KR102453894B1 - 캄페롤 배당체 화합물을 포함하는 피부 보호용 조성물 - Google Patents

캄페롤 배당체 화합물을 포함하는 피부 보호용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 동백 씨에서 오일 추출 후 폐기되는 동백 유박(Camellia japonica seed cake)으로부터 추출된 캄페롤 화합물을 유효 성분으로 포함하여 자연친화적이면서도, 부작용이 적어 인체에 안전하고 피부 재생 등의 효과가 우수한 피부 보호용 조성물을 제공한다.

Description

캄페롤 배당체 화합물을 포함하는 피부 보호용 조성물 {COMPOSITION FOR SKIN PROTECTION COMPRISING KAEMPFEROL SACCHARIDES COMPOUNDS}
본 명세서에는 인체에 안전하면서도 피부 보호 효과가 우수한 캄페롤 배당체 화합물을 포함하는 피부 보호용 조성물이 개시된다.
피부는 인체의 일차 방어막으로 체내의 제 기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부 환경의 자극으로부터 보호해 주며 체온조절 등의 생체 항상성 유지에도 중요한 역할을 하고 있다.
그러나, 과도한 물리적·화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍 등의 외부요인과 나이가 들어감에 따라 피부의 정상적인 기능을 저하시키고, 탄력 손실, 각질화, 주름생성 등의 현상을 촉진시키게 된다. 이러한 현상을 방지하고 보다 건강하고 탄력 있는 피부를 유지하기 위해서 생리 활성 물질들이 강화된 화장품을 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키고 피부 세포를 활성화시켜 피부 재생을 효과적으로 촉진시키기 위한 노력이 있어 왔다.
그러나 기존의 많은 화장품 원료들은 대부분 효능이 미진하거나, 강한 효능을 가지는 경우, 피부 부작용을 유발하는 등의 여러 가지 문제점을 가지고 있다. 따라서 피부에 안전하면서도 효과적으로 피부 재생을 촉진하고, 피부 각질 생성 주기를 조절할 수 있는 성분에 대한 관심이 늘어가고 있다.
B.-C. Liau et al. / Industrial Crops and Products 95 (2017) 296-304
본 발명의 일 측면에서, 캄페롤 배당체 화합물을 유효 성분으로 포함하여, 부작용이 적어 인체에 안전하면서도 피부 보호 효과가 우수한 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 동백 유박(Camellia japonica seed cake)으로부터 추출된 캄페롤 배당체 화합물을 유효 성분으로 포함하여, 동백씨 오일 추출 후 버려지는 폐자원을 활용한 피부 보호용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 피부 주름을 개선하거나, 피부 재생을 촉진하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 기질 메탈로 프로테아제-1 (Matrix matallloprotease-1, MMP-1)의 발현을 억제하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 아토피성 피부를 개선하기 위한 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 피부 각질 생성 주기를 조절하거나, 피부 각질을 조절하거나, 피부 각질 턴오버를 촉진시키거나, 피부 각질 턴오버 주기를 정상화하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 아토피성 피부를 개선하거나, 아토피성 피부염을 개선, 예방 또는 치료하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 피부 각질 생성 주기를 조절하거나, 피부 각질을 조절하거나, 피부 각질 턴오버를 촉진시키거나, 피부 각질 턴오버 주기를 정상화하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효 성분으로 포함하는, 피부 보호용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112020097839990-pat00001
[화학식 2]
Figure 112020097839990-pat00002
[화학식 3]
Figure 112020097839990-pat00003
[화학식 4]
Figure 112020097839990-pat00004
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 피부 보호용 조성물은, 캄페롤 배당체 화합물, 특히, 캄페롤 4-배당체 화합물을 유효 성분으로 포함하여, 기질 메탈로 프로테아제-1 (Matrix matallloprotease-1, MMP-1)의 발현을 억제함으로써, 피부 주름을 개선하고, 피부 재생을 촉진시킬 수 있다.
다른 일 측면에서, 본 명세서에 개시된 피부 보호용 조성물은, 캄페롤 4-배당체 화합물을 유효 성분으로 포함하여, 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제함으로써, 아토피성 피부를 개선하거나, 아토피성 피부염을 개선, 예방 또는 치료할 수 있고, 피부 각질 생성 주기를 조절할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 노화 마커 SA-beta-gal의 발현을 관찰한 결과이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 활성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 기질 메탈로 프로테아제-1 (Matrix matallloprotease-1, MMP-1) 발현 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물이 H&E, Ki-67, KRT10, FLG, INV에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5a-5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물이 표피 두께, Ki-67 에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.
도 6a-6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물이 KRT10, FLG, INV에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.
도 8a-8b는 PDK1 억제시 재생 능력이 회복되는지에 관한 실험 개략도이다.
도 9a-9b는 PDK1 억제에 의한 피부 세포의 기능적 회복을 나타낸 결과이다.
도 10a-10b는 피부 재생에 대한 PDK1의 효과를 나타낸 결과이다.
도 11a-11b는 PDK1 억제가 피부 등가물에서 SASP를 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
본 명세서에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 예시적인 구현예들에서는, 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효 성분으로 포함하는, 피부 보호용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112020097839990-pat00005
[화학식 2]
Figure 112020097839990-pat00006
[화학식 3]
Figure 112020097839990-pat00007
[화학식 4]
Figure 112020097839990-pat00008
본 명세서에서 "이성질체"는 특히 광학 이성질체(optical isomers)(예를 들면, 본래 순수한 거울상 이성질체(essentially pure enantiomers), 본래 순수한 부분 입체 이성질체(essentially pure diastereomers) 또는 이들의 혼합물)뿐만 아니라, 형태 이성질체(conformation isomers)(즉, 하나 이상의 화학 결합의 그 각도만 다른 이성질체), 위치 이성질체(position isomers)(특히, 호변이성체(tautomers)) 또는 기하 이성질체(geometric isomers)(예컨대, 시스-트랜스 이성질체)를 포함한다.
본 명세서에서 "본래 순수(essentially pure)"란, 예컨대 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체와 관련하여 사용한 경우, 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체를 예로 들 수 있는 구체적인 화합물이 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 99% 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 99.5% 이상(w/w) 존재하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 “수화물(hydrate)”은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념이다.
본 명세서에서 “용매화물”은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미한다.
상기 화학식 1로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물의 IUPAC명은 캄페롤-3-O-β-D-자일로피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-자일로피라노실-(1→2)-O-β-D-갈락토피라노사이드 (Kaempferol-3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-O-β-D-galactopyranoside) 이며, 이는 상온에서 옅은 노란색 분말 (pale yellow powder)로 존재할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물의 정보는 하기와 같다.
Pale yellow powder; UV ( HPLC -PDA) λ max 266, 347 nm ; [α] 22 D -57.4 (c 0.10); ESI -Q- TOF -MS: m/z 859.2503 [M+H] + ( calcd . for C 37 H 47 O 23 + , 859.2508), 881.2329 [M+Na] + ( calcd . for C 37 H 46 O 23 Na + , 859.2327); 1 H- ( CD 3 OD , 500 MHz ) and 13 C-NMR ( CD 3 OD , 125 MHz ) (도 7 참조)
상기 화학식 2로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물의 IUPAC명은 캄페롤-3-O-β-D-자일로피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-자일로피라노실-(1→2)-O-β-D-글루코피라노사이드 (Kaempferol-3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranoside) 이며, 이는 상온에서 옅은 노란색 분말 (pale yellow powder)로 존재할 수 있다.
상기 화학식 2로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물의 정보는 하기와 같다.
Pale yellow powder; UV ( HPLC -PDA) λ max 266, 347 nm ; [α] 22 D -63.7 (c 0.10); ESI -Q- TOF -MS: m/z 859.2505 [M+H] + ( calcd . for C 37 H 47 O 23 + , 859.2508), 881.2325 [M+Na] + ( calcd . for C 37 H 46 O 23 Na + , 859.2327); 1 H- ( CD 3 OD , 500 MHz ) and 13 C-NMR ( CD 3 OD , 125 MHz ) (도 7 참조)
상기 화학식 3으로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물의 IUPAC명은 캄페롤-3-O-β-D-자일로피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노실-(1→2)-O-β-D-갈락토피라노사이드 (Kaempferol-3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-galactopyranoside) 이며, 이는 상온에서 옅은 노란색 분말 (pale yellow powder)로 존재할 수 있다.
상기 화학식 3으로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물의 정보는 하기와 같다.
Pale yellow powder; UV ( HPLC -PDA) λ max 266, 347 nm ; [α] 22 D -72.5 (c 0.2); ESI -Q- TOF -MS: m/z 889.2616 [M+H] + ( calcd . for C 38 H 49 O 23 + , 889.2613) and 911.2432 [M+Na] + ( calcd . for C 38 H 48 O 24 Na + , 859.2327); 1 H- ( CD 3 OD , 500 MHz ) and 13 C-NMR ( CD 3 OD , 125 MHz ) (도 7 참조)
상기 화학식 4로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물의 IUPAC명은 캄페롤-3-O-β-D-자일로피라노실-(1→3)-O-α-L-람노피라노실-(1→6)-O-β-D-글루코피라노실-(1→2)-O-β-D-글루코피라노사이드 (Kaempferol-3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-gluctopyranoside) 이며, 이는 상온에서 옅은 노란색 분말 (pale yellow powder)로 존재할 수 있다.
상기 화학식 4로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물의 정보는 하기와 같다.
Pale yellow powder; UV ( HPLC -PDA) λ max 266, 347 nm ; [α] 22 D -45.1 (c 0.10); ESI -Q- TOF -MS: m/z 889.2613 [M+H] + ( calcd . for C 38 H 49 O 23 + , 889.2613) and 911.2423 [M+Na] + ( calcd . for C 38 H 48 O 24 Na + , 859.2327); 1 H- ( CD 3 OD , 500 MHz ) and 13 C-NMR (CD 3 OD, 125 MHz) (도 7 참조)
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은, 동백 씨에서 오일 추출 후 폐기되는 동백 유박(Camellia japonica seed cake)으로부터 추출된 캄페롤 4 배당체 화합물(Kaempferol tetrasaccharides)을 유효 성분으로 포함하여, 종래의 캄페롤 배당체 화합물을 유효 성분으로 포함하는 조성물과 비교하여, 현저히 우수한 피부 주름 개선, 피부 재생, 아토피성 피부염 개선, 예방 또는 치료, 피부 각질 생성 주기 조절 효과를 나타낼 수 있다.
동백 유박 추출물은 테르핀배당체, 플라보노이드배당체, 당 및 단백질로 이루어져 있다. 특히, 동백 유박의 플라보노이드 배당체는 캄페롤의 4 배당체(화학식 1, 2, 3, 4)와 3 배당체 (하기 화학식 5, 6, 7, 8)로 구성되어 있는데, 본 발명자들은 동백 유박에서 유래된 캄페롤 배당체 중 4 배당체 4종(화학식 1, 2, 3, 4)의 피부 보호 효과가 뛰어남을 확인하였다.
[화학식 5]
Figure 112020097839990-pat00009
[화학식 6]
Figure 112020097839990-pat00010
[화학식 7]
Figure 112020097839990-pat00011
[화학식 8]
Figure 112020097839990-pat00012
일 구현예에서, 상기 캄페롤 배당체 화합물은 동백 유박으로부터 추출된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 캄페롤 배당체 화합물은 동백씨로부터 압착 방법을 통해서 오일(기름)을 생산한 후 얻어지는 동백 유박을 얻은 후, 동백 유박으로부터 70% 에탄올을 사용하여 캄페롤 배당체 화합물을 추출함으로써 얻어질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 유효 성분의 농도가 상기 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01-100 μM 일 수 있고, 예컨대, 0.01 μM 이상, 0.1 μM 이상, 0.5 μM 이상, 1 μM 이상, 1.5 μM 이상, 2 μM 이상, 또는 2.5 μM 이상일 수 있고, 100 μM 이하, 50 μM 이하, 10 μM 이하, 8 μM 이하, 6 μM 이하, 또는 4 μM 이하일 수 있다.
상기 농도가 0.01 μM 미만인 경우 피부 재생 촉진, 아토피성 피부염 개선, 또는 피부 각질 생성 주기를 조절 등의 피부 보호 효과가 미미할 수 있고, 100 μM 초과인 경우 세포 독성이 나타날 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 피부 주름을 개선하기 위한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 피부 재생을 촉진하기 위한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 기질 메탈로 프로테아제-1 (Matrix matallloprotease-1, MMP-1)의 발현을 억제할 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 기질 메탈로 프로테아제-1 (Matrix matallloprotease-1, MMP-1)의 발현을 억제하여, 피부 주름을 개선하기 위한 것일 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 기질 메탈로 프로테아제-1 (Matrix matallloprotease-1, MMP-1)의 발현을 억제하여, 피부 재생을 촉진하기 위한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 아토피성 피부를 개선하기 위한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 피부 각질 생성 주기를 조절하기 위한 것일 수 있다.
상기 피부 각질 생성 주기는 표피 세포의 턴오버(turn-over) 주기라 할 수 있는데, 이는 각질형성세포(keratinocyte) 의 피부 표피(epidermis) 바닥에서부터 피부 표면의 퇴화된 각질세포(corneocytes)가 되기까지의 주기를 의미한다.
피부 세포의 턴오버 주기는 두 가지 요소에 의하여 결정될 수 있는데 하나는 표피 세포의 성장 포텐셜(potential)을 유지하여 콜로니(colony) 형성 효율 측정하는 것이고, 다른 하나는 표피 세포의 분화 촉진으로 장벽 강화를 유지하여 분화 정도를 측정하는 것이다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 캄페롤 4 배당체 화합물을 유효 성분으로 포함하여, 표피 세포의 콜로니 형성을 촉진시키고, 분화를 촉진시켜 피부 각질 생성 주기 또는 표피 세포의 턴오버 주기를 단축시킬 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 피부 각질을 조절하기 위한 것일 수 있고, 또는 피부 각질 턴오버를 촉진시키기 위한 것일 수 있으며, 또는 피부 각질 턴오버 주기를 정상화하기 위한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제할 수 있다.
상기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물을 포함하는 조성물을 이용하여 PDK1 활성을 억제하는 경우, 노화되어 성장이 억제된 세포가 다시 성장을 할 수 있고, 또한 손상된 세포가 회복될 수 있다.
다시 말해, 노화된 인간 진피 섬유아세포에서 PDK1의 억제가 노화 특징을 근절하고 NF-κB 및 mTOR 신호 전달을 억제하여, 세포 생성 주기를 회복시켜 피부 재생 능력을 회복 또는 촉진시킬 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 피부 주름을 개선하기 위한 것일 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 피부 재생을 촉진하기 위한 것일 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 아토피성 피부를 개선하거나, 아토피성 피부염을 개선, 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 피부 각질 생성 주기를 조절하기 위한 것일 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 피부 각질을 조절하기 위한 것일 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 피부 각질 턴오버를 촉진시키기 위한 것일 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 피부 각질 턴오버 주기를 정상화하기 위한 것일 수 있다.
또다른 일 구현예에서, 상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하여, 피부 장벽을 개선하기 위한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유할 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이 크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 유효 성분 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 피부 외용제일 수 있으며, 상기 피부 외용제는 피부 외부에서 도포되는 어떠한 것이라도 포함될 수 있는 총칭으로서 다양한 제형의 화장품, 의약품이 여기에 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 아토피성 피부염 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.
상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효 성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여 형태로 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물은 비경구, 직장, 국소, 경피, 피하 등으로 투여될 수 있다.
상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 미만 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 조성물 0.01 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일 일 수 있고, 예컨대 0.01 mg/kg/일 이상, 0.1 mg/kg/일 이상, 0.5 mg/kg/일 이상, 1 mg/Kg/일 이상, 1.3 mg/Kg/일 이상, 1.5 mg/Kg/일 이상, 1.7 mg/Kg/일 이상, 2 mg/Kg/일 이상, 또는 2.2 mg/Kg/일 이상일 수 있고, 100 mg/kg/일 이하, 50 mg/kg/일 이하, 10 mg/kg/일 이하, 7 mg/kg/일 이하, 5 mg/kg/일 이하, 3 mg/kg/일 이하, 또는 2.5 mg/kg/일 이하일 수 있으며, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 5 mg/kg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제, 과립제, 음료(드링크제), 다이어트바, 초콜렛, 카라멜 제형 또는 과자류 제형일 수 있으며, 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 유효 성분 외에도 필요에 따라 부형제, 당류, 향료, 색소, 유지류, 단백질 등을 적의 함유할 수 있다.
본 발명의 또다른 예시적인 구현예들에서, 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 피부를 보호하는 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112020097839990-pat00013
[화학식 2]
Figure 112020097839990-pat00014
[화학식 3]
Figure 112020097839990-pat00015
[화학식 4]
Figure 112020097839990-pat00016
본 발명의 또다른 예시적인 구현예들에서, 피부 보호용 조성물을 제조하기 위한, 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 용도를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112020097839990-pat00017
[화학식 2]
Figure 112020097839990-pat00018
[화학식 3]
Figure 112020097839990-pat00019
[화학식 4]
Figure 112020097839990-pat00020
본 발명의 또다른 예시적인 구현예들에서, 피부를 보호하기 위한 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물의 비치료적 용도를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112020097839990-pat00021
[화학식 2]
Figure 112020097839990-pat00022
[화학식 3]
Figure 112020097839990-pat00023
[화학식 4]
Figure 112020097839990-pat00024
본 발명의 또다른 예시적인 구현예들에서, 아토피성 피부염 개선, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112020097839990-pat00025
[화학식 2]
Figure 112020097839990-pat00026
[화학식 3]
Figure 112020097839990-pat00027
[화학식 4]
Figure 112020097839990-pat00028
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시에는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
실시예
실험에 사용한 동백유박은 제주도 동백마을의 동백씨로부터 압착 방법을 통해서 오일(기름)을 생산한 후 얻었다. 동백유박으로부터 70% 에탄올을 사용하여 추출물을 제조하였고, 동백유박 추출물이 테르핀배당체, 플라보노이드배당체, 당 및 단백질로 이루어진 것을 확인하였다. 특히 동백유박의 플라보노이드 배당체는 카페롤의 4 배당체(화학식 1-4)와 3 배당체 (화학식 5-8)로 구성되어 있으며, 본 명세서에서는 동백유박 캄페롤 배당체 중 4 배당체 4종(화학식 1-4)의 피부 항노화 및 재생효과가 뛰어남을 확인하였다.
1) 동백유박 캄페롤배당체 분획의 정제
저온 착유하여 오일을 제거한 동백유박 1kg에 70% 에탄올 8kg을 넣고 가온 추출기를 이용하여 60℃에서 8시간 추출하였다. 필터프레스로 여과하여 얻은 추출물을 50~60℃에서 회전감압 농축기로 고형분이 약 50% 될때까지 감압농축하고 200g의 농축액을 얻었다. 이 농축액을 고형분 10%가 되도록 정제수로 희석하였다.
이 용액을 이온교환수지(HP-20) 2L가 충진된 유리관 컬럼에 로딩한 후 정제수 10L로 세척하여 불순물 및 당 성분을 제거하였다. 이어서 순차적으로 30% 에탄올 10L를 흘려주고 용출액을 감압농축하고 동결건조하여 동백캄페롤 배당체 분획 파우더 약 20g을 얻었다.
2) 동백유박 캄페롤 4 배당체 및 3 배당체의 정제
동백캄페롤 배당체 분획의 각 성분들은 HPLC결과 용출시간의 차가 매우 적어 분취용 HPLC를 이용하여 분리하였다. 사용 용매조건은 물과 아세토니트릴, 메탄올의 혼합용매를 사용하였고, 이들 용매의 농도구배 또는 일정한 비율의 혼합액을 사용하였으며 그 결과 화학식 1-4 (4 배당체) 및 5-8 (3 배당체)의 캄페롤 배당체 화합물 성분을 분리하였다.
시험예
통계
하기 모든 실험에서 시료 간의 통계적 유의성은 student t-test를 이용하였고, p-value 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 분석하였다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
시험예 1 : 노화마커 SA-beta gal 발현 정도 확인
*세포주 및 배양
(1) 늙은피부 세포 배양
인간진피섬유아세포인 normal human dermal fibroblast (NHDF; Lonza, Switzerland)를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 개대숫자가 6-9인 세포를 젊은 세포로 하고, 이를 1:5 개대배양하여 37번 개대하여 노화된 진피섬유아세포를 얻었다.
(2) 노화마커 SA-beta gal 발현 활성 분석
상기 (1)의 늙은피부 세포에 DMSO, 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8로 표시되는 화합물과 하기 화학식 9, 10으로 표시되는 캄페롤 3-O-β-루티노사이드 (Kaempferol 3-O-β-rutinoside) (화학식 9), 캄페롤 7-O-β-D-글루코피라노사이드 (Kaempferol 7-O-β-D-glucopyranoside) (화학식 10) 3 μM을 각각 7일 동안 처리하였다.
[화학식 9]
Figure 112020097839990-pat00029
[화학식 10]
Figure 112020097839990-pat00030
8일째 PBS로 세척하고, 세포 노화 분석 키트(Cellular Senescence Assay kit)(Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA)에서 제공한 고정액과 염색약으로 37℃에서 16시간 동안 염색하였다. 다음날 PBS로 세척하고, 20% 글리세롤 용액으로 덮어서 현미경으로 초록색으로 염색된 세포 수를 측정한 후 노화 표지자인 SA-beta-Gal 발현 정도를 평가하여, 그 결과를 하기 표 1, 도 1 에 나타내었다.
Control Kaempferol Kaempferol 3-O-β-rutinoside Kaempferol 7-O-β-D-glucopyranoside 5 6 7 8 1 2 3 4
78± 5.2 80 ± 12.1 81 ± 11.3 79± 9.9 79 ± 11.2 81 ± 9.7 69 ± 21.1 75 ± 10.6 38 ± 10.4 40 ± 10.4 42 ± 9.7 37 ± 9.1
*세포 생존력 분석 (Cell viability assay)
1. HDF(human dermal fibroblast) 세포를 96 well plate에 1x104 cells/well 농도로 분주하고 세포 배양 조건에서 48시간 배양하였다.
2. FBS를 함유하지 않은 DMEM 배지에 시험물질을 농도별로 희석한 뒤 세포에 처리하여 48시간 배양하였다.
3. DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척하고 10% EZ-Cytox 용액을 포함한 배양 배지로 교체하여 1시간동안 세포 배양 조건에서 배양한 뒤 ELISA reader (Tecan　Infinite M200 Pro)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 표 1을 참조하면, 본 발명의 화학식 1-4의 화합물이 대조군 또는 비교예 화합물(화학식 5-8)과 비교하여, 약 50% 수준으로 노화 마커인 SA-beta 발현을 억제시킨 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 1을 참조하면, 본 발명의 화학식 1-4의 화합물이 배양된 세포에서 노화 마커인 SA-beta gal이 현저히 줄어든 것을 육안상으로 확인할 수 있다.
시험예 2 : PDK1 분석
3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 활성은 재조합 정제 PDK1 효소 (recombinant purified PDK1 enzyme)와 ADP-Glo + PDK1 키나아제 효소 시스템 (PDK1 Kinase Enzyme System) (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 측정하였다. 기재(Substrate), ATP, 버퍼(buffer) 혼합물 분주 후 시험물질(1, 3, 10 μM)을 각 웰(well)에 분주하였다. 직후에 PDK1을 분주하여 60분간 반응시켰다. 반응 후 ADP-glo를 넣고 상온에서 40분 인큐베이션(incubation) 후 키나아제 탐지 버퍼 (kinase detection buffer)를 넣고 30분 반응 후 발광 리더 (Luminescence reader) (Wallac Victor2, perkin elmer)로 측정하였다. 그 결과를 도 2a및 2b에 나타내었다.
도 2a및 2b를 참조하면, 비교예인 화학식 5-8의 화합물(2a)과 비교하여, 본 발명의 화학식 1-4의 화합물(2b)의 PDK 활성 억제 효과가 더욱 우수하다는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, 도 2a를 참조하면 대조군인 DMSO와 비교하여 화학식 5-8의 화합물의 경우 PDK1 활성을 전혀 억제하지 못하고 오히려 촉진시키는 모습을 보였으나, 도 2b를 참조하면 본 발명의 화학식 1-4의 화합물은 재도군인 DMSO와 비교하여 눈에 띄게 PDK1 활성을 억제한다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 캄페롤 4 배당체 화합물(화학식 1-4) 중에서도 OH가 더 붙어있는 경우 동일 농도에서 더 높은 효과를 보인다는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3 : MMP -1 ELISA 분석
HDF 세포를 24 웰 플레이트 (well plate)에 2.5x104 cells/well 농도로 분주하고 세포 배양조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 FBS를 함유하지 않은 DMEM 배지에 시험물질을 희석한 뒤 세포에 처리하여 48시간 배양하였다. DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척 후 DPBS를 넣은 상태에서 15 mJ/cm2 의 광량으로 UVB (15mJ/cm2) 조사 후 시험물질(2 μM 또는 3 μM)이 희석된 DMEM 배지로 교체 후 48시간 배양하였다. 이후 상층액(supernatant)를 수거하여 Human Total MMP-1 ELISA (R&D systems)을 사용하여 MMP-1의 양을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 캄페롤 4당체 화합물(화학식 1, 3, 4)들의 MMP-1 발현 억제가 캄페롤 3당체 화합물(화학식 5, 7) 및 레티노익산(retinoic acid, RA) 등의 대조군들에 비하여 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
시험예 4 : 피부 장벽 개선 확인
1) 3D 기관형 피부 표피 (3D organotypic skin epidermis)
인간 표피 모델(human epidermis models) (EpidermTM EPI-201; MatTek corportation, Ashland, MA, USA) 을 젊은 사람(21세, 21Y로 표시) 및 늙은 사람(58세, 58Y로 표시)에 해당하는 것으로 각각 구입하였으며, 이 중 늙은 사람에 해당하는 인간 표피 모델에 화학식 1로 표시되는 캄페롤의 4 배당체를 3 μM 씩 4일 동안 처리하였다. 10% 중성 버퍼 포르말린 (neutral buffered formalin)으로 고정한후 파라핀 블락을 제조하였다.
2) 피부 장벽 마커 확인
anti-KRT 10 (Biolegend, San Diego, CA), anti-FLG (Novus Biologicals, Centennial CO, USA), anti-Involucrin, 및 anti-Ki67 (Abcam) 항체로 반응시킨후 현미경에서 각 항체발현을 분석하였다. 구체적으로, 젊은 기증자(donor) (Young 21Y)에서 유래한 표피 조직과 늙은 기증자(donor) (Old 58Y)에서 유래한 표피조직에 약물을 처리한 후 제시한 항체를 가지고 염색하고 정량화하였다. 그 결과를 도 4, 도 5a-5b 및 도 6a-6c에 나타내었으며, 5a-5b 및 도 6a-6c는 도 4의 결과를 정량화한 것이다.
이를 참조하면, 젊은 표피조직에 비교하여 늙은 표피조직은 표피 두께가 감소하였고(도 5a), 장벽기능(KRT10-도 6a, FLG-도 6b, INV-도 6c)이 약화되었으며, 재생능력마커(KI67-도 5b)의 발현이 떨어지는 것을 확인하였다. 다만, 늙은 표피조직에 화학식 1로 표시되는 화합물을 처리한 경우, 모든 항목에서 젊은 표피조직과 유사한 정도로 표피 두께, 장벽 기능 및 재생능력마커 발현 효과가 회복되는 것으로 나타났다.
시 험예 5 : PDK1 억제시 재생 능력 회복
조절 신호 네트워크를 분석하여 PDK1이 노화 섬유아세포(senescent fibroblasts)를 정지 섬유아세포(quiescent fibroblasts)로 전환할 수 있는 억제제 표적임을 예측하였다(도 8a). 이 예측을 검증하기 위해 PDK1 억제제에 노출된 NHDF(normal human dermal fibroblasts) (도 8b)로 실험을 수행하였으며, 이는 세포 노화의 특징을 제거하고 성장 인자에 대한 반응으로 세포의 증식을 회복 시키는 것을 확인하였으며, 2 차원 컬쳐와 3 차원 피부 동등 모델에서 피부 재생 능력을 회복한 것을 확인하였다.
종합적으로, PDK1 억제가 노화 표현형을 유지하는 핵심 과정인 세포 성장과 SASP를 모두 감소시키고, 세포 성장과 관련된 PDK1, AKT, IKBKB 및 PTEN으로 구성된 주요 양성 피드백 루프를 비활성화함을 확인하였다. 신호 전달의 결과적인 변화는 정지 표현형(quiescence phenotype)을 복원한다.
하기 실험들에서 인간진피섬유아세포인 정상 인간 진피 섬유아세포 (normal human dermal fibroblast)(NHDF; Lonza, Switzerland)를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 개대숫자가 6-9인 세포를 젊은 세포로 하고, 이를 1:5 개대배양하여 37번 개대하여 노화된 진피섬유아세포를 얻었다.
1) 상처 치유 분석에 의해 분석된 PDK1 억제에 의한 피부 세포의 기능적 회복
먼저, PDK1 억제 또는 mTOR 및 NF-κB 의 이중 억제에 의해 노화의 특징 감소뿐만 아니라 진정한 재생 능력이 달성되었는지 확인하기 위해, 2 차원 상처 치료와 3 차원 피부 재생을 위한 역전된 세포의 능력을 조사하였다.
구체적인 실험방법은 하기와 같다.
젊은 NHDF는 노화 조건이나 약물 치료를 받지 않았다. 젊은 NHDF는 배양이 PDL 12에서 약 80 % 합류에 도달했을 때 분석되었다. 나머지 NHDF는 독소루비신 (100ng / ml)과 IGF-1 (100ng / ml)에 7 일 노출시켜 노화를 유도하였다. 약물 처리 조건의 경우 노화 세포를 DMSO, 라파 마이신 (100nM), 라파 마이신과 JSH (2.5μM) 또는 BX795 (100nM)로 7 일 더 처리하였다. 컨디셔닝된 배지 처리 (BX795 + CM(Conditioned medium))를 위해, 세포를 독소루비신 및 IGF-1의 존재하에 7 일 동안 성장시킨 다음, 독소루비신, IGF-1 및 BX795의 추가 존재하에 7 일 동안 계대 배양한 다음, 노화 세포에서 추출한 조절 배지와 함께 3 일 더 배양하였다.
도 9a-9b를 참조하면, 각각 다음과 같다: (9a) 상처 후 0 시간 및 96 시간의 대표적인 이미지가 표시되었으며, 파선은 상처 부위를 표시한 것이다. 스케일 바 = 200 μm. (9b) 스크래치 상처 분석에서 마이그레이션 영역의 정량화 분석. 평균(Mean) ± SD (n=3), 분산의 일방향 분석에 의하여 DMSO 대조군 노화 세포와 비교하여 *** P <0.001.
조사 결과, PDK1 억제 또는 mTOR 및 NF-κB의 이중 억제 (mTOR 단일 억제는 아님)는 NHDF 단일층의 스크래치 상처의 치료를 촉진시켰다(도 9a-9b).
2) 피부 재생에 대한 PDK1의 효과
3D 피부 모델 (피부 등가물)은 젊은 NHDF (PDL 12), 또는 독소루비신(doxorubicin)과 IGF-1 또는 반복된 도금 (복제 노화, PDL 57)에 의해 노화로 유도된 노화 NHDF로 준비하였고, 이들을 DMSO 또는 BX795에 노출시켰다. 각각 처리된 함량은 다음과 같다: 독소루비신 (100mg/mL), IGF-1 (100ng/mL), BX-795(100nM)
도 10a-10b를 참조하면, 각각 다음과 같다: (10a) 피부 등가 모델 섹션은 콜라겐 섬유를 검출하기 위해 해마톡실린 및 에오신(haematoxylin and eosin, H&E) 또는 메이슨 트리크롬 (Masson's Trichrome)으로 염색되었다. 표시된 단백질은 면역 조직 화학(immunohistochemistry)에 의해 검출되었다. 결과는 3 개의 대표 실험으로부터 얻은 것이다. 스케일 바 = 50 μm.
구체적으로, 실험 방법은 다음과 같다.
파라핀 샘플은 자일렌에서 탈랍되고, 하강하는 에탄올을 통해 물 재수화되었다 (각 용액당 3 분). 에피토프(Epitope) 회수는 Citrate Buffer pH 6.0 Antigen Retriever (64142; Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)를 이용하여 121 ℃에서 10 분 동안 수행하였으며, 슬라이드는 PBS/0.05 % Tween 20에서 3 회 세척하기 전에 냉각되었다. 그런 다음 섹션을 물/1 % H2O2와 함께 30 분 동안 배양하여 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase)를 블로킹(blocking)하고, 물과 PBS/0.05 % Tween 20으로 5 분 동안 헹구고, 4 ℃에서 밤새 다음 1차 항체에 노출되기 전에 PBS/10 % 염소 혈청 (Dako, Glostrup, Denmark)과 함께 20 분 동안 배양하였다. 1차 항체는 다음과 같다; anti-KRT 10 (Biolegend, San Diego, CA), anti-FLG (Abcam), anti-MMP-1(Abcam), anti-Ki67 (Abcam).
샘플을 10분 동안 물로 완전히 세척하고 5분 동안 PBS/0.05 % Tween 20으로 철저히 세척한 다음, EnVision + System- 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 폴리머 항-마우스 항체 (K4001; Dako, Carpinteria, CA)와 함께 30분 배양하였다. 그런 다음, 샘플을 액체 DAB+ Substrate Chromogen System (K3468; Dako)으로 배양하기 전에, 물과 PBS로 3-5분 동안 세척하였다. 상기 반응을 수돗물로 헹구어 중단하고, 섹션을 Mayer's hematoxylin에서 3-5 분 동안 대비염색(counterstain)하고 수돗물에서 1 분 동안 헹구었으며, Scott's bluing water 에서 2 분 동안 헹구었다.
마지막으로, 섹션은 등급이 지정된 에탄올에서 탈수되고, 자일렌에서 제거되었으며, Cytoseal 60 (ThermoScientific, Waltham, MA)에 장착되었다. Masson's trichrome 염색은 시판되는 키트 (BBC Biochemical, Seattle, WA, USA)를 사용하여 수행되었다. 면역 형광 염색을 위해 Dako 표적 회수 용액 (Dako)에서 슬라이드를 20분 동안 끓여서 항원 회수를 수행하였다. 비특이적 염색은 10% 당나귀 혈청 및 0.05% Triton X-100을 포함하는 PBS로 30분 동안 배양하여 블로킹(blocking)하였다. 조직 섹션을, 4 ℃에서 밤새 Dako Fluorescence Mounting Medium (Dako)에서 COL17A1 (Abcam) 및 Laminin 5 (Santa Cruz Biotechnology)와 함께 배양한 다음, 실온에서 2 시간 동안 Alexa Fluor 488 (Invitrogen-Molecular Probes)과 결합된 적절한 2차 항체와 함께 배양하였다. PBS로 세척한 후, 핵 대비염색(counterstaining)을 위하여, 4',6-디아미딘-2'-페닐인돌 디히드로클로라이드 (4',6-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride) (DAPI, Invitrogen-Molecular Probes)를 추가하였다. 커버슬립은 형광 장착 배지(fluorescent mounting medium) (Thermo Electron)를 사용하여 유리 슬라이드에 장착되었다.
(10b) 도 10b의 왼쪽 위에서부터 차례대로, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 피부 두께의 정량화/ MMP1의 정량화/ 메이슨 트리크롬 (Masson's Trichrome) 염색으로 검출된 판-콜라겐(pan-collagen) 섬유의 정량화(Collagen fiber)/ Ki-67 양성 세포의 정량화/ ImageJ 소프트웨어를 사용하여 표피 두께의 정량화/ 케라틴 10의 정량화/. 필라그린의 정량화/ COL17A1의 정량화/ Laminin5의 정량화/ ELISA에 의해 정량화된 배양 배지로 분비된 타입 I 프로콜라겐 단백질의 정량화. B의 데이터는 3 개의 독립 샘플에서 얻은 3 개의 독립 필드의 평균(Mean) ± SD로 표시된다. 분산의 일방향 분석에 의하여 DMSO 대조군 노화 세포와 비교하여 *** P <0.001.
PDK1 억제는, MMP1의 증가, 콜라겐 섬유의 감소, 프로 콜라겐 분비의 감소에 의해 입증된, 복제 노화 및 화학적으로 유도된 노화와 관련된 진피 노화를 역전시켰다(도 10a-10b). 표피 항상성의 경우, 각질 세포 증식과 분화 사이의 균형은 진피 섬유아세포에 의해 조절된다.
따라서, PDK1 억제에 의한 노화 진피 섬유아세포의 역전이 각질 세포의 증식과 분화에 영향을 미치는지 조사하였다. BX-795는 종양 세포에서 PDK1/Akt 신호 전달을 차단하고, 배양 또는 유도된 세포자연사(apoptosis)에서 다양한 종양 세포주의 부착 의존적 성장(anchorage-dependent growth)을 억제하는 강력한 PDK1 억제제이다. 조사 결과, Ki-67 증식 마커는 PDK1 억제제로 널리 알려진 BX795로 처리된 피부 등가물 (도 10a-10b)의 표피에서 현저하게 상승하여, 노화-유발된 NDHF에서 피부 등가물에서 표피 두께를 보존한 케라티노사이트의 증식 능력이 증가했음을 나타내었다(도 10a-10b).
또한, 각질 세포 분화 마커 (케라틴 10 및 필라그린)와 진피 표피 접합부 (COL17A1 및 라미닌5)의 기저막 마커에 대한 염색 강도를 비교한 결과, PDK1 억제는 노화 NHDF의 피부 등가물에서 발견되는 이러한 각질 세포 분화 마커 및 진피 표피 접합의 성분의 감소된 풍부함을 회복시켰다(도 10a).
2차원 노화 NHDF (도 9a-9b)에 대한 관찰과 유사하게, BX795로 처리된 두 가지 유형의 노화 NHDF에서 준비된 피부 등가물에서 추출한 컨디셔닝 배지에는, 비히클(vehicle)-처리 피부 등가물에서 컨디셔닝된 배지에 존재하는 것보다, GRO, GROα, IL-6, IL-8, MCP-1 ~ 3 및 RANTES가 덜 함유되도록 준비하였다(도 11a-11b).
구체적으로, 실험 방법은 다음과 같다.
PDK1 억제는 피부 등가물에서 SASP를 억제한다. 3D 피부 모델(피부 등가물)은 젊은 NHDF (PDL 12), 또는 독소루비신과 IGF-1 또는 반복된 도금(복제 노화, PDL 57)에 의해 노화로 유도된 노화 NHDF로 준비하였고, 이들을 DMSO 또는 BX795에 노출시켰다. 각각 처리된 함량은 다음과 같다: 독소루비신 (100mg/mL), IGF-1 (100ng/mL), BX-795(100nM).
BX795를 사용하거나 사용하지 않고 처리된 화학적-유도 또는 복제 노화 NHDF의 피부 등가물로부터의 컨디셔닝된 배지 (Conditioned medium, CM)를 사이토카인 항체 어레이로 측정하고 각 막의 내부 양성 대조군으로 정규화하였다. (11a) BX795를 사용하거나 사용하지 않고 처리된 화학적 유도된 NHDFs로부터의 피부 등가물의 사이토카인 어레이에서 측정된 분비 단백질. (11b) BX795로 처리되거나 처리되지 않은 복제 노화 NHDFs로부터 피부 등가물의 사이토카인 어레이에서 측정된 분비 단백질. 분산의 일방향 분석에 의하여 DMSO 대조군 노화 세포와 비교하여 평균 ± SD (n=3), *** P <0.001.
전체적으로, 이러한 발견은 PDK1 억제가 노화 진피 섬유아세포를 정지 섬유아세포로 전환하여 표피 재생을 향상시키고 피부 두께를 보존하여 노화와 관련된 피부 악화를 제한함을 나타내는 것이다.
구체예
구체예 1: 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효 성분으로 포함하는, 피부 보호용 조성물:
[화학식 1]
Figure 112020097839990-pat00031
[화학식 2]
Figure 112020097839990-pat00032
[화학식 3]
Figure 112020097839990-pat00033
[화학식 4]
Figure 112020097839990-pat00034
구체예 2: 구체예 1에 있어서,
상기 캄페롤 배당체 화합물은 동백 유박으로부터 추출된 것인, 피부 보호용 조성물.
구체예 3: 구체예 1 또는 2에 있어서,
상기 유효 성분의 농도가 상기 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01-100 μM 인, 피부 보호용 조성물.
구체예 4: 구체예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 피부 주름을 개선하기 위한 것인, 피부 보호용 조성물.
구체예 5: 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 피부 재생을 촉진하기 위한 것인, 피부 보호용 조성물.
구체예 6: 구체예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 기질 메탈로 프로테아제-1 (Matrix matallloprotease-1, MMP-1)의 발현을 억제하는, 피부 보호용 조성물.
구체예 7: 구체예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 아토피성 피부염을 개선, 예방 또는 치료하기 위한 것인, 피부 보호용 조성물.
구체예 8: 구체예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 피부 각질 생성 주기를 조절하기 위한 것인, 피부 보호용 조성물.
구체예 9: 구체예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하는, 피부 보호용 조성물.
구체예 10: 구체예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인, 피부 보호용 조성물.
구체예 11: 구체예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 아토피성 피부염 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물인, 피부 보호용 조성물.
구체예 12: 구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서,
상기 유효 성분의 투여량은 0.01-100 mg/kg/일 인, 피부 보호용 조성물.
구체예 13: 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인, 피부 보호용 조성물.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 캄페롤 배당체 화합물, 이의 이성질체, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 수화물 또는 이의 용매화물을 유효 성분으로 포함하는, 피부장벽의 기능 회복용 화장료 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112022089318962-pat00035

    [화학식 2]
    Figure 112022089318962-pat00036

    [화학식 3]
    Figure 112022089318962-pat00037

    [화학식 4]
    Figure 112022089318962-pat00038
  2. 제1항에 있어서,
    상기 캄페롤 배당체 화합물은 동백 유박으로부터 추출된 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유효 성분의 농도가 상기 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01-100 μM 인, 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 기질 메탈로 프로테아제-1 (Matrix matallloprotease-1, MMP-1)의 발현을 억제하는, 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 3-포스포이노시티드-의존 키나아제 1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1) 의 활성을 억제하는, 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서,
    상기 유효 성분의 투여량은 0.01-100 mg/kg/일 인, 조성물.
  13. 삭제
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