述芝麻来源的低苦味ACE抑制肽在制备降血压药物、保健品、食品等中的应用，如其可以作为添加剂或者活性药物添加至医药、食品、保健品、营养强化剂等多种行业和领域，具有广阔的市场情景。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

1）本发明所用的原料为芝麻榨油后副产品-芝麻饼粕，实现芝麻蛋白资源的高值化利用，对促进社会经济的可持续发展有重要意义。

2）本发明提供的芝麻活性多肽，基本无苦味，具有较强的降血压活性，且分子量小，易于消化吸收。

3）本发明提供的低苦味芝麻ACE抑制肽，制备条件温和，操作简单，可放大规模化生产，作为食品添加剂或功能性成分在食品、保健品、医药等领域有广阔的市场前景。

附图说明

图1为实施例1中高压层析色谱系统分离色谱图；

图2为实施例1提取所得低苦味芝麻ACE抑制肽在Nano-LC-ESI-MS/MS中的二级质谱图；

图3为实施例2中人工合成低苦味芝麻ACE抑制肽WLYR的HPLC图；

图4为实施例2中人工合成低苦味芝麻ACE抑制肽WLYR的质谱图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员未做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明的保护范围。

下述实施例中，所用碱性蛋白酶Alcalase购买自诺维信（中国）生物技术有限公司，酶活235000 U/mL；所用风味蛋白酶购买自诺维信（中国）生物技术有限公司的500 MG风味蛋白酶，酶活19000 U/mL。

实施例1

一种从脱脂芝麻粉中制备低苦味ACE抑制肽的方法，其具体包括如下步骤：

1）脱脂芝麻粉制备：

将芝麻饼粕粉碎，采用索式抽提器进行脱脂，选用溶剂为石油醚（沸点40-60℃），萃取温度为60℃，脱脂7 h。将脱脂后的芝麻粕原料进行粉碎，过100目网筛，收集筛下物，即为脱脂芝麻粉，凯式定氮法（GB5009.5-2003）测定蛋白含量为51.23%；

2）蛋白酶解：

将步骤1）所得脱脂芝麻粉按料液比10 g：100mL加蒸馏水搅拌均匀。用6 mol/LNaOH调节pH为8.2，然后在50-55℃条件下加入9000 U/g_原料蛋白的碱性蛋白酶Alcalase，于50-55℃下酶解1 h后加入4000 U/g_原料蛋白的风味蛋白酶，继续酶解2 h。酶解结束迅速放入沸水浴中加热10 min，冷却至室温，然后在5000 r/min下离心20 min，取上清液，4-6℃低温放置，备用；

3）脱苦：

将D201型大孔树脂加入步骤2）所得上清液中，大孔树脂浓度为0.9 g/mL，调节pH值为7，于35℃条件下搅拌吸附20 min，过200目网筛，收集滤液；

4）分离纯化

将步骤3）所得滤液用截留分子量3 kDa的超滤膜进行超滤，然后采用高压层析色谱系统进行进一步分离纯化，色谱条件如下：流动相A为含0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；洗脱梯度：0~30%流动相B洗脱时间3 min，30%~65% 流动相B洗脱时间5 min，65%~60% 流动相B洗脱时间25 min，60%~0%流动相B洗脱时间5 min；流速6mL/min，检测波长为220 nm，色谱柱为Shim-pack GIS C₁₈柱（内径250 mm，柱长20 cm，粒度10 μm）。使用收集器收集并筛选出高ACE抑制活性的洗脱峰对应的组分，即收集保留时间在10.95-11.10 min的组分（见图1，主要有6个洗脱峰，收集第五个峰P5），80℃水浴静置挥发浓缩2h，-60℃冷冻干燥24h，即得。

将收集到的多肽样品使用Nano-LC-ESI-MS/MS进行质谱鉴定（见图2），鉴定到该低苦味ACE抑制肽的氨基酸序列为：Trp-Leu-Tyr-Arg（WLYR）。

实施例2

一种人工合成低苦味芝麻ACE抑制肽的方法，其采用固相合成法人工合成。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接到固相载体上；其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸在与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端项N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的多肽。该方法合成的低苦味芝麻ACE抑制肽Trp-Leu-Tyr-Arg（WLYR），其液相和质谱分析图见图3和图4。此高纯度合成肽的只要离子峰质荷比为636.74，符合需要合成序列的分子量，说明固相合成成功。

上述采用固相合成法合成低苦味芝麻ACE抑制肽的具体过程参见：①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.贾库布克著，刘克良等译，肽：化学与生物学，科学出版社，2005年。），该低苦味芝麻ACE抑制肽也可以委托相应的多肽生物公司进行合成，因其化学合成过程不是本申请的重点所在，故本申请此处不再对化学合成过程进行详细赘述。

低苦味降压肽应用试验

苦味感官评价试验：以奎宁为苦味基准物质，称取盐酸奎宁0.1 g溶于100mL 95%乙醇中；取10 mL用水稀释至100 mL配成1×10^-4 g/ml的盐酸奎宁溶液，进一步稀释到9×10^-5、8×10^-5、7×10^-5、6×10^-5、5×10^-5、4×10^-5、3×10^-5、2×10^-5、1×10^-5 g/mL，随后进行感官评价，按浓度梯度，苦味值分别记为1-10，将待测溶液与不同浓度的盐酸奎宁溶液比较，确定其苦味值。

电子舌分析试验：将样品倒入电子舌测定专用塑料杯，利用苦味和苦味的回味良好总传感器获得味觉数据结果。苦味值表示入口的苦味强度，苦味回味值反映了苦味的残留情况。苦味值和苦味回味值越大说明测定样品苦味越严重。参比溶液为含0.030 mol/L氯化钾和0.003 mol/L酒石酸的水溶液，接近无味。

ACE抑制活性测定试验：将多肽样品溶于蒸馏水中并进行适当稀释，用96孔酶标板作为反应容器。取15 μL稀释液（对照液以蒸馏水代替）和30 μL 4.66 mmol/L 马尿酰-组氨酰-亮氨酸HHL（用含0.3 mol/L NaCl的0.05 mol/L pH 8.3的硼酸盐缓冲液配制）混合，随后加入30 μL ACE（12.5 mU/mL），于37℃水浴中反应1 h，随后加入125 μL 1.2 mol/L NaOH终止反应。然后加入20 μL 2%（m/v）邻苯二甲醛甲醇溶液，混匀并在室温下放置20 min后，用6 mol/L的HCl（30 μL）终止衍生反应。反应液稀释10倍后测定荧光吸收强度，激发波长340 nm，发射波长455 nm，狭缝宽度5 nm。ACE活性抑制率的计算见下述公式。以多肽浓度的对数值为横坐标，ACE活性抑制率为纵坐标，绘制回归直线，计算抑制率达到50%时抑制肽的浓度（即半抑制浓度），记为IC₅₀值。

式中：a，多肽WLYR与ACE都存在时的荧光吸收强度；b，多肽WLYR不存在而ACE存在时的荧光吸收强度；c，多肽WLYR存在而ACE不存在时的荧光吸收强度；d，多肽WLYR与ACE都不存在时的荧光吸收强度。

低苦味芝麻多肽的活性应用，以感官评价和电子舌分析苦味值、ACE抑制能力IC₅₀值作为指标，测试分析实施例1从脱脂芝麻粉中提取的低苦味芝麻多肽WLYR和实施例2采用人工合成的芝麻多肽WLYR的苦味和降压活性，具体结果见表1。

表1、实施例1和2所得芝麻多肽WLYR的苦味评价结果和ACE抑制活性

由表1可知：本发明芝麻多肽WLYR基本无苦味，具有较强的ACE抑制活性，食用时不仅满足消费者口感和嗜好需求，同时可预防、缓解、控制、辅助治疗高血压，适宜用于开发降压药物，保健品或食品，

综上可以看出：本发明低苦味芝麻ACE抑制肽不仅可以通过蛋白酶解、脱苦、分离纯化获得，还可以通过化学固相合成的方法进行人工合成。本发明通过分析苦味值并测定ACE抑制活性发现：该活性肽基本无苦味，具有较强的ACE抑制活性，属于食源性降压肽，可满足消费者口感需求，分子量小，易吸收，可以制备降血压药物，作为添加剂或者活性药物添加至食品、保健品等行业和领域，具有广阔的应用开发前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。凡依本发明申请专利范围所做的均等改变与修饰，都应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种低苦味芝麻ACE抑制肽，其特征在于，该肽由四个氨基酸组成，序列为：Trp-Leu-Tyr-Arg。

2.一种从脱脂芝麻粉中制备权利要求1所述低苦味ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1）脱脂芝麻粉制备：

以芝麻或芝麻饼粕为原料，采用亚临界萃取或索式抽提进行脱油，然后粉碎过100-200目网筛，收集筛下物，即为脱脂芝麻粉，并用凯式定氮法测定其中蛋白含量；

2）蛋白酶解：

将步骤1）所得脱脂芝麻粉，按料液比10 g：50-150 mL加蒸馏水，调节pH值至8-9，在50-55℃条件下加入碱性蛋白酶Alcalase，酶解1-1.5 h后加入风味蛋白酶，继续酶解2-2.5 h，酶解结束后放入85~100℃水浴中加热10-20 min，离心，取上清液，4-6℃低温放置，备用；

3）苦味脱除：

向步骤2）所得上清液中加入大孔树脂直至浓度为0.1-1 g/mL，然后调节pH值为4-8，于25-45℃条件下搅拌吸附5-25 min，过100-200目网筛，取滤液；

4）分离纯化：

将步骤3）所得滤液用3 ~5 kDa的超滤膜进行超滤，然后采用高压层析色谱系统进一步分离纯化，收集保留时间在10.95-11.10 min的组分，浓缩后冷冻干燥，即得低苦味ACE抑制肽样品。

3.如权利要求2所述从脱脂芝麻粉中制备低苦味ACE抑制肽的方法，其特征在于，步骤2）中，碱性蛋白酶Alcalase添加量为9000-9500 U/g_原料蛋白，风味蛋白酶添加量为4000-4500U/g_原料蛋白。

4.如权利要求2所述从脱脂芝麻粉中制备低苦味ACE抑制肽的方法，其特征在于，步骤3）中，所述大孔树脂为D201型、D301型和D001型的一种或两种以上的组合。

5.如权利要求2所述从脱脂芝麻粉中制备低苦味ACE抑制肽的方法，其特征在于，步骤4）中，高压层析色谱系统的条件为：流动相A为含0.1%三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；洗脱梯度：0~30%流动相B洗脱时间3 min，30%~65% 流动相B洗脱时间5 min，65%~60% 流动相B洗脱时间25 min，60%~0%流动相B洗脱时间5 min；检测波长为220nm，色谱柱为Shim-pack GIS C₁₈柱。

6.一种权利要求1所述芝麻来源的低苦味ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，采用化学固相法人工合成低苦味ACE抑制肽。

7.权利要求1所述芝麻来源的低苦味ACE抑制肽在制备降血压药物中的应用。