JP4470212B2

JP4470212B2 - 皮膚改善剤

Info

Publication number: JP4470212B2
Application number: JP2007296091A
Authority: JP
Inventors: 勉野崎; 翠子塩谷; 崇高下; 健夫石原
Original assignee: BHN Co Ltd
Current assignee: BHN Co Ltd
Priority date: 2006-11-11
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2027-10-17
Also published as: JP2008137998A

Description

本発明は、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物（水のみによって抽出されるものに限る。以下、同様。）を有効成分としてなる皮膚改善剤に関する。より詳細には、前記皮膚改善剤は経口用の皮膚繊維芽細胞増殖促進剤、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生増強剤、又は、皮膚老化防止剤である。

皮膚は、その構成上、表皮、真皮及び皮下組織から成り立っている。表皮は、外界と接し、角質層、顆粒層、有棘層及び基底層から構成され、基底層で産生された角化細胞（ケラチノサイト）が分裂を繰り返しながら有棘細胞、顆粒細胞を経て角質細胞となって皮膚表面を覆い、古くなった角質細胞は垢となって剥離する。角化細胞が基底層から角質層に達するまでの時間（約１４日間）及び角質細胞として皮膚表面を保護する期間（約１４日間）の合計を、皮膚の新陳代謝としてターンオーバーという。真皮組織は、表皮とは異なり細胞が少なく、主にコラーゲンやエラスチン等の蛋白質、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸等のムコ多糖類といった細胞外成分で占められており、マトリックス構造を形成して細胞及び皮膚組織の支持、細胞間隙における保水、皮膚の潤滑性と柔軟性の保持、紫外線、乾燥環境、機械的刺激や損傷、微生物感染等の外的因子から皮膚組織を保護する等の役割を担っている。これらの細胞外成分は繊維芽細胞により産生される（非特許文献１）。

繊維芽細胞によって産生される前記細胞外マトリックス成分は、日常的に、活性酸素や微生物の影響あるいは紫外線照射を受けて変性し分解されて、肌のシワ、シミ、ソバカス、かさつき、肌荒れ等の皮膚トラブルを誘発する。又、加齢にともない生体の諸機能が低下し、組織は老化し、皮膚組織中のヒアルロン酸等の細胞外成分の含量も減少することが知られている（非特許文献２）。皮膚組織中のヒアルロン酸やコラーゲン等の含量が減少すると、乾燥肌、肌荒れ、弾力性や柔軟性の低下、張りや艶の減少、シワ・たるみ・くすみの増加等の皮膚トラブルや肌の老化症状をひき起こす。したがって、健康な肌を保つためには前記細胞外マトリックス成分を補給することが必要であり、このためには真皮組織中の前記成分産生細胞である繊維芽細胞を活性化させることが望ましい。

皮膚繊維芽細胞の活性化物質を探索する試みは従来から検討され、これまでにハイビスカス抽出物（特許文献１）、Ｌ−アスコルビン酸及びその誘導体（特許文献２）、アーモンド、セイヨウタンポポ、センブリ、ホップ等の抽出物（特許文献３）、コラーゲン加水分解トリペプチド（特許文献４）、ゲンクワニンを含有するローズマリー抽出物（特許文献５）、α−Ｄ−グルコピラノシルグリセロール（特許文献６）、特定アミノ酸配列を有するポリペプチド（特許文献７）等が提案されている。

これら成分や抽出物は、例えば、化粧料や外用剤に配合して皮膚に適用される可能性が開示されているが、経皮吸収の点で難点があり、皮膚洗浄時には容易に洗い流される等のために前記皮膚トラブルに対する効果が持続せず、皮膚組織の生理的機能を本質的に改善するものではなかった。又、ペプチド類を経口摂取する場合には胃腸内で変質や分解を受けるリスクがあり、実用面において有効性を発現し得るものは数少なかった。更には、併用する原料や成分によっては実用製品の色調、風味、物性等に影響を及ぼし、安定性や使用面、コスト面等の点でも必ずしも満足できるものではなかったのが実情である。したがって、前記皮膚トラブルを改善し得る実効性のある素材が求められていた。

後述するツバキについては次のようなことが知られている。すなわち、ツバキは古来より観賞用園芸植物として利用されてきた歴史があり、種子から採取した油脂は燃料油、整髪料、高級食用油等に、木部は灰化して日本酒の醸造に、又、実の脱脂粕は農作物の肥料等に利用されてきた。脱脂粕にはサポニンやタンニンが含まれ、これを加工して殺虫防虫剤（特許文献８）、農園芸用線虫防除剤（特許文献９）等となす提案もある。しかしながら、ツバキの実の脱脂粕に含まれる成分を皮膚、とりわけ真皮組織の改善のために用いる例は見当たらない。

特開平９−２９５９２８号公報特表平１０−５０９７３５号公報特開平１０−３６２７９号公報特開２００２−２５５８４７号公報特開２００４−１３７２１７号公報特開２００４−３３１５７８号公報特開２００６−２６５２２１号公報特許第１７００７１号明細書特開平９−３０９１６号公報服部道広、「スキンケアの科学」、第６頁〜第１４頁及び第１５頁〜第８３頁、（株）裳華房、１９９７年２月２５日発行ＭａｒｉａＯ．Ｌｏｎｇａｓ等、"Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｎｇｅｉｎｄｅｒｍａｔａｎｓｕｌｆａｔｅａｎｄｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｗｉｔｈａｇｉｎｇ"（オランダ）、１９８７年、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第１５９巻、第１２７頁〜第１３６頁

かかる現状に鑑み、本発明者らは、紫外線、活性酸素、加齢等を起因とする代謝機能の低下によってもたらされる生体とりわけ皮膚組織中の前記細胞外マトリックス成分含量の低減を回復させ、皮膚の前記トラブルを予防及び／又は改善するための、安全かつ安定な素材を開発し、これを産業上有効に活用できる態様の組成物を提供することを課題とした。

前記課題を解決するために、本発明者らは、皮膚組織中の前記細胞外マトリックス成分の代謝機構とその産生を促進する素材について鋭意検討を重ねた結果、前記皮膚トラブルを改善するためには意外にもツバキが極めて有効であり、ツバキには皮膚繊維芽細胞を活性化し、その増殖を促進し、該細胞による前記細胞外マトリックス成分の産生を増強し、皮膚の老化症状を顕著に改善し得る成分が含まれていること、又、これを飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の分野に有効利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物を有効成分として含有してなる経口用皮膚繊維芽細胞増殖促進剤が提供される。

本発明によれば、又、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物を有効成分として含有してなる経口用コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生増強剤が提供される。ここで、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生増強は皮膚組織中のコラーゲン及び／又はヒアルロン酸の増量であることが望ましい。

本発明によれば、更に、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物を有効成分として含有してなる経口用皮膚老化防止剤が提供される。ここで、皮膚老化とは、その症状が皮膚のシワ、シミ、くすみ、ソバカス及びたるみからなる群から選ばれる少なくとも１つの症状を含むものである。

本発明の前記の各剤において、有効成分である水抽出物は、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕を水で抽出処理した抽出物である。

又、本発明の参考として、前記の皮膚繊維芽細胞増殖促進剤、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生増強剤、又は、皮膚老化防止剤のうちいずれかを含有してなる美容健康用経口組成物が期待される。この経口組成物は飲食品であることが望ましい。

尚、本発明の参考として、更に、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物を経口摂取することを特徴とする、皮膚繊維芽細胞増殖促進作用、生体内コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生増強作用、及び、皮膚老化防止作用からなる群から選ばれる少なくとも１つの作用を発現させるための方法が期待される。ここで、皮膚繊維芽細胞増殖促進、生体内コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生増強、及び、皮膚老化防止とは、前記と同様である。

本発明に係るツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物は、品質安定性に優れ、皮膚繊維芽細胞の増殖を促進し、該繊維芽細胞によるコラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生を増強し、皮膚のターンオーバーを促して皮膚のシワ、シミ、くすみ、ソバカス及びたるみ等の皮膚トラブルを改善する効果を奏する。又、損傷を受けた皮膚の再生を促進して肌の健康維持に寄与する効果を奏する。かかる効果は、本発明の皮膚繊維芽細胞増殖促進剤、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生増強剤、又は、皮膚老化防止剤を経口的に摂取又は投与することによって顕著に発現される。したがって、本発明の前記各剤はとりわけ飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の分野において、前記各剤の態様のままで又は前記分野の従来の各種製品に配合した形態で、皮膚改善のために有効利用することが可能となる。

以下に本発明を詳細に説明する。まず、本発明の経口用繊維芽細胞増殖促進剤は、生体組織とりわけ皮膚の真皮組織中に存在する繊維芽細胞の増殖を促進させる作用を有するものであり、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）のツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とする。

ツバキ属に属する植物として、一般に、ツバキ節に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）等、チャ節に属するチャ（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）等、サザンカ節に属するサザンカ（Ｃ．ｓａｓａｎｑｕａ）等、カワリバツバキ節に属するグランサムツバキ（Ｃ．ｇｒａｎｔｈａｍｉａｎａ）等、ヤナギバサザンカ節に属するヤナギバサザンカ（Ｃ．ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉａ）等、ヒメサザンカ節に属するヒメサザンカ（Ｃ．ｌｕｔｃｈｕｅｎｓｉｓ）等が知られているが、本発明ではツバキ節に属するものを用いる。この例としてヤブツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、ユキツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａｓｕｂｓｐ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）、リンゴツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａｖａｒ．ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）、ホウザンツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａｓｕｂｓｐ．ｈｏｚａｎｅｎｓｉｓ）、ホンコンツバキ（Ｃ．ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｅｓｉｓ）、トウツバキ（Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、サルウィンツバキ（Ｃ．ｓａｌｕｅｎｅｎｓｉｓ）、ピタールツバキのピタルディー種（Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉｖａｒ．ｐｉｔａｒｄｉｉ）及びユンナン種（Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉｖａｒ．ｙｕｎｎａｎｉｃａ）、金花茶（Ｃ．ｎｉｔｉｄｉｓｓｉｍａ）、ヤマツバキ（ヤブツバキと同種）、山茶花（ヤブツバキと同種）、ヤクシマツバキ（リンゴツバキと同種）等を挙げることができる。これらのツバキは日本列島、朝鮮半島、中国山東半島等で自生し又は栽培されているものを適宜に利用すればよい。

本発明では、前記のツバキの実及び／又は種子を圧搾処理、ヘキサンやヘプタン等の疎水性有機溶媒又は液化二酸化炭素、液化プロパン等の液化ガスを用いた抽出処理に供して、常法により油分を抽出した残渣である脱脂粕を必須の原料とする。ここで、ツバキの実及び／又は種子は早熟実及び成熟実のいずれでもよく、これらの種子を用いてもよいが、脱脂粕及び有効成分の収量の点から成熟実又はその種子を用いることが望ましい。本発明では、成熟実から得られる種子を１〜２週間程度、天日等で乾燥させたものを用いるのが簡便である。

前記脱脂粕の水抽出物は任意の方法で製造することができるが、水を用いて抽出処理する。

脱脂粕を抽出するには、脱脂粕１重量部に対して水を約１重量倍〜約３０重量倍加え、常圧下又は１〜５気圧の加圧下、常温ないしは約１２０℃で、約１０分〜約３時間、必要に応じて撹拌して混合後、常温に冷却して濾過し、濾液を減圧乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等の適当な手段により濃縮、乾燥する。尚、乾燥物は適宜に粉砕処理してもよい。このようにして本発明に係る脱脂粕の水抽出物である淡黄色ないし黄色の固体を得ることができる。前記抽出方法は、一旦抽出処理した抽出残渣を繰り返し抽出処理したり、１〜３気圧の加圧下、約１００℃〜約１３０℃で行うことが望ましい。これにより本発明に係る抽出物の収量が増える。この水抽出物はサポニン、タンニン、ケンフェロール、その配糖体等を含む。

本発明の繊維芽細胞増殖促進剤は、その有効成分としての前記水抽出物を固体状、ペースト状又は液体状の形態となし、これをそのまま経口用繊維芽細胞増殖促進剤としてよいが、必要に応じて本発明の繊維芽細胞増殖促進剤が利用される用途の公知の添加物を併用して、常法により含有せしめて組成物として調製することもできる。ここで、公知の添加物は経口摂取するために通常利用されるものが望ましく、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤、流動化剤、保存剤、界面活性剤、安定剤、希釈剤、溶解剤、等張化剤、殺菌剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料等の添加物質を使用でき、又、繊維芽細胞増殖促進作用が既知の素材を用いることができる。

繊維芽細胞増殖促進作用が既知の素材として、前記の特許文献に記載のもの以外に、クロレラ、アロエベラ、イネ、ナツメ、月桃、マンゴージンジャー、ノブドウ、ホウライシダ、ハス胚芽、ゴマ、トウガラシ、トウキ、ドクダミ、ハスカップ果実、クスノハガシワ、藻類（カウレルパ、ラセモサ）、オニイチゴ、ハトムギ等の植物や藻類の乾燥物又は抽出物、カテキン類、イミノ基含有ペプチド、α−リポ酸及びその塩、エステル、アミド等の誘導体、ジヒドロリポ酸及びその誘導体、キチン加水分解物、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びそのオリゴマー等を例示できる。尚、本発明はこれらの例示によって何ら限定されるものではない。

尚、前記組成物の形態は、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の経口用製剤となすことが可能である。かかる製剤組成物における前記水抽出物の含有量は、併用原料の種類や含有量等により一律に規定し難いが、概ね０．０１重量％〜９０重量％程度、より望ましくは約０．１重量％〜約７０重量％である。前記含有量が約０．０１重量％を下回ると本発明の所望効果が認められなくなり、約９０重量％を超えると実用的な製剤組成物を調製することが難しくなり及び本発明の更なる所望効果も期待できない。本発明の繊維芽細胞増殖促進剤は、これを経口的に摂取又は投与する態様で利用する。経口摂取又は投与する場合の本発明の繊維芽細胞増殖促進剤の好適な量の目安は、該剤に含まれる前記水抽出物ベースで、ヒト成人１日あたり約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、望ましくは約３０ｍｇ〜約５００ｍｇ、更に望ましくは約５０ｍｇ〜約３００ｍｇである。

次に、本発明の経口用コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生増強剤は、生体中のコラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生を増強する作用を有するものであり、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）のツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とする。

本発明のコラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強剤に適用するツバキの種類や部位、脱脂粕、その抽出方法及び条件、水抽出物、水抽出物の配合量、併用原材料、組成物及びその形態、利用方法、摂取量等は、前述の繊維芽細胞増殖促進剤の場合と同じである。本発明のコラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強剤において、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生は、より望ましくは真皮組織中の繊維芽細胞によるコラーゲン及び／又はヒアルロン酸の産生である。

又、本発明の経口用皮膚老化防止剤は、皮膚トラブルや損傷を改善する作用を有するものであり、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）のツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物を有効成分として含有してなることを特徴とする。

本発明の皮膚老化防止剤に適用するツバキの種類や部位、脱脂粕、その抽出方法及び条件、水抽出物、水抽出物の配合量、併用原材料、組成物及びその形態、利用方法、摂取量等は、前述の繊維芽細胞増殖促進剤の場合と同じである。本発明の皮膚老化防止剤において、皮膚老化の症状は皮膚のシワ、シミ、くすみ、ソバカス及びたるみからなる群から選ばれる少なくとも１つの症状を含むものである。

本発明の参考として、前述した皮膚繊維芽細胞増殖促進剤、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強剤及び皮膚老化防止剤のうち少なくとも１つの剤をそのままの形態で飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料、その他産業分野の様々な製品とすることができ、あるいは該各種製品の配合原料の一部として使用する態様でも利用できる。とりわけ美容及び／又は健康のための経口組成物となすことが好ましく、この経口組成物の最も好適な態様は飲食品である。この例を以下に述べるが、本発明はこれにより限定されるものではない。

飲食品の具体例として、野菜ジュース、果汁飲料、清涼飲料、茶等の飲料類、スープ、ゼリー、プリン、ヨーグルト、ケーキプレミックス製品、菓子類、ふりかけ、味噌、醤油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、植物性クリーム、焼肉用たれや麺つゆ等の調味料、麺類、うどん、蕎麦、スパゲッティ、ハムやソーセージ等の畜肉魚肉加工食品、ハンバーグ、コロッケ、ふりかけ、佃煮、ジャム、牛乳、クリーム、バター、スプレッドやチーズ等の粉末状、固形状又は液状の乳製品、マーガリン、パン、ケーキ、クッキー、チョコレート、キャンディー、グミ、ガム等の各種一般加工食品のほか、粉末状、顆粒状、丸剤状、錠剤状、ソフトカプセル状、ハードカプセル状、ペースト状又は液体状の栄養補助食品、特定保健用食品、機能性食品、健康食品、濃厚流動食や嚥下障害用食品の治療食等を挙げることができる。

これらの飲食品を製造するには、本発明の皮膚繊維芽細胞増殖促進剤、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強剤及び皮膚老化防止剤のうち少なくとも１つの剤と公知の原材料を用い、あるいは公知の原材料の一部を前記剤の少なくとも１種で置き換え、常法によって製造すればよい。例えば、本発明の皮膚繊維芽細胞増殖促進剤と、必要に応じてグルコース（ブドウ糖）、デキストリン、乳糖、澱粉又はその加工物、セルロース粉末等の賦形剤、ビタミン、ミネラル、動植物や魚介類の油脂、たん白（動植物や酵母由来の蛋白質、その加水分解物等）、糖質、色素、香料、酸化防止剤、界面活性剤、その他の食用添加物、各種栄養機能成分を含む粉末やエキス類等の食用素材とともに混合して粉末、顆粒、ペレット、錠剤等の形状に加工したり、常法により前記例の一般加工食品に加工処理したり、これらを混合した液状物をゼラチン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース等の被覆剤で被覆してカプセルを成形したり、飲料（ドリンク類）の形態に加工して、栄養補助食品や健康食品として利用することは好適である。とりわけ錠剤、カプセル剤やドリンク剤が望ましい。

かかる飲食品に配合する本発明の皮膚繊維芽細胞増殖促進剤、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強剤及び皮膚老化防止剤のうち少なくとも１つの剤の比率は、飲食品の種類や形態、本発明の前記剤中の本発明に係る水抽出物の含量、他の配合原料の種類や成分や配合量等のちがいにより一律に規定しがたいが、飲食品中の前記水抽出物の含量が約０．０１重量％〜約９０重量％、より望ましくは約１重量％〜約５０重量％となるように、本発明の皮膚繊維芽細胞増殖促進剤、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強剤及び皮膚老化防止剤のうち少なくとも１つの剤をその他の飲食品製造用公知原料と適宜に組み合わせて処方を設計し、常法に従い目的とする飲食品を調製すればよい。前記水抽出物の含量が約０．０１重量％を下回るような飲食品では前記水抽出物による所望効果を期待するために多量の当該飲食品を摂取しなければならず、一方、前記水抽出物の量が約９０重量％を超えると実用的な飲食品を製造することが困難になることがある。本発明の飲食品は、ヒト成人の場合１日あたりの前記水抽出物の摂取量の目安を約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、望ましくは約３０ｍｇ〜約５００ｍｇ、更に望ましくは約５０ｍｇ〜約３００ｍｇとして任意の方法、例えば、食事の摂取と同時又は前後に、経口摂取、経管投与等の方法で体内に取り込むことができる。

次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。各例において、％、部及び比率はいずれも重量基準である。

製造例１
長崎県五島産ヤブツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ）の乾燥種子を粗粉砕して蒸煮後、圧搾して圧搾油を分離した圧搾粕を得、次いで圧搾粕にノルマルヘキサンを加えて常法により抽出処理し、抽出液を分離して抽出粕を採取した。この抽出粕をノルマルヘキサンで洗浄して油分を取り除き脱脂粕を採取した。この脱脂粕１００ｇに水３００ｍＬを加え、常圧下、８０℃に加熱して１時間適宜に撹拌した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度水２００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して、本発明に係る水抽出物である粉末（試料１とする）１５．４ｇを得た。この粉末は、これを加水分解してＨＰＬＣ分析したところ、サポニンのアグリコンであるサポゲニンを１６．５％、フラボノールの一種であるケンフェロールを１．８％含むものであった。

製造例２
屋久島産リンゴツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａｖａｒ．ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）の乾燥種子を製造例１に記載の方法で脱脂して脱脂粕を採取した。この脱脂粕１００ｇに水３００ｍＬを加え、２気圧の加圧下、１２０℃で２０分間加熱した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度水２００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して、本発明に係る水抽出物である粉末（試料２とする）１６．６ｇを得た。該粉末を製造例１と同様に加水分解してＨＰＬＣ分析した結果、サポゲニン含量は１４．３％であり、ケンフェロール含量は２．４％であった。

製造例３（参考例）
製造例１に記載の方法で得た脱脂粕１００ｇに含水エタノール（含水率３５％）２５０ｍＬを加え、８０℃で１時間加熱還流した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度含水エタノール（含水率３５％）２００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して、含水エタノール抽出物である粉末（試料３とする）１１．７ｇを得た。該粉末を製造例１と同様に加水分解してＨＰＬＣ分析した結果、サポゲニン含量は１２．３％であり、ケンフェロール含量は２．５％であった。

製造例４（参考例）
製造例２に記載の方法で得た脱脂粕１００ｇにエタノール（純度９９．５％）２００ｍＬを加え、８０℃で１時間加熱還流した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度エタノール（純度９９．５％）２００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して、エタノール抽出物である粉末（試料４とする）４．７ｇを得た。該粉末を製造例１と同様に加水分解してＨＰＬＣ分析した結果、サポゲニン含量は１４．１％であり、ケンフェロール含量は２．７％であった。

製造例５
製造例１において、乾燥種子を未熟実（種子を含む実全体）におきかえること以外は同様に処理して、脱脂粕を得た後、これから水抽出物である粉末（試料５とする）１８．４ｇを得た。該粉末を製造例１と同様に加水分解してＨＰＬＣ分析した結果、サポゲニン含量は１４．９％であり、ケンフェロール含量は２．３％であった。

試験例１：皮膚繊維芽細胞増殖促進作用
本発明及び参考の皮膚繊維芽細胞増殖促進剤（試料１〜試料５）が皮膚繊維芽細胞の増殖に及ぼす影響を以下の方法で調べた。すなわち、ペトリディッシュ（φ１０ｃｍ）を用い、正常ヒト成人皮膚繊維芽細胞（クラボウ（株）製、ＮＨＤＦ（ＡＤ）。以下、単に細胞という。）を１０％ウシ胎児血清（第一化学薬品（株）製）添加Ｄ−ＭＥＭ培地（シグマ社製、低グルコース）に２×１０^５個播き、サブコンフルエント（約８０％密度）になるまで４日間培養した。次いで、培地を除去し、細胞をＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄し、更に０．０２％ＥＤＴＡ溶液５ｍＬで洗浄した後、０．２５％トリプシン溶液（ナカライテスク（株）製）５ｍＬを用いて細胞を回収し、遠心分離（４℃、１，０００ｒｐｍ、５分）して上清を除き、ＰＢＳで２回洗浄して細胞を得た。この細胞を前記条件下で繰り返し培養して継代培養した。

９６穴細胞培養プレート（０．３２ｃｍ^２、旭テクノグラス（株）製）を用いて、前記継代培養細胞をヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清培地（クラボウ（株）製、ＬＳＧＳ添加１０６Ｓ培地：皮膚繊維芽細胞基礎培地（１０６Ｓ）５００ｍＬに低血清増殖添加剤（ＬＳＧＳ）１０ｍＬを添加した培地）中に１×１０^４個／ウェル播種し、２４時間培養した。次いで、培地を除去し、終濃度が５、１０又は２０μｇ／ｍＬとなるように各試料を添加した前記ヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清培地中で更に４８時間培養を続けた。この後、ＭＴＴ溶液（チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド（シグマ社製、試薬）を濃度５ｍｇ／ｍＬで溶解したＰＢＳ）を２５μＬ加えて１時間培養した。培地をデカンテーションで完全に除去した後、ホルマザン溶液（２５％（ｖ／ｖ）０．４５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、２５％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１０％（ｗ／ｖ）ｎ−ドデシル硫酸ナトリウムを含む。ｐＨ４．５）を１００μＬ加えて撹拌した。室温で１夜放置後、５９０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞の増殖度合いを評価した。尚、上記方法において、Ｄ−ＭＥＭ培地及びヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清培地はペニシリン（終濃度１００ＩＵ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加したものとし、細胞培養はすべてＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２強化気相下）で行った。

この結果を表１に示す。同表において、数値は同時に実施した対照試験（試料を添加しない場合）の値を１００としたときの相対値で示した。表１のデータから、本発明に係る脱脂粕の水抽出物にはヒト皮膚繊維芽細胞の増殖を促進する作用があること、又、この作用は前記脱脂粕を加熱して常圧下又は加圧下で水抽出した場合に顕著なものとなることを確認した。

試験例２：ヒアルロン酸産生増強作用
本発明及び参考のヒアルロン酸産生増強剤（試料１〜試料５）が皮膚繊維芽細胞によるヒアルロン酸の産生増強に及ぼす影響を以下の方法で調べた。すなわち、試験例１に記載の方法で継代培養した皮膚繊維芽細胞を、９６穴細胞培養プレート（０．３２ｃｍ^２、旭テクノグラス（株）製）を用いて、ヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清培地（クラボウ（株）製、ＬＳＧＳ添加１０６Ｓ培地：皮膚繊維芽細胞基礎培地（１０６Ｓ）５００ｍＬに低血清増殖添加剤（ＬＳＧＳ）１０ｍＬを添加した培地）に１×１０^４個／ウェル播種し、１日間培養した。次いで、ＬＳＧＳ添加１０６Ｓ培地中に終濃度が５、１０又は２０μｇ／ｍＬとなるように各試料を添加して更に４８時間培養を続けた。この培養液をすべて回収し、以下のＥＬＩＳＡ試験によるヒアルロン酸定量用試験液とした。

前記細胞培養液中のヒアルロン酸含量は、市販のヒアルロン酸測定キット（生化学工業（株）製）を用いて、ＥＬＩＳＡ試験法により分析した。すなわち、前記細胞培養液を前記キットの緩衝液で１６倍希釈し、ヒアルロン酸固層化マイクロプレートに５０μＬ添加した。次いで、ここにビオチン標識ＨＡＢＰ溶液を５０μＬ添加後、１分間混和し、３７℃で１時間、一次反応を行わせた。更に、ウェル内の溶液を除いてプレートを洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を１００μＬ添加し、３７℃で１時間、二次反応を行わせた。この後、ウェル内の溶液を除いて前記プレートを洗浄し、酵素基質溶液を１００μＬ加え、遮光下、室温にて３０分間、酵素反応を行わせた。該反応停止液を１００μＬ加えて混和した後、プレートリーダーで吸光度を測定した（測定波長：４９０ｎｍ、対照波長：６２０ｎｍ）。試験液中のヒアルロン酸含量はヒアルロン酸標準品による検量線から求めた。

この結果を表２に示す。同表において、数値は同時に実施した対照試験（試料を添加しない場合）の値を１００としたときの相対値で示した。表２のデータから、本発明に係る脱脂粕の水抽出物にはヒト皮膚繊維芽細胞によるヒアルロン酸産生を増強する作用があること、又、この作用は前記脱脂粕を加熱及び加圧下で水抽出した場合に顕著なものとなることを確認した。

試験例３：皮膚老化防止作用（その１）
５週齢の雌性ヘアレスマウス（日本エスエルシー（株）から購入）を１週間予備飼育後、通常食（日本クレア（株）製、ＣＥ−２）で更に１週間飼育した後、対照群：紫外線照射なし＋通常食、陽性対照群：紫外線照射＋通常食、試料添加群：紫外線照射＋試料２（１重量％）＋通常食、及び、比較群：紫外線照射＋ツバキ油（１重量％）＋通常食、の４群（各群５匹）に分け、それぞれの条件下で１２週間飼育した。紫外線照射はマウス背部に毎週５回、１２週間にわたり、６５ｍＪ／ｃｍ^２の強さでＵＶ−Ｂを照射した。各群のマウス皮膚上に形成されるシワ及び肌荒れの程度を目視観察して評価した。

この結果、紫外線を照射しなかった対照群ではシワ形成及び肌荒れは認められなかった。これに対して、紫外線を照射した陽性対照群では明確なシワ形成及び肌荒れが発生しており、ツバキ油を添加した比較群でも大差がなかった。一方、通常食に試料２を配合した試料添加群の場合は、紫外線照射によるシワ形成及び肌荒れがほぼ半減していた。このことから、本発明に係る前記水抽出物は紫外線照射による皮膚トラブルを軽減し得る皮膚老化防止作用を有することが確認された。

参考試作例１
試料２を１６０部、ミツロウ３０部及び中鎖脂肪酸トリグリセリド（日清オイリオ（株）、商品名：ＯＤＯ（登録商標）６０部を約５０℃に加熱混合して均質にした後、カプセル充填機に供して、常法により１粒あたり内容量が２５０ｍｇのゼラチン被覆ソフトカプセル製剤を試作した。このカプセル製剤は経口摂取できる栄養補助食品として利用できる。

参考試作例２
試料１を５０部、α−リポ酸（ドイツ・デグサ社製、商品名：ＡＬＩＰＵＲＥ（登録商標））２０部、ハス胚芽エキス末（丸善製薬（株）製）２０部、クレアチン（ドイツ・デグサ社製、「クレアピュア」）２５部、リボフラビン（ＤＳＭニュートリション・ジャパン（株）製）１８部、マルチトール（東和化成（株）製）９２部、リン酸三カルシウム（米山化学工業（株）製）１００部及びセルロース２５部を混合機に仕込み、１０分間攪拌混合した。この混合物を直打式打錠機に供して直径７ｍｍ、高さ４ｍｍ、重量１５０ｍｇ／個の素錠を作成し、ついでコーティング機でシェラック被膜を形成させて錠剤形状の食品を試作した。

ツバキの実及び／又は種子の脱脂物から得られる水抽出物は、皮膚繊維芽細胞増殖促進作用、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強作用、皮膚老化防止作用等を有するため、これを経口や経管で摂取することにより、皮膚の本来の生理機能を回復させ、皮膚トラブルの改善や皮膚損傷の早期回復に役立つため、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の分野において美容健康用経口組成物として利用できる。

Claims

ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物（水のみによって抽出されるものに限る）を有効成分として含有してなる経口用皮膚繊維芽細胞増殖促進剤。
ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物（水のみによって抽出されるものに限る）を有効成分として含有してなる経口用コラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強剤。
コラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強が皮膚組織中のコラーゲン及び／又はヒアルロン酸の増量である請求項２に記載の経口用コラーゲン及び／又はヒアルロン酸産生増強剤。
ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂粕の水抽出物（水のみによって抽出されるものに限る）を有効成分として含有してなる、皮膚のシワ、シミ、くすみ、ソバカス及びたるみからなる群から選ばれる少なくとも１つの症状を改善するための経口用皮膚老化防止剤。