KR20200079215A - 누에콜라겐 건강식품 조성물과 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 누에콜라겐 건강식품 조성물과 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 누에의 유효성분을 함유하며, 어류에서 추출된 마린콜라겐에 의해 피부개선 및 건강증진 효과를 증대시킬 수 있는 누에콜라겐 건강식품 조성물과 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 누에분말을 효소처리한 효소처리누에분말과, 어류로부터 추출된 마린콜라겐을 함유한다.
본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 누에분말을 효소처리한 효소처리누에분말과, 어류로부터 추출된 마린콜라겐을 함유한다.
Description
본 발명은 누에콜라겐 건강식품 조성물과 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 누에의 유효성분을 함유하며, 어류에서 추출된 마린콜라겐에 의해 피부개선 및 건강증진 효과를 증대시킬 수 있는 누에콜라겐 건강식품 조성물과 이의 제조방법에 관한 것이다.
콜라겐은 동물 체내에 가장 풍부하게 존재하는 단백질로서 체단백질의 약 30% 이상을 차지하며, 최소 19종류(Type Ⅰ-ⅩⅨ) 이상인 것으로 밝혀져 있다. 또한, 콜라겐은 동물의 결합조직의 주요 단백질이며, 조직이나 장기를 지탱하게 하고 체표를 둘러싸고 있어 체형을 유지시키는 역할을 한다. 특히 생체에서 피부, 연골, 뼈 등의 결합조직의 주요한 구성성분으로 40%는 피부, 20%는 뼈와 연골, 그 외 혈관과 내장 등 전신에 넓게 분포되어 있다.
콜라겐은 2중 나선구조를 하고 있는 근원섬유 단백질과는 달리 3중 나선구조로, 그 직경이 약 14~15nm, 길이는 280~300nm, 평균 분자량은 약 300KDa이며, (Gly-XY)n과 같은 규칙적인 형태의 아미노산 배열을 가지며 섬유상 단백질의 기본단위 분자인 트로포콜라겐(tropocollagen) 분자 내 또는 트로포콜라겐(tropocollagen) 분자 간의 공유결합성 교차결합(crosslinking)에 의해 물리적, 생물학적으로 안정한 구조를 형성하고 있다.
콜라겐은 추출된 원료에 따라 동물성 콜라겐과 마린 콜라겐(해양성 콜라겐, 피쉬콜라겐)으로 구분된다. 소, 닭, 돼지 등에서 추출한 동물성 콜라겐의 경우 열에 강해 가공이 용이하여 일반적으로 널리 이용되고 있으나 분자량이 커 섭취시 인체 흡수성이 높지 않다. 마린콜라겐의 경우 어류에서 추출한 것으로, 동물성 콜라겐과 비교하여 안정성이 높으나, 체내 흡수성이 다소 좋지 못하다.
한편, 누에(Bombyx mori L.)는 누에나방과에 속하는 누에나방에 유충으로 대량 사육이 가능하며 단백질 함량이 높아 고단백질 식품소재로(Cho, C. H. et al., Effect of temperature, time and pH on the extraction of proteinin a chrysalis of silkworm, Korean J. Biotechnol. Bioeng., 4, P65-68, 1989), 필수 아미노산과 n-3 계열의 고도불포화 지방산 함유량이 높아 간 기능 개선이나 혈액순환 관련 건강식품 소재로 활용 가능성이 제시되고 있다(Seong, S. I. et al., Effect of metamorphois on the major hemolymph proteins of the silkworm, Arch. Insect Biochem. Physiol., 2, P91-104, 1985).
또 누에실크 유래의 sericin 단백질도 serine, asparticacid 및 glycine으로 주로 구성되어 있어 간 보호 효과와 항산화 효과가 높은 것으로 보고되었다.(Kato, N. etal., Silk protein, sericin, inhibits lipid peroxidation and tyrosinase activity, Biosci. Biotechnol.Biochem., 62, P145-147, 1998).
또한 단백질 함량이 높은 누에 분말을 Bacillus속 미생물로 발효시켜 얻은 발효누에에서 항산화 작용, 혈전용해 작용, 티로시나제 활성 저해 등의 생리활성작용이 발효 전 누에 분말보다 증가하는 것으로 보고한 바 있다. (Cha, J. Y. et al., Biological activity of fermented silkworm powder, J. Life Sci., 19, P1468-1477, 2009)
그러나 종래에 열풍건조나 동결건조만으로 제조한 누에 분말의 경우 누에의 유효성분에 의한 효과를 얻기 어렵다는 단점이 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-1636680호에는 어류 유래 저분자 콜라겐 펩타이드의 제조방법이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 제10-1918759호에 누에 동결건조 분말을 이용한 가공식품 및 그 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '누에콜라겐 건강식품 조성물'에 관해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 효소처리누에분말과 마린콜라겐을 함유하여 건강 증진효과를 높일 수 있으며, 누에의 효소분해물 유래의 펩타이드가 작용하여 콜라겐의 체내흡수율을 높일 수 있는 누에콜라겐 건강식품 조성물을 제공하는 것에 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 누에분말을 효소처리한 효소처리누에분말과, 어류로부터 추출된 마린콜라겐을 함유한다.
또한, 비타민C와 첨가물을 더 함유하고, 상기 효소처리누에분말 20 내지 50 중량%, 상기 마린콜라겐 5 내지 40중량%, 상기 비타민C 1 내지 10중량%, 상기 첨가물 30 내지 60중량%를 함유한다.
상기 첨가물은 참반디 추출물이다.
그리고 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물의 제조방법은 누에분말을 효소처리하여 효소처리누에분말을 수득하는 제 1단계와; 어류로부터 추출된 마린콜라겐을 준비하는 제 2단계와; 상기 효소처리누에분말과 상기 마린콜라겐을 혼합하는 제 3단계;를 포함하고, 상기 제 1단계는 a)누에를 동결건조시켜 100 내지 300메쉬 입도 크기의 상기 누에분말을 얻는 단계와, b)상기 누에분말을 물에 현탁하여 누에현탁액을 제조하는 단계, c)상기 누에현탁액에 단백질 분해효소를 첨가하여 40 내지 70℃에서 1 내지 2일간 가수분해시켜 가수분해물을 수득하는 단계, d)상기 가수분해물을 분무건조시켜 효소처리누에분말을 수득하는 단계를 구비한다.
상기 단백질 분해효소로서 상기 누에현탁액 100중량부에 대하여 브로멜라인 0.5중량부와, 파파인 1.0중량부를 첨가한다.
상기 혼합단계는 비타민C와 첨가물을 더 혼합하며, 상기 첨가물은 참반디 추출물이다.
상술한 바와 같이 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 누에분말을 효소처리한 효소처리누에분말과, 어류로부터 추출된 마린콜라겐을 함유하여 당뇨 개선 등 건강증진에 유용하다.
아울러 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 섭취 시, 효소처리누에분말의 펩타이드가 작용하여 콜라겐의 체내흡수율을 높일 수 있다.
도 1은 단백질 분해효소의 종류에 따른 효소처리누에분말의 SDS-PAGE를 나타내는 이미지이고,
도 2는 세포 생존율 평가 실험결과를 나타내는 표이고,
도 3은 α-glucosidase의 저해 활성 평가 실험결과를 나타내는 표이고,
도 4는 인슐린 분비능 평가 실험결과를 나타내는 표이고,
도 5는 도 4의 실험결과를 나타낸 그래프이고,
도 6은 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물을 나타낸 사진이고,
도 7은 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물의 수용성 실험결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 세포 생존율 평가 실험결과를 나타내는 표이고,
도 3은 α-glucosidase의 저해 활성 평가 실험결과를 나타내는 표이고,
도 4는 인슐린 분비능 평가 실험결과를 나타내는 표이고,
도 5는 도 4의 실험결과를 나타낸 그래프이고,
도 6은 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물을 나타낸 사진이고,
도 7은 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물의 수용성 실험결과를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 누에콜라겐 건강식품 조성물과 이의 제조방법에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 예에 따른 누에콜라겐 건강식품 조성물은 누에분말을 효소처리한 효소처리누에분말과, 어류로부터 추출된 마린콜라겐을 함유한다. 가령, 누에콜라겐 건강식품 조성물은 효소처리누에분말 1 내지 90중량%, 마린콜라겐 1 내지 90중량%로 구성될 수 있다.
효소처리누에분말은 누에분말을 효소처리한 것이다.
누에(Bombyx mori)는 누에나방과에 속하는 누에나방에 유충으로서, 뽕잎을 먹고 자라며 튼튼한 고치를 만들어 번데기가 된다. 몸통은 원통형이며, 머리·가슴·배의 세 부분으로 되어 있다. 직사광선을 싫어하고 몸은 젖빛을 띠며 연한 키틴질 껍질로 덮여 있어 부드러운 감촉을 준다. 알에서 부화되어 나왔을 때 누에의 크기는 약 3mm이며, 털이 많고 검은 빛깔을 띤다. 누에는 뽕잎을 먹으면서 성장하고, 4령잠을 자고 5령이 되면 급속하게 자라서 8cm 정도가 된다. 5령 말까지의 유충기간 일수는 보통 20일 내외이다. 5령 말이 되면 뽕잎 먹는 것을 멈추고 고치를 짓기 시작한다.
누에는 1-데옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycine,DNJ)을 함유하고 있으며, 1-데옥시노지리마이신은 혈당 강하, 항바이러스 및 암세포 전이방지 효능이 있다. 이 밖에도 누에는 간 독성 회복 효과와 변비개선효과가 있으며, 뇌기능 개선효과, 노화지연 효과 등 다양한 효능을 가지고 있다.
누에분말을 효소처리한 효소처리누에분말은 200 내지 400메쉬 입도 크기로 형성될 수 있다.
마린콜라겐은 어류로부터 추출된 콜라겐이다. 마린콜라겐은 상업화된 분말 제품을 구입하여 이용하거나, 어류로부터 직접 추출하여 이용할 수 있다. 일 예로 어류의 부산물인 어피로부터 마린콜라겐을 추출할 수 있다.
마린콜라겐은 200 내지 400메쉬 입도 크기의 분말 형태로 이용한다.
본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 누에분말을 효소처리한 효소처리누에분말과, 어류로부터 추출된 마린콜라겐을 함유하므로 누에 및 콜라겐에 의한 효능을 동시에 얻을 수 있다. 아울러 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 섭취 시, 효소처리누에분말의 펩타이드가 작용하여 콜라겐의 체내흡수율을 높일 수 있다.
본 발명에서 '식품 조성물'이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
바람직하게 본 발명은 효소처리누에분말과 마린콜라겐을 함유한 건강식품 조성물로 제공될 수 있다. 여기서 '건강식품 조성물'이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에 따른 건강식품 조성물로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
나아가 본 발명은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다
또한, 건강식품 조성물에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다
건강식품 조성물은 다양한 형태로 제형이 가능하므로 그 형태는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게 건강식품 조성물은 과립, 정제, 분말, 환, 캡슐 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 형성될 수 있다. 이러한 과립, 정제, 분말, 환, 캡슐 제형을 갖는 건강식품 조성물은 휴대가 간편하고 언제 어디서나 수시로 섭취하기가 용이하다.
바람직하게 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 분말형태로 구비되어 분말 그대로 섭취할 수 있으며, 냉수 또는 온수 또는 우유 등에 첨가하여 차(tea)로 섭취할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 예에 따른 누에콜라겐 건강식품 조성물은 효소처리누에분말, 마린콜라겐, 비타민 C, 첨가물을 함유할 수 있다. 가령, 누에콜라겐 건강식품 조성물은 효소처리누에분말 20 내지 50 중량%, 마린콜라겐 5 내지 40중량%, 비타민C 1 내지 10중량%, 첨가물 30 내지 60중량%를 함유할 수 있다.
비타민 C는 콜라겐의 생합성 전구체인 물질로서, 섭취시 몸 자체의 콜라겐 생합성을 위한 물질로 사용된다.
첨가물은 누에콜라겐 건강식품 조성물의 기능성을 더하기 위한 것으로서, 참반디 추출물을 이용할 수 있다.
참반디(Sanicula chinensis)는 산형과에 속하는 다년생초로서, 숲 속에서 자란다. 참반디는 연할 때 나물로 하고 뿌리줄기는 이뇨제 및 해열제로도 사용된다.
참바디 추출물은 참반디의 잎으로부터 추출할 수 있다. 추출의 일 예로 참반디의 잎에 추출용매를 중량비로 2 내지 20배를 가하여 혼합한 후 10 내지 150℃에서 1 내지 48시간 동안 열수추출, 냉침추출 또는 온침추출하여 추출할 수 있다.
추출용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나를 이용할 수 있다. 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 메탄올, 에탄올 등을 이용할 수 있고, 다가 알코올로 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜 등을 이용할 수 있다. 그리고 혼합물로는 물 및 저급 알코올의 혼합물, 물 및 다가 알코올의 혼합물, 저급 알코올 및 다가 알코올의 혼합물, 또는 물 및 저급알코올 및 다가알코올의 혼합물을 이용할 수 있다.
추출 후 여과 및 감압농축한 후 동결건조, 분무건조 방식 등을 통해 분말 형태의 참반디 추출물을 얻을 수 있다. 동결건조 일 예로 -50 내지 -40℃의 온도에서 10 내지 20시간 급속동결시킨 다음, 0.1 내지 0.5torr의 진공도를 가진 동결건조기에서 약 -40℃에서 48시간 동안 건조시킨 다음 100 내지 300매쉬 입도 크기로 분쇄한다.
그리고 첨가물로 참반디 추출물 외에도 무수결정포도당, 결정셀루로오스, L-아르기닌, 비타민/미네랄프리믹스 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있으며, 또한 향미제, 풍미제, 착색제를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 누에콜라겐 건강식품 조성물의 제조방법에 대해 각 단계별로 설명한다.
1. 효소처리누에분말을 수득하는 제 1단계와
먼저, 누에분말을 효소처리하여 효소처리누에분말을 수득한다.
효소처리누에분말을 수득하는 과정은 a)누에를 동결건조시켜 100 내지 300메쉬 입도 크기의 상기 누에분말을 얻는 단계와, b)상기 누에분말을 물에 현탁하여 누에현탁액을 제조하는 단계, c)상기 누에현탁액에 단백질 분해효소를 첨가하여 40 내지 70℃에서 1 내지 2일간 가수분해시켜 가수분해물을 수득하는 단계, d)상기 가수분해물을 분무건조시켜 효소처리누에분말을 수득하는 단계로 이루어질 수 있다.
누에로 식용가능한 종은 모두 사용이 가능하다. 누에로 꾸지뽕잎을 먹고 자란 누에를 사용하는 것이 바람직하다. 누에분말을 얻기 위해 건조방식으로는 어떠한 것을 적용하여도 무관하나, 누에의 성분변화를 최소화하기 위해 동결건조방식을 적용하는 것이 바람직하다.
일 예로 살아있는 5령3일의 누에를 영하 40 내지 50℃ 조건에서 8 내지 16시간 동안 급속동결시킨 뒤, 영하 70℃의 진공챔버에서 다시 2 내지 10시간 동안 동결시켜 건조시킨다. 이후 분쇄기로 분쇄하여 100 내지 300입도 크기의 누에분말을 수득할 수 있다.
다음으로, 누에분말을 물에 현탁하여 누에현탁액을 제조한다. 물은 누에 분말 1g당 5~20ml를 첨가하는 것이 좋다. 물이 5ml미만으로 첨가될 경우 누에현탁액이 액상형 상태로 이루어지지 않아 효소반응이 제대로 이루어지지 않은 문제가 있으며, 20ml를 초과하여 첨가할 경우에는 수분함량이 많아 효소반응이 잘 이루어지지 않는다.
또한, 누에현탁액의 pH를 조정하기 위해 수산화나트륨(NaOH)용액 또는 염화수소(HCl)용액을 첨가할 수 있다. 이 경우 누에분말 현탁액의 pH는 5~7로 조정할 수 있다.
다음으로, 누에현탁액에 단백질 분해효소를 첨가하여 가수분해물을 수득한다.
단백질 분해효소로 브로멜라인(Bromelain), 파파인(Papain), 프로타맥스 (Protamax), 트립신(Trypsin), 프로리테르 FG-F(Proleather FG-f), 플라보자임(Flavourzyme), 프로테아제 A(Protease A), 에이로즈 AP-10(Aroase AP-10), 피스칼레이즈(Pescalase), Protease P, Protease N, Alcalase 2.4L, 피신(Ficin) 및 뉴트레이즈(Neutrase)로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 이용할 수 있다. 바람직하게는 단백질 분해효소로 브로멜라인과 파파인을 함께 이용한다. 브로멜라인과 파파인을 함께 이용할 경우 누에 단백질의 분해효과가 높으며 반응이 빠르다.
단백질 분해효소는 누에현탁에 100중량부에 대하여 0.1 내지 2중량부를 첨가할 수 있다. 가령, 누에현탁액 100중량부에 대하여 브로멜라인 0.5중량부와, 파파인 1.0중량부를 첨가할 수 있다.
누에현탁액에 단백질 분해효소를 첨가한 다음 40 내지 70℃에서 1 내지 2일간 교반하여 누에분말을 가수분해시킨다. 이와 같이 수득한 가수분해물은 90℃에서 30분동안 가열하여 불활화시킨다.
다음으로, 가수분해물을 건조시켜 효소처리누에분말을 수득한다. 건조방법으로 스프레이 건조법을 이용할 수 있다. 스프레이 건조(spray drying)는 액체를 열풍 속에 분무시켜 건조시키는 방법으로, 스프레이건조기에 가수분해물을 분무시켜 200 내지 400메쉬 입도크기의 효소처리누에분말을 수득한다.
2. 마린콜라겐을 준비하는 제 2단계
마린콜라겐은 어류로부터 추출된 콜라겐이다. 이러한 마린콜라겐으로 상업화된 분말 제품을 이용할 수 있다.
또한, 마린콜라겐은 어류로부터 직접 추출하여 이용할 수 있다. 바람직하게 어류의 부산물의 어피로부터 마린콜라겐을 추출한다.
어피는 어류의 껍질로서, 넙치나 우럭, 농어, 참돔, 연어 등의 껍질을 이용할 수 있다.
마린 콜라겐 추출을 위해 어피 분말에 수산화나트륨 용액을 가하여 비콜라겐성 단백질이 제거된 알칼리잔사를 수득하는 단계와, 상기 알칼리잔사에 초산용액을 가하여 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리하여 산가용화콜라겐을 추출하는 단계와, 상기 산가용화 콜라겐에 펩신을 가하여 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리한 다음 염화나트륨 용액을 가하여 침전시킨 침전물을 증류수로 투석하여 펩신 가용화 콜라겐을 추출하는 단계와, 상기 펩신 가용화 콜라겐을 정제하는 정제단계를 수행할 수 있다.
먼저, 어피는 세척하여 건조시킨 다음 50 내지 150메쉬 입도 크기로 분쇄하여 어피 분말을 준비한다. 건조 전 어피에 붙은 비늘을 제거하는 전처리과정을 거칠 수 있다. 이를 위해 세척한 어피를 0.1M 수산화나트륨 용액에 혼합하여 6 내지 12시간 동안 교반한다. 수산화나트륨 용액과 교반하게 되면 생선종류에 따라 다소 차이가 있으나 80 내지 90%의 비늘이 용이하게 제거된다.
어피 분말과 수산화나트륨 용액을 1:5 내지 10의 중량비로 혼합한 다음 실온(20~25℃)에서 12 내지 24시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 비콜라겐성 단백질이 제거된 알칼리잔사를 수득할 수 있다.
그리고 알칼리잔사를 증류수로 세척한 다음 초산용액을 가해 콜라겐을 추출한다. 알칼리잔사와 초산용액을 1:5 내지 10의 중량비로 혼합한 다음 실온(20~25℃)에서 12 내지 24시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하여 산 가용화 콜라겐을 수득한다.
그리고 산 가용화 콜라겐에 펩신을 가하여 10 내지 20시간 동안 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리한 다음 2M의 염화나트륨 용액을 가하여 침전시킨 침전물을 증류수로 투석하여 펩신 가용화 콜라겐을 얻을 수 있다.
그리고 펩신 가용화 콜라겐을 정제하여 마린 콜라겐을 얻기 위해, 펩신가용화 콜라겐을 20mM Na2HPO4에서 투석하여 펩신을 불활성화시킨 다음 요소를 포함한 50mM 초산용액(pH 4.8)에 대해 투석한 후 이온크로마토그래피를 이용하여 분획을 용출시킨다. 가령, 인산셀률로오스(P11, Whatman, Maidstone, UK)를 충진한 컬럼에서 0~600mM NaCl의 linear gradient(60ml/h)로 정제를 진행하고, 230nm에서 용출된 분획을 2.0M NaCl을 포함한 0.5M 초산용액으로 투석하여 회수한 다음 증류수로 투석, 동결건조하여 고순도의 마린콜라겐을 얻을 수 있다. 마린콜라겐은 200 내지 400메쉬 입도 크기의 분말 형태로 이용한다.
3. 효소처리누에분말과 마린콜라겐을 혼합하는 제 3단계
효소처리누에분말과 마린콜라겐이 준비되면, 효소처리누에분말 1 내지 90중량%, 마린콜라겐 1 내지 90중량%의 비율로 혼합하여 최종적으로 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물을 제조할 수 있다.
또한, 효소처리누에분말, 마린콜라겐 외에 비타민 C, 첨가물을 더 혼합하여 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물을 제조할 수 있다. 이 경우 효소처리누에분말 20 내지 50 중량%, 마린콜라겐 5 내지 40중량%, 비타민C 1 내지 10중량%, 첨가물 30 내지 60중량%의 비율로 혼합할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<가수분해 효소선정>
누에분말은 상업화된 제품을 시중에서 구입하여 준비하였다. 누에분말 100g에 증류수 1000㎖를 넣고 실온에서 30분 동안 혼합하여 누에현탁액을 제조하였다.
누에현탁액 10ml에 브로멜라인(Bromelain), 파파인(Papain), 프로타맥스 (Protamax), 트립신(Trypsin)을 각각 0.01g 씩 첨가하여 총 4개의 시료를 준비한 후, 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator)를 이용하여 50℃에서 120시간 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다.
단백질 마커(protein marker)는 시그마사(Sigma, 미국)에서 구입하여 샘플 버퍼(sample buffer; 60mM Tris-HCl, 25% glycerol, 2% SDS, 14.4mM 2-mercaptoethanol,0.1% bromophenol blue, 10mL distilled water)에 용해시켰다. 각 시료와 샘플 버퍼를 동량 첨가한 후 100℃의 물에서 5분간 가열하여 단백질의 완전한 변성을 유도한 후 전기영동을 실시하였다(MiniProtean, BIO-RAD Laboratories, Inc. USA.). 전기영동용 완충용액은 0.1%(w/v) SDS를 포함하는 0.025M-Trisbase-0.192 M Glycine(pH8.3) 용액을 사용하였으며 이렇게 얻어진 겔의 염색은 쿠마시 블루 R-250 용액(Coomasie blue R-250; 1.0g Coomassie blue R-250, 450mL methanol, 450mL H2O, 100mL glacial acetic acid)을 사용하여 상온에서 2시간 가량 흔들며 수행하였다. 탈색은 탈색시약(100mL methanol, 100mL glacialacetic acid, 800mL H2O)을 겔이 살짝 잠길 만큼 부어 30분간 두 번에 걸쳐 시약을 교환하면서 흔들며 수행하였고 추가로 겔이 완전히 잠기도록 하여 18시간 가량 흔들며 탈색하였다. 이때 얻어진 겔상에 염색된 밴드는 단백질 마커와 비교하여 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 프로타맥스나 트립신에 비해 브로멜라인과 파파인을 사용시 가수분해 효과가 더 우수한 것으로 확인되었다.
<누에콜라겐 건강식품 조성물의 제조>
단백질 가수분해 효소로서 브로멜라인과 파파인을 이용하여 누에콜라겐 건강식품 조성물을 제조하였다.
(실시예 1)
누에분말과 마린콜라겐 분말은 상업화된 제품을 시중에서 구입하여 준비하였다. 누에분말 100g에 증류수 1000㎖를 넣고 실온에서 30분 동안 혼합하여 누에분말을 현탁시켜 누에현탁액을 제조하였다. 누에현탁액 1000g에 브로멜라인(Bromelain) 5g과 파파인(Papain) 10g을 첨가한 후, 쉐이킹 인큐베이터(shanking incubator)를 이용하여 60℃에서 24시간 동안 가수분해하여 가수분해물을 수득하였다.
그 다음 가수분해물을 멸균기에 넣고 90℃에 30분 동안 효소불활화를 시키고, 스프레이건조기를 통해 약 200메쉬의 크기를 갖는 효소처리누에분말을 수득하였다.
그리고 효소처리누에분말과 마린콜라겐을 7:3의 중량비로 혼합하여 분말형태의 누에콜라겐 건강식품 조성물을 제조하였다.
(실시예 2)
실시예 1에서 사용된 효소처리누에분말과 마린콜라겐에 비타민C, 참반디추출물을 혼합하여 누에콜라겐 건강식품 조성물을 제조하였다. 즉, 효소처리누에분말 40중량%, 마린콜라겐 25중량%, 비타민C 5중량%, 무수결정포도당 20, 참반디 추출물 10중량%의 비율로 혼합하여 누에콜라겐 건강식품 조성물을 제조하였다.
참반디추출물은 참반디 잎에 대하여 추출용매로서 물을 중량비로 8배를 가한 후 90℃에서 6시간 동안 추출한후 여과지 여과한 다음 동결건조시켜 150메쉬 입도 크기의 분말로 수득하였다.
<시료준비>
실시 예1의 누에콜라겐 건강식품 조성물에 농도 80% 에틸알코올(ethyl alcohol)을 1:4(w/v)의 비율로 첨가하여 상온에서 24시간 동안 150rpm으로 진탕하였다. 그 후 3,000 rpm 에서 20분간 원심 분리시켜 침전물을 제거하였다. 이를 다시 syringe filter를 이용하여 부유성분을 걸러내어 이하의 실험에 사용할 시료를 준비하였다.
<세포독성실험>
인슐린 분비능 평가 실험에 사용하는 RIN-m5F 세포에 대하여 세포독성 확인 실험을 진행하였다.
RIN-m5F 세포주는 American type culture collection (ATCC, USA)으로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS)가 함유된 RPMI-1640 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그 다음 RIN-m5F 세포주를 2 x 104 cells/well의 농도로 96 well culture plate에 분주하고 24시간 배양 후 시료를 10% fetal bovine serum (FBS)가 함유된 RPMI-1640 배지를 이용하여 평가 농도로 희석하여 시험물질을 준비하였다.
시험물질을 24시간 배양하고 MTT solution을 최종 농도가 0.5mg/mL이 되도록 첨가한 후 4시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거한 후 100μL의 DMSO를 이용하여 cell lysis 후 microplate reader (Molecular device)를 이용하여 540㎚에서 triplicate (3 wells)로 흡광도를 측정하였다. 도 2에 실험결과를 나타내었다.
도 2를 참조하면, 농도에 따른 세포생존율을 평가한 결과 10, 5, 2.5, 1.25, 0.63, 0.31, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02 및 0.01%에서 4.7±1.9%, 8.5±44%, 10.2±4.3%0, 72.4±7.9%, 90.5±3.2%, 98.6±2.4%, 98.6±6.5%, 105.9±7.2%, 91.8±3.0%, 97.7±7.1% 및 110.0±4.9%로 확인되어 약 0.63% 농도에서부터 세포독성이 확인되지 않았다.
<항당뇨 실험>
본 발명의 누에콜라겐 조성물의 항당뇨성 실험을 위해 α-glucosidase의 저해 활성 및 인슐린 분비능에 대한 in-vitro 항당뇨 효능을 평가하고자 실험하였다.
1)α-glucosidase의 저해 활성 평가 실험
항당뇨 실험을 위해α-glucosidase의 저해 활성 평가를 하고자 하기와 같은 실험을 진행하였다.
시료를 50mM potassium phosphate buffer(pH6.8)를 이용하여 농도 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.781, 0.391, 0.195, 0.098, 0.049, 0.024 및 0.0%로 시험물질을 준비하였다. 각 농도별 시험물질 50μL에 2.5mM p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside(pNPG) 100μL 를 첨가하고 α-glucosidase(시그마, USA) 50μL를 첨가 후 37℃에서 반응시키면서 pNPG로부터 유리되어 나오는 반응 생성물인 p-nitrophenol을 405nm에서 10분간 1분 간격으로 흡광도를 측정하여 나온 반응속도를 통하여 α-glucosidase 활성의 억제정도를 triplicate(3 wells)로 측정하였다. 양성대조물질로 Acarbose를 사용하였으며, acarbose(시그마,USA)를 50mM potassium phosphate buffer(pH6.8)에 처리하여 농도별로 평가하였다. 도 3에 실험결과를 나타내었다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 실험군의 농도에 따른 α-glucosidase 활성억제능을 측정한 결과 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.781, 0.391, 0.195, 0.098, 0.049, 0.024 및 0.0%에서 각각 96.4±0.3%, 93.4±1.4%, 91.9±1.1%, 79.4±0.9%, 68.9±1.8%, 55.6±1.6%, 41.2±1.3%, 29.6±0.9%, 21.7±1.7%, 19.1±1.2%, 16.5±0.9% 및 0.0±0.0%로 확인되어 α-glucosidase를 50% 저해시키는 농도가 약 0.6%로 확인되었다.
2) 인슐린 분비능 평가실험
쥐 췌장 세포종에서 유래된 인슐린종(insulinoma) 세포주로서 항당뇨의 인슐린 분비능 평가 연구에서 널리 사용되고 있는 시험계로서 세포주에 대한 자료가 축적되어 있는 RIN-m5F 세포주를 이용하여 인슐린 분비능 평가실험을 진행하였다.
RIN-m5F 세포주는 American type culture collection (ATCC, USA)으로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS)가 함유된 RPMI-1640 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. RINm5F 세포주를 5 x 105 cells/well의 농도로 48 well culture plate에 분주하고 24시간 배양하였다. 각 well의 세포들을 115mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.28 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 24 mM NaHCO3, 10 mM HEPES-free acid, 1 g/L bovine serumalbumin, 그리고 1.1 mM D-glucose로 구성된 Kreb’s Ringer Buffer(pH 7.4)으로 5분씩 3번 반복 세척하였다. 5.6mM D-glucose 가 포함된 Kreb’s Ringer Buffer에 시료의 농도를 달리하여 500μL씩 세포가 있는 각 well에 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 반응액인 상층액을 취하여 insulin을 분석하였다. Insulin 농도는 Morinaga UltraSensitive MouseInsulin ELISA Kit(Morinaga Institute of Biological Science, Japan)을 이용하여 triplicate(3wells)로 측정하였다. 양성 대조군으로 glibenclamide를 5μg/mL 단일의 농도로 처리하여 동일하게 평가하였다. 도 4 내지 도 5에 실험결과를 나타내었다.
도 4 내지 도 5를 참조하면, 실험군에서 세포 독성이 없는 농도에서 인슐린 분비능을 평가하였다. 평가 결과 vehicle 군의 경우 3.08±0.10 ng/mL로 측정되었고, 양성 대조군인 glibenclamide 5ug/mL 의 경우 4.36±0.17 ng/mL로 vehicle 군 대비 유의적인 수치상승이 확인되었다. 실험군은 0.04, 0.08, 0.15, 0.3 및 0.6%에서 각각 4.22±0.10 ng/mL, 4.62±0.26 ng/mL, 5.05±0.09 ng/mL, 5.41±015 ng/mL 및 5.62±0.45ng/mL로 확인되어 vehicle 군 대비 모든 농도에서 유의적인 수치상승이 확인되었다.
상술한 항당뇨 실험결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 특정 농도에서 α-glucosidase 의 저해 효과와 함께 인슐린 분비를 증가시키는 것으로 확인되었다.
<수용성 실험>
실시예 2에서 제조된 누에콜라겐 건강식품 조성물은 도 6에 나타낸 바와 같이 녹색의 분말형태로 구비된다. 분말상의 누에콜라겐 건강식품 조성물이 물에 잘 녹는지 확인하기 위하여 하기와 같은 수용성 실험을 실시하였다.
물 10ml에 누에콜라겐 건강식품 조성물을 각각 0.1g, 0.5g, 1g, 15g씩 투입한 총 4개의 시험관을 준비했다. 각 시험관의 내용물을 유리막대로 잘 저어준 후 육안으로 관찰된 모습을 도 7에 나타내었다.
본 발명의 누에콜라겐 건강식품 조성물은 분말형태로 이루어져 있으며, 비교적 물에 잘 녹는다는 것을 알 수 있다.
<항균실험>
항균효과를 살펴보기 위해 실시예1 및 실시예2의 건강식품 조성물에 멸균수를 첨가하여 반죽한 다음 실온에서 10일간 방치한 후 일반세균의 수를 측정하였다. 세균수 측정을 위해 5g의 반죽 시료를 채취하여 멸균 균질기로 옮겨서 45mL의 0.5% 펩톤(peptone) 용액에 100초간 혼합하였다. 이 용액을 다시 순차적으로 0.5% 펩톤(peptone) 용액으로 희석하고 희석된 용액 0.1 mL를 plate count agar에 도말하고 35℃에서 배양한 후 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 제 1시험구는 실시예 1이고, 제 2시험구는 실시예 2이다.
| 제 1시험구(CFU/ml) | 제 2시험구(CFU/ml) |
| 1.8×105 | 4.2×102 |
상기 표 1의 결과를 살펴보면, 참반디추출물이 첨가된 제 2시험구가 제 1시험구에 비해 미생물의 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다.
이상, 본 발명은 실시 예를 참고로 설명하였으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.
Claims (6)
- 누에분말을 효소처리한 효소처리누에분말과, 어류로부터 추출된 마린콜라겐을 함유하는 것을 특징으로 하는 누에콜라겐 건강식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 비타민C와 첨가물을 더 함유하고,
상기 효소처리누에분말 20 내지 50 중량%, 상기 마린콜라겐 5 내지 40중량%, 상기 비타민C 1 내지 10중량%, 상기 첨가물 30 내지 60중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 누에콜라겐 건강식품 조성물. - 제2항에 있어서, 상기 첨가물은 참반디 추출물인 것을 특징으로 하는 누에콜라겐 건강식품 조성물.
- 누에분말을 효소처리하여 효소처리누에분말을 수득하는 제 1단계와;
어류로부터 추출된 마린콜라겐을 준비하는 제 2단계와;
상기 효소처리누에분말과 상기 마린콜라겐을 혼합하는 제 3단계;를 포함하고,
상기 제 1단계는 a)누에를 동결건조시켜 100 내지 300메쉬 입도 크기의 상기 누에분말을 얻는 단계와, b)상기 누에분말을 물에 현탁하여 누에현탁액을 제조하는 단계, c)상기 누에현탁액에 단백질 분해효소를 첨가하여 40 내지 70℃에서 1 내지 2일간 가수분해시켜 가수분해물을 수득하는 단계, d)상기 가수분해물을 분무건조시켜 효소처리누에분말을 수득하는 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 누에콜라겐 건강식품 조성물의 제조방법. - 제 4항에 있어서, 상기 단백질 분해효소로서 상기 누에현탁액 100중량부에 대하여 브로멜라인 0.5중량부와, 파파인 1.0중량부를 첨가하는 것을 특징으로 하는 누에콜라겐 건강식품 조성물의 제조방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 혼합단계는 비타민C와 첨가물을 더 혼합하며,
상기 첨가물은 참반디 추출물인 것을 특징으로 하는 누에콜라겐 건강식품 조성물의 제조방법.
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