KR20160101794A

KR20160101794A - 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 포함하는 항산화, 미백 및 주름 개선을 위한 조성물

Info

Publication number: KR20160101794A
Application number: KR1020150024247A
Authority: KR
Inventors: 이정순; 이강원
Original assignee: 이정순; 이강원
Priority date: 2015-02-17
Filing date: 2015-02-17
Publication date: 2016-08-26

Abstract

본 발명은 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 인간 피부 섬유아세포에서 콜라겐 생합성을 촉진하고, MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현억제를 통한 피부 노화방지 및 주름개선효과를 나타내며, DPPH 자유 라디칼 소거활성이 우수하여 항산화 효과가 있으며, 티로시나아제 저해효과를 가져 미백효과를 가질 뿐만 아니라 세포 생존율의 변화를 나타내지 않으므로 우수한 안전성(safty)을 나타낸다. 또한 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

효소 처리된 산삼배양근 추출물을 포함하는 항산화, 미백 및 주름 개선을 위한 조성물{A COMPOSITION FOR ANTIOXIDATING, WHITENING AND IMPROVING WRINKLE COMPRISING EXTRACTS OF WILD GINSENG CULTURE ROOTS TREATED WITH ENZYME}

본 발명은 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)로부터 유래된 효소를 처리하여 형질전환시킨 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 항산화, 미백 및 주름 개선을 위한 화장료, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

현대 사회에 크게 영향을 주고 있는 '웰빙'이라는 현상은 잘 먹고 잘 살자라는 일차적인 의미뿐만 아니라 '신체의 건강함이 피부의 아름다움으로 표현된다'라는 의미까지 내포하고 있다. 이러한 현상은 피부미용 분야에 가장 많이 나타나고 있으며 피부미용은 이제 단편적인 효능을 벗어나 복합적인 기능과 과학적인 접근을 필요로 하고 있다.

사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데, 그 중 각질층은 표피(epidermis)의 기저세포인 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 이러한 피부에서의 노화의 원인에 대해서는 크게 두 가지로 연구되고 있는데, 하나는 "내적 노화"로서 연령의 증가에 따른 피부의 구성단위인 세포의 기능변화에 기인한 것이고, 다른 하나는 "외적 노화"로서 외부 환경 즉 자외선, 공해, 스트레스 등에 의한 것으로 나눌 수 있다.

피부의 세포는 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 인간의 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 끊임없이 일어나는 생화학 반응에서 발생하는 활성산소종에 의해 산화적 스트레스가 가해지게 되면, 세포 구성 성분들인 지질, 단백질, 탄수화물과 DNA 산화적 손상 및 효소활성을 변화시켜 피부암 등의 각종 질병을 일으키는 원인이 되며, 노화를 촉진시킨다. 아울러 외적 노화의 원인 중에서 가장 큰 부분을 차지하고 있는 것은 자외선에 의한 광노화(photoaging)로서 UV에 지속적인 노출을 통해 피부암 등의 급성 및 만성적인 피부의 상해가 유발된다.

피부 진피층 기질을 이루는 중요한 성분의 하나인 콜라겐의 생합성과 분해는 피부 노화 억제에 핵심이 되고 있는데, 상기 활성산소종은 피부 섬유아세포에서 MMPs(matrix metalloproteinases)의 발현을 촉진하며, 자외선에 의한 콜라게나제의 합성을 촉진시킴으로써 피부 노화를 유발한다.

또한, 사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 피부 표피층에 있는 멜라노사이트에서 합성되는데, 멜라노사이트 내 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시킨다. 따라서, 피부 내의 티로시나제 활성을 저해하여 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.

따라서, 화장품 분야에서는 항산화, 미백 및 주름 개선효과를 가지는 기능성 화장품에 대한 연구 및 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 특히 피부에 독성이나 자극을 주지 않기 위하여 천연 물질을 이용한 연구가 계속되고 있다.

한편, 산삼(wild ginseng) 배양근은 특이한 냄새가 있으며 맛은 달고 약간 쓰며 성질은 약간 따뜻하다. 산삼은 원기를 보하고 신체허약，권태，피로，식욕부진，구토，설사에 효능이 있으며, 폐기능을 도우며 진액을 생성하고 안신작용 및 신기능을 높여 준다. 약리작용은 대뇌피질흥분과 억제，평형，항피로，항노화，면역증강，심장수축，성선촉진，고혈당억제，단백질합성촉진，항상성유지，항암，해독작용 등이 있다고 보고되었다.

산삼배양근의 주요 성분은 인삼의 주요성분인 인삼사포닌과 그 외에 폴리사카라이드(polysaccharide), 다우코스테롤(Daucosterol), 올리고사카라이드(Oligosaccharide), 펩타이드, 파낙시놀(Panaxynol), 말톨(Maltol), 진생(Ginseng), 아데노신(Adenosine), 당지질，당단백질 등이 있으며，산삼배양근 중 당류 물질은 주로 모노사카라이드(monosaccharide), 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 헤테로폴리사카라이드(heteropolysaccharide) 등으로 구성되어 있다. 모노사카라이드는 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 아라비노스(arabinose), 람노스(Rhamnose), 자일로스(xylose) 등의 성분으로 구성되며, 올리고사카라이드는 자당，맥아당，유당 등으로 구성된다. 폴리사카라이드는 대부분이 물에 용해되고, 산삼배양근의 뿌리，줄기，잎 중의 다당류는 대부분이 헤테로폴리사카라이드이다. 산삼배양근 중 다당류는 산삼배양근 전분과 산삼배양근 펙틴 두 부분으로 구성된다. 산삼배양근 펙틴은 주요 활성물질이며，산삼배양근의 뿌리，줄기，잎 중에 유리상태의 아미노산이 있고 각 부분이 함유한 아미노산의 수량 및 종류도 다르다. 산삼배양근 뿌리 중에는 Bl, B2, Bl2, 니코틴산, 니코틴아미드판토텐산 등의 비타민도 함유되어 있다. 이외에 산삼배양근 중에는 인체에 유익한 미량 원소 및 효소류의 물질들과 카엠페롤(Kaempferol), 트라이폴린(trifolin), 플라본(flavon) 등의 성분들도 있다.

현재까지 이러한 유용한 산삼배양근과 관련한 연구 보고는 많지 않으며, 단지 산삼배양근의 주요성분인 산삼배양근 유래사포닌을 이용한 연구가 보고된 바 있을 뿐 아직까지 산삼배양근의 항산화, 미백효과 및 주름개선 효과에 관해서는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 항산화, 미백효과 및 주름개선 효과를 가지면서 인체 부작용이 적은 새로운 천연물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 누룩으로부터 분리된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 균주 또는 이의 배양균으로 효소 처리된 산삼배양근 추출물이 세포 독성이 없으면서도 항산화, 미백효과 뿐만 아니라 주름 개선효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 항산화, 미백효과 및 주름개선 효과를 가지면서 인체 안정성이 우수한 물질을 제공하기 위한 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 및 주름 개선을 위한 조성물을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에서 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 산화, 미백 및 주름 개선을 위한 조성물의 유효성분인 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 베타-글루코시다아제에 활성이 있는 식용 가능한 누룩 균주의 배양액내 효소를 산삼배양근에 처리한 다음 추출하여 제조할 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서는 상기 효소가 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)로부터 유래된 효소인 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다:

(S1) 아스퍼질러스 니거 균주를 고체배양 또는 액체배양하여 조질의 진세노시다아제(ginsenosidase)를 수득하는 단계;

(S2) 상기 수득된 조질의 진세노시다아제에 에탄올, 메탄올, 부탄올 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택된 유기용매(확인하여 주시기 바랍니다)를 넣어 효소 단백질을 침전시킨 다음 침전물을 완충용액에 용해시켜 투석하고 이물질을 제거하여 진세노시다아제 농축액을 수득하는 단계; 및

(S3) 상기 진세노시다아제 농축액을 이온교환수지에 로딩한 다음 KCL 또는 NaCL 완충용액으로 용출시켜 수득된 분획을 산삼배양근과 반응시키고 활성을 나타내는 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 선별하는 단계.

상기 단계 (S1)에서 균주 배양시 산삼배양근 추출물 또는 분말을 추가로 첨가함으로써 진세노시다아제의 수율을 보다 향상시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 효소처리되어 형질전환된 산삼배양근 추출물을 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.01 내지 30 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%로 포함할 수 있다. 이 때 효소 처리된 산삼배양근 추출물의 함량이 0.01 중량% 미만일 경우 본 발명의 목적효과인 항산화, 미백 및 주름 개선효과를 수득할 수 없으며, 30 중량%를 초과할 경우 함량의 증가에 따라 효과가 비례적이지 않아 경제적인 면에서 비효율적일 수 있다.

본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 함유하는 조성물은 항산화 효과, 미백효과 및 주름 개선효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 효소 처리된 산삼배양근 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 약학적 조성물은 효소 처리된 산삼배양근 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 효소 처리된 산삼배양근 추출물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인간 피부 섬유아세포에서 콜라겐 생합성을 촉진하고, MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현억제를 통한 피부 노화방지 및 주름개선효과를 나타내며, DPPH 자유 라디칼 소거활성이 우수하여 항산화 효과가 있으며, 티로시나아제 저해효과를 가져 미백효과를 가질 뿐만 아니라 세포 생존율의 변화를 나타내지 않으므로 우수한 안전성(safty)을 나타낸다. 또한 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물과 기존의 산삼배양근 추출물의 진세노사이드 성분의 변화 및 다당류 당지질의 변화를 비교분석한 그래프이다. 여기에서, 검은색 라인은 산삼배양근 추출물이고, 파란색 라인은 효소 처리된 산삼배양근 추출물이며, 분홍색 라인은 진세노사이드 Rg2 표준물질이며, 갈색 라인은 진세노사이드 Re 표준물질이다.
도 2는 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물에 의한 인간 피부 섬유아세포의 생존율 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 피부 섬유아세포에서 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물에 의한 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 단백질의 발현을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 인간 피부 섬유아세포에서 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물에 의한 Type-l Procollagen 단백질의 발현을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 B16F10 생쥐 유래 멜라노마 세포주에서 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물에 의한 멜라닌 함량 및 세포 생존율 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6는 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물의 티로시나제 저해활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 균주배양액을 이용한 효소의 제조

누룩으로부터 유래된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 균주를 액체 또는 고체 배양법으로 배양하였다. 고체배양 시에는 배양 후 완충용액에 잠가두었다가 효소를 분리하고, 액체배양 시에는 원심분리하여 조질의 진세노시다아제(crude ginsenosidase)를 수득하였다.

수득된 조질 효소액에 유기용매(구체적인 예를 기술하여 주시기 바랍니다)를 넣어 효소 단백질을 침전시킨 다음 침전물을 완충용액에 용해시켜 투석한 후 이물질을 제거하여 진세노시다아제 농축액을 수득하였다.

이어서 이온교환수지에 로딩한 후 KCL 또는 NaCL 완충용액으로 용출시켰다. 수득된 분획을 산삼배양근과 반응시키고 활성을 나타내는 분획의 단백질을 측정하여 순수한 효소를 수득하였다.

<실시예 2> 효소 처리된 산삼배양근의 제조

산삼배양근을 입수하여 20-40 mesh로 분쇄한 다음 플라스크 또는 유리 용기에 담고, 상기 실시예 1에서 제조한 효소를 산삼배양근 무게 대비 20 중량%의 양으로 산삼배양근 무게대비 10배의 물에 녹여 산삼배양근이 담긴 플라스크에 넣고 잘 혼합하였다.

발효 용기에 담긴 혼합물을 55℃에서 24시간 동안 반응시킨 다음 산삼배양근 무게대비 10배의 EtOH을 첨가(50% EtOH 20배 추출진행을 위함)하여 70℃에서 4시간 동안 환류 추출하였다. 추출 후 여과를 거쳐 농축하여 EtOH을 제거한 후 동결건조하여 효소 처리된 산삼배양근을 제조하였다.

<비교예 1> 산삼배양근 추출물의 제조

효소처리하지 않은 산삼배양근을 50% 에탄올을 사용하여 추출하여 산삼배양근 추출물을 수득하였다.

<시험예 1> 효소 처리된 산삼배양근 추출물의 사포닌 성분 변화분석

실시예 2에서 제조된 효소 처리된 산삼배양근 추출물과 비교예 1에서 제조된 산삼배양근 추출물을 C18 sep-pak을 이용하여 사포닌만을 분리한 후 TLC 및 HPLC를 측정하였다. TLC 분석에는 TLC용 plate(TLC silica gel 60F, merck)에 분리한 사포닌을 점적한 후 이동상(Chloroform : Methanol : Water=65 : 35 : 10)을 이용하여 물질을 전개한 후 10% 황산 용액을 이용하여 발색한 것으로 결과를 확인하였다. HPLC 분석에는 PDA HPLC system 기기와 Eclipse XDB-C18 column (4.6 X 250 mm， ID 5 ㎛)을 사용하였으며，이동상은 물(H₂0，100%)과 아세토나이트릴(CH₃CN，100%)를 혼합하여 사용하였다. 기울기 용리 (Gradient elution) 비율(물 : 아세토나이트릴)이 75:25, 68:32, 45:55, 40:60, 0:100, 0:100 및 75:25분일 때，각각 0-10, 10-15, 15-20, 20- 25, 25-27, 27- 30 및 30-40로 조절하였다. 이동상의 유속은 1.2 ㎖/min으로 흘려주었으며，UV 탐지기 (UV detector)를 이용하여 203 nm에서 산삼배양근의 성분을 분석하였다.

그 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1은 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물과 산삼배양근 추출물의 진세노사이드 성분의 변화 및 다당류 당지질의 변화를 비교분석한 그래프이다. 여기에서, 검은색 라인은 산삼배양근 추출물이고, 파란색 라인은 효소 처리된 산삼배양근 추출물이며, 분홍색 라인은 진세노사이드 Rg2 표준물질이며, 갈색 라인은 진세노사이드 Re 표준물질이다.

도 1에서 보듯이, 실시예 2에서 제조된 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 효소에 의하여 변환되어 기존의 효소처리를 하지 않은 비교예 1의 산삼배양근에는 없었던 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2와 같은 성분들이 있음을 확인하였다. 이러한 결과로부터 효소 처리된 산삼배양근의 변화된 성분들이 피부 미용 개선에 영향을 미칠 것으로 판단된다.

<시험예 2> 인간 피부 섬유아세포에서의 피부 노화 억제 및 주름 개선 관찰

(1) 세포배양

인간 피부 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast cell)인 HDF-N cell을 Modern Cell & Tissue Technology (MCTT, Seoul, Korea)로부터 구입하여 계대 배양하여 사용하였다. HDF-N 세포를 세포 배양 접시에 부착시키고 펜니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 1% 항박테리아-항진균 용액(PAA, Canada)과 10% FBS (PAA, Canada)를 첨가한 DMEM(PAA, Canada)을 사용하여 배양하였다. 배양액은 2-3 일에 한 번씩 교체하면서 세포 접종시 세포를 혼합한 배지와 Tryphan blue 용액을 1:1로 혼합하여 hemocytometer를 이용하여 tryphan blue에 의해 염색되지 않은 살아 있는 세포를 계수하였다. HDF-N cell의 배양시 습도는 95%, 온도는 37℃를 유지하면서 5% C0₂를 계속 공급하였다.

(2) 세포 증식율 측정

HDF-N cell의 증식 측정은 UVB Peak range 312nm, UV dose : 144 mJ/cm²의 조건으로 HDF-N cell에 UVB를 조사한 후 세포 증식 효과를 확인하였다. 세포 증식률은 단시간에 대량 검색이 가능한 MTT colorimetric assay 방법 (EZ-CyTox, Daeil-Lab Co., Korea)을 사용하여 측정하였다. 35mm 세포 배양 접시에 1.2 x 10³ cells/well로 cell을 분주한 다음 24시간 동안 37℃의 CO₂ incubator에서 배양한 후 UVB를 조사하기 전에 시료 (실시예 2에서 제조된 효소 처리된 산삼배양근 추출물 및 비교예 1에서 제조한 산삼배양근 추출물)을 농도별(1，10 및 100 ㎍/㎖)로 처리하여 3일간 배양하였다. 3 일째 되는 날(72h) 각 well 당 MTT(lO ㎕/well) 시약을 첨가하고 2시간 동안 37℃에서 배양한 후 MTT가 포르마잔(formazan)으로 분해되는 양을 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2는 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물에 의한 인간 피부 섬유아세포의 생존율 측정결과를 나타낸 그래프이다.

도 2에서 보듯이, 실시예 2에서 제조된 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 비교예 1의 일반 산삼배양근 추출물에 비하여 섬유아세포의 증식(Proliferation)을 증가시키는 것으로 확인되었으며, 이는 주름 예방효과의 의미를 가진다. 각 처리군은 3 well씩 3회 반복실험하였으며，시료의 세포 증식효과는 3번 반복 실험의 평균값을 취한 후 아무것도 처리하지 않은 DMEM 용액에 배양한 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.

(3) Type-1 Procollagen 합성 촉진 및 MMP-1 억제 효과 측정

인간 피부 섬유아세포를 35mm 세포 배양 접시에 2 ㎖의 배양액을 넣고 약 1.2 X 10⁵의 농도로 세포를 접종한 후 ，37℃, 5% C0₂ 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후，자외선 B를 144mJ/cm²로 조사한 후，실시예 2의 효소 처리된 산삼배양근 추출물과 비교예 1의 일반 산삼배양근 추출물 각각 1, 10 및 100 ㎍/㎖을 포함한 배지로 교체하여 1 일간 배양하였다. 배양 1 일 후 세포를 회수(hervest)하여 Protein을 분리하고 ELISA 방법을 이용하여 Type-1 Procollagen 및 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 mRNA 발현량을 확인하였다. 그 결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3은 인간 피부 섬유아세포에서 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물에 의한 MMP-1 단백질의 발현을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 4는 인간 피부 섬유아세포에서 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물에 의한 Type-l Procollagen 단백질의 발현을 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 3 및 4에서 보듯이, 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 MMP-1 단백질의 발현을 억제하고, 콜라겐 생합성을 촉진하는 것을 알 수 있었다. 이로부터 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 피부 노화방지 및 주름개선 효과를 가진다는 것을 확인할 수 있다.

<시험예 3> B16FI0 멜라노마 (melanoma) 에 대한 효능 실험

(1) 멜라닌 함량 측정

B16F10 생쥐 유래 멜라노마 세포주 (B16FlO murine melanoma cell line)(ATCC CRL-9475)를 24-웰 플레이트에 1 X 10⁴ 세포/웰로 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 흑색종화(melanogenesis)를 촉진하는 것으로 알려진 alpha-MSH (alpha-melanin stimulating hormone)를 배지에 첨가하였다. 웰당 990 ㎕의 배양액을 매일 갈아주고，농도에 맞춘 10 ㎕의 시료(실시예 2에서 제조된 효소 처리된 산삼배양근 추출물 및 비교예 1 에서 제조된 산삼배양근 추출물)를 3 일간 처리한 후，1 일간 더 배양하였다.

그 후， 배양한 세포에서 배지를 제거한 다음 세포를 회수하고 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 얻었다. 10% DMSO (dimethyl sulfoxide)가 포함된 lN 수산화나트륨 용액을 첨가한 후，60℃에서 2시간 동안 배양하여 멜라닌을 용해시킨 다음 400 내지 405 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 측정하였다.

(2) 세포 생존율 측정

상기 (1)에서 배양한 세포에서 배지를 제거하고, 세포를 10 mM 인산 완충액 (PBS, pH 7.4)으로 세척한 다음 크리스탈 바이올렛 염색제 (Crystal violet 0.1 %, 10% 에탄올, 나머지 PBS)를 200 ㎕를 첨가하여 5분간 상온에서 배양한 후，물로 2회 세척하였다. 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 상온에서 20분간 진탕한 후，590 nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5는 B16F10 생쥐 유래 멜라노마 세포주에서 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물에 의한 멜라닌 함량 및 세포 생존율 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 5에서 보듯이, 본 발명에 따라 얻어진 효소 처리된 산삼배양근 추출물 100 ㎍/ml의 농도에서 40% 정도 멜라닌 생성을 억제시킬 수 있었으며, 세포독성 또한 낮아 우수한 피부 미백용 조성물로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.

<시험예 4> 항산화 활성 측정

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA)의 환원력을 이용하는 상 등의 문헌(Sang S et al., J. Agric. Food Chem. 50(8), p2459- 2463(2002))에 기술된 방법에 따라 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물의 항산화 활성을 측정하였다.

메탄올에 녹인 0.2mM DPPH 용액 180㎕와 증류수 20㎕에 녹인 시료(실시예 2에서 제조된 효소 처리된 산삼배양근 추출물 및 비교예 l에서 제조된 산삼배양근 추출물) 각 1, 10 및 100 ㎍/㎖를 96-웰 마이크로플레이트에 넣고 37℃에서 30분간 배양한 후 환원된 DPPH의 양을 분광광도계(Precision microplate reader; Molecular Devices, VersaMax)를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하여 시료를 가하지 않는 무첨가 대조군과 활성을 비교하였다. 상기 시험은 3회 반복하였으며，그 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6는 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.

도 6에서 보듯이, 본 발명에 따라 제조된 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 용량 의존적으로 우수한 항산화 활성을 나타내는 바, 우수한 피부 미백 및 주름개선 활성을 가질 것으로 판단된다.

<시험예 5> 버섯 유래 티로시나제에 대한 저해활성 측정

이시하마 등의 문헌(Ishihara Y et a1. J. Antibiot(Tokyo). 44(1), p25-32( 1991))에 기재된 활성 실험법을 변형하여 멜라닌 생합성에 관여하는 버섯 유래 티로시나제 저해활성을 측정하였다.

0.3 %의 티로신 용액 50 ㎕(O.lM 인산 완충액 pH 6.8에 용해시킴)와 증류수 50 ㎕에 녹인 시료(실시예 2에서 제조된 효소 처리된 산삼배양근 추출물 및 비교예 1에서 제조된 산삼배양근 추출물) 각 1, 10 및 100 ㎍/㎖를 96-웰 마이크로플리에트에 넣고 버섯 추출 티로시나제 (200U/ml, O.lM 인산 완충액 pH 6.8에 용해시킴) 50 ㎕를 첨가하였다. 37℃에서 10분간 배양한 후，생성된 도파 크롬의 양을 분광광도계(Precision microplate reader; Molecular Devices, VersaMax)를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나제 저해활성은 마즈다 등의 문헌 (Matsuda H. et a1. Biol. Pharm. Bull. 19(1), p153-156(1996))에 따라 하기 수학식 1에 따라 산술하였다. 시료를 가하지 않는 공시험군을 대조군으로 하고, 상기 시험은 3회 반복하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7은 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물의 티로시나제 저해활성 측정결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 본 발명에 따라 제조된 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 용량 의존적으로 티로시나제에 대한 우수한 저해활성을 가지는 것으로 확인되었다. 이로부터 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물이 우수한 미백 활성을 가진다는 것을 알 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인간 피부 섬유아세포에서 콜라겐 생합성을 촉진하고, MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현억제를 통한 피부 노화방지 및 주름개선효과를 나타내며, DPPH 자유 라디칼 소거활성이 우수하여 항산화 효과가 있으며, 티로시나아제 저해효과를 가져 미백효과를 가질 뿐만 아니라 세포 생존율의 변화를 나타내지 않으므로 우수한 안전성(safty)을 나타낸다. 또한 본 발명의 효소 처리된 산삼배양근 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 또는 주름 개선을 위한 조성물.
제 1 항에 있어서,
효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 또는 주름 개선을 위한 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 또는 주름 개선을 위한 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
효소 처리된 산삼배양근 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 또는 주름 개선을 위한 식품 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 효소가 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)로부터 유래된 효소인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 효소 처리된 산삼배양근 추출물이 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물:
(S1) 아스퍼질러스 니거 균주를 고체배양 또는 액체배양하여 조질의 진세노시다아제를 수득하는 단계;
(S2) 상기 수득된 조질의 진세노시다아제에 에탄올, 메탄올, 부탄올 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택된 유기용매를 넣어 효소 단백질을 침전시킨 다음 침전물을 완충용액에 용해시켜 투석하고 이물질을 제거하여 진세노시다아제 농축액을 수득하는 단계; 및
(S3) 상기 진세노시다아제 농축액을 이온교환수지에 로딩한 다음 KCL 또는 NaCL 완충용액으로 용출시켜 수득된 분획을 산삼배양근과 반응시키고 활성을 나타내는 효소 처리된 산삼배양근 추출물을 선별하는 단계.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 효소 처리된 산삼배양근 추출물이 조성물 총 중량을 기준으로 하여 0.01 내지 30 중량%의 양으로 포함된 것을 특징으로 하는 조성물.