KR102385221B1

KR102385221B1 - 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102385221B1
Application number: KR1020200003857A
Authority: KR
Inventors: 안긴내; 지영흔; 전유진; 한의정
Original assignee: 전남대학교 산학협력단; 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2022-04-13
Also published as: KR20210090778A

Abstract

괭생이모자반에서 추출한 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시된다.

Description

피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating dermatitis}

본 발명은 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 염증 반응을 억제하는 유효성분인 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

피부염(dermatitis)은 피부의 염증을 의미하는 것으로, 유형별로 다음과 같이 분류될 수 있다. (1) 아토피성 피부염은 아토피 체질인 사람에게 생기는 습진 모양의 피부병변으로서 내인성 습진이라고도 한다. 유전적인 영향이 있는 것으로 보고되고 있으나 정확한 원인은 불명이다. 다른 피부염과는 증세와 변천의 차이가 있으며, 소아습진의 70% 이상을 차지하고 나이가 들수록 병증이 가벼워지는 것이 일반적이다. 치료제로서는 항히스타민제가 주로 처방된다. (2) 접촉성 피부염은 외부의 물질과 접촉함으로서 일어나는 피부염이며, 피부가 헐고 가려워지는 것이 특징이다. 접촉성 피부염을 일으키는 외부 물질로는 옻나무, 은행나무, 도료, 합성수지, 피혁, 고무, 약품, 화장품 등이 있다. 치료제로서는 붕산아연화연고, 항히스타민제, 부신피질호르몬제 등이 있다. (3) 지루성 피부염은 피지가 많은 부위에 발생하는 피부염으로서 주로 20 내지 40대에 발병한다. 다른 피부염과는 달리 체질 및 피지분비이상에 의해 발생한다. 치료제는 습진 치료제, 비타민 B2, 비타민 B6가 있다. 피부염 치료에는 일반적으로 스테로이드제제(국소 부신피질호르몬제제), 항히스타민제제가 사용되나 국소 부신피질호르몬은 장기간 사용하는 경우 피부 위축, 혈관 확장 등 부작용이 있으며, 항히스타민제제는 내성 및 과민반응을 일으킬 수 있다. 이러한 부작용 발생 양상은 사람에 따라 다르게 나타날 수 있으며 효과적인 피부염 치료를 위해 다양한 피부염 치료제 발굴이 필요한 실정이다.

괭생이모자반(Sargassum horneri)은 갈조강(Phaeophyceae), 모자반목(Fucale), 모자반과(Sargassaceae)에 속하는 황갈색의 식물체로 얇고 주걱 모양의 잎을 지닌 조간대의 갈조류이다. 괭생이모자반 추출물은 골다공증 방지 효과(Yakugaku Zasshi. 2006, 126, 1117-1137), 혈액응고 방지 효과(Bioresour. Technol. 2007, 98, 1711-1716), 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus type 1)의 억제효과(Chem. Pharm. Bull. 2001, 49, 484-485. ; Biol. Pharm. Bull. 1998, 21, 730-734) 및 항염증 효과가 있다는 것이 보고되었다. 그러나 괭생이모자반에서 어떤 성분이 이러한 역할을 하는지에 대해서는 명확히 밝혀지지 않은 실정이다.

대한민국 공개공보 제10-2019-0087199호(2019.07.24)

일 구체예에 따르면 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 구체예에 따르면 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 피부염 예방 또는 개선용 화장품 조성물을 제공한다.

또 다른 구체예에 따르면 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 피부염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

일 양상은 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명자는 모자반크로마놀 또는 HTT(6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one)를 피부각질형성세포에 처리하면 생존율에 영향이 없거나 오히려 증가시키고, TNF-α/IFN-γ에 의한 염증성 사이토카인 발현 및 염증 관련 신호전달 경로를 억제함으로서 피부염을 예방, 개선, 및 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기 "유효성분으로 포함하는"은 투여하고자 하는 개체에 대한 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 양을 포함하는 것을 의미하며, 당업자가 다양한 변수를 고려하 여 양적 상한을 적절히 조정할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 모자반크로마놀은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 1]

일 구체예에서, 상기 HTT는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 2]

상기 모자반크로마놀 및 HTT는 통상적인 추출 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 통상적인 유기합성 방법을 이용하여 제조할 수도 있다. 통상적인 추출방법으로는 초음파 추출법, 여과법, 및 환류 추출법 등을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 모자반크로마놀 및 HTT는 괭생이모자반에서 추출한 것일 수 있다. 예를 들면 괭생이모자반을 세척하고 동결건조시킨 다음, 분쇄하여 저장하고, 물과 에탄올을 혼합한 용매에 침지시켜 상온 또는 가온 조건에서 추출할 수 있다.

상기 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 모자반크로마놀 및 HTT의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태를 포함할 수 있다. 상기 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 사용될 수 있다. 상기 산 부가염은 통상의 방법, 예컨대 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 수혼화성 유기 용매(예컨대, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴)로 침전시켜 제조할 수 있다. 또한, 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예컨대, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나 석출된 염을 흡인 여과할 수 있다. 상기 유리산은 유기산 및 무기산이 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 또는 인산일 수 있으며, 상기 유기산은 구연산(Citric acid), 초산, 젖산, 주석산(Tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(Fumaric acid), 포름산, 프로피온산(Propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄 설폰산, 글리콜산, 숙신산(Succinic acid), 4-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 살리실산, 니코틴산, 이소니코틴산, 피콜린산, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다. 상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 모자반크로마놀 또는 HTT과 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.

다른 양상은, 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 피부염 예방 또는 개선용 화장품 조성물을 제공한다.

상기 모자반크로마놀 및 HTT에 대한 내용은 상술한 바와 동일하다.

상기 '화장품'은 인체를 청결미화하여 용모를 밝게 변화시키거나 피부의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 물품을 의미하며, 인체에 대한 작용이 경미한 것을 말한다. 통상적인 의미로서 로션, 크림, 오일, 세정용 제품 및 기능성 화장품을 모두 포함한다. 기능성 화장품이란 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 화장품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 화장품군이나 화장품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 화장품을 의미한다.

상기 화장품 조성물은 예를 들면, 크림, 로션, 앰플, 스킨, 에센스, 샴푸, 비누 등으로 제공될 수 있으며, 다른 측면에서 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스), 또는 마스크 팩 또는 팩의 형태로 제조될 수 있다.

상기 화장품 조성물이 적용될 수 있는 부위는 피부 염증이 유발될 수 있는 부위에 사용될 수 있으며, 이러한 피부염증이 유발될 수 있는 피부를 포함하는 신체 부위를 포함하며, 예를 들면, 얼굴, 목, 손등, 두피 등을 포함할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 적용되는 부위에 다양한 투여 경로, 예를 들면 전신 또는 국소, 특히 국소 투여, 경피, 또는 주사, 특히 경피 경로로 투여될 수 있다.

상기 화장품 조성물은 필수 성분으로서 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 화장품, 예를 들면 크림의 경우, 식물성 오일, 유화제, 증점제, 향료, 물, 산화방지제, 및 UV 흡수제를 포함할 수 있다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 모자반크로마놀 또는 HTT의 함량은 목적하는 제품의 구체적 용도 또는 제형 등에 따라 달라질 수 있으나, 전체 조성물 중에 약 0.001 내지 약 50 중량%로 포함될 수 있으나, 이 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다.

상기 화장용 조성물은 필수 성분과 더불어 필요에 따라 다른 성분이 배합될 수 있으며, 예를 들면 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

또 다른 양상은, 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 피부염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등 모든 형태의 식품 조성물을 포함할 수 있다. 상기 유형의 식품 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 식품 조성물은 건강기능식품 형태로 제공될 수 있다. 상기 건강기능식품은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 상기 기능성은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 의미한다.

상기 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 적합성 여부를 판단할 수 있다. 상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목은 예컨대 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연 첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류를 들 수 있다.

상기 식품 조성물은 피부염 예방 또는 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물은 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함함으로서 피부염을 예방 또는 치료할 수 있다.

다른 구체예에 따른 화장품 조성물은 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함함으로서 피부염을 예방 또는 개선할 수 있다.

또 다른 구체예에 따른 식품 조성물은 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함함으로서 피부염을 예방 또는 개선할 수 있다.

도 1은 모자반크로마놀 및 HTT의 NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2은 일 실시예에 따른 MC 또는 HTT가 HaCaT 세포의 생존력에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 TNF-α/IFN-γ 자극에 의해 증가된 사이토카인 유전자의 mRNA 발현이 MC 또는 HTT에 의해 억제된 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 TNF-α/IFN-γ 자극에 의해 증가한 p38 및 ERK의 인산화가 MC 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 B 및 도 4의 C는 도 4의 A의 결과를 정량화한 그래프이다. 도 4의 B 및 도 4의 C에서 M-Fr.1은 MC를 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 TNF-α/IFN-γ 자극에 의해 증가한 p38 및 ERK의 인산화가 HTT 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 것이다. 도 5의 B 및 도 5의 C는 도 4의 A의 결과를 정량화한 그래프이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 TNF-α/IFN-γ 자극에 의해 증가한 p65 및 IκBα의 인산화가 MC 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 TNF-α/IFN-γ 자극에 의해 증가한 p65 및 IκBα의 인산화가 MC 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 TNF-α/IFN-γ 자극에 의해 증가한 p65 및 IκBα의 인산화가 HTT 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 TNF-α/IFN-γ 자극에 의해 증가한 p65 및 IκBα의 인산화가 HTT 처리에 의해 억제된 결과를 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 실험결과는 PASW statistics 19.0 software(SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하여 통계적 유의성에 대해 평가하였으며, 각 실험군 간의 평균치의 유의성을 P < 0.05 수준에서 Duncan's test를 사용하여 비교하였다.

실시예 1: 괭생이모자반으로부터 모자반크로마놀 및 HTT 분리

45 내지 55℃의 온도에서 건조시킨 괭생이모자반(Sargassum horneri)을 분쇄하였다. 분쇄된 괭생이모자반 분말을 70% 에탄올 용매에 침지시켜 65 내지 80℃에서(평균 70℃) 12시간 동안 교반하면서 추출하였다. 추출물의 용매를 제거하고 동결건조하여 에탄올 추출물 분말을 얻었다. 분말을 다시 95% 에탄올 용액에 침지시키고 불순물을 제거한 후 12000rpm에서 원심분리하고 상층액을 건조시켜 최종적인 괭생이모자반 에탄올 추출물을 획득하였다.

괭생이모자반 에탄올 추출물로부터 유용성분인 모자반크로마놀(mojabanchromanol, MC) 및 HTT(6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one)를 분리 및 정제하였다.

모자반크로마놀 분리 및 정제는 다음과 같이 수행하였다. 괭생이모자반 에탄올 추출물을 증류수에 용해시키고, n-헥산 및 에틸 아세테이트를 사용하여 극성에 따라 분배(partition)하였다. 생성된 용매 분획(fraction)을 회전 증발기를 사용하여 농축시켰다. 괭생이모자반 에탄올 추출물은 90:10(F1), 80:20(F2), 70:30(F3), 60:40(F4), 50:50(F5)의 연속비율로 헥산/에틸 아세테이트 단계 구배 용리(step-gradient elution)에 의해 ODS 오픈 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분별하였다. 각 분획은 회전식 증발기를 사용하여 증발시켰다. 5개의 ODS 컬럼 분획 중에서 높은 β-hexosaminidase 방출을 나타내는 F4를 Prep HPLC를 사용하여 추가 정제하여 순수한 화합물을 수득하였다. 반정제 C18 컬럼(semipreparative C18 column)을 이용하여 역상 HPLC(reverse-phase HPLC)를 실시하였다. 역상 HPLC는 YL9120 UV/Vis detector가 장착된 YL900 HPLC 시스템을 사용하였고, HPLC 등급 용매를 사용하였다. 이동상(mobile phase)는 0.01% TFA의 증류수 및 0.01% TFA의 아세토니트릴이고, 구배용리(gradient elution)는 10ml/분의 유속으로 254nm에서 자외선 흡광도를 측정하고, 0-5 min 50 : 50 - 50 : 50 v/v; 5-25 min 50 : 50 - 0 : 100 v/v; 25-45 min 0 :100 - 50 : 50 v/v; 45-50 min 50 : 50 - 50 : 50 v/v 으로 수행되었다. 각 정제 공정의 단계는 비만세포(mast cell)로부터 β-hexosaminidase 방출에 대한 생물 활성의 평가와 함께 생물 검정 유도 분별법(bioassay-guided fractionation)으로 수행되었다.

HTT 분리 및 정제는 다음과 같이 수행하였다. 괭생이모자반 에탄올 추출물을 증류수로 용해시키고, n-헥산, 클로로포름, 및 에틸 아세테이트를 사용하여 극성에 따라 분별하였다. HPCPC를 사용하여 n-헥산/에틸 아세테이트/물(5:5:5:5 v/v) 2상 비혼화성 용매 시스템(a two phase immiscible solvent system)에 의해 클로로포름에 용해된 괭생이모자반 에탄올 추출물을 분별하고, 상부 용매상(upper solvent phase)을 정지상(stationary phase)으로, 하위 용매상(lower solvent phase)을 이동상(mobile phase)로 하였다. 이동상이 컬럼을 통과하는 동안 압력은 3.7MPa이고, 240nm UV로 공정을 모니터링하였다.

5개의 HPCPC 분획 중에서 우수한 항염증 활성을 나타내는 2번째와 4번째 분획을 Prep HPLC를 사용하여 고수율로 추가 정제하여 순수한 화합물을 취득하였다. 반정제 C18 컬럼(semipreparative C18 column)을 이용하여 역상 HPLC(reverse-phase HPLC)를 실시하였다. 역상 HPLC는 Waters HPLC 시스템을 사용하였고, HPLC 등급 용매를 사용하였다. 이동상(Mobile phase)는 아세토니트릴, 증류수이고, 구배용리(gradient elution)은 0-60 min 5 : 95 - 100 : 0 v/v; 60-70 min 100 : 0 - 100: 0 v/v에서 수행하고, 유속 3 ml/min 및 자외선 흡광도 230 및 254nm에서 검출되었다.

화합물의 구조를 NMR에 의해 분석한 결과 모자반크로마놀과 HTT임이 확인되었다(도 1 의 NMR 분석 결과 참조).

모자반크로마놀(C₂₇H₃₆O₄, MW:424)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 명칭은 (2Z,6E)-6-(2-(6-hydroxy-8-methyl-2H-chromen-2-yl)ethyl)-2-(4-methylpent-3-en-1-yl)octa-2,6-dienoic acid일 수 있다.

HTT는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이며, 화학식 2의 명칭은 6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one일 수 있다.

[화학식 2]

실시예 2: 피부각질형성세포(HaCaT) 배양

실험에 사용한 피부각질형성세포(HaCaT)는 DMEM(HyClone^TM)에 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS)과 페니실린(100 unit/ml)을 첨가한 것을 사용하였으며, 배양기를 이용하여 37℃와 5% CO₂ 상태를 유지하였다.

실시예 3: 유용성분들에 대한 HaCaT 세포의 생존율 평가

유용성분들(MC, HTT)의 처리에 의한 HaCaT 세포의 생존율을 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다. HaCaT 세포(1×10⁴)를 96 well plate의 각 well에 10% FBS와 1% streptomycin 및 페니실린이 포함되어 있는 DMEM 배지 190μl와 함께 분주하고, MC 및 HTT를 PBS에 희석하여 각 농도별(15.6, 31.3, 62.5 μg/ml)로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 15 μl의 MTT(5 mg/ml)를 각 well에 첨가하고 4 시간 동안 반응시킨 뒤, dimethyl sulfoxide (DMSO) 150μl를 첨가하여 microplate reader기(SpectraMax M2/M2e, CA)를 이용하여 540 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다.

또한 TNF-α/IFN-γ가 처리된 HaCaT 세포의 생존에 대한 각 유용성분의 효능을 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다. HaCaT 세포(1×10⁴ cell)를 96 well plate의 각 well에 10% FBS 및 1% 스트렙토마이신과 페니실린이 포함되어 있는 DMEM 배지 180 μl와 함께 분주하고, MC 및 HTT를 각 농도별(15.6 내지 62.5 μg/ml)로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 1 시간 뒤에 TNF-α/IFN-γ(10 ng/ml)를 처리하여 24 시간 배양 후, 15 μl의 MTT(5mg/ml)를 각 well에 첨가하고 4시간 동안 반응시킨 뒤, dimethyl sulfoxide (DMSO) 150μl를 첨가하고 microplate reader기(SpectraMax M2/M2e, CA)를 이용하여 540 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다.

도 2의 A 및 B에 따르면, MC 및 HTT를 15.6, 31.3, 62.5 μg/ml의 농도로 세포에 처리하였을 때, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 유사하거나 오히려 높은 세포 생존율을 나타내었으므로 MC 및 HTT는 HaCaT 세포에 대한 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

도 2의 C 및 D에 따르면, HaCaT 세포의 생존율은 TNF-α/IFN-γ를 처리에 의해 감소하였으나, MC 또는 HTT를 TNF-α/IFN-γ와 함께 처리하면 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 MC 및 HTT는 TNF-α/IFN-γ 자극에 의한 HaCaT 세포의 사멸을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: TNF-α/IFN-γ로 활성화시킨 HaCaT 세포에서 염증 유발 사이토카인 및 케모카인 mRNA 발현에 대한 유용성분들의 억제 효과

TNF-α/IFN-γ를 처리한 HaCaT 세포에서 염증 유발 사이토카인 및 케모카인의 발현량을 확인하기 위해 reverse transcription-PCR(RT-PCR)을 수행하였다. HaCaT 세포(3×10⁵ cells)를 6 well plate의 각 well에 동일하게 분주하고 MC 및 HTT를 농도별(15.6, 31.3, 62.5 μg/ml)로 처리한 다음, 2 시간 뒤에 TNF-α/IFN-γ를 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 trizol reagent를 이용하여 수거하고, 클로로포름을 넣고 10초간 vortexing한 다음, 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액을 취하여 isopropanol을 혼합하여 교반하였다. 그리고 다시 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)을 DEPC water에 녹여 total RNA를 확보하였다. 확보한 total RNA와 cDNA synthesis kit를 이용하여 cDNA를 합성하고 RT-PCR에 사용하였다.

도 3의 A 및 B에 따르면, TNF-α/IFN-γ로 자극한 HaCaT 세포에서 염증과 관련된 사이토카인(IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, IFN-γ)의 mRNA 발현량이 대조군보다 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 MC 또는 HTT를 처리한 경우 농도의존적으로 사이토카인의 mRNA 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: TNF-α/IFN-γ로 활성화시킨 HaCaT 세포에서 염증 매개성 단백질 발현(MAPKs 신호전달 및 NF-κB 신호전달)에 대한 유용성분들의 억제 효능 평가

TNF-α/IFN-γ를 처리한 HaCaT 세포에서 MC 및 HTT의 효능과 관련된 기전을 규명하기 위해 MAPK 및 NF-κB 신호전달 경로에 대한 영향을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

HaCaT 세포(5×10⁵ cell/dish)를 6 cm culture dish에 동일하게 분주하고 부착시킨 뒤, HTT를 농도별(15.6, 31.3, 및 62.5 μg/ml)로 처리하여 2 시간 동안 배양하였고, 이후 세포에 TNF-α/IFN-γ를 처리하여 1 시간 동안 자극하였다. 반응이 끝난 후, 세포로부터 lysis buffer를 이용하여 세포질 단백질과 핵 단백질을 추출하였고, 추출한 단백질은 10% SDS-PAGe 겔에서 전기영동한 후, PVDF membrane으로 전이되었다. 비특이적인 반응을 억제하기 위해 skim milk를 이용하여 blocking 하였으며, 1차 항체 p38, p-p38, ERK, p-ERK, p65, p-p65, IκBα, 및 p- IκBα가 첨가된 용액에서 12 시간 동안 반응시켰으며, 반응이 끝난 후 0.1% tween 20이 함유된 TBS(TBST)로 10번씩 3번 세척하였다. 그 후 2차 항체인 goat anti-rabbit IgG와 goat anti-mouse IgG를 이용하여 1시간 30분 동안 반응시키고, 반응이 종결된 후, ECL을 이용하여 표적 단백질의 발현을 측정하였다.

도 4 및 도 5에 따르면, TNF-α/IFN-γ를 처리한 HaCaT 세포는 아무것도 처리하지 않은 대조군보다 p38 및 ERK의 인산화가 증가(p-p38 및 p-ERK의 발현 증가)하였으나, MC 또는 HTT를 처리하면 농도의존적으로 p-38 및 ERK의 인산화가 억제(p-p38 및 p-ERK의 발현 감소)됨을 확인할 수 있었다.

MC 또는 HTT에 의한 염증 억제 효능이 MAPK 경로의 하위 분자인 NF-κB의 활성 억제와 연관되어 있는지 조사하였다. 도 6 및 도 7에 따르면, HaCaT 세포에 TNF-α/IFN-γ를 처리하면 세포질 내의 NFκB p65 및 p-IκBα의 인산화가 증가하고(세포질 내 IκBα 및 NFκB p65의 발현 감소 및 인산화된 형태 발현 증가), 핵 내의 NFκB p65 단백질의 발현이 증가하였으나, MC는 세포질 내 IκBα 및 NFκB p65의 인산화를 감소시키고, 핵 내 NFκB p65의 발현을 감소시켰다. 또한 도 8 및 도 9에 따르면, HTT는 MC와 마찬가지로 세포질 내 IκBα 및 NFκB p65의 인산화를 감소시키고, 핵 내 NFκB p65의 발현을 감소시켰다. 따라서 MC 및 HTT는 모두 TNF-α/IFN-γ 자극에 의해 활성화된 MAPK ERK/p38 및 NFκB 신호전달 경로를 억제함으로서 염증 억제 효능을 가짐을 알 수 있었다.

Claims

하기의 화학식 1로 표시되는 모자반크로마놀을 유효성분으로 포함하는,
피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
삭제
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하기의 화학식 1로 표시되는 모자반크로마놀을 유효성분으로 포함하는 피부염 예방 또는 개선용 화장품 조성물.
[화학식 1]
하기의 화학식 1로 표시되는 모자반크로마놀을 유효성분으로 포함하는 피부염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]