KR102563734B1 - 알로에 베라 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물 - Google Patents
알로에 베라 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알로에 베라 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물과 알로에 베라 다당체의 혼합물은 MFAP4의 발현을 증가시킴으로써, NHDF(normal human dermal fibroblast), HaCaT(human epidermal keratinocytes) 세포의 증식, 이동 및 특히 ECM(Extracellular matrix) 형성을 상승적으로 유도할 뿐 아니라, 피브릴린, 콜라겐, 엘라스틴, TGF β 및 α-SMA 발현과 같은 MFAP4와 관련된 다른 세포외 성분도 증가시키며, 또한 각각의 알로에 베라 꽃 추출물 또는 알로에 베라 다당체와 비교하여 상승적인 상처 치료 효과를 나타내므로, 본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물과 알로에 베라 다당체의 혼합물은 MFAP4 및 관련 신호 전달 경로를 표적으로 하는 피부 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 알로에 베라 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물에 관한 것이다.
피부(skin)는 인체의 가장 외부를 덮고 있는 조직으로 인체를 보호하고 장벽기능을 하여 외부의 화학적·물리적 충격으로부터 몸을 보호하는 일차적인 방어기능을 한다. 피부는 표피(epidermis)와 진피(dermis), 피하지방층(subcutis)의 3개의 층으로 구성되어 있으며, 가장 바깥층에 위치하고 있는 표피는 90%가 각질형성세포(keratinocyte)로 구성되어 있다. 피부는 자외선 및 스트레스 등에 의해 노화되거나 상처로 인해 손상되면 그 기능이 약화되고, 이때 피부 재생 과정이 시작된다. 피부 재생 과정은 급성 염증반응을 시작으로 표피 세포의 증식과 이동과 증식을 거쳐 새로운 혈관의 생성과 콜라겐(collagen) 합성을 통하여 결체조직의 수축을 거친다. 이때 표피의 90% 이상을 차지하는 각질형성세포와 진피 섬유아세포의 이동과 증식은 상처치유와 피부 재생을 제공할 뿐만 아니라, 콜라겐 합성을 유도하여 피부의 탄력 증진과 기저막 형성에 중요한 역할을 한다.
알로에(Aloe)는 열대 지방에 서식하는 백합과(Liliaceae 계)의 알로에 속(Aloineae)에 속하는 식물로, 전 세계적으로 식용 및 약용으로 사용되고 있다. 그 중에서 가장 잘 알려진 소재는 알로에 베라(Aloe vera)로서, 그 잎을 가공 처리한 주스나 겔은 대표적인 건강기능식품의 하나이며, 또 제약이나 화장품 소재로 널리 사용되고 있는 천연소재의 하나이다. 알로에 베라 겔은 약 99~99.5%가 수분이고 고형분은 약 0.5~1.0%이며, 그 중 다당체가 55%, 당류 17%, 미네랄 16%, 단백질 7%, 지방 4%, 페놀성분 1%로 구성되어 있다. 알로에 베라 겔의 고형분 중 큰 부분을 차지하는 다당체는 알로에 베라 겔의 주요 생리활성성분이며, 대표적으로 아세틸화 만난(acetylated mannan, 또는 아세만난(acemannan))이 있다.
한편, 알로에 베라를 이용한 선행기술로, 대한민국 공개특허 제10-2020-0140520호에는 알로에 베라 겔의 호흡기질환 개선 효과가 기재되어 있고, 대한민국 공개특허 제10-2016-0086809호에는 알로에 베라 추출물의 비알콜성 만성지방간 치료 효과를 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1520643호에는 알로에 베라 겔의 당뇨병 치료 효과가 개시되어 있을 뿐, 알로에 베라 꽃에 대한 활성 및 알로에 베라 다당체와 혼합한 혼합물의 유의적인 상처 치료 효과에 대해서는 알려진 바 없다.
이에, 본 발명자들은 천연물 유래 상처 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물이 MFAP4의 발현을 증가시킴으로써, NHDF(normal human dermal fibroblast), HaCaT(human epidermal keratinocytes) 세포의 증식, 이동 및 특히 ECM(Extracellular matrix) 형성을 상승적으로 유도할 뿐 아니라, 피브릴린, 콜라겐, 엘라스틴, TGF β 및 α-SMA 발현과 같은 MFAP4와 관련된 다른 세포외 성분도 증가시키며, 또한 각각의 AVF 또는 PAG와 비교하여 상승적인 상처 치료 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물을 MFAP4 및 관련 신호 전달 경로를 표적으로 하는 피부 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 MFAP4 및 관련 신호 전달 경로를 표적으로 하는 피부 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 또는 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물은 MFAP4의 발현을 증가시킴으로써, NHDF(normal human dermal fibroblast), HaCaT(human epidermal keratinocytes) 세포의 증식, 이동 및 특히 ECM(Extracellular matrix) 형성을 상승적으로 유도할 뿐 아니라, 피브릴린, 콜라겐, 엘라스틴, TGF β 및 α-SMA 발현과 같은 MFAP4와 관련된 다른 세포외 성분도 증가시키며, 또한 각각의 AVF 또는 PAG와 비교하여 상승적인 상처 치료 효과를 나타내므로, 본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물은 MFAP4 및 관련 신호 전달 경로를 표적으로 하는 피부 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 AVF 및 PAG, 또는 이들의 혼합물의 생포 생존율을 MTT 분석을 통해 확인한 도이다.
도 1b 및 1c는 상처 치유 활성을 확인하기 위하여, NHDF 세포의 72시간 동안 이동을 확인한 도이다.
도 2a는 BrdU 세포 증식 분석 키트를 이용하여 세포 증식 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 본 발명의 AVF 및 PAG 혼합물 처리시 AKT, ERK 경로의 인산화 활성화, 및 혈관신생 단백질(TGF-β, VEGF)의 발현 증가 효과를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도이다.
도 2c는 본 발명의 AVF 및 PAG 혼합물 처리시 AKT, ERK 경로의 상대적 활성화 프로파일을 정량화한 도이다.
도 2d는 본 발명의 AVF 및 PAG 혼합물 처리시 TGF-β및 VEGF의 발현 수준을 정량화한 도이다.
도 3a는 본 발명의 AVF와 PAG 혼합물 처리시 MFAP4, COL1A 및 α-SMA 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 도이다.
도 3b는 본 발명의 AVF와 PAG 혼합물 처리시 ECM 합성 관련 단백질인 MFAP4, COL1A, 피브릴린, 엘라스틴 발현 수준을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 도이다.
도 3c는 MFAP4, COL1A, 피브릴린 및 엘라스틴의 발현 프로파일을 정량화한 도이다.
도 4a는 웨스턴 블랏 분석을 통해 MFAP4의 siRNA 매개 녹다운을 확인하고 정량화한 도이다.
도 4b는 MFAP4 siRNA 매개 녹다운 조건에서 세포 이동 분석을 수행한 도이다.
도 4c는 MFAP4 siRNA 매개 녹다운 조건에서 이동 분석의 상처 합류(confluence)를 보여주는 그래프이다.
도 4d는 유세포 분석을 통해 MFAP4 siRNA 녹다운 조건 및 AVF + PAG 처리군에서 세포 주기의 진행을 확인한 도이다.
도 4e는 유세포 분석을 통해 각 실험군의 세포 주기 분포를 나타낸 도이다.
도 5a는 HaCaT 세포에 AVF 및 PAG 처리 또는 비처리 후, 세포 생존율을 확인한 도이다.
도 5b는 AVF 및 PAG 혼합물을 처리 또는 비처리 후, BradU 세포 증식 분석을 수행한 도이다.
도 5c는 HaCaT 세포에 AVF와 PAG 혼합물을 처리한 후, 세포 이동 분석을 수행한 도이다.
도 5d는 12시간 동안 대조군 및 AVF 및 PAG 혼합물 처리군의 상처 합류(confluence)의 관점에서 이동율를 보여주는 그래프이다.
도 5e는 MFAP4 및 IVN 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 도이다.
도 6a는 MTT 분석에 의한 TNF-α 및 IFN-γ(10 ng/ml)에 의해 유도된 HaCaT 세포의 세포 생존율을 확인한 도이다.
도 6b는 정상 및 MFAP4 siRNA 녹다운 조건뿐만 아니라 AVF 및 PAG 혼합물 처리군에서 세포 생존율을 확인한 도이다.
도 6c는 qPCR을 통해 MFAP4의 siRNA 매개 녹다운을 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 AVF 및 PAG 혼합물 처리가 상처 치료에 대한 상승적 효과를 나타내는 기전을 나타낸 도이다.
본 발명의 도면에서 C는 대조군, PC는 양성 대조군(메다카소사이드) 5μM 처리군, AVF는 25, 100 μg/mL의 알로에 베라 꽃 에탄올 추출물이고, PAG는 50 μg/mL의 알로에 베라 다당체를 나타낸다. 또한, AVF + PAG 25는 PAG (50 μg/ml)와 AVF (25 μg/mL)의 혼합물을 나타내고, AVF + PAG 100은 PAG(50 μg/ml) 및 AVF (100 μg/mL)의 혼합물을 나타낸다.
도 1b 및 1c는 상처 치유 활성을 확인하기 위하여, NHDF 세포의 72시간 동안 이동을 확인한 도이다.
도 2a는 BrdU 세포 증식 분석 키트를 이용하여 세포 증식 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 본 발명의 AVF 및 PAG 혼합물 처리시 AKT, ERK 경로의 인산화 활성화, 및 혈관신생 단백질(TGF-β, VEGF)의 발현 증가 효과를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도이다.
도 2c는 본 발명의 AVF 및 PAG 혼합물 처리시 AKT, ERK 경로의 상대적 활성화 프로파일을 정량화한 도이다.
도 2d는 본 발명의 AVF 및 PAG 혼합물 처리시 TGF-β및 VEGF의 발현 수준을 정량화한 도이다.
도 3a는 본 발명의 AVF와 PAG 혼합물 처리시 MFAP4, COL1A 및 α-SMA 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 도이다.
도 3b는 본 발명의 AVF와 PAG 혼합물 처리시 ECM 합성 관련 단백질인 MFAP4, COL1A, 피브릴린, 엘라스틴 발현 수준을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 도이다.
도 3c는 MFAP4, COL1A, 피브릴린 및 엘라스틴의 발현 프로파일을 정량화한 도이다.
도 4a는 웨스턴 블랏 분석을 통해 MFAP4의 siRNA 매개 녹다운을 확인하고 정량화한 도이다.
도 4b는 MFAP4 siRNA 매개 녹다운 조건에서 세포 이동 분석을 수행한 도이다.
도 4c는 MFAP4 siRNA 매개 녹다운 조건에서 이동 분석의 상처 합류(confluence)를 보여주는 그래프이다.
도 4d는 유세포 분석을 통해 MFAP4 siRNA 녹다운 조건 및 AVF + PAG 처리군에서 세포 주기의 진행을 확인한 도이다.
도 4e는 유세포 분석을 통해 각 실험군의 세포 주기 분포를 나타낸 도이다.
도 5a는 HaCaT 세포에 AVF 및 PAG 처리 또는 비처리 후, 세포 생존율을 확인한 도이다.
도 5b는 AVF 및 PAG 혼합물을 처리 또는 비처리 후, BradU 세포 증식 분석을 수행한 도이다.
도 5c는 HaCaT 세포에 AVF와 PAG 혼합물을 처리한 후, 세포 이동 분석을 수행한 도이다.
도 5d는 12시간 동안 대조군 및 AVF 및 PAG 혼합물 처리군의 상처 합류(confluence)의 관점에서 이동율를 보여주는 그래프이다.
도 5e는 MFAP4 및 IVN 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 도이다.
도 6a는 MTT 분석에 의한 TNF-α 및 IFN-γ(10 ng/ml)에 의해 유도된 HaCaT 세포의 세포 생존율을 확인한 도이다.
도 6b는 정상 및 MFAP4 siRNA 녹다운 조건뿐만 아니라 AVF 및 PAG 혼합물 처리군에서 세포 생존율을 확인한 도이다.
도 6c는 qPCR을 통해 MFAP4의 siRNA 매개 녹다운을 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 AVF 및 PAG 혼합물 처리가 상처 치료에 대한 상승적 효과를 나타내는 기전을 나타낸 도이다.
본 발명의 도면에서 C는 대조군, PC는 양성 대조군(메다카소사이드) 5μM 처리군, AVF는 25, 100 μg/mL의 알로에 베라 꽃 에탄올 추출물이고, PAG는 50 μg/mL의 알로에 베라 다당체를 나타낸다. 또한, AVF + PAG 25는 PAG (50 μg/ml)와 AVF (25 μg/mL)의 혼합물을 나타내고, AVF + PAG 100은 PAG(50 μg/ml) 및 AVF (100 μg/mL)의 혼합물을 나타낸다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "추출물(extract)"은 상기 알로에 베라 꽃의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 상기 추출물은 알로에 베라 꽃의 천연, 잡종, 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.
본 발명에서, 상기 알로에 베라 꽃은 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있고, 상기 유기용매는 C1 내지 C5의 저급 알코올, 에틸아세테이트 및 아세톤 등의 극성용매, 헥산 및 디클로로메탄 등의 비극성 용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물, C1 내지 C4 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 추출물일 수 있다. 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 이소프로판올일 수 있고, 바람직하게는 에탄올일 수 있다. 추출방법으로는 초음파추출, 진탕추출, Soxhelt 추출 또는 환류 추출방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출용매를 세척하고 잘 건조된 알로에 베라 꽃 분량의 1 내지 20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 5 내지 20배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 추출시간은 1 내지 72시간이 바람직하며, 1 내지 48시간이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아울러 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어, "다당체"는 알로에 베라 겔을 효소적으로 가수분해하고, 색소 및 안트라퀴논계 (anthraquinones) 물질을 제거한 후 건조함으로써 수득된 알로에 다당체인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 효소적 가수분해 공정에 의해, 알로에 베라 겔에 함유된 다당체 중 특정다당체(예를 들어, 5 내지 400 kDa의 분자량을 갖는 저분자량 알로에 다당체, 바람직하게는 50 내지 200 kDa의 분자량을 갖는 저분자량 알로에 다당체)의 비율이 높아질 수 있다. 또한, 상기 효소적 가수분해 공정은 셀룰라아제(cellulase)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체는 0.5:1 내지 1:2의 농도비로 혼합하는 것이 바람직하고, 상기 다양한 농도로 혼합할 경우, 알로에 베라 꽃 추출물 또는 알로에 베라 다당체 각각과 비교하여 상승적인 상처 치료 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 혼합물은 MFAP4(microfibril-associated glycoprotein 4) 신호 전달 경로를 통해 상처 치유 효과를 나타내며, AKT 및 ERK 신호 전달 경로를 활성화화 한다.
아울러, 본 발명의 조성물은 액제, 현탁제,과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 에멀젼, 시럽제, 겔, 페이스트, 연고 프로스트, 산제, 유제 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제제인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 NHDF 세포 이동에 대한 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 상승적 효과를 확인한 결과, AVF 및 PAG, 및 이의 혼합물(AVF + PAG 25 및 AVF + PAG 100)은 유의적으로 상처 봉합 비율을 증가시키는 것을 확인하였다. 특히, AVF와 PAG의 혼합물은 다른 실험군 보다 24시간 빠르게 세포 이동률을 증가시킴을 확인하였다(도 1b 및 도 1c 참조).
또한, 본 발명자들은 AKT 및 ERK 신호 전달 경로 활성화를 통한 세포 증식에 있어서 AVF 및 PAG 혼합물의 시너지 효과를 확인한 결과, 본 발명의 AVF + PAG 혼합물은 AKT 및 ERK 신호 전달 경로를 활성화하여 세포 증식 및 이동을 촉진함을 확인하였다(도 2a 내지 도 2d 참조).
또한, 본 발명자들은 AVF와 PAG 혼합물의 혈관신생 관련 단백질 발현 유도 효과를 확인한 결과, AVF + PAG 혼합물의 용량 의존적으로 TGF-β, VEGF의 발현 수준을 증가시키는 것을 확인하였고, 특히 TGF-β는 AVF + PAG 혼합물 처리군에서 약 1.5배 이상 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 2b 및 도 2d 참조).
또한, 본 발명자들은 MFAP4 신호 전달 경로를 통한 피부 상처 치유에 있어서 AVF와 PAG의 시너지 효과를 확인한 결과, AVF + PAG 처리군은 대조군 및 양성 대조군에 비해 MFAP4의 발현을 상향 조절하고, ECM(Extracellular matrix) 합성 관련 인자인 COL1A, 피브릴린 및 엘라스틴 단백질의 발현을 용량 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다(도 3a 내지 도 3c 참조).
또한, 본 발명자들은 MFAP4 siRNA 녹다운 조건에서 세포 이동과 세포 주기를 확인한 결과, MFAP4 siRNA 녹다운은 스크램블 siRNA로 형질감염된 그룹과 처리하지 않은 그룹에 비해 세포 이동 속도를 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, AVF + PAG 혼합물 처리가 세포 주기의 S기를 통해 DNA 복제를 강화함으로써 세포 주기의 진행을 수정할 수 있는 반면, MFAP4 siRNA 녹다운 조건은 세포사멸 과정의 시작을 나타냄을 확인하였다(도 4a 내지 도 4e 참고).
아울러, AVF 및 PAG 혼합물의 HaCaT 세포 이동 유도 효과 및 염증성 사이토카인의 방출 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 혼합물은 HaCaT 세포 이동을 증가시키고, 염증성 사이토카인(IL-6 및 IL-1β) 방출이 억제되는 것을 확인하였다(도 5a 내지 도 5f 참고).
따라서, 본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물은 각각의 AVF 또는 PAG와 비교하여 상승적인 상처치료 효과를 나타낸다. 또한, MFAP4의 발현을 증가시킴으로써, NHDF, HaCaT 세포의 증식, 이동 및 특히 ECM 형성을 상승적으로 유도하며, 피브릴린, 콜라겐, 엘라스틴, TGF β 및 α-SMA 발현과 같은 MFAP4와 관련된 다른 세포외 성분도 증가시키므로, 본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물은 MFAP4 및 관련 신호 전달 경로를 표적으로 하는 피부 상처 치료용 또는 피부 재생용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효 성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 이때, 비경구 경로로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 도포에 의한 국부 투여(topical application)가 가장 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 경구 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg(체중) 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ㎖의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속할 수 있다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위로 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 발명의 조성물은 외용제일 수 있다. 피부외용제는 외용산제, 외용정제, 외용액제, 연고제, 크림제, 겔제, 경고제, 드레싱제, 패취제, 스프레이제 및 좌제로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제형화할 수 있다.
또한, 상기 피부외용제는 상용되는 무기 또는 유기의 담체, 부형제 및 희석제를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 제제화된 비경구 투여제일 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패취, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 외용제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명은 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물은 각각의 AVF 또는 PAG와 비교하여 상승적인 상처치료 효과를 나타낸다. 또한, MFAP4의 발현을 증가시킴으로써, NHDF, HaCaT 세포의 증식, 이동 및 특히 ECM 형성을 상승적으로 유도하며, 피브릴린, 콜라겐, 엘라스틴, TGF β 및 α-SMA 발현과 같은 MFAP4와 관련된 다른 세포외 성분도 증가시키므로, 본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물은 MFAP4 및 관련 신호 전달 경로를 표적으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "화장료 조성물"은 신체의 구조 또는 기능에 영향을 주지 않으면서 인간 피부에 국소적으로 도포되어 피부의 외관 및 건강을 개선시키는 조성물이다.
본 발명에서, 상기 화장료 조성물은 피부 점착 타입의 화장료 제형, 예를 들어, 기초제품 화장료(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 비누), 바디제품 화장료(바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 비누), 색조제품 화장료(파운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발제품 화장료(샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤) 등을 가질 수 있다. 또한, 경피 투여형 제형, 예를 들어, 연고제, 액제, 드레싱제, 패취제 또는 스프레이제 등으로 제조될 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 화장료 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물은 각각의 AVF 또는 PAG와 비교하여 상승적인 상처치료 효과를 나타낸다. 또한, MFAP4의 발현을 증가시킴으로써, NHDF, HaCaT 세포의 증식, 이동 및 특히 ECM 형성을 상승적으로 유도하며, 피브릴린, 콜라겐, 엘라스틴, TGF β 및 α-SMA 발현과 같은 MFAP4와 관련된 다른 세포외 성분도 증가시키므로, 본 발명의 알로에 베라 꽃 추출물(AVF)과 알로에 베라 다당체(PAG)의 혼합물은 MFAP4 및 관련 신호 전달 경로를 표적으로 하는 피부 재생용 식품 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "식품 조성물"은 각각의 조성물을 먹거나 마시는 데에 독성증상을 유발함이 없이 먹고/먹거나 마실 수 있는 임의 종류의 조성물을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "건강기능식품(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FOSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품이다.
본 발명에서, 상기 식품 조성물은 음료, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품, 통상적인 의미에서의 가공 식품 및 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 음료조성물은 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제(천연 향미제, 예를 들어 타우마틴, 스테비아추출물, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등; 및 합성 향미제, 예를 들어 사카린, 아스파르탐 등) 또는 천연 탄수화물(모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜) 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 g 내지 10 g이다.
또한, 상기 외에 본 발명의 식품은 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제, 천연 풍미제, 착색제, 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산, 팩트산 염, 알긴산, 알긴산염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 및 과육 등을 함유할 수 있다, 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 0.1 g 내지 20 g, 바람직하게는 약 1 g 내지 20 g일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 건강기능식품은 원료에 대하여 바람직하게 15 중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이지 본 발명의 권리범위를 이로 한정하는 것을 의도하지 않는다.
화학물 및 시약
건조된 알로에 베라(Aloe vera; A.vera) 꽃(UV-AVF1001) 및 알로에 겔(gel)은 Univera Co., Ltd.(서울, 한국)로부터 제공 받았다. DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지, 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린과 스트렙토마이신은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. IL-6 및 IL-1β의 검출에 사용되는 ELISA 키트는 R&D Systems Inc.(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. 또한, 웨스턴 블랏 분석을 위해 사용된 GAPDH, MFAP4, type I collagen (COL1A), fibrillin-1, elastin, TGF-β, VEGF-C, MMP-9, AKT, pAKT, ERK1/2, pERK1/2에 대한 1차 항체, HRP(horseradish peroxidase)와 접합된 이차 항체는 각각 Santa Cruz(Dallas, TX, USA), Cell Sciences(Canton, MA, USA), Abcam(UK), 및 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide)가 포함된 FITC(fluorescein isothiocyanate) Annexin V apoptosis detection kit Ⅰ는 BD Biosciences Pharmingen(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 아울러, BrdU 세포 증식 분석 키트(cell proliferation assay kit)는 Cell signaling(Danvers, USA)에서 구입하였다.
세포 배양
정상 인간 진피 섬유아세포(Normal human dermal fibroblast; NHDF) 및 불멸(immortal) 각질형성 세포(human epidermal keratinocytes; HaCaT 세포)는 한국 세포주 은행(서울대학교, 한국)에서 구입하였다. 상기 세포는 모두 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS)이 포함된 고-포도당 DMEM(Thermo Scientific, Waltham, MA)에서 배양하였고, 배양된 세포는 37℃ 및 5% CO2의 가습 조건에서 유지하였다. 또한, 본 발명에서 사용된 NHDF 세포는 계대 번호 5와 10 사이를 이용하였다.
통계적 분석
결과는 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± 표준 오차로 표시하였고, GraphPad Prism 5(GrahPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 또한, 일원 분산 분석(One-way analysis of variance)에 이어 Newman-Keuls 다중 비교 테스트를 수행하였고, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
<실시예 1> 알로에 베라 꽃 추출물 제조
1 g의 건조 및 분말화된 알로에 베라 꽃을 100% 에탄올 10 mL에 넣고, 40℃에서 60분 동안 초음파로 추출한 후 원심분리 및 여과하였다. 이후 각 추출물은 회전감압농축기를 사용하여 감압농축한 후 동결건조하였다. 제조한 추출물(AVF)은 사용 시까지 -4℃에서 보관하였다.
<실시예 2> 알로에 베라 다당체의 제조
알로에 베라 다당체인 가공된 알로에 겔(processed Aloe gel; PAG)를 제조 하기 위해, naive 알로에 베라 겔을 셀룰라아제(cellulase)와 함께 배양하고 가열하여 고농도의 중간 크기(50~200 kDa)의 다당체를 수득하였다. 그런 다음, 상기 셀룰라아제 처리 겔을 charcoal 컬럼을 통해 여과하여 안트라퀴논(anthraquinone) 및 기타 착색 물질을 제거하였다. 회전감압농축기를 사용하여 감압농축한 후 동결건조하였고, 사용 시까지 -4℃에서 보관하였다.
<실시예 3> 샘플 제조 및 세포 처리
상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>에서 제조한 AVF 및 PAG를 PBS에 용해하고, 여과하여 10 mg/mL의 농도의 스톡 용액을 만들었다. 또한 스톡 용액을 무혈청 배지에서 25 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL의 농도로 희석하였다.
또한, PAG와 AVF의 시너지 효과를 확인하기 위하여 PBS에서 50 ㎍/mL PAG를 각각 25 ㎍/mL AVF와 100 ㎍/mL AVF와 혼합하고 [AVF + PAG 25]와 [AVF + PAG 100]으로 표시하였다. 또한, 상기 혼합물은 세포에 처리하기 위해 4℃에서 보관하였다.
한편, 세포 처리는 80% confluency에서 HaCaT와 NHDF 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 원하는 농도로 처리한 후 각각 24시간 및 48시간 동안 배양하였다. 아울러, 양성 대조군(PC)으로는 5 μM 마데카소사이드(madecassoside)를 이용하였다.
<실시예 4> 세포 생존율 및 세포 증식 효과 확인
세포 생존율을 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. 구체적으로, HaCaT(3 × 104 세포/웰) 및 NHDF(3 × 103 세포/웰) 세포를 96웰 플레이트에 접종하였다. 두 세포 그룹 모두 AVF + PAG 25 및 AVF + PAG 100 뿐만 아니라 개별 농도의 AVF(25 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL) 및 PAG(25 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL)를 포함하는 무혈청 배지로 처리한 후, 5% CO2에서 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 24시간 및 48시간 배양 후, MTT 용액 0.5 mg/mL를 첨가하였다. 1시간 후, MTT 용액을 제거한 후, 각 웰에 DMSO 100 μL를 첨가하였다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices E09090; San Francisco, CA, USA)를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
또한, 세포 증식 분석을 수행하기 위하여, BrdU 세포 증식 분석 키트(Cell signaling, Danvers, USA)를 사용하여 분석을 수행하였다. 구체적으로, NHDF 세포(3 × 103 세포/웰)를 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 인큐베이션한 다음 BrdU와 함께 무혈청 배지에서 다양한 농도의 AVF + PAG 25 및 AVF + PAG 100으로 처리한 후, 48시간 동안 추가 배양을 수행하였다. 그런 다음, 제조업체의 방법에 따라 ELISA 방법을 통해 BrdU-양성 세포의 통합을 확인하였다.
<실시예 5> 스크래치 상처-치료 분석
배양된 HaCaT 및 NHDF 세포의 단층에 WoundMakerTM(Essen Bioscience, Michigan, USA)로 스크래치 상처를 가하였다.
그런 다음, AVF + PAG 25 또는 AVF + PAG 100을 각각 포함하는 무혈청 배지, 개별 농도의 AVF(25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL)를 포함하는 무혈형 배지 또는 PAG(25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL)를 포함하는 무혈청 배지에서 세포를 각각 24시간 및 72시간 동안 배양하였다.
상처 치료 효과는 IncuCyte ZOOM(Essen Bioscience, MI, USA)을 사용하여 2시간마다 세포의 이미지를 캡처하여 확인하였다.
<실시예 6> 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)
NHDF(1.2 × 105 세포/웰) 및 HaCaT(4 × 105 세포/웰) 세포를 완전 배지의 60-mm 접시 및 6-웰 플레이트에 각각 접종하였다. 24시간 동안 배양한 후, 포화된세포 단층(confluent cell monolayer)을 형성시키고, p200 피펫 팁을 사용하여 여러 상처(가로 및 세로 5줄)를 가하였다. 그런 다음, 상기 HaCaT 및 NHDF 세포 모두에 각각 AVF + PAG 25 및 AVF + PAG 100으로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 PBS로 다시 2회 세척한 후, RNA 정제를 수행하였다. 제조사의 지시에 따라 TRIzol® Reagent(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 NHDF 및 HaCaT 세포에서 총 RNA를 추출한 후, PrimeScript RT 시약 키트(Takara, Beijing, China)를 사용하여 약 0.5μg의 정제된 총 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 또한, 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)에 사용된 프라이머 서열은 하기 [표 1]에 나타내었다. 아울러, MFAP4, COL1A, IVL 및 α-SMA mRNA의 발현은 GAPDH으로 정규화하였다.
| Gene name | Forward primer sequences | Reverse primer sequences |
| Human MFAP4 | 5′-GGCTCAGTAAGTTTCTTCCGCG-3′ (서열번호 1) |
5′-CCAAGTCCACTCGCAGCTCATA-3′ (서열번호 2) |
| Human COL | 5′-GATTCCCTGGACCTAAAGGTGC-3′ (서열번호 3) |
5′AGCCTCTCCATCTTTGCCAGCA-3′ (서열번호 4) |
| Human α-SMA | 5′-CTATGCCTCTGGACGCACAACT-3′ (서열번호 5) |
5′-CAGATCCAGACGCATGATGGCA-3′ (서열번호 6) |
| Human IVL | 5′-GTGGGGGAGAGAGGGAATTA-3′ (서열번호 7) |
5′-CTCACCTGAGGTTGGGATTG-3′ (서열번호 8) |
| Human GAPDH | 5′-TCCACTGGCGTCTTCACC-3′ (서열번호 9) |
5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′ (서열번호 10) |
<실시예 7> 웨스턴 블랏 분석
NHDF 세포에 실험군을 처리 48시간 후 세포를 회수하고, 차가운 PBS(1X)로 세척하였다. 그런 다음 단백질분해효소(protease)가 포함된 PRO-PREP™에서 용해시키고, Bradford's assay를 통해 단백질을 정량하였다. 또한, 6-12% SDS-PAGE 겔 전기영동을 수행한 다음, 각 그룹 40 μg의 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 이동시키고, 5% 탈지유로 차단하여 비특이적 결합을 차단하였다. 이어서, GAPDH, MFAP4, fibrillin 1, COL1A, elastin, TGF-β, VEGF-C, AKT, p-AKT, ERK, p-ERK 등에 대한 1차 항체를 사용하여 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 상기 멤브레인을 각각의 HRP(horseradish peroxidase)와 접합된 이차 항체, 및 향상된 화학 발광 시약과 함께 배양하였다. 그런 다음 ChemiDoc XRS + 이미징 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 각 단백질 밴드를 시각화하였다. 또한, 농도계 이미지 분석(Densitometric analysis)은 Image Master TM 17 2D Elite 소프트웨어 버전 3.1(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)에 의해 수행되었고, 단백질 밴드를 정량하였다.
<실시예 8> ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 분석
HaCaT 세포(4 × 104 세포/웰)를 48웰 플레이트에 24시간 동안 접종하였다. 그런 다음, 10 ng/ml의 TNF-α 및 IFN-γ로 염증을 유도하고, 각각 원하는 농도의 AVF + PAG 혼합물로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 상등액을 수집하고, 혈청 내 IL-6 및 IL-1β의 분비를 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA를 통해 측정하였다.
<실시예 9> siRNA(small interfering RNA)를 사용한 일시적 형질감염
NHDF 세포를 6-웰 플레이트(~60% confluence)에 접종하고 제조업체의 지시에 따라 Lipofectamine(Invitrogen)을 사용하여 100 nM의 MFAP4 특이적 siRNA (BIONEER)로 형질감염시켰다. 6시간의 형질감염 후, Lipofectamine 함유 배지를 원하는 농도의 시료를 함유하거나 시료가 없는 무혈청 배지로 교체하고 37℃에서 48시간 동안 배양을 유지한 후, 상층액을 제거하였다. 이어서, 세포를 수확, 용해하고, MFAP4 특이적 siRNA 녹다운을 확인하기 위해 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
또한, qRT-PCR를 수행하기 위하여, RNA를 추출하고 상기 <실시예 6>과 동일한 방법으로 MFAP4 유전자의 발현을 확인하였다.
아울러, NHDF 세포의 녹다운 조건에서 세포 이동 분석을 수행하였다.
<실시예 10> MFAP4(microfibril-associated glycoprotein 4) 특이적 siRNA 녹다운 상태에서 스크래치 상처 치유 분석 및 유세포 분석에 의한 세포 주기 분석
6시간의 MFAP4 특이적 siRNA 처리 후, 배지를 제거하고 이동 분석을 위해 세포에 상처를 준 후 AVF + PAG 25 및 AVF + PAG 100 혼합물을 처리 또는 비 처리하였다. 그런 다음, 2시간마다 이미지를 캡처하여 세포 이동을 분석하였다.
세포 주기 분석은 Khamchun 및 Thongboonkerd, 2018에 기초하여 MFAP4 특이적 siRNA 녹다운 상태에서 유세포 분석을 통해 수행하였다. 녹다운 후, 세포에 AVF + PAG 25 및 AVF + PAG 100 혼합물을 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 상기 세포를 4℃에서 1시간 동안 70% 에탄올로 고정시킨 후 1000×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 후, 세포를 PBS에 재현탁시키고 혼합물을 원심분리하였다. 그런 다음, 세포를 RNase A 및 propidium iodide(PI, 1 mg/mL) 각각 10 μL가 포함된 500μL PBS에 재현탁하였다. 아울러, 유세포 분석(FACSCaliburTM; Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)은 1 시간 이내에 수행하였다.
<실험예 1> NHDF 세포 이동에 대한 AVF와 PAG의 상승적 효과 확인
먼저, 세포 생존율 확인을 통해, AVF 및 PAG 추출물의 개별 농도와 AVF 및 PAG의 혼합물 최대 100 ㎍/mL로 처리된 NHDF 세포는 도 1a에 나타낸 바와 같이 대조군 또는 양성대조군(PC)인 Medacassoside 처리 그룹 모두에 비해 세포 독성의 나타내지 않음을 확인하였다(도 1a).
따라서, MTT assay를 통해 확인한 최적화된 용량을 이용하여 상처 치유 활성을 알아보기 위해 in vitro 상처 치유 분석를 수행하였다.
한편, 세포 이동은 피부 상처 치유의 중요한 특징으로, NHDF 세포 이동율은 스크래치 분석을 통해 유도된 상처 갭에 대한 상처 봉합의 백분율을 기반으로 결정하였다.
도 1b 및 도 1c에 나타낸 바와 같이 AVF 및 PAG, 및 이의 혼합물(AVF + PAG 25 및 AVF + PAG 100)은 유의적으로 상처 봉합 비율을 증가시키는 것을 확인하였다. 특히, AVF와 PAG의 혼합물은 다른 실험군 보다 24시간 빠르게 세포 이동률을 증가시킴을 확인하였다(도 1b 및 도 1c).
<실험예 2> AKT 및 ERK 신호 전달 경로 활성화를 통한 세포 증식에 있어서 AVF 및 PAG 혼합물의 시너지 효과 확인
BrdU 세포 증식 분석 키트를 이용하여 세포 증식 분석을 수행한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 AVF + PAG 처리군은 대조군 및 PC군에 비해 NHDF 세포 증식을 향상시켰고, 특히 AVF + PAG 100 처리군은 DNA 합성을 0.5 배 이상 증가시키는 것을 확인하였다(도 2a).
한편, AKT 및 ERK 신호 전달 경로의 활성화는 피부 섬유아세포의 이동 및 증식에 관여한다(Beserra et al., 2018).
이에, 본 발명의 AVF + PAG 혼합물 처리군의 AKT 및 ERK 신호 전달 경로에 대한 효과를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과, 도 2b 및 도 2c에 나타낸 바와 같이 대조군과 PC군(5μM madecassoside)에 비해 AVF + PAG 혼합물 처리군이 AKT와 ERK1/2의 인산화를 유의하게 증가시키는 것으로 확인하였다. 특히 AKT의 경우, AVF + PAG 혼합물 용량 의존적으로 증가되었고, ERK 인산화의 경우 AVF + PAG 100 처리군에서 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다(도 2b 및 도 2c).
따라서, 본 발명의 AVF + PAG 혼합물은 AKT 및 ERK 신호 전달 경로를 활성화하여 세포 증식 및 이동을 촉진함을 확인하였다.
<실험예 3> AVF와 PAG 혼합물의 혈관신생 관련 단백질 발현 유도 확인
상처 치료와 관련된 혈관 신생 단백질인 TGF-β, VEGF의 발현 수준을 확인한 결과, 도 2b 및 도 2d에 나타낸 바와 같이 AVF + PAG 혼합물의 용량 의존적으로 TGF-β, VEGF의 발현 수준을 증가시키는 것을 확인하였고, 특히 TGF-β는 AVF + PAG 혼합물 처리군에서 약 1.5배 이상 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 2b 및 도 2d).
<실험예 4> MFAP4 신호 전달 경로를 통한 피부 상처 치유에 있어서 AVF와 PAG의 시너지 효과 확인
MFAP4는 세포 이동 및 증식을 개시하고, ECM(Extracellular matrix)의 합성을 도울 수 있음이 알려져 있다.
이에, 상처 치유 과정에서 AVF + PAG의 기전을 밝히기 위하여, NHDF 세포에서 MFAP4 및 관련 경로의 qRT-PCR 및 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다.
도 3a 내지 도 3c에 나타낸 바와 같이, AVF + PAG 처리군은 대조군 및 PC군에 비해 MFAP4의 발현을 상향 조절하는 것으로 확인하였다. 구체적으로, MFAP4의 단백질 발현을 3배 증가시켰고, mRNA 수준은 2배 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, COL1A 및 α-SMA 유전자의 발현도 상향 조절하는 것을 확인하였고, 특히 AVF + PAG 100 처리군은 COL1A, 피브릴린 및 엘라스틴 단백질의 발현을 용량 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다(도 3a 내지 도 3c).
따라서, 본 발명의 AVF와 PAG의 혼합물은 용량 의존적으로 MFAP4 신호 전달 경로를 통해 피부 상처 치유에 상승적 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 5> MFAP4 siRNA 녹다운 조건에서 세포 이동과 세포 주기 확인
MFAP4 녹다운은 상처 치유에서 MFAP4의 역할을 평가하기 위하여 수행하였다.
구체적으로, MFAP4 발현의 단백질 및 RNA 수준은 스크램블(scramble) siRNA 및 형질감염되지 않은 대조군과 비교하여 MFAP4-형질감염된 세포에서 유의하게 하향조절되었으며, 이는 웨스턴 블랏 분석(도 4a) 및 qPCR(도 6c) 모두에서 확인하였다. 또한, 세포 독성도 없는 것을 확인하였다(도 6b).
그런 다음, 세포 이동 및 세포 주기 분석을 수행하여 siRNA 매개 녹다운 상태에서 MFAP4와의 상관 관계를 확인하였다.
그 결과 도 4b 및 도 4c에 나타낸 바와 같이, MFAP4 siRNA 녹다운은 스크램블 siRNA로 형질감염된 그룹과 처리하지 않은 그룹에 비해 세포 이동 속도를 감소시켰고, 세포 이동은 72시간까지 유사하게 느리게 유지됨을 확인하였다.
그러나 AVF와 PAG 혼합물로 처리한 군은 이동 속도가 증가하여 즉각적인 상처 봉합을 위한 간격이 줄어들은 것을 확인하였다(도 4b 및 4c).
또한, MFAP4 siRNA 녹다운 조건에서 세포 주기의 여러 단계를 조사하기 위해 유세포 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 4d 및 4e에 나타낸 바와 같이, 24시간 후 AVF 및 PAG 처리군은 대조군 및 양성 대조군에 비해 S기를 증가시키는 것을 확인하였다. 구체적으로 S기의 세포 집단의 수는 대조군은 20%였으나, 실험군은 약 30%임을 확인하였다(도 4d 및 4e).
그러나 대조군과 AVF + PAG 치료군 모두 G2/M기에 차이를 보이지 않았고, MFAP4 siRNA 및 스크램블 siRNA 형질감염된 세포의 경우, 대부분의 세포 집단이 G2/M기에 분포된 반면, 세포의 가장 낮은 분포는 도 4d 및 도 4e와 같이 S기 임을 확인하였다.
따라서, AVF + PAG 혼합물 처리가 세포 주기의 S기를 통해 DNA 복제를 강화함으로써 세포 주기의 진행을 수정할 수 있는 반면, MFAP4 siRNA 녹다운 조건은 세포사멸 과정의 시작을 나타냄을 확인하였다.
<실험예 6> AVF 및 PAG 혼합물의 세포 이동 유도 효과 및 염증성 사이토카인의 방출 억제 효과 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 HaCaT 세포에서 세포 독성 및 세포 이동을 확인하였다.
그 결과, 도 5a 내지 도 5f에 나타낸 바와 같이, AVF + PAG 혼합물 처리 시 세포 독성은 없었고(도 5a), 대조군에 비해 세포 증식이 증가하는 것으로 확인하였다(도 5b).
또한, NHDF 세포의 경우와 유사하게, AVF + PAG 혼합물은 용량 의존적 방식으로 대조군 및 양성 대조군에 비해 HaCaT 세포의 이동을 유의하게 유도하는 것을 확인하였다(도 5c).
또한, HaCaT 세포의 단층도 6시 만에 빠르게 상처 부위로 이동하기 시작했으며 12시간에 최대 합류가 관찰되었고, IVL 및 MFAP4 유전자 발현의 경우 약 1.5배 증가를 확인하였다(도 5e).
또한, HaCaT 세포를 TNF-α 및 IFN-γ(10ng/mL)에 노출시킨 후 AVF + PAG 혼합물로 처리하여 염증을 유도한 후, ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과, IL-6 및 IL-1β의 혈청 수준이 감소함으로 확인하였다(도 5f). 또한 이 조건에서도 세포 독성이 없음을 확인하였다(도 6a).
<110> univera
Gachon University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Composition for wound treatment or skin regeneration containing
Aloe vera flower extract and Aloe vera polysaccharide as active
ingredients
<130> KP2260010-NAAL
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human MFAP4 Forward primer
<400> 1
ggctcagtaa gtttcttccg cg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human MFAP4 Reverse primer
<400> 2
ccaagtccac tcgcagctca ta 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human COL Forward primer
<400> 3
gattccctgg acctaaaggt gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human COL Reverse primer
<400> 4
agcctctcca tctttgccag ca 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human a-SMA Forward primer
<400> 5
ctatgcctct ggacgcacaa ct 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human a-SMA Reverse primer
<400> 6
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<213> Artificial Sequence
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<223> Human IVL Forward primer
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<212> DNA
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<223> Human IVL Reverse primer
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<211> 18
<212> DNA
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<223> Human GAPDH Forward primer
<400> 9
tccactggcg tcttcacc 18
<210> 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human GAPDH Reverse primer
<400> 10
ggcagagatg atgacccttt t 21
Claims (14)
- 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학적 조성물로서,
상기 알로에 베라 다당체는 알로에 베라 겔을 효소로 가수분해하여 수득한 것인, 상처 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 알로에 베라 꽃 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 알로에 베라 꽃 추출물은 에탄올, 또는 에탄올 및 물의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 알로에 베라 다당체는 5 내지 400 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 효소로 가수분해는 셀룰라아제(cellulase)를 사용하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 알로에 베라 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체는 0.5:1 내지 1:2의 농도비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 알로에 베라 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체는 MFAP4((microfibril-associated glycoprotein 4) 신호 전달 경로를 통해 상처 치유 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 알로에 베라 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체는 AKT 및 ERK 신호 전달 경로를 활성화하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 액제, 현탁제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 에멀젼, 시럽제, 겔, 페이스트, 연고 프로스트, 산제, 유제 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제제인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 약학적 조성물.
- 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 약학적 조성물로서,
상기 알로에 베라 다당체는 알로에 베라 겔을 효소로 가수분해하여 수득한 것인, 피부 재생용 약학적 조성물.
- 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물로서,
상기 알로에 베라 다당체는 알로에 베라 겔을 효소로 가수분해하여 수득한 것인, 피부 재생용 화장료 조성물.
- 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 식품 조성물로서,
상기 알로에 베라 다당체는 알로에 베라 겔을 효소로 가수분해하여 수득한 것인, 피부 재생용 식품 조성물.
- 알로에 베라(Aloe vera) 꽃 추출물 및 알로에 베라 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 건강기능식품 조성물로서,
상기 알로에 베라 다당체는 알로에 베라 겔을 효소로 가수분해하여 수득한 것인, 피부 재생용 건강기능식품 조성물.
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-
2022
- 2022-04-28 KR KR1020220052745A patent/KR102563734B1/ko active IP Right Grant
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| KR20200080189A (ko) * | 2018-12-26 | 2020-07-06 | 한국콜마주식회사 | 고농도의 페놀 화합물을 함유하는 알로에속 식물 추출물의 제조방법 및 그 방법을 이용하여 제조된 추출물을 포함하는 피부 재생, 항염 및/또는 항산화용 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Cristina Quispe 외. Chemical Composition and Antioxidant Activity of Aloe vera from the Pica Oasis (Tarapaca´, Chile) by UHPLC-Q/Orbitrap/MS/MS. Journal of Chemistry. 2018, Vol. 2018, pp. 1-12* * |
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