KR101483872B1 - 신갈나무 잎 분획물을 포함하는 항주름용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신갈나무 잎의 용매분획물을 유효성분으로 포함하는 항주름용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항주름용 조성물의 유효성분인 신갈나무 잎 분획물이 DPPH 라디칼 소거능, elastase 억제 활성 및 collagenase 억제 활성이 우수하고, MMP-1 생성을 억제하고 pro-collagen 합성을 유의적으로 증가시킬 뿐만 아니라, 종래의 레티노이드에 비하여 피부 부작용이 적고, 경시적인 화학적 변화가 적어 안전성 및 안정성이 우수하므로, 피부노화를 방지하고 주름을 개선, 예방, 방지 또는 치료하는 약제학적 조성물, 화장품학적 조성물, 기능성 식품 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신갈나무 잎 분획물을 포함하는 항주름용 조성물{COMPOSITION FOR ANTI-WRINKLING COMPRISING FRACTIONS FROM LEAVES OF QUERCUS MONGOLICA}

본 발명은 항주름용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 신갈나무 잎 분획물 또는 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항주름용 조성물에 관한 것이다.

피부 노화(skin aging)는 피부 진피층에 존재하는 세포외기질(extracellular matrix)의 구조적인 변화로 발생되는데 구성요소 중 탄력섬유(elastic fiber)의 변성과 교원질(collagen) 양의 감소가 피부의 주름을 야기한다. 또한, 피부의 노화를 이끄는 주요 요인 중에는 collagen의 감소와 관련하여 자외선이나 스트레스에 의한 활성산소의 생성을 들 수 있다. 피부에서의 활성 산소의 생성은 세포막을 공격함으로써 세포에 손상을 입혀 그 기능을 상실하게 한다. 피부세포로써의 기능상실은 피부의 거친 상태를 형성하거나 유지시키고, 윤기를 없애는 결과를 초래함으로써 피부의 주름을 유발하게 된다. 결국, 생체 내 활성산소의 생성은 matrix metalloprotease (MMPs) 유전자와 collagen 분해효소의 연쇄적인 활성화를 유도함으로써 collagen의 구조적인 파괴를 유발하고, 피부의 탄력을 감소시키는 피부주름의 형성을 이끌게 된다. 따라서 피부노화는 collagen 분해효소와 활성산소의 생성억제, collagen의 합성을 촉진시킴으로써 피부노화의 완화 효과를 나타낼 수 있다.

이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 화장료 조성물이 연구되고 있고, 피부의 주름개선 효과는 일부에서 가시적인 성과를 보이고 있다. 현재, 피부 주름개선 화장료에 사용되는 레티노이드에는 레티놀(retinol), 레티날(retinal), 레틴산(retinoic acid), 레티닐 아세테이트(retinyl acetate), 레티닐 리놀리에이트(retinyl linoleate) 및 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate) 등이 있다. 이들 중 레티놀은 인체에 자연적으로 존재하는 내인성 화합물로서 상피 조직의 분화와 성장에 필수적인 물질이며, 레틴산 등의 레티노이드에 비해 매우 높은 안전성을 가지고 있어 피부 주름 개선 화장료의 원료로서 매우 적합하다고 할 수 있다. 미국특허등록 제4,603,146호 및 제4,877,805호에서는 콜라겐 합성과 콜라겐나아제 활성억제에 의한 콜라겐 분해억제에 효과적인 레티놀(비타민 A)을 이용한 주름개선 사례가 있다.

이러한 레티노이드는 피부 주름개선에 효능이 있는 것으로 피부 임상을 통하여 검증되었지만 제품에 처방될 경우 변색, 변취 현상이 발생하고, 소량 사용시에도 피부 자극이 유발되는 부작용이 있으며, 경시적인 변화에 의한 역가 감소와 이에 따른 효과 감소 등이 큰 문제점으로 인식되고 있다. 따라서 최근에는 이러한 레티노이드의 문제점들을 극복하기 위해 천연물 유래 생리 활성 물질들을 이용한 주름개선용 조성물을 개발하는 것이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 신갈나무 잎 분획물을 포함하는 항주름용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 신갈나무 잎의 용매분획물을 유효성분으로 포함하는 항주름용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 용매분획물은

a) 신갈나무의 잎을 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매로 추출하는 단계;

(b) 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 신갈나무 잎 추출물을 얻는 단계; 및

(c) 상기 신갈나무 잎 추출물을 n-헥산, 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하는 단계에 의하여 획득되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 용매분획물은 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 용매분획물은 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

(여기서, R₁은 OH이고, R₂는 OH 또는 H이다)

[화학식 3]

(여기서, R₁은 (6"-O-galloyl)-β-D-glucose 또는 β-D-glucose이고, R₂는 OH 또는 H이며, R₃은 α-L-rhamnose 또는 H이다)

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 화장품학적 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항주름용 조성물의 유효성분인 신갈나무 잎 분획물이 DPPH 라디칼 소거능, elastase 억제 활성 및 collagenase 억제 활성이 우수하고, MMP-1 생성을 억제하고 pro-collagen 합성을 유의적으로 증가시킬 뿐만 아니라, 종래의 레티노이드에 비하여 피부 부작용이 적고, 경시적인 화학적 변화가 적어 안전성 및 안정성이 우수하므로, 피부노화를 방지하고 주름을 개선, 예방, 방지 또는 치료하는 약제학적 조성물, 화장품학적 조성물, 기능성 식품 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 신갈나무 잎의 에틸아세테이트층 분획물에서 분리한 화합물 1 내지 화합물 6의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 신갈나무 잎 추출물과 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성, elastase 및 collagenase 억제 활성 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 화합물 1 내지 화합물 6의 DPPH 라디칼 소거활성, elastase 및 collagenase 억제 활성 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 화합물 4 내지 화합물 6과 다른 플라보노이드 계열 화합물 간의 항산화 활성 비교 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 화합물 1 내지 화합물 6의 MTT assay에 의한 세포독성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 신갈나무 잎 추출물과 분획물의 CCD-986sk 세포 내 UVB-유도된 (A) MMP-1 및 (B) type-1 procollagen의 생성억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 화합물 1 내지 화합물 6의 CCD-986sk 세포 내 UVB-유도된 (A) MMP-1 및 (B) type-1 procollagen의 생성억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 화합물 1의 CCD-986sk 세포 내 UVB-유도된 (A) MMP-1 및 (B) type-1 procollagen 단백질발현 억제 효과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 천연물로부터 주름을 개선하여 피부노화를 방지하는 천연물 소재를 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 신갈나무 잎의 용매분획물 및 이로부터 분리된 화합물이 우수한 DPPH 라디칼 소거능, elastase 억제 활성 및 collagenase 억제 활성을 가지는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신갈나무 잎의 용매분획물을 유효성분으로 포함하는 항주름용 조성물을 제공한다. 본 발명의 신갈나무 잎의 용매분획물은 신갈나무의 잎을 용매로추출하여, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 신갈나무 잎 추출물을 얻은 후, 이를 n-헥산, 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하는 단계에 의하여 획득될 수 있으며. 바람직하게는 에틸아세테이트 분획물일 수 있다.

이 때, 본 발명에서 신갈나무 잎 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서, 신갈나무 잎 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 아세톤을 사용할 수 있다. 또한, 신갈나무 잎으로부터 추출물을 추출하는 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 통하여 추출할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 신갈나무 잎 용매분획물에는 하기의 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

여기서, R₁은 OH이고, R₂는 OH 또는 H이다.

[화학식 3]

여기서, R₁은 (6"-O-galloyl)-β-D-glucose 또는 β-D-glucose이고, R₂는 OH 또는 H이며, R₃은 α-L-rhamnose 또는 H이다.

본 발명에서 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물은 신갈나무 잎의 용매분획물로부터 분리된 것뿐만 아니라 화학적으로 합성된 것도 동등한 항주름 효능을 갖는다는 것은 당업자에게 자명하다. 이때, 신갈나무 잎의 용매분획물로부터 화학식 1 내지 화학식 3의 화합물은 통상적인 화합물의 분리 및 정제 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한, 천연물 분획물로부터 분리된 단일 화합물은 MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectroscopy), EI MS (Electron Ionization Mass Spectroscopy), CI (Chemical Ionization Mass Spectroscopy), FABI (Fast Atom Bombardment Ionization)와 같은 질량분석법과, 적외선 분광법(IR Sectrum), 핵자기공명법(NMR, Nuclear Magnetic Resonance), CD (Circular Dichroism) 등을 이용하여 최종적으로 동정할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 신갈나무 잎으로부터 추출물 및 분획물을 수득하여(실시예 1-2 참조), 상기 추출물 및 분획물의 항주름 효능을 평가한 결과, 신갈나무 잎의 용매분획물, 특히 에틸아세테이트 분획물이 DPPH 라디칼 소거능, elastase 억제 활성 및 collagenase 억제 활성이 우수하고(실시예 2 참조), MMP-1 생성을 억제하고 pro-collagen 합성을 증가시킴을 확인하였다(실시예 5-1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 신갈나무 잎의 에틸아세테이트 분획물로부터 pedunculagin ('화합물 1'), (-)-epigallocatechin ('화합물 2'), (+)-catechin ('화합물 3'), quercetin 3-O-(6"-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside ('화합물 4'), kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside ('화합물 5') 및 kaempferol 3-O-(6"-galloyl)-β-D-glucopyranoside ('화합물 6')를 분리하고(실시예 1-3 참조), 상기 화합물들의 항주름 효능을 평가한 결과, 상기 화합물들이 DPPH 라디칼 소거능, elastase 억제 활성 및 collagenase 억제 활성이 우수하고(실시예 3 참조), MMP-1 생성을 억제하고 pro-collagen 합성을 증가시킴을 확인하였다(실시예 5-2 참조).

따라서, 신갈나무 잎의 용매분획물, 특히 에틸아세테이트 분획물 및 이로부터 분리된 화합물 1 내지 화합물 6은 주름을 개선, 예방, 방지 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이에, 본 발명의 항주름용 조성물은 약제학적 조성물의 형태일 수 있으며, 약제학적 조성물은 유효성분으로서 신갈나무 잎의 용매분획물 또는 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하고 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)는 모두 사용 가능하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구투여를 위한 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 바람직하게는 피부외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 피부 도포, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 항주름용 조성물은 화장품학적 조성물의 형태일 수 있으며, 화장품학적 조성물은 유효성분으로서 신갈나무 잎의 용매분획물 또는 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물에 함유된 화장품학적으로 유효한 담체는 제형에 따라, 당업계에서 통상적으로 이용되는 담체가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 항주름용 조성물은 주름을 예방 또는 개선하는 기능성 식품 조성물의 형태일 수 있으며, 기능성 식품 조성물은 유효성분으로서 신갈나무 잎의 용매분획물 또는 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 기능성 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 분획물 및 화합물의 분리

1-1. 실험준비

본 실험에 사용한 신갈나무(Quercus mongoica)는 2011년 10월 경에 국립수목원에서 채집한 것을 실험재료로 사용하였다.

¹H 및 ¹³C-NMR spectra는 Gemini 2000 (300MHz, 75 MHz)로 측정하였다. Column chromatography 용 충진제는 Sephadex LH-20 (10-25 μm, GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Sweden), ODS-B gel (40-60 μm, Daiso, Osaka, Japan)을 사용하였으며, Thin layer chromatography (TLC) plate는 pre-coated silica gel 60 F₂₅₄ plate (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. 흡광도는 ELISA reader (TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 측정하였고, TLC spot은 UV 자외선 (280 nm)으로 검출한 뒤, FeCl₃ 및 10% H₂SO₄를 뿌린 후 가열하였다.

1-2. 신갈나무 잎 분획물 추출

건조된 신갈나무 잎 (4.2 kg)을 80% 아세톤으로 실온에서 3회 추출하고, 추출된 추출액은 여과한 후 감압농축하여 신갈나무 잎 추출물(400 g)을 얻었다. 그 중 80% 아세톤 추출물 300g을 극성 차를 이용해 서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다. 추출물과 n-헥산(hexane)을 1:1 비율로 분획 깔대기에 넣고 n-헥산층과 H₂O층으로 분획하였고, n-헥산층은 감압, 농축하여 n-헥산 분획물 22.7g을 얻었다. H₂O층은 다시 에틸아세테이트(ethyl acetate)와 혼합하여 상기한 과정과 동일한 과정을 통하여 에틸아세테이트층 35.5g과 H₂O층 240g의 분획물을 각각 얻었다. 이들 분획물들은 감압, 농축 후 동결 건조하여 용매를 제거한 후 실험에 사용하였다.

1-3. 화합물 분리 및 구조동정

에틸아세테이트층 50g은 MCI-gel CHP 20P (0→100% MeOH, gradient system)와 ODS-B gel in MPLC (5mL/min, 280nm) (0→100% MeOH, gradient system)를 실시하여 총 5개의 서브-분획(sub-fraction), 즉, 분획 1(Fr. 1)(4.8 g), 분획 2(Fr. 2)(5.4 g), 분획 3(Fr. 3)(7.9 g), 분획 4(Fr. 4)(8.1 g), 분획 5(Fr. 5) (5.3 g)로 나누었다. 분획 1(Fr. 1)은 Sephadex LH-20 (2 kg, 10 × 80 cm), (0→100% MeOH, gradient system)을 실시하여 최종적으로 pedunculagin ('화합물 1', 470 mg)과 (-)-epigallocatechin ('화합물 2', 105 mg)을 얻었다. 또한, 분획 2(Fr. 2)는 Sephadex LH-20 (0→100% MeOH, gradient system)과 ODS-B gel in reversed-phase MPLC (5mL/min, 280nm) (0→100% MeOH, gradient system)를 실시하여 최종적으로 (+)-catechin ('화합물 3', 59 mg)을 얻었고, 분획 3(Fr. 3)은 ODS-B gel with a H2O-MeOH (1:0 to 0:1) gradient, YMC-ODS gel (12 nm, 600 g, 5 × 60 cm) with a H2O-MeOH (8:2 to 0:1) gradient를 실시하여 quercetin 3-O-(6"-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside ('화합물 4', 56 mg)와 kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside ('화합물 5', 98 mg)를 최종적으로 얻었다. 분획 4(Fr. 4)는 ODS-B gel과 YMC-ODS gel를 반복 실시하여 kaempferol 3-O-(6"-galloyl)-β-D-glucopyranoside ('화합물 6', 378 mg)를 최종적으로 얻었고, 상기 화합물 1 내지 화합물 6의 구조를 도 1에 나타내었다.

상기에서 분리한 화합물 1 내지 화합물 6의 ¹H 및 ¹³C-NMR spectra를 측정하였고, 그 결과는 하기와 같다.

① 화합물 1 : Pedunculagin (연한 갈색의 무정형 분말(Light brown amorphous powder))

¹H-NMR (300 MHz, Me₂CO-d₆): δ α-glc 6.32, 6.51, 6.59, 6.65 [2H in total, HHDP-H], 5.45 (1/2H, d, J=3.6 Hz, H-1), 5.04 (1/2H, dd, J=3.6, 10.0 Hz, H-2), 5.43 (1/2H, t, J=10.0 Hz, H-3), 5.06 (1/2H, t, J=10.0 Hz, H-4), 4.59 (1/2H, ddd, J=1.5, 6.6, 10.0 Hz, H-5), 5.21 (1/2H, dd, J=6.9, 13.0 Hz, H-6a), 3.75 (1/2H, dd, J=1.5, 13.0 Hz, H-6b), β-glc 6.32, 6.56, 6.59, 6.66 [2H in total, HHDP-H], 5.04 (1/2H, d, J=7.8 Hz, H-1), 4.83 (1/2H, dd, J=8.0, 9.0 Hz, H-2), 5.10 (1/2H, d, J=9.0, 10.0 Hz, H-3), 5.05 (1/2H, t, J=10.0 Hz, H-4), 4.19 (1/2H, ddd, J=0.9, 6.6, 10.0 Hz, H-5), 5.26 (1/2H, dd, J=6.6, 13.0 Hz, H-6a), 3.82 (1/2H, dd, J=0.9, 13.0 Hz, H-6b).

② 화합물 2 : (-)-Epigallocatechin (흰색의 무정형 분말(White amorphous powder))

¹H-NMR (300 MHz, MeOH-d₆): δ 6.51 (2H, s, H-2', 6'), 6.13 (1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 5.95 (1H, d, J=2.4 Hz, H-6), 4.68 (1H, d, J=6.9 Hz, H-2), 4.01 (1H, m, H-3), 2.85 (1H, dd, J=5.7 Hz, 16.2, H-4eq), 2.58 (1H, dd, J=7.5, 16.2, Hz, H-4ax).

③ 화합물 3 : (+)-Catechin (흰색의 무정형 분말(White amorphous powder))

¹H-NMR (300 MHz, MeOH-d₆): δ 6.79 (1H, d, J= 1.8 Hz, H-2'), 6.71 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5'), 6.67 (1H, dd, J=1.8, 8.1 Hz, H-6'), 5.88 (1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 5.81 (1H, d, J=2.4 Hz, H-6), 4.52 (1H, d, J=7.5 Hz, H-2), 3.93 (1H, m, H-3), 2.80 (1H, dd, J=5.4 Hz, 16.2, H-4eq), 2.46 (1H, dd, J=8.1, 16.2, Hz, H-4ax).

④ 화합물 4 : Quercetin 3-O-(6"-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside (노란색의 무정형 분말(Yellow amorphous powder))

¹H-NMR (300 MHz, MeOH-d₆): δ 7.53 (1H, dd, J=9.0, 2.1 Hz, H-6'), 7.53 (1H, d, J=1.8 Hz, H-2'), 6.90 (2H, s, H-2''', 6'''), 6.71 (1H, d, J=9.0 Hz, H-5'), 6.32 (1H, d, J=2.1 Hz, H-8), 6.16 (1H, d, J=2.1 Hz, H-6), 5.19 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1''), 4.33 (1H, dd, J=12.0, 1.8 Hz, H-6''a), 4.26 (1H, dd, J=12.0 Hz, H-6''b).

¹³C-NMR (75 MHz, MeOH-d₆): δ 63.1 (C-6''), 69.7 (C-4''), 74.4 (C-2''), 74.6 (C-5''), 76.9 (C-3''), 93.8 (C-6), 98.7 (C-8), 103.3 (C-1''), 104.4 (C-10), 109.0 (C-2'", 6'"), 114.9 (C-2'), 116.1 (C-5'), 120.6 (C-1'"), 121.7 (C-6'), 122.4 (C-1'), 134.4 (C-3), 137.8 (C-4'"), 144.3 (C-3'), 144.4 (C-3'", 5'"), 148.3 (C-4'), 156.9 (C-9), 157.5 (C-2), 161.5 (C-5), 164.4 (C-7), 166.0 (C=O), 178.0 (C-4).

⑤ 화합물 5 : Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside (노란색의 무정형 분말(Yellow amorphous powder))

¹H-NMR (300 MHz, MeOH-d₆): δ 8.25 (2H, d, J=9.0 Hz, H-2', 6'), 7.10 (2H, d, J=9.0 Hz, H-3', 5'), 6.58 (1H, d, J=2.1 Hz, H-8), 6.38 (1H, d, J=2.1 Hz, H-6), 5.92 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1''), 5.41 (1H, brs, H-1'''), 1.16 (3H, d, J=6.3 Hz, H-6''').

¹³C-NMR (75 MHz, MeOH-d₆): δ 16.8 (C-6'''), 61.4 (C-6''), 68.3 (C-5'''), 70.6 (C-4''), 70.9 (C-2'''), 71.3 (C-3'''), 72.6 (C-4'''), 76.7 (C-2''), 77.5 (C-3''), 78.2 (C-5''), 93.6 (C-8), 98.5 (C-6), 99.1 (C-1'''), 100.9 (C-1''), 104.6 (C-10), 115.0 (C-3', 5'), 121.8 (C-1'), 130.9 (C-2', 6'), 133.2 (C-3), 156.9 (C-9), 157.1 (C-2), 160.0 (C-4'), 161.8 (C-5), 162.6 (C-7), 177.9 (C-4).

⑥ 화합물 6 : Kaempferol 3-O-(6''-galloyl)-β-D-glucopyranoside (노란색의 무정형 분말(Yellow amorphous powder))

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 7.90 (2H, d, J=8.7 Hz, H-2', 6'), 6.90 (2H, s), 6.75 (2H, d, J=9.0 Hz, H-3', 5'), 6.40 (1H, d, J=2.1 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J=2.1 Hz, H-6), 5.43 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1''), 4.24 (1H, d, J=11.4 Hz, H-6''a), 4.14 (1H, dd, J=2.1, 11.4 Hz, H-6''b).

¹³C-NMR (75 MHz, MeOH-d₆): δ 64.0 (C-6''), 70.5 (C-4''), 75.2 (C-2'', 5''), 77.2 (C-3''), 95.5 (C-8), 99.9 (C-6), 102.5 (C-1''), 105.2 (C-10), 109.7 (C-2''', 6'''), 116.2 (C-3', 5'), 120.6 (C-1'''), 121.9 (C-1'), 132.0 (C-2', 6'), 134.4 (C-3), 139.4 (C-4'''), 146.5 (C-3''', 5'''), 157.6 (C-2), 158.0 (C-9), 160.9 (C-4'), 162.1 (C-5), 165.2 (C-7), 166.9 (C=O), 178.5 (C-4).

실시예 2. 신갈나무 잎의 분획물의 항주름 효능 평가

2-1. 프리 라디칼 소거능 비교

실시예 1-2에서 획득된 80% 아세톤 추출물, n-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 프리 라디칼 소거능을 측정하여 비교하였다.

보다 구체적으로, 프리 라디칼 소거작용의 측정은 Blois et al. 의 방법에 의하여 실시하였다. 즉 시료를 각 농도별로 조제한 용액 100 μl (control : 99.5% ethanol)에 0.1 mM DPPH 용액 (99.5% ethanol) 1.9 ml을 가하였고, 각 시료는 5가지 농도로 조제하였다. Vortex mixer로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 incubation 시킨 후, spectrophotometer를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 에틸아세테이트 분획물이 다른 분획물 또는 추출물과 비교할 때, 가장 강력한 DPPH 라디칼 소거능을 가짐을 확인할 수 있었다.

2-2. 엘라스타제 억제 활성의 측정

실시예 1-2에서 획득된 80% 아세톤 추출물, n-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 엘라스타제(elastase) 억제 활성을 하기와 같이 측정하였다 (Cannell et al., 1988).

즉, 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. 보다 구체적으로, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5 mL씩 시험관에 취하고, 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (2.5 U/mL)용액 0.5 mL을 가한 후 기질로 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(0.5mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였고, Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

효소활성 저해(%) = (1-시료첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도) × 100

도 2에 나타낸 바와 같이, 에틸아세테이트 분획물이 다른 분획물 또는 추출물과 비교할 때, 가장 강력한 엘라스타제(elastase) 억제 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

2-3. 콜라게나제 억제 활성의 측정

실시예 1-2에서 획득된 80% 아세톤 추출물, n-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 콜라게나제(Collagenase) 억제 활성을 van Wart의 실험법에 의해 측정하였다 (van Wart and Steinbrink, 1981).

즉, 반응물은 0.05M tricine 버퍼(pH 7.5) 0.8 mL와 기질 0.05 mL [0.2 mM FALGPA (N-(3-[2-furyl]acryloyl)-Leu-Gly-Pro-Ala)]를 시료 0.05 mL와 혼합하여 collagenase 0.05 mL (3 mg/mL)과 20℃에서 18시간 반응시킨 뒤 1 N 아세트산으로 반응정지 시켰다. Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

효소활성 저해(%) = (1-시료첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도) × 100

도 2에 나타낸 바와 같이, 에틸아세테이트 분획물이 다른 분획물 또는 추출물과 비교할 때, 가장 강력한 콜라게나제(Collagenase) 억제 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

상기 실시예 2의 결과로부터, 신갈나무 잎의 용매분획물, 특히 에틸아세테이트 분획물은 주름을 개선, 예방, 방지 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 화합물 1 내지 화합물 6의 항주름 효능 평가

3-1. 프리 라디칼 소거능 비교

실시예 1-3을 통해 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 화합물 1 내지 화합물 6의 프리 라디칼 소거능을 실시예 2-1의 방법과 동일한 방법으로 측정하여 비교하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 한편, 양성대조약물로는 L-ascorbic acid를 5가지 농도로 조제하여 측정하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 중에서 화합물 1(pedunculagin)은 12.5 μM에서 92.15±2.07%의 저해율을 나타내어 가장 강력한 DPPH 라디칼 소거능을 보임을 확인할 수 있었고, galloyl group을 포함한 플라보노이드 화합물 4와 화합물 6은 flavan 3-ols (화합물 2와 화합물 3) 보다 강력한 억제 효과를 보임을 확인할 수 있었다.

추가적으로, 화합물 1 내지 화합물 6 중, 화합물 4 내지 화합물 6과 다른 플라보노이드 계열 화합물과의 라디칼 소거능을 비교하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 4 내지 화합물 6이 다른 플라보노이드 계열 화합물에 비해 항산화 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.

3-2. 엘라스타제 억제 활성의 측정

실시예 1-3을 통해 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 화합물 1 내지 화합물 6의 엘라스타제(elastase) 억제 활성을 실시예 2-2의 방법과 동일한 방법으로 측정하여 비교하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 중에서 화합물 1(pedunculagin)은 12.5 μM에서 19.19±2.47%의 저해율을 나타내어 가장 강력한 엘라스타제(elastase) 저해 활성을 나타내었고, 그 다음으로 화합물 5가 강력한 엘라스타제(elastase) 저해 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

3-3. 콜라게나제 억제 활성의 측정

실시예 1-3을 통해 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 화합물 1 내지 화합물 6의 콜라게나제(collagenase) 억제 활성을 실시예 2-3의 방법과 동일한 방법으로 측정하여 비교하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 중에서 화합물 1(pedunculagin)은 12.5 μM에서 19.69±0.84%의 저해율을 나타내어 가장 강력한 콜라게나제(collagenase) 저해 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 세포 독성 실험

세포 독성 측정에 사용된 세포주 (CCD-986sk cell)는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포 독성 측정 및 배양을 위해 dulbecco's modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin, 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co. (Grand Island, USA)에서 구입하였으며, haemacytometer (Marienfeld, Germany), 3-[4,5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyl- tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

CCD-986sk를 96 well plate에 5×10⁴cells/well이 되게 0.18 mL분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 mL첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 48시간 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15 mL를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

실시예 5. MMP -1 및 Pro - collagen 생합성 측정

5-1. 신갈나무 잎 추출물 및 분획물의 MMP -1 및 Pro - collagen 활성 비교

실시예 1-2에서 획득된 80% 아세톤 추출물, n-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 MMP-1 및 Pro-collagen 생성량을 하기와 같이 측정하였다.

CCD-986sk 세포에 각 시료를 농도별로 처리했을 때 MMP-1 및 type-1 procollagen의 합성량을 측정하기 위해 Procollagen Type-1 C-Peptide (PIP) EIA kit를 TAKARA Bio Inc. (Shiga, Japan)에서 구입하여 이용하였다. 이때, 각 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

96-well plate에 각 well당 1×10⁴cells/well 세포가 되도록 심어준 후 24시간을 안정화하였다. 이 후, 배양된 배지를 제거하고 CCD-986sk 세포에 UVB 20 mJ/cm²를 조사한 뒤, 상기 추출물과 분획물을 농도별(6.25-25 μg/mL)로 처리한 후 48시간을 배양하였다. 각 well로부터 상등액을 회수하여 MMP-1 및 procollagen Type-1 C-Peptide (PIP) EIA kit의 각 well에 첨가한 후, 제조사의 방법에 따라 MMP-1 및 procollagen type 1의 총 양을 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 에틸아세테이트 분획물 처리군은 UVB-유도된 MMP-1 production 측정에서 6.25 μg/mL에서 9%, 12.5 μg/mL에서 31%, 25 μg/mL에서 81%의 저해율을 보였고(도 6의 A 참조), UVB-유도된 type-1 procollagen synthesis 측정에서는 6.25, 12.5 및 25 μg/mL의 농도에서 각각 66%, 90%, 93%의 합성율을 보임을 확인할 수 있었다(도 6의 B 참조). 이러한 MMP-1 및 type-1 procollagen에서 나타난 에틸아세테이트 분획물의 결과는 실시예 2의 DPPH, elastase and collagenase assay의 결과와 매우 유사한 패턴을 보임을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 에틸아세테이트 분획물의 강력한 MMP-1 저해효과는 폴리페놀 함량과 관련이 있음을 알 수 있었다.

5-2. 화합물 1 내지 화합물 6의 MMP -1 및 Pro - collagen 활성 비교

실시예 5-1과 동일한 방법으로 실시예 1-3을 통해 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 화합물 1 내지 화합물 6의 MMP-1 및 Pro-collagen 생성량을 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 UVB-유도된 MMP-1 세포 내 6.25, 12.5 및 25 μM의 농도로 처리하여 각각 37%, 60%, 80%의 저해율을 보였고, Galloyl flavonol glycosides (화합물 4와 화합물 6)는 각각 UVB-유도된 MMP-1 세포 내 12.5 μg/mL에서 46%와 22%, 25 μg/mL에서 69%와 72%의 저해율을 보임을 확인할 수 있었다(도 7의 A 참조). 또한 type-1 procollagen production level은 6.25 및 12.5 μM의 농도로 화합물 1을 처리 시, 46% 및 91%로 합성율이 증가함을 확인할 수 있었다(도 7의 B 참조).

5-3. 단백질 발현 측정

추가적으로, MMP-1 및 type-1 procollagen 활성을 확인하기 위하여 CCD-986sk세포를 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 후 48시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 화합물 1을 농도별(6.25-25 μg/mL)로 처리한 배지로 48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. Lysis buffer를 이용하여 CCD-986sk 세포를 분해하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 정량하여 30 μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE gel에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. MMP-1 및 type-1 procollagen은 각각의 1차 항체(Santacruz (CA, USA))를 1:1000으로 희석하여 4℃에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP의 각각의 2차 항체(Santacruz (CA, USA))를 1:1,000로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 washing한 뒤 LAS 4,000 image analyzer (Fugifilm life science, Tokyo, Japan) 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 농도의존적으로 MMP-1 발현을 상당히 저해하였고 type-1 procollagen 발현 역시 농도 의존적으로 약간씩 증가시킴을 확인할 수 있었다.

탄닌의 비특이적 단백질 결합 활성은 유사한 행동방식을 가지는 화합물로 그것을 다루는데 가장 초점이 맞춰져 있는바, 상기 결과로부터, 가수분해형 탄닌인 화합물 1(pedunculagin)이 UVB-유도된 MMP-1 발현으로부터 사람의 섬유아세포를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.

한편, 상기 실시예에서의 결과 통계처리는 SPSS 10.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA : analysis of variance)프로그램을 이용하여 t-test를 이용하여 통계적 유의수준 p<0.05 에서 검증하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 항주름용 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   

   
   (여기서, R₁은 OH이고, R₂는 OH 또는 H이다)
   [화학식 3]
   

   

   
   (여기서, R₁은 (6"-O-galloyl)-β-D-glucose 또는 β-D-glucose이고, R₂는 OH 또는 H이며, R₃은 α-L-rhamnose 또는 H이다)
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장품학적 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.

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