KR101528448B1

KR101528448B1 - 살비아놀릭산 b를 포함하는 피부상태 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101528448B1
Application number: KR1020150000560A
Authority: KR
Inventors: 이종성
Original assignee: 을지대학교 산학협력단
Priority date: 2015-01-05
Filing date: 2015-01-05
Publication date: 2015-06-11

Abstract

본 발명은 살비아놀릭산 B를 포함하는 저색소증 개선용 조성물에 관한 것으로, 살비아놀릭산 B를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 멜라닌 생성효과 및 티로시나아제 활성 증가효과를 가져 피부 저색조증을 개선시킬 수 있다. 또한, 살비아놀릭산 B는 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

Description

살비아놀릭산 B를 포함하는 피부상태 개선용 조성물{A composition for improving skin conditions containing salvianolic acid B}

본 발명은 살비아놀릭산 B(salvianolic acid B)를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 살비아놀릭산 B를 유효성분으로 포함하는 저색소증 개선을 위한 화장료, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되어진다. 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 자외선으로 발생하는 피부손상을 차단하는 중요한 역할을 하고 있다. 멜라닌 생합성에는 멜라닌 세포에 존재하는 티로시나아제(tyrosinase)의 작용이 가장 중요하며, 이러한 티로시나아제는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)을 멜라닌 중합체 생성과정의 중간산물인 도파(DOPA) 및 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환함으로써 피부 흑화과정에 핵심적 역할을 수행한다. 멜라닌은 햇빛 중 자외선의 빛 에너지를 흡수하여 피부 깊숙이 있는 세포들을 자외선에 의한 손상으로부터 보호하는 역할을 하지만, 멜라닌이 비정상적으로 과잉 생산되면 기미, 주근깨, 색소 침착 등과 같은 피부색소 이상 침착 증상이 발생되며, 반대로 적게 생산되면 백반증(vitiligo), 탈색소 모반, 백색 비강진(pseudoleucoderma atopicum), 어루러기(Tinea versicolor), 반상 경피증, 알레르기, 염증 후 탈색증, 특발성 적상 저색소증, 부분 백피증 등의 멜라닌 저색소증 질환(Leukoderma)이 발생한다(Bolognia와 Pawelek, J Am Acad Dermatol (1988) 19:217-255; Pinto와 Bolognia, Pediatr Clin North Am (1991) 38:991-1017). 상기 멜라닌 저색소증 질환 중 백반증은 멜라닌 세포가 파괴되어 발병하는 질환이고, 나머지 질환은 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 양의 감소로 인해 발병하는 질환이다. 현재까지 보고된 저색소증 치료법으로는 소랄렌 등의 광감작제를 이용한 광화학적 방법, 수술 등의 외과적 방법, 멜라닌 세포의 활성을 높여 멜라닌 생성을 증가시키는 방법, 산화적 스트레스로부터 멜라닌 세포를 보호하는 방법 등이 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 바와 같이 저색조증 개선 효과를 가지면서 인체 부작용이 적은 물질을 찾고자 예의 연구한 결과, 살비아놀릭산 B가 멜라닌 생성을 유도하여 피부 저색소증 개선효능을 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 피부 저색소증 개선효과를 가지면서 인체 안전성이 우수한 물질을 제공하고자 하는 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 살비아놀릭산 B를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 저색소증 개선을 위한 조성물을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에서 살비아놀릭산 B를 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 살비아놀릭산 B는 하기 화학식 1의 구조식을 가지며, 주로 단삼(Salvia miltiorrhiza, 丹蔘])으로부터 추출되거나 화학적으로 합성될 수 있다.

단삼은 혈액순환을 돕고, 어혈을 제거하며 사지관절 동통을 완화시키고, 생리불순, 생리통, 산후복통, 어혈성 심복부통, 타박상 등을 치료하며, 고열로 인한 정신혼몽, 헛소리, 번조, 불면증, 피부발진, 심계항진 등에 치료효과가 있다고 알려져 있다. 약리작용은 관상동맥 확장, 콜레스테롤 강하, 혈압 강하, 간기능 활성화, 진정 항염, 항암, 항균작용이 보고되었다.

본 발명에서는 살비아놀릭산 B 화합물을 통상의 방법에 따라 단삼으로부터 추출하거나 화학적으로 합성하여 사용하거나 또는 시판하는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 이에 특별한 제한이 없다.

본 발명의 조성물에서 살비아놀릭산 B는 조성물 총 중량을 기준으로 하여 0.00001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 30 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 살비아놀릭산 B의 함량이 0.00001 중량% 미만일 때는 피부 저색조증 개선효과가 미약하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과증가가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 살비아놀릭산 B를 유효성분으로 포함하는 피부 저색소증 개선을 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 세포독성이 거의 없으면서 자외선으로부터 피부세포를 보호하며, 특히 자외선으로부터 피부를 보호하는 기능을 하는 멜라닌 세포를 활성화시켜 피부보호 효능을 발휘하며, 자외선보호효과는 통상적인 피부 보호용도(피부진정효과, 피부흑화유도 효과, 피부암예방효과)를 포함하는 것으로 해석된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "저색소증 개선"은 멜라닌 세포나 멜라닌 색소 합성기능에 이상이 생겨 멜라닌 생성이 감소되어 야기되는 백반증, 백모 등의 피부 트러블을 개선하는 흑화(melanogenesis) 작용을 의미한다.

본 발명의 피부 저색소증 개선을 위한 조성물에서, 살비아놀릭산 B는 인간 유래 멜라닌 세포의 멜라닌 생성을 증가시키고, 안정성이 높으며, 피부 자극 유발 등의 부작용이 거의 없다.

본 발명의 조성물에는 유효성분인 살비아놀릭산 B 이외에 피부 저색소증 개선 효과를 가지는 성분을 추가로 첨가할 수 있으며, 바람직하게 글리시리진(glycyrrhizin)을 살비아놀릭산 B와 함께 혼합하여 사용할 수 있다.

이 때 글리시리진의 첨가량은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.00001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 30 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 살비아놀릭산 B와 함께 글리시리진을 혼합하여 첨가함으로써 피부 저색조증 개선에 있어서 유의적으로 우수한 상승효과를 수득할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 살비아놀릭산 B 및 글리시리진을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 저색소증 개선을 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 살비아놀릭산 B 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 약학적 조성물은 살비아놀릭산 B 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 하나의 실시양태에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 살비아놀릭산 B뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 살비아놀릭산 B 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 살비아놀릭산 B는 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 살비아놀릭산 B를 유효성분으로 포함하는 조성물은 멜라닌 생성효과 및 티로시나아제 활성 증가효과를 가져 피부 저색조증을 개선시킬 수 있다. 또한, 살비아놀릭산 B는 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 살비아놀릭산 B에 의한 멜라닌 생성효과를 인간 표피 멜라닌형성세포(Human epidermal melanocyte)에서 관찰하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 멜라닌 생성에 있어서, 살비아놀릭산 B와 글리시리진의 혼합에 의한 상승효과를 인간 표피 멜라닌형성세포에서 관찰하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 살비아놀릭산 B에 의한 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들의 발현증가 효과를 쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)에서 관찰하여 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 살비아놀릭산 B에 의한 인간 표피 멜라닌형성세포의 멜라닌 생성 증가효과 측정

인간 표피 멜라닌형성세포(Human epidermal melanocyte)를 이용하여 살비아놀릭산 B(Salvianolic acid B)에 의한 멜라닌 생성 증가효과를 측정하였다.

신생아 유래 인간 표피 멜라닌형성세포(Human epidermal melanocyte, Cascade Biologics사로부터 입수함)를 인간 멜라닌형성세포 성장 보조제(Human Melanocyte Growth supplement)를 포함하는 Medium 254배지(Cascade Biologics사로부터 입수함)에서 배양하였다. 인간 표피 멜라닌형성세포를 6-well plate에 well당 1 X 10⁵ 개로 접종한 후 5 % CO_2,37℃ 하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다.

배양 후 배지를 제거하고 시료를 희석하여 배지에 처리한 후 5% CO_2,37℃ 하에서 이틀에 한 번 배지를 갈아주면서 5일간 배양하였다. 살비아놀릭산 B(시그마 알드리치에서 입수)의 희석 농도범위는 세포독성이 없는 1 uM, 10 uM, 100 uM로 설정하였다. 처리가 끝난 후 배지를 제거하고 PBS(phosphated buffer saline)로 세척한 후, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 각 처리 그룹별 세포수를 동수로 맞추어 5,000 ~ 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 세포를 얻었다.

수득된 세포를 60℃에서 건조한 후, 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕를 넣어 60 ℃ 항온조에서 세포내 멜라닌액을 얻었다. 수득한 멜라닌액을 마이크로플레이트 리더로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정 수당 멜라닌 양을 조사하였다.

비교군으로서 폴스콜린 10 uM을 사용하였으며, 대조군(-)으로 공시험군을 사용하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보듯이, 인간 표피 멜라닌형성세포에서 살비아놀릭산 B 처리에 의한 멜라닌 양이 농도 의존적으로 증가됨을 알 수 있었다. 이로부터 살비아놀릭산 B가 인체 세포에 흑화 효능을 나타내고 있음을 확인하였다.

<실시예 2> 살비아놀릭산 B에 의한 세포내 티로시나아제 활성 증가효과 측정

인체 멜라닌세포(melanocyte)를 이용하여 살비아놀릭산 B(Salvianolic acid B)에 의한 티로시나아제 활성 증가효과를 측정하였다.

배양 후 배지를 제거하고 시료를 희석하여 배지에 처리한 후 5% CO_2,37℃ 하에서 이틀에 한 번 배지를 갈아주면서 5일간 배양하였다. 살비아놀릭산 B(시그마 알드리치에서 입수)의 희석 농도범위는 세포독성이 없는 1 uM, 10 uM, 100 uM로 설정하였다. 처리가 끝난 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 각 처리 그룹별 세포수를 동수로 맞추어 5,000 ~ 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 세포를 얻었다. 이 세포를 용해 완충액을 이용하여 분쇄한 후, 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 수집하였다. 이 효소액을 40μl 넣고 2mg/ml 으로 녹인 기질 L-dopa를 100μl 첨가하였다. 37℃, 1 시간 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나아제 활성을 계산하였다. 티로시나아제의 활성도는 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다. 비교군으로 폴스콜린 10 uM을 사용하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	처리농도	세포내 타이로시나아제 활성 증가율 (%)
forskolin	10 uM	70.01
살비아놀릭산 B	1 uM	18.87
살비아놀릭산 B	10 uM	71.98
살비아놀릭산 B	100 uM	85.77

상기 표 1에서 보듯이, 살비아놀릭산 B를 10 uM로 처리한 군은 폴스콜린을 사용한 비교군과 필적할 만한 높은 수준으로 세포내 티로시나아제 활성 증가율을 나타내었다. 또한, 살비아놀릭산 B의 타이로시네이즈 활성 증가 정도는 농도에 의존적이라는 것을 알 수 있었다.

<실시예 3> 살비아놀릭산 B의 세포독성 측정

신생아 유래 인간 표피 멜라닌형성세포(Cascade Biologics사로부터 입수함)를 인간 멜라닌형성세포 성장 보조제를 포함하는 Medium 254배지에서 배양하였다. 인간 표피 멜라닌형성세포를 6-well plate에 well당 1 X 10⁵ 개로 접종한 후 5 % CO_2,37℃ 하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다.

배양 후 배지를 제거하고 살비아놀릭산 B를 1 uM, 10 uM, 100 uM 농도로 희석된 배지에 처리하고, 5% CO_2,37℃ 하에서 2일간 배양하였다. 세포독성 효과를 MTT(3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide) 평가법으로 측정하였다. MTT는 담황색의 기질로서 생세포의 미토콘드리아 내의 호흡연쇄효소에 의해 개열하고 암청색의 포마잔을 생성한다. 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않으므로 이 포마잔의 생성량은 살아있는 세포수 측정에 이용된다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시료	처리농도	세포생존율 (% of control)
forskolin	10 uM	100±2.1
살비아놀릭산 B	1 uM	100.7±4.1
살비아놀릭산 B	10 uM	101.51±1.3
살비아놀릭산 B	100 uM	103.56±2.2

상기 표 2에서 보듯이, 살비아놀릭산 B는 모든 농도 군에서 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 살비아놀릭산 B와 글리시리진(Glycyrrhizin)의 혼합에 의한 인간 표피 멜라닌형성세포의 멜라닌 생성 증가에 대한 상승효과 측정

인간 표피 멜라닌형성세포를 이용하여 살비아놀릭산 B와 글리시리진(glycyrrhizin)(시그마알드리치 구입)에 혼합에 의한 멜라닌 생성 증가에 대한 상승효과를 측정하였다.

신생아 유래 인간 표피 멜라닌형성세포를 인간 멜라닌형성세포 성장 보조제를 포함하는 Medium 254배지에서 배양하였다. 인간 표피 멜라닌형성세포를 6-well plate에 well당 1 X 10⁵ 개로 접종한 후 5 % CO_2,37℃ 하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다.

배양 후 배지를 제거하고 시료를 희석하여 배지에 처리한 후 5% CO_2,37℃ 하에서 이틀에 한 번 배지를 갈아주면서 5일간 배양하였다. 처리 농도는 살비아놀릭산 B 5 uM, 살비아놀릭산 B 10 uM, 글리시리진 5 uM, 글리시리진 10 uM, 살비아놀릭산 B 5 uM + 글리시리진 5 uM로 설정하였다. 처리가 끝난 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 각 처리 그룹별 세포수를 동수로 맞추어 5,000 ~ 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 세포를 얻었다. 이 세포를 60℃에서 건조한 후, 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕를 넣어 60 ℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다. 이 액으로 마이크로플레이트 리더를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정 수당 멜라닌 양을 구하였다. 비교군으로 폴스콜린 10 uM을 사용하고, 대조군(-)으로 공시험군을 사용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보듯이, 인간 표피 멜라닌형성세포에서 살비아놀릭산 B와 글리시리진을 각각 단독으로 처리한 군에 비하여 살비아놀릭산 B와 글리시리진을 혼합하여 처리한 군에서 멜라닌 양이 유의성 있게 증가하는 것을 볼 수 있었다. 이로부터 살비아놀릭산 B와 글리시리진의 혼합할 경우 상호 상승적인 흑화 효능을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 5> 멜라닌 생성에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 살비아놀릭산 B의 효과 측정

쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)를 이용하여 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들에 대한 살비아놀릭산 B의 효과를 측정하였다.

본 실험은 murine melanoma(B-16 F10) 세포를 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well당 1ㅧ 10⁵ 개로 접종한 후, 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석된 배지에 처리하고, 5% CO_2,37 ℃하에서 2일간 배양하였다. 살비아놀릭산 B의 농도는 세포독성이 없는 100 uM로 결정하였다.

이어서, 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 각 처리 그룹별 세포수를 동수로 맞추어 2 mL 튜브에 나누어 담은 뒤 5,000 내지 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 얻었다. 이 세포 pellet으로부터 TRIzol reagent(Carlsbad, CA, USA, Invitrogen)를 사용하여 total RNA를 분리하였고, random primers와 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(Carlsbad, CA, USA, Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. ABI7900HT machine(Applied Biosystems)을 사용하여 real-time PCR 분석을 수행하였고, 이 때 Taqman 분석을 사용하였다. 이를 활용하여 각 유전자의 Taqman probe를 사용하여, 유전자들의 발현을 real-time PCR assay로 측정하였다. Taqman probe로는 MITF, Tyrosinase, TRP1, TRP2, GAPDH를 사용하였고(PCR 조건 50 C: 2분, 60 C: 30분, 95 C:５분, PCR cycle: 45회), 비교 정량법은 기존 논문(Langman et al., 2003, J Lipid Res, 44, 968-977)을 참조하여 수행하였다.

그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보듯이, 살비아놀릭산 B는 멜라닌 생합성에 관여하는 유전자인 tyrosinase, MITF, TRP1 및 TRP2 유전자들의 발현을 모두 증가시킴을 확인할 수 있었다.

이상의 시험 결과로부터 살비아놀릭산 B가 흑화(melanogenesis)에 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

살비아놀릭산 B를 유효성분으로 포함하는 피부 저색소증 개선용 화장료 조성물.
살비아놀릭산 B를 유효성분으로 포함하는 피부 저색소증 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
살비아놀릭산 B를 유효성분으로 포함하는 피부 저색소증 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서,
상기 살비아놀릭산 B를 조성물 총 중량을 기준으로 하여 0.00001 내지 50 중량%의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
글리시리진(Glycyrrhizin)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서,
상기 글리시리진을 조성물 총 중량을 기준으로 하여 0.00001 내지 50 중량%의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.