KR20220136528A - 식물 및 곤충 단백질 가수 분해물을 이용한 배양육 제조를 위한 최적 배양 방법 및 그 응용 - Google Patents

식물 및 곤충 단백질 가수 분해물을 이용한 배양육 제조를 위한 최적 배양 방법 및 그 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물 세포 배양용 배지 조성물에 있어서, 첨가제 중 혈청 대용으로 식물 단백질 가수분해물 또는 곤충 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 동물 세포 배양용 조성물에 관한 것으로, 식물 및 곤충 유래 단백질 가수 분해물(10 %)은 조 분리물에 비해 시험관 내 생존력과 근 모세포 단백질 마커 발현을 향상시켜, 이는 단백질 가수분해물을 배양 조성물에 혈청 대체제로 사용할 수 있는 효과가 있으며, 산화 스트레스 완화에 이상적인 식단 공급원으로 사용될 수 있는 천연 유래 단백질 보충제의 역할과 잠재적인 항산화 특성을 제공한다.

Description

식물 및 곤충 단백질 가수 분해물을 이용한 배양육 제조를 위한 최적 배양 방법 및 그 응용{A METHOD OF OPTIMAL CULTIVATION FOR PREPARING CULTURED MEAT USING PLANT AND INSECT PROTEIN HYDROLYSATE AND APPLICATION OF THE SAME}
본 발명은 식물 및 곤충 단백질 가수 분해물을 이용한 배양육 제조를 위한 최적 배양 방법 및 그 응용에 관한 것이다.
2050년이 되면 전 세계 인구는 90억 명에 이르고, 인류의 육류 소비량 역시 465백만 톤에 달할 것으로 추정되고 있으며, 이에 국제연합식량농업기구(FAO)는 증가하는 육류 수요를 맞추기 위해 매년 2억 톤의 추가 생산이 필요함을 발표한 바 있다.
또, 최근 들어 가축 광우병, 구제역 등의 가축 질병 문제, 가축 내장에 함유되어 있던 병원균이 가공 과정에서 사멸되지 않음으로 인해 각종 질환을 야기시키는 사례가 속속 발생하고 있어 사회적으로 큰 문제점을 야기시키고 있다.
한편, 기능성 식품의 세포 보호 효과는 세포 산화 스트레스를 제거하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 오랫동안 연구되어 왔다. 산화 스트레스는 세포 내부에 슈퍼 옥사이드 음이온 (O-), 하이드 록실 음이온 (OH-), 과산화수소 (H2O2)와 같은 활성 산소 종 (ROS)이 축적되어 질병 발생에 중요한 역할을 한다.
일반적으로 세포의 항상성, 신호 전달, 병원체 사멸,자가 포식, 세포 분열 등 다양한 생물학적 기능을 수행하는 호흡 또는 대사 과정에서 활성 산소가 세포 내부에서 생성된다. 실제로, 과도한 ROS 축적은 비정상적인 산화 및 항산화 효과를 일으켜 산화 스트레스로 인한 세포 사멸을 초래한다.
세포 내 ROS의 상승 된 수준은 또한 심각한 DNA 손상, 단백질 손상 및 지질 과산화를 유발한다. 그 결과 심혈관 질환 (CVD), 신경 퇴행성 질환 (NDD), 만성 염증성 질환 (CID), 심지어 암과 같은 다양한 치명적 질환이 발생하고 있다.
따라서 산화 스트레스를 개선하기 위해 항산화 물질을 사용하는 것이 주요 관심사이다. 천연 유래 항산화제와 비교하여 합성 항산화제(부틸화 하이드록시 아니솔 및 부틸화 하이드록시톨룬)는 간 손상 등의 잠재적 위험이 있다.
따라서 천연 유래 항산화제의 개발은 인체의 스트레스 반응을 줄이는 데 중요하다. 폴리페놀, 알칼로이드 등과 같은 천연 유래 비 단백질 성분은 종종 항산화 제의 공급원으로 사용된다.
천연 유래 단백질 가수 분해물 (PH)은 높은 항산화 특성으로 인해 큰 관심을 받고 있다. PHs는 주로 스트레스 감소제로 작용하는 몇 가지 생리 활성 펩타이드를 포함한다.
한편, 골격근은 살아있는 유기체의 수축 운동을 담당하는 복잡한 다핵 구조이다.
배아 단계에서, 근 형성 전구 세포는 증식으로 알려진 과정에 의해 숫자가 증가한다. 나중에 전구 세포가 정렬되고 융합되어 근관으로 알려진 다핵 세포를 형성하며, 이는 수축성 근섬유로 더욱 발전한다.
성인의 경우 위성 세포 (SC)는 기저층과 근섬유의 혈장 기본형 사이에 위치한다. 새로운 myotube의 형성은 근육 조직에서 SC의 활성화, 증식 및 융합에 의해 크게 영향을 받는다. 근육 조직이 부상이나 스트레칭과 같은 다양한 외부 자극을 받으면 SC가 활성화되고 융합되어 근 모세포를 형성한다. 따라서 통제된 환경에서 근육 세포의 분리 및 체외 배양은 근육 생리학 및 분화 과정을 연구할 수 있는 기회를 제공한다.
[선행 특허 문헌]
대한민국특허공개번호10-2018-0132325(2018년12월12일)
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 혈청 대체 또는 감소된 혈청 첨가량을 포함하는 동물 세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 소 근육 위성 세포 (bMSC) 배양 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 동물 세포 배양용 배지 조성물에 있어서, 첨가제 중 혈청 대용으로 식물 단백질 가수분해물 또는 곤충 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 동물 세포 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서,
상기 식물 단백질 가수분해물은 대두 단백질 가수분해물, 완두콩 단백질 가수분해물 및 글루텐 단백질 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 가수분해물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서,
상기 대두 단백질 가수분해물은 알카레이즈(Alcalase)로 대두 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12.7 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하고,
뉴트라제(Neutrase)로 대두 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 35 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
상기 완두콩 단백질 가수분해물은 뉴트라제(Neutrase)로 완두콩 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 36 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
상기 글루텐 단백질 가수분해물은 플라보자임(flavourzyme)으로 글루텐 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 160 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서,
상기 곤충 단백질 가수분해물은 딱정벌레 단백질 가수분해물, 귀뚜라미 단백질 가수분해물 및 밀웜(Meal-worm) 단백질 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 가수분해물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서,
상기 딱정벌레 단백질 가수분해물은 알카레이즈(Alcalase)로 딱정벌레 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하고,
뉴트라제(Neutrase)로 딱정벌레 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 26 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
상기 귀뚜라미 단백질 가수분해물은 알카레이즈(Alcalase)로 귀뚜라미 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하고,
뉴트라제(Neutrase)로 귀뚜라미 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
상기 밀웜 단백질 가수분해물은 뉴트라제(Neutrase)로 밀웜 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
상기 조성물은 식물 단백질 가수분해물 또는 곤충 단백질 가수분해물은 전체 조성물 중에 10 중량 % 포함하고, 우태아 혈청은 5 중량 % 이하 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서,
상기 동물 세포는 소 근육 위성(bovine myosatellite) 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 인 비트로에서 소 근육 위성(bovine myosatellite) 세포 배양 중에 배양 조성물에 뉴트라제(Neutrase)로 딱정벌레 단백질을 가수분해된 단백질 가수 분해물 을 10% 첨가하여 상기 세포에서 데스민과 미오게닌의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
고 포도당 배지의 포도당 농도는 4500.0 mg/L인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서,
상기 성장 배지의 조성은 L-alanyl-L-glutamine 다이펩타이드를 포함하는 10% 우태아 혈청, 1 % 페니실린-스트렙토마이신 및 Amphotericin-B를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 단백질 가수분해물을 포함하는 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 [0036] 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있고, 그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 더 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
또한, 식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
상기 식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 단백 가수분해물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
일반적으로 단백질 가수 분해물 (PHs)은 항산화 펩티드를 포함한 여러 생리 활성 성분의 풍부한 공급원이다.
본 발명에서는 일부 식물 및 식용 곤충 유래 PH의 효과와 항산화 특성을 조사했다.
이를 위해 다양한 시판 프로테아제 (alcalase, neutrase 및 flavourzyme)를 사용하고 Glycine max (대두), Cajanus cajan (비둘기 완두콩), Triticum vulgare (글루텐 추출물), Protaetia bervitarsis (딱정벌레), Gryllus bimaculatus (크리켓) 및 Tenebrio molitor (밀웜) 단백질 분리물을 제조하였다.
PHs는 궁극적으로 소 myosatellite 세포의 체외 생체 적합성 측정을 위해 테스트되었다. 세포 보호 특성은 또한 DCF-DA 염색 방법을 통해 조사되었다.
생성된 가수 분해물은 나트륨 도데실설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 결정된 바와 같이 조 분리물에 비해 저 분자량 밴드를 나타냈다. 더욱이, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 분석은 alcalase 및 neutrase 처리된 PH의 자유 라디칼 감소의 향상을 보여주었다. 또한 식물 유래 PH와 곤충 유래 PH는 모두 myosatellite 세포에서 H2O2로 유도된 산화 스트레스에 대해 우수한 세포 보호 활성을 나타냈다. desmin 및 myogenin과 같은 근 모세포 단백질 마커의 발현은 PHs 처리된 세포에서 유의하게 증가했다. 종합하면, 우리의 결과는 대두와 딱정벌레 유래 PH가 탁월한 세포 보호 효과로 인해 이상적인 식품 재료로 사용될 수 있음을 시사한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 식물 및 곤충 유래 단백질 가수 분해물이 항산화성이며 육류 샘플에서 추출한 소 근성 세포의 세포 내 ROS를 제거하는 데 도움이된다는 것을 입증하였으며, 우수한 항산화 활성으로 인해 가수 분해물 (10 %)은 조 분리물에 비해 시험관 내 생존력과 근 모세포 단백질 마커 발현을 향상시켜, 이 단백질 가수분해물을 배양 조성물에 혈청 대체제로 사용할 수 있는 효과가 있으며, 산화 스트레스 완화에 이상적인 식단 공급원으로 사용될 수 있는 천연 유래 단백질 보충제의 역할과 잠재적인 항산화 특성을 제공한다.
도 1은 식물 단백질 가수 분해물 및 곤충 단백질 가수분해물의 제조와 관련된 개략도이고,
도 2는 단백질 가수 분해물의 특성화를 나타낸 그림으로,
(a-b) PPH 및 IPH의 효소 분해 후 가수 분해 정도.
(c) 가수 분해물의 디지털 사진. 및 (d) 단백질 단리 물 및 해당 가수 분해물의 나트륨 도데 실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 분석.
도에서 AH, 알칼라제 가수 분해물; NH, 뉴트라제 효소 가수 분해물; FH, 플라보자임 가수 분해물; M, 마커. 데이터는 3 회 반복 실험 (n = 3)의 평균 ± SD, * p <0.05에서 통계적 유의성임.
도 3은 단백질 가수 분해물의 항산화 특성을 나타낸 그림으로,
(a) SPI (AH) 및 SPI (NH), (b) PPI (AH), PPI (NH) 및 GI (FH), (c) BPI (AH) 및 BPI (NH)의 시간에 따른 항산화 활성 , (d) CPI (AH) 및 CPI (NH), (e) WPI (AH) 및 WPI (NH). 데이터는 3 회 반복 실험 (n = 3)의 평균 ± SD, * p <0.05에서 통계적 유의성임.
도 4는 소 myosatellite 세포의 분리 및 특성을 나타낸 그림으로,
(a) 처음 7-12 일 이내에 초기 성장을 보여주는 근성 세포의 형태학적 특징. 그 후 세포를 분화 배지에서 배양하였다. 분화된 세포는 전형적인 근 모세포 형태를 나타낸다. 스케일 바 : 스케일 바 : 100 μm.
(b) 3 일 동안 성장 및 분화 배지에서 myosatellite 세포의 대표적인 면역 세포 화학적 염색. 스케일 바 : 스케일 바 : 100 μm.
도 5는 표시된 시간 간격에서 (a) PPH 및 (b) IPH의 존재하에 소 myosatellite 세포의 시험관 내 세포 독성 평가를 나타낸 그림으로, 데이터는 3 회 반복 실험 (n = 3)의 평균 ± SD, * p <0.05에서 통계적 유의성임.
도 6은 인큐베이션 3 일 후 PPH 및 IPH의 존재하에 소 myosatellite 세포의 면역 세포 화학 염색을 나타낸 것으로,
(a) 10 % SPI (NH) 및 BPI (NH) 처리 된 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지는 (b) 해당 정량 값으로 desmin 및 myogenin에 대해 양성을 나타낸다.
데이터는 3 회 반복 실험 (n = 3)의 평균 ± SD, * p <0.05에서 통계적 유의성임. 스케일 바 : 100 μm.
도 7은 H2O2로 인한 산화 세포 손상에 대한 PH의 세포 보호 효과를 나타낸 그림으로,
(a) PHs 처리된 세포의 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석. 세포는 DCF-DA로 염색되었고 약 5,000 개의 이벤트가 M1 게이트에서 계수되었다.
(b) 세포 내부의 ROS를 보여주는 세포의 대표적인 형광 현미경. 스케일 바 : 100 μm.
(c) DCF의 형광 강도 측정. 데이터는 3 회 반복 실험 (n = 3)의 평균 ± SD, * p <0.05에서 통계적 유의성.
도 8 및 도 9는 각각 SDS-PAGE에 의한 본 발명의 식물 단백질 가수분해물(PPH) 및 곤충 단백질 가수분해물(IPH)에 대한 밴드 강도의 정량화 값을 나타낸 그림,
도 10은 본 발명의 PPH 및 IPH의 DPPH 감소 디지털 사진, 및
도 11은 Desmin 및 Myogenin의 형광 강도의 정량적 값을 나타낸 그래프.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 물질
식물 유래 단백질 분리물 (대두, 완두콩 및 글루텐)은 Pingdingshan Tianjin Plant Albumen Co. Ltd. (중국, Pingdingshan), The Green Labs LLC (Clifton, New Jersey, USA) 및 ADM Chamtor Ltd. (Bazancourt, 프랑스)에서 얻었다.
Alcalase (2.4L), Neutrase (0.8L) 및 Flavourzyme (1000L)를 포함한 프로테아제 효소는 Novozymes Ltd., Bagsvaerd, Denmark에서 조달했다.
곤충 샘플(Protaetia bervitarsis, Gryllus bimaculatus 및 Tenebrio molitor)은 현지 농장 (대한민국 원주 고대 농장)에서 획득했다.
실시예 2: 식물 단백질 가수 분해물 (PPH)의 제조
식물 유래 단백질 가수 분해물은 Yoon, S.; Wong, N.A.; Chae, M.; Auh, J.-H. Foods 2019, 8, 563에서 보고 된 것을 약간 변형을 가하여 제조되었다.
요약하면, 3 개의 상업적 단백질 분리물을 20 배의 멸균 증류수로 수화시키고 격렬하게 교반하면서 90 °C에서 15 분 동안 저온 살균했다.
다음으로 온도를 50 °C로하고, 살균된 용액에 효소 용액을 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50 °C에서 12 시간 동안 반응시켰다. 효소 분해 후 100 °C에서 20 분 동안 가열하여 반응을 중단시켰다.
다음으로, 혼합물을 실온에서 냉각시키고 3,220g에서 15 분 동안 원심분리하여 정제한 후 여과하였다. 제조 과정은 도 1에 간략하게 설명되어 있다.
실시예 3: 곤충 단백질 가수 분해물 (IPH)의 제조
Ganguly, K.; Jeong, M.-S.; Dutta, S.D.; Patel, D.K.; Cho, S.-J.; Lim, K.-T. Molecules 2020, 25, 6056에서 보고 된 바와 같이 곤충 단백질 분리물을 제조하였다.
IPH 제조 과정은 위에서 언급했듯이 PPH와 유사하다.
식물 및 곤충 유래 단백질 분리물의 목록과 이름은 표 1에 나열되어 있다.
분리물 명칭 Enzyme treatment Sample ID
대두 단백 분리물 (SPI) Alcalase/Neutrase SPI(AH)/SPI(NH)
완두콩 단백 분리물 (PPI) Alcalase/Neutrase PPI(AH)/PPI(NH)
글루텐 분리물 (GI) Flavourzyme GI(FH)
Protaetia bervitarsis (beetle) protein isolate (BPI) Alcalase/Neutrase BPI(AH)/BPI(NH)
Gryllus bimaculatus (cricket) protein isolate (CPI) Alcalase/Neutrase CPI(AH)/CPI(NH)
Tenebrio molitor (meal-worm) protein isolate (WPI) Alcalase/Neutrase WPI(AH)/WPI(NH)
표 1은 단백질 분리 물의 이름 및 해당 가수 분해물로, AH; Alcalase hydrolysates, NH; Neutrase hydrolysates, FH; Flavourzyme hydrolysates를 의미함.
실시예 4: 가수 분해 정도
Hall, F.; Johnson, P.E.; Liceaga, A. Effect of enzymatic hydrolysis on bioactive properties and allergenicity of cricket (Gryllodes sigillatus) protein. Food chemistry 2018, 262, 39-47에서 보고한 바와 같이 가수 분해 정도는 TNBS (trinitrobenzene sulfonic acid) 테스트를 사용하여 결정되었다.
요약하면, PPH와 IPH를 등량의 트리클로로 아세트산(TCA, Sigma-Aldrich, USA)과 혼합하고 10 초 동안 볼텍싱한 다음 12,000g에서 5 분 동안 원심분리했다. 다음으로, 상청액 (0.2 mL)을 0.2 M 붕산 나트륨 완충액 (pH 9.2)에 첨가하고 4mM TNBS 용액 (1 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한 다음, 1mL의 2M 모노나트륨 포스페이트 (Sigma-Aldrich, USA) 및 18mM 나트륨 설파이트 (Sigma-Aldrich, USA)를 첨가했다. 흡광도는 420 nm에서 기록되었다.
가수 분해도 (%)는 식. 1과 같이 계산되었다: 가수 분해도 (%) = m / n × 100 (1)
여기서 m은 가수 분해물의 펩티드 함량이고 n은 효소 가수 분해 전 시료의 총 단백질 함량이다.
실시예 5: 분자량 추정
PPH 및 IPH의 분자량은 Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) 방법으로 측정되었다.
요약하면, 전기 영동은 각각 60V 전류의 5 % 스태킹 젤과 100V 전류의 10 % 분리 젤을 사용하여 수행되었다.
다음으로 겔을 0.05 % Coomassie Brilliant Blue (Sigma-Aldrich, USA)로 염색하고 대상 용액 (아세트산 : 메탄올 : 탈 이온수; 2 : 5 : 5, v/v/v)을 사용하여 탈색했다. 이미지는 Chemi-Dox XRS+ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 캡처되었으며 밴드 강도는 Image Lab 소프트웨어 (v6.0, Bio-Rad, USA)를 사용하여 정량화되었다.
실시예 6: DPPH 라디칼 소거 활성
가수 분해물의 항산화 특성은 Liao, X.; Zhu, Z.; Wu, S.; Chen, M.; Huang, R.; Wang, J.; Wu, Q.; Ding, Y. Preparation of Antioxidant Protein Hydrolysates from Pleurotus geesteranus and Their Protective Effects on H2O2 Oxidative Damaged PC12 Cells. Molecules 2020, 25, 5408에서 보고된 DPPH 분석을 사용하여 결정되었다.
요약하면, 10 %의 단백질 가수 분해물을 DPPH 용액 (0.4mM)에서 10 초 동안 볼텍싱으로 준비하고 실온의 암실에서 30 분 동안 배양했다. 분광 광도계는 60 분 동안 10 분 간격으로 517 nm에서 흡광도를 측정했다. 1 % 아스코르베이트 (Sigma-Aldrich, USA) 용액을 대조군으로 준비하고 테스트 샘플과 비교했다.
실시예 7: myosatellite 세포의 분리 및 배양
소고기(성숙한 암컷 소)는 대한민국 강원도 홍천 육 공장에서 입수했다.
요근에서 육류 샘플을 채취하여 도축 30 분 이내에 세포 배양 실험을 수행 하였다. 동물 실험 윤리위원회(강원대학교 동물 보호 이용위원회, 허가 번호 KW-210317-1)는 동물 조직 배양 및 취급 절차를 승인했다.
myosatellite 세포 분리는 Baquero-Perez, B.; Kuchipudi, S.V.; Nelli, R.K.; Chang, K.-C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC cell biology 2012, 13, 1-12에서 보고된 것을 약간의 수정을 가하여 수행되었다.
요약하면, 육류 샘플을 인산염 완충 식염수 (PBS; Welgene, 대한민국)로 여러 번 세척하여 적혈구 (RBC)를 제거한 다음 20 mL의 세척 배지로 배양했다. 약 3-4g의 다진 샘플을 진탕 수조에서 37 °C에서 1.5 시간 동안 1.4mg/mL 프로나제 효소 (Sigma-Aldrich, USA)를 포함하는 30mL의 효소 소화 용액과 함께 배양했다. 그 후, 효소 소화된 조직 샘플을 300g에서 3-5 분 동안 원심분리하고 상청액을 버렸다. 획득한 조직을 15 mL 수집 배지에 재현탁하고 격렬한 파이펫팅 (10-15 회)을 거쳐 조직의 세포를 방출했다. 상층액을 300g에서 3 분간 원심 분리하여 세포가 들어있는 수프를 수집하였다. 다음으로 상등액을 40 μm 세포 스트레이너 (BD Falcon, Corning, U.S.A.)에 통과시키고 수집 배지에 재현탁한 후 800g에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠릿화했다. 세포 분리 및 배양에 사용되는 배지 구성 목록은 표 2에 나와 있다.
과정 배지ㅣ조성
Muscle tissue harvest DMEM, 1% P/S solution, Amphotericin-B
Stock solution for enzymatic digestion DMEM/Ham's F12 (1:1), pronase (1.4 mg/mL), 1% P/S solution, Amphotericin-B
Collection medium DMEM-Glutamax-1, 1% P/S, Amphotericin-B
Growth medium DMEM-Glutamax-1, 10% FBS, 1% P/S, Amphotericin-B
Differentiation medium DMEM-Glutamax-1, 20% FBS, 10% HS, 1% P/S, Amphotericin-B
표 2는 소(bovine) 세포 분리 및 배양에 사용된 배지 조성 리스트로, DMEM; Dulbecco's Modified Eagle Media, P/S; Penicillin/streptomycin, FBS; fetal bovine serum, HS; Horse serum를 의미함.
세포 플레이팅을 위해, 펠릿 함유 세포를 성장 배지에 재현탁하고 5 % CO2 환경에서 37 °C에서 0.5 % 젤라틴 (Sigma-Aldrich, USA) 코팅된 T75 플라스크에 시드했다. 처음 48 시간 동안 배지는 오염을 제거하기 위해 자주 교체되었다. 그 후 배지는 매일 교체되었다. 세포 배양 실험을 위해 각각 계대 1 세포를 사용하였다.
실시예 8: 면역 세포 화학 (ICC) 염색
myoblast-specific protein markers로 염색하여 myogenic 세포 집단을 확인 하였다. 이를 위해 4 × 104 세포를 24 웰 플레이트에서 24 시간 동안 성장시켰다. 그 후 세포를 3.7 % 파라포름알데히드(PFA; Sigma-Aldrich, USA)로 실온에서 15 분 동안 고정한 후 100 % 메탄올로 5 분 동안 투과시켰다.
다음으로, 세포를 PBS로 2 회 세척하고 1 % 소 혈청 알부민 (BSA; Sigma-Aldrich, USA)으로 4 °C에서 밤새 차단하였다. 그 후 차단된 세포를 Desmin (1 : 100) 및 Myogenin (1 : 200)에 대한 특정 1 차 항체로 1 시간 동안 염색한 후 AF-488 (녹색 발광) 및 AF-647 (적색 발광) 접합된 이차 항체와 함께 1 시간 동안배양했다. 모든 항체는 미국 산타 크루즈 바이오테크놀로지(SCBT)에서 구입했다.
핵은 DAPI (Sigma-Aldrich, USA)에 의해 대조 염색되었고, 세포는 도립 광학 현미경 (DMi8, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 시각화되었다. 이미지는 40 배 배율로 캡처하고 ImageJ 소프트웨어 (ImageJ, v1.8, NIH, Bethesda, MD, USA)로 처리했다.
실시예 9: 세포 생존력 분석
myosatellite 세포의 세포 생존력은 WST-8 분석으로 평가되었다.
이를 위해, 계대 -1 myosatellite 세포 (1 × 104 세포/100 μL 배지)를 성장 배지의 존재하에 96- 웰 플레이트에서 배양하였다. 그 후, 세포를 100 μL의 10 % PPH 및 IPH + 5 % FBS 함유 배지로 보충하고 24 시간 및 48 시간 동안 배양하였다. 원하는 배양 후, 세포를 PBS로 세척하고 신선한 배지로 보충하였다. 5 % FBS만을 포함하는 배양 플레이트는 대조군으로 간주되었다. 마지막으로, 세포를 100 μL의 WST-8 염료(대한민국 셀릭스 생존력 분석 키트)와 함께 배양하고 2 시간 동안 배양하였다. 반응된 포르마잔은 450nm (참조 값으로 625nm)에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 정량화되었다. 모든 실험은 3 회(n = 3)로 수행되었으며 데이터는 평균±표준 편차 (SD)로 표시된다.
실시예 10: 세포 형태 및 세포 내 ROS 검출
PPH와 IPH가 myoblastic-protein markers 발현에 미치는 영향은 immunocytochemical 기술을 사용하여 평가되었다.
이를 위해 세포 (2.5 × 104 세포/500 μL 배지)를 공 초점 디쉬에서 배양하고 10 % PPH 및 IPH로 3 일 동안 처리했다. FBS가 5 %에 불과한 배지를 대조군으로 사용되었다.
염색 절차는 Ganguly, K.; Jeong, M.-S.; Dutta, S.D.; Patel, D.K.; Cho, S.-J.; Lim, K.-T. Protaetia brevitarsis seulensis Derived Protein Isolate with Enhanced Osteomodulatory and Antioxidative Property. Molecules 2020, 25, 6056에서 설명되었다.
요약하면, 세포를 실온에서 15 분 동안 3.7 % 파라포름알데히드(PFA)로 고정시킨 다음 10 분 동안 Triton-X 100 (0.1 %)으로 투과화시켰다. 그 후, 세포는 1 % BSA에 의해 1 시간 동안 차단되고 Desmin 및 Myogenin에 대한 특정 1 차 및 2 차 항체와 함께 배양되었다. 핵은 DAPI 용액으로 어둠 속에서 1-2 분 동안 대조 염색하고 도립형 형광 현미경 (DMi8, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 시각화했다. 이미지는 40 배 배율로 캡처하고 Cell Suite-X 소프트웨어 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)로 처리했다.
세포 내 ROS 검출을 위해, myosatellite 세포 (1.5 x 104 세포/웰)를 96- 웰 플레이트에 접종하고 성장 배지와 함께 배양했다.
다음으로, 세포에 10 % PPH 및 IPH + 5 % FBS를 포함하는 100 μL의 배지를 보충하고 대조군 그룹에는 5 % FBS 만 보충했다. 세포를 추가로 24 시간 동안 성장시킨 다음, 어두운 조건에서 20 분 동안 30 %(v/v) H2O2 200μM로 처리했다.
다음으로, 세포를 PBS로 세척하고 20 μM DCF-DA (Sigma-Aldrich, USA)와 함께 30 분 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 수확하고 50 μL의 세포 현탁액을 슬라이드에 취하여 역 형광 현미경으로 시각화했다. 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어 (ImageJ v1.8, NIH Lab., Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화되었다.
모든 실험은 3 회 (n = 3)로 수행되었으며 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시된다.
본 발명에서 수행된 통계 분석은 Origin Pro 9.0 소프트웨어를 사용하여 일원 분산 분석으로 통계 분석을 수행했다. 모든 실험은 3 회 (n = 3)로 수행되었으며 결과는 평균±SD, * p <0.05에서 통계적 유의성으로 표시된다.
상기 실시예의 결과를 하기에 기재한다.
단백질 분리물의 효소 가수 분해
효소 가수 분해의 효과를 조사하기 위해 가수 분해 효율의 정도를 평가했다. 그림 2a에서 볼 수 있듯이 가수 분해의 정도는 12 시간의 프로테아제 소화 후에 증가했다. TCA 용해성 펩타이드는 alcalase, neutrase 및 flavourzyme 처리 분리주에서 유의하게 증가했다. 또한, SPI, PPI 및 GI는 다른 프로테아제에 비해 알칼라아제의 존재 하에서 가장 높은 수준의 가수 분해(* p <0.05)를 나타냈다. BPI, CPI 및 WPI를 alcalase 효소와 함께 배양했을 때 유사한 경향이 관찰되었다.
SPI, PPI, GI, BPI, CPI, WPI의 가수 분해 정도는 각각 34.7 %, 31 %, 26.8 %, 48.9, 60.25, 65.5 %였다.
가수 분해물의 디지털 사진은 도 2b에 나와 있다. 더욱이, 펩티드 단편의 분자량은 SDS-PAGE로 분석되었다.
PPH 및 IPH에 대한 밴드 강도의 정량화 값은 도 8 및 9에 나타내었다. 소화되지 않은 PPH 샘플은 12-160 kDa 범위의 특징적인 밴드를 나타냈다. 흥미롭게도, alcalase와 neutrase를 사용하여 가수 분해 후 주요 밴드가 사라졌다. 플라보자임 처리된 샘플도 유사한 방식을 나타냈다. 분리된 단백질의 다양한 절단 패턴은 가수 분해 효과를 나타내며 사용된 효소와 밀접한 관련이 있다
TCA-용해성 펩티드 함량의 향상과 alcalase, neutrase 및 flavourzyme의 존재하에 주요 밴드의 부재는 PPI 및 IPI가 충분히 가수 분해되었음을 시사한다.
가수 분해물의 항산화 특성
활성 산소 (ROS)는 대사 부산물이며 암 및 심혈관 질환 (CVD)과 같은 여러 질병의 발병에 적극적으로 관여한다.
본 발명에서는 DPPH 라디칼 소거 분석을 통해 PPH 및 IPH의 항산화 활성을 평가했으며 그 결과는 도 3에 나와 있다.
아스코르브 산 (1 %) 용액을 대조군으로 사용했다. 10 % PPH 및 IPH의 항산화 특성은 시간이 지남에 따라 변했으며 그림 3a와 같이 alcalase 처리 식물 가수 분해물 (SPI 및 PPI)에서 증가하는 경향이 관찰되었다. 특히, flavourzyme 처리 샘플 (GI)은 SPI 또는 PPI 샘플에 비해 향상된 항산화 활성을 나타내어 글루텐 분리 물의 라디칼 소거 잠재력을 나타낸다 (그림 3b).
그러나 IPH는 대체 활동 방식을 보여주었다. 517 nm의 흡광도는 alcalase 처리 샘플과 비교하여 neutrase 처리 샘플에서 극적으로 변화하여 neutrase 가수 분해가 alcalase 가수 분해보다 더 많은 항산화 펩티드를 생성했음을 나타낸다(그림 3c-e). 항산화 활성은 아마도 PPH와 IPH에 존재하는 특정 아미노산 (트립토판, 시스테인, 메티오닌, 히스티딘) 또는 펩티드 (크립 타이드)의 존재 때문일 것이다.
PPH 및 IPH의 DPPH 감소 사진은 보충 그림 3에 나와 있다.
myosatellite 세포의 특성화
Myosatellite 세포는 골격 조직의 주요 전구 세포이다. 근육 조직 발달과 생리학을 연구하기 위해, myosatellite 세포는 실험에 적합한 단계까지 분리, 배양 및 분화될 수 있다
본 발명은 성체 암컷 젖소에서 소 myosatellite 세포를 분리한 다음 2 주 동안 배양했다. 그림 4a에서 볼 수 있듯이, 세포는 초기에 둥근 모양이었고 1 차 배양 7 일 이내에 젤라틴 코팅 T75 플라스크에서 적절하게 성장했다. 생장 세포는 크기가 비교적 작고 성장 배지에서 배양 할 때 섬유 아세포와 유사한 성장을 나타낸다. 특히, 세포는 분화 배지(고-포도당 DMEM + 20 % FBS + 10 % HS + 1 % P/S)에서 배양 할 때 전형적인 근 모세포 형태를 나타낸다.
myosatellite 세포는 desmin (Des), myogenin (MyoA, MyoD), paxillin-7 등과 같은 다양한 myogenic 유전자와 단백질 마커를 발현했다. 세포는 단백질 마커 발현을 평가하기 위해 성장 및 분화 배지에서 계대 1까지 배양되었다. 세포를 myoblast-specific markers로 염색하여 desmin 및 myogenin 양성 세포를 결정했으며 그 결과는 그림 4b에 나와 있다.
실제로, 세포는 성장 배지에서 배양했을 때 desmin 및 myogenin 마커 모두에 대해 양성인 것으로 나타났다. 흥미롭게도 두 마커의 발현은 분화 배지에서 3 일 동안 배양했을 때 더 높게 나타났다. 형광 강도의 정량적 값은 보충 그림 4에 나와 있다.
PHs는 myosatellite 세포 생존력을 향상시킴
myosatellite 세포의 생존력에 대한 PH의 영향은 배양 48 시간 후 WST-8 분석에 의해 평가되었으며 그 결과는 그림 5에 나와 있다. 세포는 5 % FBS가 있는 10 % PPH 및 IPH 보충 배지에서 배양되었다. 5 % FBS만을 포함하는 플레이트를 대조군으로 사용했다. 특히 PPH는 생존력이 약간 감소한 PPI (NH)를 제외하고 생체 적합성이 확인되었다. myosatellite 세포의 생존력은 대조군 및 다른 그룹에 비해 SPI (NH) 보충제의 존재 하에서 유의하게 증가했다 (* p <0.05) (그림 5a).
유사한 종류의 관찰이 IPH의 존재에서 관찰되었으며, 여기서 BPI (NH) 보충제는 48 시간의 배양 후 근성 세포의 최대 생존력을 나타냈다(그림 5b). IPH 중 어느 것도 배양 세포에 독성이 있는 것으로 밝혀지지 않아 생체 적합성을 시사한다.
세포 형태
PPH 및 IPH 처리 된 세포의 형태는 형광 현미경으로 조사되었다. 세포를 10 %의 SPI (NH) 및 BPI (NH) 보충제로 처리하고 근 모세포 특이 단백질 마커로 염색했다. PH가 없는 플레이트는 대조군으로 간주되었다. 상응하는 강도 프로파일을 가진 형광 이미지는 그림 6에 나와있다. SPI 및 BPI 보충 배지에서 나타난 마커의 발현은 PHs가 데스민과 미오게닌의 증식 및 발현을 충분히 향상시켰음을 의미한다. PH의 존재 하에서 세포 형태의 이상은 관찰되지 않았다.
H 2 O 2 에 의한 산화 손상에 대한 PH의 영향
본 발명자들은 DCF-DA 염색에 의해 소 myosatellite 세포의 H2O2 유도 산화 손상에 대한 PPH 및 IPH의 효과를 조사했다. 이를 위해 PHs 처리된 세포를 DCF-DA로 염색하고 FACS 및 형광 현미경으로 분석하였다.
그림 7a에서 볼 수 있듯이 H2O2 처리된 세포에서는 세포 내 ROS 수준이 급격히 증가한 반면 10 % SPI (NH) 및 BPI (NH) 보충 세포는 매우 낮은 수준의 세포 내 ROS를 보여 ROS 소거 특성을 시사한다. 이것은 형광 현미경으로 추가로 확인되었다. 흥미롭게도, PHs 처리된 myosatellite 세포는 H2O2 처리된 세포보다 낮은 수준의 DCF 형광을 보였는데, 이는 DCF의 강렬한 색상이 특징이다.
DCF의 평균 형광 강도는 그림 7c에 나와 있다. 대조군 세포는 분자 산소의 부분적인 감소로 인해 매우 낮은 생리적 ROS 수준을 유지한다.

Claims (12)

  1. 동물 세포 배양용 배지 조성물에 있어서, 첨가제 중 혈청 대용으로 식물 단백질 가수분해물 또는 곤충 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 동물 세포 배양용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 식물 단백질 가수분해물은 대두 단백질 가수분해물, 완두콩 단백질 가수분해물 및 글루텐 단백질 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 가수분해물인 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 대두 단백질 가수분해물은 알카레이즈(Alcalase)로 대두 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12.7 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하고,
    뉴트라제(Neutrase)로 대두 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 35 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 완두콩 단백질 가수분해물은 뉴트라제(Neutrase)로 완두콩 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 36 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 글루텐 단백질 가수분해물은 플라보자임(flavourzyme)으로 글루텐 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 160 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 곤충 단백질 가수분해물은 딱정벌레 단백질 가수분해물, 귀뚜라미 단백질 가수분해물 및 밀웜(Meal-worm) 단백질 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 가수분해물인 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 딱정벌레 단백질 가수분해물은 알카레이즈(Alcalase)로 딱정벌레 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하고,
    뉴트라제(Neutrase)로 딱정벌레 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 26 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 귀뚜라미 단백질 가수분해물은 알카레이즈(Alcalase)로 귀뚜라미 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하고,
    뉴트라제(Neutrase)로 귀뚜라미 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 밀웜 단백질 가수분해물은 뉴트라제(Neutrase)로 밀웜 단백질을 가수분해된 경우에는 단백질 가수 분해물 중의 분자량 12 킬로 달톤의 펩티드의 함량을 상대적으로 다른 펩타이드에 비하여 최고로 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 식물 단백질 가수분해물 또는 곤충 단백질 가수분해물은 전체 조성물 중에 중량 10 % 포함하고, 우태아 혈청은 5 중량 % 이하 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 동물 세포는 소 근육 위성(bovine myosatellite) 세포인 것을 특징으로 하는 동물 세포 배양용 조성물.
  12. 인 비트로에서 소 근육 위성(bovine myosatellite) 세포 배양 중에 배양 조성물에 뉴트라제(Neutrase)로 딱정벌레 단백질을 가수분해된 단백질 가수 분해물 을 10% 첨가하여 상기 세포에서 데스민과 미오게닌의 발현을 증가시키는 방법.
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