KR20220043706A - 누룩 및 단백가수분해효소를 사용한 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법 및 항산화 성분 함량이 증진 된 갈색거저리 단백질의 가수분해물 - Google Patents
누룩 및 단백가수분해효소를 사용한 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법 및 항산화 성분 함량이 증진 된 갈색거저리 단백질의 가수분해물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 누룩 및 단백가수분해효소를 이용한 갈색거저리(밀웜) 단백질의 가수분해물 제조방법 및 이로부터 제조되는 항산화 성분 함량이 증진 된 갈색거저리 단백질의 가수분해물에 관한 것으로, 본 발명의 누룩 및 단백가수분해효소를 이용한 갈색거저리 단백질의 가수분해물 제조방법은 단백가수분해효소 단독 처리 대비 갈색거저리 단백질가수분해물을 고 수율로 회수할 수 있고, 또한 본 발명의 제조방법으로부터 수용성 펩타이드와 아미노산과 같은 항산화 기능성 성분 함량이 증진 된 갈색거저리 단백질 가수분해물이 제공되는 바, 향상 된 항산화 기능성 건강기능식품 조성물이 제공되는 유용한 효과가 있다.
Description
본 발명은 누룩 및 단백가수분해효소를 사용한 갈색거저리(Tenebrio molitor) 단백질 가수분해물의 제조방법 및 이로부터 제조되는 항산화 성분 함량이 증진 된 갈색거저리 단백질의 가수분해물에 관한 것이다.
식용곤충의 시장규모는 2007년 11조원에서 2020년 38조원으로 늘어날 것으로 전망된다. 우리나라에서도 곤충산업에 주목하기 시작하여 정부는 2011년 곤충산업육성 5개년 종합계획 발표 후 정책 및 규제 완화를 통해 곤충산업을 육성 중에 있고, 농림축산식품부에서는 2014년 식용곤충을 농식품 32개 핵심규제개혁과제 중 하나로 선정하였다. 2009년에 국내시장규모 1570억원에서 2014년 2000억원으로 성장하였고, 2020년 7000억원까지 성장할 것으로 예상된다.
갈색거저리(Tenebrio molitor)는 딱정벌레목 거저리과의 곤충이며 "갈색쌀거저리"라고도 불리며 현재 한국을 비롯한 전 세계에 분포되어 있고, 강한 적응력을 가지고 있으며 변태 기간이 짧고 사육이 쉬어 산업화에 용이한 이점이 있으며, 2016년 식품공전에 고단백질 소재의 식용곤충원료로 등록되었다.
갈색거저리는 고단백질 소재로서 활용도가 높은 원료이고, 또한 갈색거저리 단백질 가수분해물은 수용성 펩타이드와 아미노산과 같은 항산화 기능성 성분 함량이 증대되는 것으로 알려져 있다. 한 연구에서는 갈색거저리에 상업용 단백가수분해효소를 처리하여 갈색거저리 단백질 가수분해물의 항산화 기능성 성분 함량을 증진시켜 식품 소재를 개발하려는 시도가 있었다 (공개특허 10-2018-0010067호). 그러나, 상업용 단백가수분해효소의 단독 처리는 기질특이성(substrate specificity)으로 인하여 특이도를 갖는 단백질을 가수분해 시키는 바, 갈색거저리 단백질과 같이 여러 단백질이 존재하는 복합 단백질 식품에 대한 가수분해 효과가 충분하지 못하고, 단백가수분해효소 처리량을 높이더라도 가수분해물에 대한 수율은 일정 이상 높일 수 없으며, 오히려 이취와 같은 문제를 야기한다. 이에, 상업용 단백가수분해효소의 단독 처리만으로는 갈색거저리 단백질이 가지는 항산화 기능성 성분을 충분하게 이끌어내지 못한다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 우리나라 전통 술 발효제인 누룩과 상업용 단백가수분해효소를 복합 처리함으로써, 상업용 단백가수분해효소 단독 처리 대비 갈색거저리 단백질 원료로부터 가수분해물을 보다 고수율로 회수할 수 있음을 확인하고, 또한 항산화 기능성 성분 함량이 증진 된 갈색거저리 단백질 가수분해물이 제공될 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 상업용 단백가수분해효소 단독 처리로는 일정 이상 높일 수 없었던 단백질 가수분해물의 낮은 수율 문제와 갈색거저리 단백질이 가지는 항산화 기능성 성분을 충분하게 이끌어내지 못하는 문제를 해결할 수 있는 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 기능성 성분 함량이 증진 된 갈색거저리 단백질 가수분해물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은, 갈색거저리(Tenebrio molitor)에 누룩 및 단백가수분해효소를 처리하여 갈색거저리 단백질을 가수분해하는 단계; 및
상기 누룩 및 단백가수분해효소가 처리된 갈색거저리로부터 단백질 가수분해물을 회수하는 단계;를 포함하는, 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로부터 제조되는, 갈색거저리 단백질의 가수분해물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 갈색거저리 단백질의 가수분해물을 함유하는 항산화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법은 누룩 및 단백가수분해효소를 복합 처리함으로써 갈색거저리 단백질 가수분해물을 고수율로 회수할 수 있고, 또한 항산화 기능성 성분 함량을 증진시킬 수 있는 바, 본 발명의 제조방법으로부터 제조된 갈색거저리 단백질 가수분해물은 보다 향상 된 항산화 기능성의 건강기능식품 조성물로 제공되는 유용한 효과가 있다.
도 1은 갈색거저리 원료에 대한 가수분해 공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 단백가수분해효소 단독 처리, 누룩 단독 처리, 또는 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리 조건에 따른 갈색거저리 단백질 가수분해물의 유리 아미노산 함량을 측정하여 나타낸 것이다.
도 3은 갈색거저리 단백질 원료와 단백가수분해효소 단독 처리, 누룩 단독 처리, 또는 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리 조건에 따른 갈색거저리 단백질 가수분해물의 분자량 구성 범위를 확인한 것이다.
도 4는 단백가수분해효소 단독 처리, 누룩 단독 처리, 또는 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리 조건에 따른 갈색거저리 단백질 가수분해물의 ABTS 항산화 활성 시험결과를 나타낸 것으로, 3 kDa 이하 또는 3 kDa 초과의 펩타이드 분획물 별 항산화 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 단백가수분해효소 단독 처리, 누룩 단독 처리, 또는 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리 조건에 따른 갈색거저리 단백질 가수분해물의 ABTS 항산화 활성 시험결과를 나타낸 것으로, 10 kDa 이하, 10-30 kDa 또는 30 kDa 초과의 펩타이드 분획물 별 항산화 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 단백가수분해효소 단독 처리, 누룩 단독 처리, 또는 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리 조건에 따른 갈색거저리 단백질 가수분해물의 유리 아미노산 함량을 측정하여 나타낸 것이다.
도 3은 갈색거저리 단백질 원료와 단백가수분해효소 단독 처리, 누룩 단독 처리, 또는 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리 조건에 따른 갈색거저리 단백질 가수분해물의 분자량 구성 범위를 확인한 것이다.
도 4는 단백가수분해효소 단독 처리, 누룩 단독 처리, 또는 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리 조건에 따른 갈색거저리 단백질 가수분해물의 ABTS 항산화 활성 시험결과를 나타낸 것으로, 3 kDa 이하 또는 3 kDa 초과의 펩타이드 분획물 별 항산화 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 단백가수분해효소 단독 처리, 누룩 단독 처리, 또는 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리 조건에 따른 갈색거저리 단백질 가수분해물의 ABTS 항산화 활성 시험결과를 나타낸 것으로, 10 kDa 이하, 10-30 kDa 또는 30 kDa 초과의 펩타이드 분획물 별 항산화 활성을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, 갈색거저리에 누룩 및 단백가수분해효소를 처리하여 갈색거저리 단백질을 가수분해하는 단계; 및
상기 누룩 및 단백가수분해효소가 처리된 갈색거저리로부터 단백질 가수분해물을 회수하는 단계;를 포함하는, 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
종래의 상업용 단백가수분해효소를 단독 처리하는 방법은 단백가수분해효소의 기질특이성으로 인하여 특이도를 갖는 단백질을 주로 가수분해시키는 바, 갈색거저리 단백질과 같은 복합 단백질에 대해서는 가수분해 효과가 충분하지 못한 문제가 있고, 설사 처리량을 높이더라도 가수분해 공정의 시간이 단축될 뿐, 수율은 일정 이상 높일 수 없으며, 오히려 제조사가 권고하는 처리량 이상으로 사용하는 경우 이취와 같은 문제를 야기한다. 또한 상업용 단백가수분해효소 단독 처리는 기질 특이성으로 인하여 갈색거저리 단백질이 가지는 다양한 수용성 펩타이와 아미노산 성분들을 충분히 추출해 내지 못하는 문제가 있다.
본 발명의 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법은, 우리나라 전통 술 발효제인 누룩과 상업용 단백가수분해효소를 복합 처리하여 갈색거저리 단백질 가수분해물을 제조하는 방법으로서, 누룩에 존재하는 균과 그 균에 함유되는 다양한 단백가수분해효소의 작용으로부터 상업용 단백가수분해효소가 특이도를 갖지 못하는 단백질까지 가수분해시킬 수 있는 바, 종래의 단백가수분해효소 단독 처리로는 일정 이상 높일 수 없었던 가수분해물 수율을 보다 고수율로 높일 수 있고, 또한 갈색거저리 단백질 원료로부터 추출되는 수용성 펩타이드 및 아미노산의 종류와 함량을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 누룩(NURUK)은 한국의 전통 주류 발효제로서, 곡류를 띄워 누룩곰팡이를 번식시켜 만들어진 것으로, 상기 누룩곰팡이는 예를 들어 황국균(Aspergillus oryzae), 흑국균(Aspergillus niger), 홍국균(Monascus anka, Monascus purpureus, Monascus barkeri) 및 백국균(Aspergillus luchuensis) 중 어느 하나 이상을 사용하여 얻은 것일 수 있다. 한편, 상기 누룩은 전통적인 방법으로 생산된 누룩 외에도 상업적으로 입수 가능한 누룩도 포함되며, 또한 개량 누룩을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 상기 단백가수분해효소는 갈색거저리 단백질에 대하여 가수분해 활성을 갖는 효소로서, 상기 단백가수분해효소는 예를 들어 플레버자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamax), 알칼레이즈(Alcalase) 및 뉴트라제(Neutrase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이다. 또한, 상기 가수분해효소의 처리는 플레버자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamax), 알칼레이즈(Alcalase) 및 뉴트라제(Neutrase)를 조합하여 처리할 수 있는데, 예를 들어 뉴트라제, 알칼레이즈, 프로타맥스, 플레버자임으로 처리할 수 있고, 알칼레이즈 및 플레버자임을 처리할 수 있다.
상기 누룩과 단백가수분해효소는 갈색거저리 원료의 중량 기준으로, 0.1 내지 20 중량%로 첨가될 수 있고, 예를 들어, 0.2 내지 18 중량%, 0.3 내지 15 중량% 또는 0.5 내지 10 중량%로 첨가될 수 있다.
상기 누룩의 경우, 갈색거저리 원료의 중량 기준으로, 1 내지 20 중량%로 첨가될 수 있고, 예를 들어, 2 내지 18 중량%, 3 내지 15 중량% 또는 5 내지 15 중량%로 첨가될 수 있고, 예를 들어 상업용 누룩 5 내지 15 중량% 또는 10중량%를 사용할 수 있고, 또는 개량 누룩 5 내지 15 중량% 또는 10중량%를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 단백가수분해효소의 경우, 갈색거저리 원료의 중량 기준으로, 0.1 내지 10 중량%로 첨가될 수 있고, 예를 들어, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 0.1 내지 3 중량%, 0.2 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1.5 중량%로 첨가될 수 있고, 예를 들어 알칼레이즈 0.5 내지 1.5 중량% 또는 플레버자임 0.5 내지 1.5 중량%를 사용할 수 있고, 또는 알칼레이즈 및 플레버자임 혼합 효소를 0.5 내지 1.5 중량%로 사용할 수 있다.
한편, 상기 누룩 및 단백가수분해효소의 처리 시간은 30분 내지 30시간, 40분 내지 25시간, 60분 내지 20시간, 2 내지 20시간, 5 내지 20시간, 10 내지 20시간, 또는 15 내지 20시간, 17 내지 19시간, 또는 약 18시간 동안 처리할 수 있다.
상기 누룩의 처리 시간은 5 내지 20시간, 10 내지 20시간, 또는 15 내지 20시간, 17 내지 19시간, 또는 약 18시간 동안 처리할 수 있다.
상기 단백가수분해효소의 처리 시간은 30분 내지 5시간, 40분 내지 3시간, 60분 내지 2시간, 70분 내지 110분, 80분 내지 100분, 또는 약 90분 동안 처리할 수 있다.
다른 한편, 상기 누룩 및 단백가수분해효소의 처리 시 pH는 4 내지 8 또는 4.5 내지 7이다.
상기 누룩의 처리 시 pH는 4 내지 6, 4.2 내지 5 또는 약 4.5이다.
상기 단백가수분해효소의 처리 시 pH는 6 내지 8, 6.5 내지 7.5 또는 약 7이다.
또 다른 한편, 상기 누룩 및 단백가수분해효소 처리 시 온도는 20 내지 80℃, 30 내지 70℃, 40 내지 60℃, 45 내지 55℃, 또는 약 50℃이다.
상기 누룩 처리 시 온도는 20 내지 50℃, 30 내지 40℃, 35 내지 40℃, 또는 약 36℃이다.
상기 단백가수분해효소의 처리 시 온도는 30 내지 80℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 약 50℃이다.
상기 갈색거저리 단백질 가수분해물을 회수하는 단계는 공지의 방법을 제한 없이 사용할 수 있고, 예를 들어 가수분해 반응 후 원심분리 하여 층 분리시키고, 상등액을 취하는 것으로부터, 갈색거저리 단백질 가수분해물을 회수할 수 있다.
상기 갈색거저리 단백질 가수분해 단계에서 갈색거저리는 건조, 분말화 및 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있고, 분말화 된 갈색거저리 원료로 사용하여 가수분해시키는 것일 수 있다. 상기 건조, 분말화 및 멸균 단계는 공지의 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 단백질 가수분해 단계 이후에는 단백가수분해 반응을 종료시키기 위하여, 효소실활 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 효소실활 단계는 공지의 방법을 제한 없이 사용할 수 있고, 예를 들어 pH 또는 온도를 조절하여 단백가수분해효소의 활성을 실활시킬 수 있고, 본 발명의 일 구체예에서, 반응계 온도를 70 내지 90℃ 또는 약 80℃로 할 수 있고, 5 내지 30분, 10 내지 20분 또는 약 15분 동안 처리하여 효소 반응을 실활시킨다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 상기 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법은 회수 된 갈색거저리 단백질 가수분해물을 분획하여 분획물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분획은 공지의 단백질 분획 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있고, 예를 들어 회수 된 갈색거저리 단백질 가수분해물을 분자량 크기에 따라 구분하여 분획하는 것일 수 있다. 또한, 상기 분획단계로부터 얻어지는 분획물은 30 kDa 이하, 20 kDa 이하, 또는 10 kDa 이하의 분획물일 수 있고, 또는 3 내지 30 kDa, 3 내지 20 kDa, 또는 3 내지 10 kDa의 분획물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명자들은 갈색거저리 단백질 원료에 대하여 단백가수분해 단독 처리, 누룩 단독 처리, 또는 누룩과 단백가수분해효소 복합 처리하여 얻어진 각각의 갈색거저리 단백질 가수분해물에 대하여 품질 특성을 비교한 결과, 누룩과 단백가수분해효소 복합 처리군에서 단백가수분해 단독 처리 대비 우수한 품질 특성을 확인하였다. 구체적으로, 각 처리 조건 별 얻어진 갈색거저리 단백질 가수분해물의 수율을 확인한 결과, 단백가수분해효소 단독 처리군 대비 누룩과 단백가수분해효소 복합 처리군에서 수율이 47%로 향상된 것을 확인하였다(표 2 참조). 또한, 각 처리 조건 별 얻어진 갈색거저리 단백질 가수분해물에 함유 된 유리 아미노산 함량을 분석한 결과, 단백가수분해효소 단독 처리군 대비 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리군에서 갈색거저리 단백질 가수분해물의 아미노산 함량이 증가 된 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 각 처리 조건 별 얻어진 갈색거저리 단백질 가수분해물의 유기물 함량을 분석한 결과, 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리를 통하여 갈색거저리 원료에 함유 된 단백질 성분의 약 77% 이상이 추출되었음을 확인하였다(표 3 참조).
또한, 각 처리 조건 별 얻어진 갈색거저리 단백질 가수분해물의 항산화 활성을 분석한 결과, 단백가수분해효소 단독 처리군 대비 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리군에서 보다 우수한 항산화 활성이 확인되었다. 또한 얻어진 단백질 가수분해물의 크기 별 항산화 활성을 분석한 결과, 3 kDa 초과의 고분자단백질 보다 3 kDa 이하의 저분자 펩타이드의 항산화 활성이 우수한 것으로 확인되었으며(도 4 참조), 10 kDa 미만의 펩타이드 분획에서는 단백가수분해효소 단독 처리군의 항상화 활성이 65%인 것에 비하여, 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리군에서는 10 kDa 미만 펩타이드의 항산화 활성이 70% 이상으로 나타나 항산화 기능성 성분 함량이 증가되었음을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로부터 제조되는, 갈색거저리 단백질의 가수분해물을 제공한다.
본 발명의 누룩 및 단백가수분해효소 처리를 통해 얻어진 갈색거저리 단백질의 가수분해물은 갈색거저리 원료에 함유 된 단백질 성분의 약 77% 이상을 추출하여 얻어진 가수분해물로서, 종래 단백가수분해효소 단독 처리를 통해 얻어진 갈색거저리 단백질의 가수분해물 대비 유리 아마노산 함량이 높은 바, 아미노산 함량이 풍부한 식품 조성물, 사료 조성물 등으로 활용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 갈색거저리 단백질의 가수분해물을 함유하는 항산화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 누룩 및 단백가수분해효소 처리를 통해 얻어진 갈색거저리 단백질의 가수분해물은 종래 단백가수분해효소 단독 처리를 통해 얻어진 갈색거저리 단백질의 가수분해물 대비 항산화 활성을 갖는 펩타이드 분획의 함량이 높고, 보다 높은 항산화 활성을 나타내는 바, 항산화 기능성이 증진된 건강기능식품 조성물이 제공된다.
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명의 일부를 예시하는 것일 뿐, 본 발명에 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 누룩 및 단백가수분해효소 처리 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조
<1-1> 갈색거저리 원료의 준비
전남 담양지역에 위치한 곤충사육 농가로부터 생산 된본 발명에서 사용된 갈색거저리(밀웜; Tenebrio molitor L.) 유충을 72시간 동안 절식시키고, 세척한 뒤 살균처리하고, 열풍건조시킨 후, 가정용 분쇄기로 분쇄하여 갈색거저리 원료 분말을 준비하였다.
<1-2> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조
준비 된 갈색거저리 원료 분말에 적당량의 물을 첨가한 뒤, 원료 분말 중량 대비 Alcalase 0.5 중량% 및 Flavourzyme 1 중량%를 첨가하여 pH 7 및 50℃ 조건에서 90분 동안 처리하고, 이어서 원료 분말 중량 대비 상업용 누룩 10 중량%를 첨가하여 pH 4.5 및 36℃ 조건에서 18시간 동안 처리하여 가수분해 반응을 실시하였다. 가수분해 후 원심분리를 통해 층을 분리시키고, 갈색거저리 단백질 가수분해물로서 상등액 부분을 회수하였으며, 침전물은 갈색거저리 외피(키틴)에서 유래한 불용성 잔사로 구분하였고, 상등액과 침전물은 각각 동결건조하여 시료로 활용하였다.
<비교예 1> 누룩 단독 처리 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조
상기 <1-1>에서 준비 된 갈색거저리 원료 분말에 적당량의 물을 첨가한 뒤, 원료 분말 중량 대비 상업용 누룩 10 중량%를 첨가하여 pH 4.5 및 36℃ 조건에서 18시간 동안 처리하여 가수분해 반응을 실시하였다. 가수분해 후 원심분리를 통해 층을 분리시키고, 갈색거저리 단백질 가수분해물로서 상등액 부분을 회수하였으며, 침전물은 갈색거저리 외피(키틴)에서 유래한 불용성 잔사로 구분하였고, 상등액과 침전물은 각각 동결건조하여 시료로 활용하였다.
<비교예 2> 단백분해효소 단독 처리 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조
상기 <1-1>에서 준비 된 갈색거저리 원료 분말에 적당량의 물을 첨가한 뒤, 원료 분말 중량 대비 Alcalase 0.5 중량% 및 Flavourzyme 1 중량%를 첨가하여 pH 7 및 50℃ 조건에서 90분 동안 처리하여 가수분해 반응을 실시하였다. 가수분해 후 원심분리를 통해 층을 분리시키고, 갈색거저리 단백질 가수분해물로서 상등액 부분을 회수하였으며, 침전물은 갈색거저리 외피(키틴)에서 유래한 불용성 잔사로 구분하였고, 상등액과 침전물은 각각 동결건조하여 시료로 활용하였다.
상기 실시예 1, 비교예 1 및 2에서 실시한 가수분해 반응 조건을 아래 표 1로 나타내었다.
| 실험군 | 적용 효소 및 사용량(중량%) | 반응 조건(pH, 온도, 시간) | |
| 실시예 1 | MW - CN - AF | CN(10), A(0.5) F(1) | pH 7, 50℃, 90분 처리 후, pH 4.5, 36℃, 18시간 처리 |
| 비교예 1 | MW - CN | CN(10) | pH 4.5, 36℃, 18시간 처리 |
| 비교예 2 | MW - AF | A(0.5) F(1) | pH 7, 50℃, 90분 처리 |
(상기 표에서, MW : Mealworm A : Alcalase 2.4L, F : Flavourzyme 100L, C : celluclast, V : viscozyme, CN : 상업용 누룩)
<실험예 1> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 수율
상기 실시예 1과 비교예 1 및 2에서 원심분리 후 얻어진 갈색거저리 단백질 가수분해물 상등액과 불용성 침전물을 구분하여 각각 동결건조 후 회수된 샘플의 무게를 정밀히 측정하고, 아래의 수식으로 가수분해 수율을 도출하였고, 그 결과를 아래 표 2에 나타내었다.
| 실험군 | 가수분해 수율(%) | |
| 실시예 1 | MW - CN - AF | 47 |
| 비교예 1 | MW - CN | 30.18 |
| 비교예 2 | MW - AF | 41.08 |
(상기 표에서, MW : Mealworm A : Alcalase 2.4L, F : Flavourzyme 100L, C : celluclast, V : viscozyme, CN : 상업용 누룩)
표 2를 보면, 단백가수분해효소 단독 처리군의 가수분해물 수율은 약 41%로 나타났으며, 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리군의 가수분해 수율은 47%로 향상 되었음이 확인된다.
<실험예 2> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 유리 아미노산 함량
상기 실시예 1과 비교예 1 및 2에서 얻어진 갈색거저리 단백질 가수분해물의 유리 아미노산 함량을 측정하기 위해 AccQ-Tag법을 사용하였으며 아미노산 유도체화를 위해 Waters AccQ-Tag Ultra Derivatization kit(Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였다. 분석은 Waters ACQUITY UPLC system(Waters, USA)과 2.1×100 mm AccQ-Tag Ultra column(Waters, USA)을 사용하였고 이동상용매는 AccQ-Tag Ultra Eluent A & B (Waters, USA)를 사용하였고, 샘플 20℃, column 55℃, 검출기 260 nm, 유속은 0.7 mL/min의 조건으로 키트에서 제시한 구배(gradient)를 사용하여 측정하였다. 아미노산 표준물질은 amino acid standard H (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA)를 사용하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 보면, 단백가수분해효소 단독 처리군의 유리 아미노산 함량 대비 본 발명의 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리군의 유리아미노산 함량이 향상되었음이 확인된다.
<실험예 3> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 유기물 함량
갈색거저리 단백질 원료와 상기 실시예 1과 비교예 1 및 2에서 얻어진 갈색거저리 단백질 가수분해물의 유기원소(탄소, 질소) 함량 변화를 분석하기 위하여 가수분해 반응 후 상등액 및 불용성 잔사를 분획하여 동결건조기(MCFD8518, Ilshin Lab Co. Lat, Seoul, Korea)를 사용해 응측기 온도 -80℃, 압력 5 mmTorr 조건하에서 120 시간 동결 건조된 시료를 균일하게 마쇄하여 분석시료로 사용하였다. 탄소 및 질소 분석은 N2O를 N2로 환원시켜 N2가스의 부피를 측정하여 정량하는 Dumas법으로 0.2g씩 칭량 후, 원소분석기(Elementary, vario MAX cube., Germany)를 사용하였으며, 조단백질 함량은 질소 농도에 갈색거저리 단백질 환산 계수 4.76을 곱하여 표시하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 실험군 | 질소 함량(%) | 단백질 함량 | ||
| 상등액 | 불용성 잔사 | 상등액 | ||
| 실시예 1 | MW - CN - AF | 7.1441 | 9.21 | 34.0 |
| 비교예 1 | MW - CN | 5.2353 | 10.10 | 24.9 |
| 비교예 2 | MW - AF | 6.25 | 10.839 | 29.7 |
| Raw MW (갈색거저리 단백질 원료) |
9.27 | 44.1 | ||
갈색거저리 단백질에 대하여 각 처리 조건별 가수분해를 통해 저분자화 된 단백질 성분이 수용액 성분에 녹아들게 되므로, 시료 내의 수용성 단백질 함량을 확인하기 위해 질소함량을 확인한 후 이를 단백질 함량으로 환산하였다.
표 3을 보면, 갈색거저리 원료에 함유된 44.1%의 단백질 함량이 단백가수분해효소 단독 처리군 가수분해물에는 29.7% 함유되어 약 67% 회수되는 것으로 확인되고, 본 발명의 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리군 가수분해물에는 34.0% 함유되어 약 77% 회수되는 것으로 확인된다.
한편, 불용성 잔사에 함유된 질소 함량이 10% 수준으로 높게 측정되는 것은 갈색거저리 등 식용곤충의 외벽을 구성하는 키틴이 글루코사민 등 비단백질 질소를 함유하는 단위물질로 이루어진 것에 기인한다는 연구보고가 있으며, 그에 따라 함량이 높게 나타나는 것으로 판단되었다.
<실험예 4> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 펩타이드 분자량 범위
<4-1> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 분자량 확인을 위한 FPLC 이용 수용성 펩타이드 분획 구성범위 측정
갈색거저리 단백질 원료와 상기 실시예 1과 비교예 1 및 2에서 얻어진 갈색거저리 단백질 가수분해물의 분자량 구성 범위를 확인하기 위한 실험조건은 다음과 같다. 단백질 사이즈 배제 크로마토그래피 전용 컬럼(SEC, size exclusive chromatography; Superdex 30 increase 10/300 GL,)을 FPLC(AKTA explorer 100, GE healthcare, Sweden) 분석 기기에 장착하여, 각 조건별 가수분해 반응 후 상등액의 동결건조분을 동량을 사용하여 동일한 단위부피에 녹인 용액을 10mg/mL로 주입하고, eluent buffer(phosphate saline buffer)를 0.5ml/ml 유속으로 흘려 컬럼을 통과시켜 각각의 조건으로 가수분해 반응 후 상등액에 함유 된 수용성 펩타이드 분자량을 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때 SEC 방식의 경우 고분자 물질이 먼저 컬럼을 통과하므로 10분에 용출되는 물질이 60분에 용출되는 물질보다 더 고분자 물질형태를 가진 것으로 추측할 수 있다.
<4-2> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 수용성 펩타이드 분획 분자량 구성 범위 결과
도 3을 보면, 갈색거저리 단백질 원료는 10-20분, 55-60분 사이에 통과되는 수용성 펩타이드 물질로 구성된 것으로 확인되었고, 갈색거저리 단백질 원료에서 15분대 확인된 물질이 갈색거저리 단백가수분해효소 단독 처리군 가수분해물에서는 30-40분 사이에 용출되는 물질로 변화된 것으로 확인되었다. 반면 누룩 단독 처리군의 가수분해물에서는 10-20분에 용출되는 물질이 적고 38분, 45분, 56분에 특징적인 물질로 가수분해됨을 확인하였다. 또한 누룩과 단백가수분해효소 복합 처리군의 가수분해물의 크로마토그램의 결과는, 동량의 샘플을 구성하는 수용성 펩타이드의 물질의 함량이 증가한 것을 40분 44분, 58분, 60분에 용출되는 피크의 면적을 통해 유추할 수 있었으며, 복합 처리 결과의 효과가 우수함을 확인하였다.
<실험예 5> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 항산화 활성
<5-1> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 3 kDa 이하 또는 3 kDa 초과 분획물 별 항산화 활성 측정
갈색거저리 단백질 가수분해물의 항산화 활성을 확인하기 위하여 ABTS 항산화 활성을 시험하였다. 이때 항산화활성에 효과적인 가수분해 펩타이드 크기를 확인하기 위해 센트리콘(centricon) 형태의 멤브레인 필터를 사용하여 3 kDa 이하 또는 3 kDa 초과 분획물로 펩타이드를 구분하여 항산화 활성을 정량하였다.
갈색거저리 분해물의 총 항산화 활성은 ABTS(2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 라디칼 소거 활성에 의해 나타내었다. ABTS를 과황산칼륨과 반응시켜 라디칼 양이온을 제조한 뒤 이어서, 1 mL의 ABTS 용액을 6 분 동안 샘플과 반응시켜 주었고, 라디칼 소거능 백분율을 계산하여, 도 3에 나타내었다.
도 3을 보면, 단백가수분해효소 단독 처리군 대비 본 발명의 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리군이 3 kDa 이하 또는 3 kDa 초과 펩타이드 분획물 둘 모두에서 보다 우수한 항산화 활성이 확인된다.
<5-2> 갈색거저리 단백질 가수분해물의 10 kDa 이하, 10-30 kDa 또는 30 kDa 초과 분획물 별 항산화 활성 측정
상기 <5-1>에서 확인한 3 kDa 초과 펩타이드의 항산화 활성의 경우, 한외여과 방식의 분자량크기별 분획과정에서 상대적으로 큰 분자량의 물질이 농축되는 효과에 기인하여 나타나는 값일 수 있으므로, 갈색거저리 단백질 가수분해물을 30 kDa 사이즈 필터로 거른 후, 이를 다시 10 kDa 사이즈 필터로 거르는 방법으로, 10 kDa 이하, 10-30 kDa 또는 30 kDa 초과의 분획물로 구분하여 항산화 활성을 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 보면, 10 kDa 미만의 펩타이드 분획물의 경우 단백가수분해효소 단독 처리군은 항산화활성이 약 65%인 것에 비하여, 본 발명의 누룩 및 단백가수분해효소 복합 처리군에서는 10 kDa 미만 펩타이드의 항산화 활성이 약 70% 이상으로 확인된다.
Claims (10)
- 갈색거저리(Tenebrio molitor)에 누룩 및 단백가수분해효소를 처리하여 갈색거저리 단백질을 가수분해하는 단계; 및
상기 누룩 및 단백가수분해효소가 처리된 갈색거저리로부터 단백질 가수분해물을 회수하는 단계;를 포함하는, 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 누룩은 황국균, 흑국균, 홍국균 및 백국균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하여 얻어진 누룩인 것을 특징으로 하는, 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단박가수분해효소는 플레버자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamax), 알칼레이즈(Alcalase) 및 뉴트라제(Neutrase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백가수분해효소인 것을 특징으로 하는, 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단백가수분해효소의 처리는 pH 6 내지 8 및 온도 40 내지 60℃의 조건에서 60분 내지 120분 동안 처리하는 것인, 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 누룩의 처리는 pH 4 내지 6 및 온도 30 내지 40℃의 조건에서 10 내지 20시간 동안 처리하는 것인, 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단백가수분해효소의 처리는 갈색거저리 원료 중량 대비 0.1 내지 5 중량%로 처리하고, 및 상기 누룩의 처리는 갈색거저리 원료 중량 대비 1 내지 20 중량%로 처리하는 것을 특징으로 하는, 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 누룩 및 단백가수분해효소를 처리하여 갈색거저리 단백질을 가수분해하는 단계는,
1) 갈색거저리에 단백가수분해효소를 갈색거저리 원료 중량 대비 0.1 내지 5 중량%로, pH 6 내지 8 및 온도 40 내지 60℃의 조건에서 60분 내지 120분 동안 처리하는 단계; 및
2) 상기 단백가수분해효소가 처리 된 갈색거저리에 누룩을 갈색거저리 원료 중량 대비 1 내지 20 중량%로, pH 4 내지 6 및 온도 30 내지 40℃의 조건에서 10 내지 20시간 동안 처리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법.
- 제1항의 제조방법으로부터 제조되는 갈색거저리 단백질 가수분해물.
- 제8항에 있어서, 상기 갈색거저리 단백질 가수분해물은 10 kDa 이하의 분자량을 갖는 펩타이드 분획물인 것을 특징으로 하는, 갈색거저리 단백질 가수분해물.
- 제8항의 갈색거저리 단백질 가수분해물을 함유하는 항산화용 건강기능식품 조성물.
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| KR1020200127420A KR102586229B1 (ko) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | 누룩 및 단백가수분해효소를 사용한 갈색거저리 단백질 가수분해물의 제조방법 및 항산화 성분 함량이 증진 된 갈색거저리 단백질의 가수분해물 |
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| KR20220136528A (ko) * | 2021-03-30 | 2022-10-11 | 강원대학교산학협력단 | 식물 및 곤충 단백질 가수 분해물을 이용한 배양육 제조를 위한 최적 배양 방법 및 그 응용 |
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| 학위논문('식용곤충 단백질 발효추출물 제조와 이를 이용한 육포 형태의 육류대체식품', 강상훈, 세종대학교, 2019년 02월 28일) * |
| 한국식품영양과학회지 제46권 제4호, 435_441쪽, 2017년 04월 30일. * |
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