KR101800498B1 - 미성숙 사과 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 화장료 조성물, 약학 조성물, 식품 조성물 또는 의약외품 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명의 상기 조성물은 MMP-1 저해 및 콜라겐 합성 촉진 활성으로 인하여 인체에 독성 없이 피부 주름, 피부 탄력 저하 및 피부 노화의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미성숙 사과 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 조성물{Composition for improving skin wrinkle comprising extract or compounds derived from unripe apple}
본 발명은 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 화장료 조성물, 약학 조성물, 식품 조성물 또는 의약외품 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부 환경으로부터 인체를 보호하고, 내부의 수분 및 유용 성분이 밖으로 유출되는 것을 막아주는 장벽기능, 체온조절, 배설 등 다양한 생리적 기능을 담당하고 있는 중요한 기관이다. 일반적으로 피부 노화의 주요 원인은 나이의 증가와 외부 인자들인 것으로 알려져 있다.
콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로써 세포 외 간질에 존재하고, 중요한 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 및 세포 접착의 지탱 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선과 같은 외부 자극에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 노화가 되면 콜라겐 자체의 합성이 줄어들 뿐 아니라 콜라겐을 포함한 결합조직을 분해하는 MMPs(기질 금속 단백질 분해 효소, matrix metalloproteinase)의 활성이 증가하여 피부조직 내의 콜라겐 분해를 촉진시켜 콜라겐의 함량이 저하되는 원인이 되기도 한다고 알려져 있다. 이러한 MMPs를 억제하는 내재성 억제제인 TIMP(Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinase)가 존재하는데 MMPs와 TIMP의 활성이 균형을 이루어 적절히 조절이 될 때에 생리적인 조직의 재구성과 항상성이 잘 유지되게 된다.
TIMP는 TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, 및 TIMP-4의 4종이 알려져 있는데, 이 중에서 특히 TIMP-1는 MMP-1 및 젤라티나아제(MMP-2, MMP-9) 등의 MMPs의 활성부위에 결합하여 그들의 분해능을 거의 비가역적으로 저해한다.
즉, 노화에 따른 피부 주름 발생의 중요한 원인이 되는 피부 속 콜라겐은 합성력이 저하되는 것뿐 아니라 분해가 촉진되는데 이 항상성의 주요 기능을 MMPs 및 TIMP가 담당하고 있으며 MMPs는 콜라겐을 포함한 결합조직을 분해함으로써 피부 노화를 촉진시키며 TIMP-1이 이를 저해하는 작용을 수행하게 되는 것이다.
종래에는 콜라겐의 피부 보습효과로부터 화장품에 콜라겐 자체를 배합한 제품들이 출시되어 있으나, 이들 화장품은 콜라겐을 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자인 콜라겐의 경피 흡수에 의한 주름 개선 작용을 기대하기 어려우므로, 본질적인 피부 기능 개선이라 말하기 어렵다. 이에 따라, 피부 세포로부터 콜라겐 합성을 촉진시키는 방법에 대한 연구가 요구된다.
한편, 종래 콜라겐 합성을 촉진시키는 물질로는 레티노산(retinoic acid), TGF(transforming growth factor), 동물 태반 유래 단백질, 베툴린산(betulinic acid), 클로렐라 추출물 등이 알려져 있으나, 피부 적용시 자극 및 발적 등과 같은 안전성의 문제로 사용이 제한되거나, 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성을 촉진하여 피부 기능을 개선하는 효과를 기대할 수 없다. 따라서, 생체에 안전하면서도 기존의 콜라겐 합성을 촉진하는 물질보다 효과가 높은 새로운 콜라겐 합성 촉진제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 사과는 기원전부터 유럽과 중앙아시아에서 재배되기 시작하여 전세계적으로 널리 생산되고 있는 주요 과실이다. 우리나라에서는 연간 약 50만 톤의 사과가 생산되고 있으며, 재배 과정 중 5월 ~ 6월에 실시하는 적과(摘果) 작업에서 전체의 20 ~ 30% 정도의 미성숙 사과가 적과되고 있다. 각종 과채류에 존재하는 페놀성 화합물들은 뛰어난 항비만, 항염증, 항알러지, 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려져 있고, 사과에는 폴리페놀, 식이섬유, 비타민 C, 당, 칼륨 등의 다양한 기능성 성분 및 영양성분이 풍부하여 심혈관질환, 뇌질환 및 암 등의 예방에 효과가 있다고 보고된 바 있다. 특히 미성숙 사과에는 성숙사과에 비하여 항산화 성분인 폴리페놀류의 함량이 10배 이상 높고 유기산, 아미노산의 함량 역시 많다고 알려져 있다. 이와 같이 미성숙 사과는 폴리페놀 성분의 함량이 높음에도 불구하고 현재 대부분 폐기 되어지는 경우가 많다.
대한민국 등록특허 제1065558호 "미숙사과 추출물을 함유한 피부상태 개선용 약제학적 조성물"은 장경 1~2㎝ 인 미숙사과의 에탄올 추출물이 완숙사과에 비하여 활성성분 함량이 높고 미백효과가 우수하여 이를 피부상태 개선용 약제로 이용할 수 있음을 제시하고 있다.
또한 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0108930호는 "항산화제 및 피부화장료"에 관한 것인데, 농약과 비료를 의도적으로 사용하지 않고 재배된 사과의 적과 과실의 착즙물 또는 추출물이 주름의 증가나 탄력성의 저하 등의 피부 노화, 색소 침착, 건조, 피부의 염증 등의 개선 또는 치료에 사용될 수 있음을 보고하였다.
그러나, 미성숙 사과 추출물의 피부 주름 개선 효능에 대하여 직접적으로 보고된 바는 전혀 없었다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 천연에 존재하는 독성이 없고 피부 주름 개선 효과가 우수한 물질에 관하여 연구를 수행하였으며, 이에 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물이 피부 주름 개선 효능을 나타냄을 규명하여, 이를 활용한 주름 개선용 화장료 조성물을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 하나의 목적은 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 화장료 조성물, 약학 조성물, 식품 조성물 또는 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 하기 화학식 1, 3, 4 및 6으로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 화장료 조성물, 약학 조성물, 식품 조성물 또는 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure 112014098080723-pat00001
(R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))
[화학식 3]
Figure 112014098080723-pat00002
(R = Glc(β-D-글루코피라노실, β-D-glucopyranosyl))
[화학식 4]
Figure 112014098080723-pat00003
(R = H)
[화학식 6]
Figure 112014098080723-pat00004
(R1 = H; R2 = H)
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "미성숙 사과"는 완숙하지 않은 사과로서 개화 수정 후 2~3주 후에 적과된 사과인 것을 의미한다. 미성숙사과에는 성숙사과에 비하여 항산화 성분인 폴리페놀류의 함량이 10배 이상 높고 유기산, 아미노산의 함량 역시 많다고 알려져 있는데, 주름 개선을 위한 화장료 조성물의 원료로 적용된 예는 아직 보고된 바 없다.
본 발명에서 상기 미성숙 사과로부터 분리된 화합물은 하기 화학식 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 중 하나일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112014098080723-pat00005
(R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))
[화학식 2]
Figure 112014098080723-pat00006
(R = Rha(α-L-람노피라노실, α-L-rhamnopyranosyl))
[화학식 3]
Figure 112014098080723-pat00007
(R = Glc(β-D-글루코피라노실, β-D-glucopyranosyl))
[화학식 4]
Figure 112014098080723-pat00008
(R = H)
[화학식 5]
Figure 112014098080723-pat00009
(R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))
[화학식 6]
Figure 112014098080723-pat00010
(R1 = H; R2 = H)
[화학식 7]
Figure 112014098080723-pat00011
(R1 = CH3; R2 = OH)
[화학식 8]
Figure 112014098080723-pat00012
(R1 = H; R2 = OH)
그에 따라, 본 발명에서는 상기 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물이 MMP-1 저해능 및 타입-1-콜라겐 생합성 활성을 통하여 주름 개선 용도를 가짐을 새롭게 밝혔다.
본 발명의 일실시예에서는, 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 주름 개선 효능을 확인하기 위하여 화학식 1 내지 8의 MMP-1 저해능 및 타입-1-콜라겐 생합성 활성을 측정하였고, 상기 8종의 화합물은 MMP-1을 효과적으로 저해하고(표 3), 그 중에서 특히 상기 화합물 1, 3, 4 및 6은 타입-1-콜라겐의 생합성을 촉진시킴을 확인하였다(도 2).
본 발명에서 용어, "추출물"은 상기 미성숙 사과의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명의 상기 미성숙 사과의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 미성숙 사과를 추출하는 데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부탄올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게, 물, 저급알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 미성숙 사과를 추출하는 용매로 보다 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 미성숙 사과를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올, 부탄올 등의 극성 용매; 헥산 (Hexane), 에틸 아세테이트 (Ethyl acetate), 클로로포름 (Chloroform), 디클로로메탄 (Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다. 본 발명에서 분획 용매로 보다 바람직하게는 에틸 아세테이트를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 에탄올을 이용하여 미성숙 사과의 에탄올 추출물을 제조하였고, 상기 에탄올 추출물을 다시 n-헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올로 분획하여 미성숙사과 분획물을 제조하였다(실시예 1).
본 발명에서는, 상기 미성숙 사과 추출물로부터 분리된 화합물의 주름 개선 효과를 확인하였는데, 상기 화합물은 이에 제한되지는 않으나, 상기 화학식 1 내지 8로 구성된 군에서 선택된 화합물을 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 화학식 1, 3, 4 및 6으로 구성된 군에서 선택된 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 미성숙 사과 에탄올 추출물의 에틸 아세테이트 분획물로부터 피부 주름 개선 효능을 갖는 8종의 유효 화합물을 분리하였다(실시예 1).
구체적으로, 8종의 유효 화합물은 화학식 1의 레이노트린(Reynoutrin), 화학식 2의 쿼시트린(Quercitrin), 화학식 3의 이소쿼시트린(Isoquercitrin), 화학식 4의 플로리진(Phloridzin), 화학식 5의 플로레틴-2'-O-자일로글루코사이드 (Phloretin-2'-O-xyloglucoside), 화학식 6의 5-O-p-쿠마로일퀴닉산(5-O-p-coumaroylquinic acid), 화학식 7의 클로로겐산 메틸에스테르(Chlorogenic acid methyl ester) 및 화학식 8의 클로로겐산(Chlorogenic acid)을 포함한다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 8종의 유효 화합물이 MMP-1을 효과적으로 저해하여(표 3), 피부 주름의 예방 또는 개선을 위해 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "피부 주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다. 본 발명에서는, 타입-1-콜라겐 생합성 활성과 MMP-1 저해능을 측정하는 것을 통하여 상기 주름 개선 효과를 확인하였다.
상기 콜라겐(collagen)은 결합 조직의 주성분이며 뼈와 피부에 주로 분포하는 성분으로, 특히 피부의 구조와 형태를 유지하고 단단한 강도와 탄력을 제공하는 경단백질이다. 피부가 노화되거나 자외선, 열 등에 노출이 되면 콜라겐 합성능력이 떨어지고 콜라겐 양이 급속히 감소하게 된다. 콜라겐 양이 줄어들게 되면, 근육의 형태를 유지하지 못하고 이른바 주름이 생기게 된다. 또한 MMP-1은 콜라겐을 포함한 결합조직을 분해함으로써 피부 노화를 촉진한다. 따라서, MMP-1 활성을 저해하고, 콜라겐 합성을 촉진시키면 주름이 개선되는 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물 8종의 MMP-1 저해 효능(표 1 내지 3) 및 상기 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 및 화합물 1, 3, 4 및 6의 타입-1-콜라겐 생합성 촉진 효과(표 5, 6 및 도 2)를 통하여 주름 개선 효과를 확인하였다.
본 발명에서 용어, "화장료 조성물"은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선 스크린 크림 또는 선오일 등으로 제형화 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1, 3, 4 및 6으로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는, 화합물 1, 3, 4 및 6이 MMP-1을 저해함과 동시에(표 3), 타입-1-콜라겐의 생합성을 현저하게 촉진시켜 (도 2), 피부 주름의 예방 또는 개선을 위해 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기 화합물, 이의 주름 개선 용도 및 화장료 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 약학 조성물을 제공한다.
상기 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물 및 화합물, 및 이들의 주름 개선 용도는 상기에서 설명한 바와 같으며, 본 발명의 상기 유효 성분은 주름 개선을 위한 의약품에 적용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1, 3, 4 및 6으로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "약학 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 혀용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로 투여 개체의 몸무게 1kg 당 일반적으로 1일 0.01mg 내지 5000mg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물 8종의 MMP-1 저해 효능(표 1 내지 3) 및 상기 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 및 화합물 1, 3, 4 및 6의 타입-1-콜라겐 생합성 촉진 효과(표 5, 6 및 도 2)를 통하여 이를 주름 개선용 약학 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 또는 피부 주름 예방 또는 개선 효과를 나타내는 기타 약학적 활성 화합물과 결합하여 또는 적당한 집합을 이루어 사용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물 및 화합물, 및 이들의 주름 개선 용도는 상기에서 설명한 바와 같으며, 본 발명의 상기 유효 성분은 주름 개선을 위한 식품에 적용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1, 3, 4 및 6으로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "식품 조성물"은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품 조성물의 제형 또한 식품 조성물로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품 조성물은 피부 주름 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
구체적으로, 상기 식품은 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 주름 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물으로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 피부 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 식품 조성물의 총중량 대비 0.00001 내지 10 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물 8종의 MMP-1 저해 효능(표 1 내지 3) 및 상기 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 및 화합물 1, 3, 4 및 6의 타입-1-콜라겐 생합성 촉진 효과(표 5, 6 및 도 2)를 통하여 이를 주름 개선용 식품 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물 및 화합물, 및 이들의 주름 개선 용도는 상기에서 설명한 바와 같으며, 본 발명의 상기 유효 성분은 주름 개선을 위한 의약외품에 적용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1, 3, 4 및 6으로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 주름 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "의약외품 조성물"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 구체적으로 피부 외용제 또는 개인위생용품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 피부 탄력 개선 또는 주름 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 마치현 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱,향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 마스크 또는 연고제가 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 피부 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 의약외품 조성물의 총중량 대비 0.00001 내지 10 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물 8종의 MMP-1 저해 효능(표 1 내지 3) 및 상기 미성숙 사과 추출물, 이의 분획물 및 화합물 1, 3, 4 및 6의 타입-1-콜라겐 생합성 촉진 효과(표 5, 6 및 도 2)를 통하여 이를 주름 개선용 의약외품 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 MMP-1 저해 및 콜라겐 합성 촉진 활성으로 인하여 인체에 독성 없이 피부 주름, 피부 탄력 저하 및 피부 노화의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 미성숙 사과(A) 및 성숙 사과(B)로부터 분리한 화합물 1 내지 8의 HPLC 분석을 나타낸 도이다.
도 2는 화합물 1 내지 8의 타입-1-콜라겐 합성 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 미성숙 사과로부터 활성 물질의 분리
1-1: 미성숙 사과 추출물 및 분획물의 제조
미성숙 사과로부터 분리한 화합물의 MMP-1 저해능 및 타입-1-콜라겐 생합성 촉진 활성을 확인하기 위하여, 미성숙 사과로부터 추출물 및 이의 분획물을 제조하였다.
개화 수정 후 2~3주 후에 적과된 사과인 미성숙 사과를 70% 에탄올(EtOH)로 추출하였고, 70% 에탄올 추출물을 얻었다.
또한, 상기 추출물에서 활성 화합물을 분리, 정제하기 위하여 추출물을 물에 현탁한 후, n-헥산(n-hexane), 에틸 아세테이트(EtOAc) 및 n-부탄올(n-BuOH)을 이용하여 유기용매 분획을 실시하여 각 분획물을 얻었다.
상기 분획물 중 실시예 2에 따라, MMP-1 저해능을 가장 강하게 나타낸 에틸 아세테이트 분획물에 대해서 Toyopearl HW-40 및 ODS 겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 소분획인 MP01 내지 MP06을 수득하였다.
1-2: 미성숙 사과로부터 화합물의 분리
상기 실시예 1-1에서 미성숙 사과 추출물 및 분획물을 제조하였는바, 이의 활성 성분을 탐색하기 위하여 유효 화합물을 분리하고자 하였다.
상기 실시예 1-1에서 수득한 소분획 MP01 내지 MP06 중에서 실시예 2에 따라, 가장 강한 MMP-1 저해 활성을 나타낸 MP02에 대한 분리를 실시하여 활성 물질 8종(화합물 1 내지 8)을 수득하였다.
상기 수득한 8종의 화합물을 1H, 13C NMR 및 MS 등의 기기분석과 발표된 문헌과의 비교를 통해 구조 동정하였으며, 그 결과 상기 8종의 화합물은 각각 레이노트린(Reynoutrin), 쿼시트린(Quercitrin), 이소쿼시트린(Isoquercitrin), 플로리진(Phloridzin), 플로레틴-2'-O-자일로글루코사이드(Phloretin-2'-O-xyloglucoside), 5-O-p-쿠마로일퀴닉산(5-O-p-coumaroylquinic acid), 클로로겐산 메틸에스테르(Chlorogenic acid methyl ester) 및 클로로겐산(Chlorogenic acid)인 것으로 확인되었다.
실시예 2: 미성숙 사과 추출물, 분획물 및 화합물의 MMP -1 저해능 측정
2-1: 미성숙 사과 에탄올 추출물의 MMP -1 저해능 측정
상기 실시예 1-1에서 추출한 미성숙 사과의 70% 에탄올 추출물을 대상으로 MMP-1 저해 활성을 갖는지 확인하고자 하였다.
배양액 안의 MMP-1 단백질은 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정하였다. MMP-1 kit의 표준 용액은, 6.25-100ng/mL로 1/2 희석하였고, 표준 용액 100μL와 시료 100μL를 MMP-1 ELISA kit의 마이크로 플레이트에 분주하고 100μL horseradish peroxidase conjugate를 첨가한 후 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 완충 용액으로 각 웰을 5회 반복 세척하여 비결합 항원을 제거한 후 100μL의 발색 테트라메틸벤지딘(chromogenic tetramethyl benzidine)을 넣어 30분간 반응시켰다. 그 후 100μL의 정지 시약을 넣고 15분 후에 450nm에서 ELISA 플레이트 리더(Tecan Austria GmBH, Grodig, Austria)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
상기 미성숙 사과의 70% 에탄올 추출물에 대하여 MMP-1 저해능을 측정한 결과, 미성숙 사과의 MMP-1 저해능은 IC50, 17.8±1.3μg/ml로 성숙 사과의 IC50, > 100μg/ml 보다 높은 MMP-1 저해 활성을 나타냄을 확인하였다(표 1).
추출물 IC 50 값 (μM)
70% 에탄올 추출물(미성숙 사과) 17.8±1.3
70% 에탄올 추출물(성숙 사과) > 100
2-2: 미성숙 사과 유기용매 분획물의 MMP -1 저해능 측정
상기 실시예 1-1에서 분리한 미성숙 사과의 n-헥산(n-hexane), 에틸 아세테이트(EtOAc) 및 n-부탄올(n-BuOH) 분획물과, 에틸 아세테이트의 소분획물 MP01 내지 MP06을 대상으로 MMP-1 저해 활성을 확인하고자 하였다. MMP-1 저해능 측정 방법은 전술한 바와 같다.
상기 미성숙 사과의 n-헥산, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물에서 MMP-1 저해 활성이 가장 강하게 나타났고, 에틸 아세테이트 분획물의 소분획인 MP01 내지 MP06 중에서 MP02가 강한 MMP-1 저해 활성을 나타내었다(표 2).
사과 분획물 IC 50 값 (μM)
미성숙사과 n-헥산 분획물 > 200
에틸 아세테이트 분획물 8.8±1.0
n-부탄올 분획물 52.1±2.8
물 분획물 > 200
MP01 > 200
MP02 7.1±0.8
MP03 183.3±7.5
MP04 5.7±0.8
MP05 > 200
MP06 > 200
2-3: 미성숙 사과로부터 분리한 화합물의 MMP -1 저해능 측정
상기 실시예 1-2에서 미성숙 사과의 MP02 소분획으로부터 분리한 화합물을 대상으로 MMP-1 저해 활성을 갖는지 확인하고자 하였다. MMP-1 저해능 측정 방법은 전술한 바와 같다.
상기 화합물에 대하여 MMP-1 저해능을 측정한 결과, 화합물 1 내지 8의 MMP-1 저해 활성은 모두 미성숙 사과의 에탄올 추출물의 MMP-1 저해 활성보다 더 높은 것으로 나타났다(표 3). (-)-EGCG를 양성 대조군으로 사용하였다.
결과적으로, 미성숙 사과로부터 분리한 화합물 1 내지 8은 모두 미성숙 사과 에탄올 추출물보다 높은 MMP-1 저해 활성을 가짐으로써, 8종의 화합물 모두 주름 개선 효과를 가짐을 확인하였다.
화합물 IC 50 값 (μM)
1 1.3±0.1
2 1.4±0.1
3 10.6±1.2
4 10.9±1.2
5 10.8±1.3
6 3.2±0.6
7 14.1±1.4
8 11.0±1.4
(-)-EGCG (양성대조군) 7.9±0.7
실시예 3: 활성 물질의 구조 분석
상기 실시예 1에서 얻은 화합물 1 내지 8에 대해서 1H, 13C NMR 및 MS를 측정하여 각각의 분자 구조를 결정하였다.
이상의 기기분석 결과를 발표된 문헌의 것과 비교 분석한 결과, 하기 화학식 1로 표시되는 레이노트린(Reynoutrin), 하기 화학식 2로 표시되는 쿼시트린(Quercitrin), 하기 화학식 3으로 표시되는 이소쿼시트린(Isoquercitrin), 하기 화학식 4로 표시되는 플로리진(Phloridzin), 하기 화학식 5로 표시되는 플로레틴-2'-O-자일로글루코사이드(Phloretin-2'-O-xyloglucoside), 하기 화학식 6으로 표시되는 5-O-p-쿠마로일퀴닉산(5-O-p-coumaroylquinic acid), 하기 화학식 7로 표시되는 클로로겐산 메틸에스테르(Chlorogenic acid methyl ester) 및 하기 화학식 8로 표시되는 클로로겐산(Chlorogenic acid)을 확인하였다. 구체적인 분석결과는 다음과 같았다.
화합물 1: 레이노트린( Reynoutrin )
[화학식 1]
Figure 112014098080723-pat00013
(R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))
FABMS m/z 435 [M+H]+.1H-NMR (CD3OD, 600 MHz): δ7.58 (1H, dd, J=8.4, 2.0 Hz, H-6'), 7.56 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2'), 6.85 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 6.38 (1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J=1.8 Hz, H-6), 5.17(1H, d, J=6.6 Hz, H-1"),3.77-3.09(6H, sugar-H).13C-NMR (CD3OD, 150 MHz): δ179.4 (C-4), 166.1(C-7), 163.1(C-5), 158.9(C-2), 158.4(C-9), 149.9(C-4'), 146.1(C-3'), 135.4(C-3), 123.3(C-6'), 123.0(C-1'), 117.2(C-5'), 115.9(C-2'), 105.6(C-10), 104.6(C-1"), 99.9(C-6), 94.7(C-8), 77.5(C-4"), 75.3(C-2"), 71.0(C-3"), 67.2(C-5").
화합물 2: 쿼시트린( Quercitrin )
[화학식 2]
Figure 112014098080723-pat00014
(R = Rha(α-L-람노피라노실, α-L-rhamnopyranosyl))
FABMS m/z 449 [M+H]+.1H-NMR (CD3OD,600 MHz): δ7.34(1H, d, J=1.8 Hz, H-2'), 7.31(1H, dd, J=8.4, 1.8 Hz, H-6'), 6.91 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 6.37(1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 6.20(1H, d,J=2.4 Hz, H-6), 5.35(1H, d,J=1.8 Hz, H-1"), 4.22-3.33(4H, sugar-H), 0.94(3H, d, J=6.0 Hz, H-6").13C-NMR(CD3OD, 150 MHz): δ179.7(C-4), 165.9(C-7), 163.2(C-5), 159.3(C-2), 158.5(C-9), 149.8(C-4'), 146.5(C-3'), 136.2(C-3), 123.2(C-6'), 123.0(C-1'), 117.3(C-5'), 116.8(C-2'), 105.9(C-10), 103.8(C-1"), 100.0(C-6), 95.1(C-8), 73.0(C-4"), 72.8(C-2"), 72.5(C-3"), 72.0(C-5"), 17.8(C-6").
화합물 3: 이소쿼시트린( Isoquercitrin )
[화학식 3]
Figure 112014098080723-pat00015
(R = Glc(β-D-글루코피라노실, β-D-glucopyranosyl))
FABMS m/z 465[M+H]+.1H-NMR (CD3OD, 600 MHz): δ7.83 (1H, d, J=2.4Hz, H-2'), 7.58(1H, dd, J=8.4,2.4 Hz, H-6'), 6.86(1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 6.39(1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 6.20(1H, d, J=1.8 Hz, H-6), 5.15(1H, d, J=7.8 Hz, H-5"), 3.84-3.46(6H, sugar-H).13C-NMR (CD3OD, 150 MHz): δ177.7(C-4), 165.5(C-7), 161.4(C-5), 157.4(C-9), 156.4(C-2), 148.7(C-4'), 144.52(C-3), 134.4(C-3), 121.79(C-1'), 121.5(C-6'), 116.3(C-2'), 114.8(C-5'), 104.4(C-10), 103.2(C-1"), 99.9(C-6), 94.3(C-8), 77.0(C-5"), 75.8(C-3"), 73.9(C-2"), 68.7(C-4"), 60.6(C-6").
화합물 4: 플로리진( Phloridzin )
[화학식 4]
Figure 112014098080723-pat00016
(R = H)
FABMS m/z 437 [M+H]+.1H-NMR(CD3OD, 600 MHz): δ7.05 (2H, d, J=7.8 Hz, H-2,6),6.67(2H, d, J=7.8 Hz, H-3,5), 6.18(1H, d, J=2.4 Hz, H-3'), 6.13(1H, d, J=2.0Hz, H-5'), 5.03(1H, d, J=7.2 Hz, H-1"), 3.71-2.87(6H, sugar-H).13C-NMR(CD3OD, 150 MHz): δ206.5 (C=O), 167.5 (C-4'), 165.9 (C-6'), 162.2 (C-2'), 156.3 (C-4), 133.8 (C-1), 130.3 (C-2, 6), 116.0 (C-3, 5), 106.7 (C-1'), 102.0 (C-1"), 98.3 (C-5'), 95.4 (C-3'), 78.5 (C-5"), 78.4 (C-3"), 74.7 (C-2"), 71.0 (C-4"), 62.4 (C-6"), 46.9 (C-7), 30.8 (C-8).
화합물 5: 플로레틴 -2' -O- 자일로글루코사이드( Phloretin -2' -O- xyloglucoside )
[화학식 5]
Figure 112014098080723-pat00017
(R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))
FABMS m/z 569 [M+H]+.1H-NMR(CD3OD, 600MHz): δ7.07(2H, d, J=8.4 Hz, H-2,6), 6.69 (2H, dd, J=8.4 Hz, H-3,5), 6.28(1H, d, J=2.0 Hz, H-3'), 5.97(1H, d, J=2.0 Hz, H-5'), 5.00(1H, d, J=7.2 Hz, H-1"), 4.35(1H, d, J=7.8 Hz, H-1"'), 4.02-2.88(11H, sugar-H).13C-NMR(CD3OD, 150MHz): δ206.6(C=O), 167.5(C-4'), 165.9(C-6'), 162.2(C-2'), 156.4(C-4), 133.9(C-1), 130.9(C-2), 130.2(C-6), 116.4(C-5), 116.6(C-3), 106.9(C-1'), 105.3(C-1"'), 102.7(C-1"), 98.3(C-5'), 95.4(C-3'), 78.4(C-3"'), 77.9(C-3"), 77.6(C-5"), 77.2(C-2"'), 75.2(C-2"), 74.7(C-4"'), 71.7(C-4"), 71.4(C-5"'), 69.6(C-6"), 46.9(C-8), 30.8(C-7).
화합물 6: 5- O-p -쿠마로일퀴닉산(5- O-p - coumaroylquinic acid )
[화학식 6]
Figure 112014098080723-pat00018
(R1 = H; R2 = H)
FABMS m/z 339 [M+H]+.1H-NMR(CD3OD, 600MHz): δ7.62(1H, d, J=16.2 Hz, H-7'), 7.20(1H, d, J=2.0 Hz, H-2'), 6.97(1H, d, J=8.0,2.0 Hz, H-6'), 6.80(1H, d, J=8.0 Hz, H-5'), 6.32(1H, d, J=16.2 Hz, H-8'), 5.32(1H, m, H-5), 4.15(1H, m, H-3), 3.65(1H, m, H-4), 2.19(4H, m, H-2,6).
화합물 7: 클로로겐산 메틸에스테르( Chlorogenic acid methyl ester )
[화학식 7]
Figure 112014098080723-pat00019
(R1 = CH3; R2 = OH)
FABMS m/z 369 [M+H]+.1H-NMR(CD3OD, 600 MHz): δ7.53(1H, d, J=16.2 Hz, H-7'), 7.04(1H, d, J=1.8 Hz, H-2'), 6.95(1H, dd, J=7.8, 1.8 Hz, H-6'), 6.78(1H, d, J=7.8 Hz, H-5'), 6.22(1H, d, J=15.6 Hz, H-8'), 5.28(1H, m, H-5), 4.14(1H, m, H-6), 3.73(1H, dd, J=9.2,2.5 Hz, H-4), 3.69(3H, s, OCH3), 2.20(2H, m, H-6),2.14(2H, m, H-2).13C-NMR(CD3OD, 150 MHz): δ175.4(COOH), 168.3(C-9'), 149.7(C-4'), 147.0(C-3'), 146.9(C-7'), 127.7(C-1'), 123.0(C-6'), 116.2(C-2'), 115.1(C-5'), 115.0(C-8'), 75.8(C-1), 72.6(C-5), 72.2(C-4), 71.6(C-3), 52.7(OCH3), 38.2(C-6), 37.8(C-2).
화합물 8: 클로로겐산( Chlorogenic acid )
[화학식 8]
Figure 112014098080723-pat00020
(R1 = H; R2 = OH)
1H-NMR(CD3OD, 600 MHz): δ7.60 (1H, d, J=16.0 Hz, H-7'), 7.09(1H, d, J=2.0 Hz, H-2'), 6.99(1H, dd, J=8.0,2.0 Hz, H-6'), 6.82(1H, d, J=8.0 Hz, H-5'), 6.30(1H, d, J=16.0 Hz, H-8'), 5.37(1H, m, H-5), 4.20(1H, m, H-3), 3.76(1H, dd, J=9.5,2.5 Hz, H-4), 2.24(2H, m, H-6),2.14(2H, m, H-2).
실시예 4: 미성숙 사과와 성숙 사과의 성분 비교
상기 실시예 1-2에서 미성숙 사과로부터 분리한 화합물을 HPLC 분석을 통하여 성숙 사과와 성분 비교를 실시한 결과, 성숙 사과 및 미성숙 사과에서 모두 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 7 및 8이 존재하였고, 화합물 4, 6 및 8은 성숙 사과보다 미성숙 사과에서 많은 양이 존재함을 확인하였다(도 1).
실시예 5: 화합물 1 내지 8의 세포 독성 확인
상기 실시예 1-2에서 미성숙 사과로부터 분리한 화합물 1 내지 8이 세포 독성을 가지는지 확인하기 위하여 MTT 방법을 통하여 세포 독성을 확인하였다.
인간 피부 섬유아세포, CCD-986sk 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 세포 독성은 MTT 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 방법을 수정하여 사용하였다. 세포 배양은 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(100U/mL)을 첨가한 Dulbeccos's Modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 적응시켜 계대 배양하였다. MTT 시험 방법은 탈수소 작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미트콘드리아의 능력을 이용한 검사법으로 MTT formazan의 농도를 540nm에서 ELISA 플레이트 리더(Tecan Austria GmBH, Grodig, Austria)를 이용하여 측정하였다.
그 결과 화합물 1 내지 8의 경우 12.5μM까지 세포에 독성이 없음을 확인하였다(표 4). 이 결과에 따라, 이후의 타입-1-콜라겐 생합성 활성 측정 실험에서 12.5μM 농도의 화합물로 실험을 진행하였다.
화합물 세포생존율 (%)
6.25μM 12.5μM
1 88.5±0.95 84.7±1.45
2 84.3±0.83 80.1±4.25
3 82.7±0.59 81.6±0.82
4 99.2±4.68 81.5±12.9
5 91.4±0.36 89.9±2.18
6 93.8±4.19 81.3±3.92
7 89.7±2.03 81.2±4.27
8 83.9±0.32 82.1±0.06
실시예 6: 미성숙 사과 추출물, 분획물 및 화합물의 타입-1-콜라겐 생합성 활성 측정
6-1: 미성숙 사과 에탄올 추출물의 타입-1-콜라겐 생합성 활성 측정
상기 실시예 1-1에서 추출한 미성숙 사과의 70% 에탄올 추출물을 대상으로 표 1에서 MMP-1 저해능을 확인하였으므로, 추가로 타입-1-콜라겐 생합성 활성을 갖는지 확인하고자 하였다.
CCD-986sk세포를 24-웰 플레이트에 5 × 104 세포/웰 의 농도로 접종한 후 24시간 배양하였다. 그 후, 세포를 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척한 후 무혈청 배양액을 첨가하고 24시간 후에 시료를 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 수집하여 콜라겐 생합성 활성 측정에 사용하였다. 세포 배양액 내의 콜라겐 합성 정도는 procollagen type I C-peptide assy kit (Takara Bio Inc., Japan)를 사용하여 propetide의 양을 측정하였다. 시료는 12.5μM 농도로 처리하였고, 모든 실험은 3번 반복하였다.
상기 미성숙 사과의 70% 에탄올 추출물에 대하여 타입-1-콜라겐 생합성 활성을 측정한 결과, 미성숙 사과 에탄올 추출물의 콜라겐 합성율은 72.3±7.2%로 양성대조군의 77.1±7.7%와 비슷한 콜라겐 합성율을 나타냄을 확인하였다(표 5).
물질 합성율 (%)
70% 에탄올 추출물(미성숙 사과) 72.3±7.2
(-)-EGCG (양성대조군) 77.1±7.7
6-2: 미성숙 사과 유기용매 분획물의 타입-1-콜라겐 생합성 활성 측정
상기 실시예 1-1에서 분리한 미성숙 사과의 n-헥산(n-hexane), 에틸 아세테이트(EtOAc) 및 n-부탄올(n-BuOH) 분획물과, 에틸 아세테이트의 소분획물 MP01 내지 MP06을 대상으로 표 2에서 MMP-1 저해능을 확인하였으므로, 추가로 타입-1-콜라겐 생합성 활성을 확인하고자 하였다. 타입-1-콜라겐 생합성 활성 측정 방법은 전술한 바와 같다.
상기 미성숙 사과의 n-헥산, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물에서 타입-1-콜라겐 생합성 활성이 가장 강하게 나타났고, 에틸 아세테이트 분획물의 소분획인 MP01 내지 MP06 중에서 MP02가 강한 타입-1-콜라겐 생합성 활성을 나타내었다(표 6).
사과 분획물 합성율 (%)
미성숙사과 n-헥산 분획물 15.9±1.2
에틸 아세테이트 분획물 76.7±7.7
n-부탄올 분획물 26.0±2.8
물 분획물 43.8±5.7
MP01 22.5±2.6
MP02 70.1±6.8
MP03 17.3±1.3
MP04 78.3±7.8
MP05 13.8±1.0
MP06 10.7±1.0
6-3: 미성숙 사과로부터 분리한 화합물의 타입-1-콜라겐 생합성 활성 측정
상기 실시예 2에서 MMP-1 저해 활성을 통하여 화합물 1 내지 8의 주름 개선 효능을 확인한 것에 추가로, 상기 화합물의 타입-1-콜라겐 생합성 활성을 측정하였다. 타입-1-콜라겐 생합성 측정 방법은 전술한 바와 같다.
상기 실시예 5에서 확인한 세포 독성이 없는 농도인 12.5μM 농도의 화합물로 실험을 진행하였을 때, 미성숙 사과로부터 분리한 화합물 중 화합물 1, 3, 4, 6번의 경우 타입-1-콜라겐 생합성을 각각 78.5, 78.6, 76.6, 74.0% 촉진하는 효과가 있음을 확인하였다(도 2).
상기 결과들을 종합하여 보면, 미성숙 사과의 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리된 화합물 1 내지 8이 MMP-1 저해 활성 및 타입-1-콜라겐 생합성 활성을 통한 주름 개선 효과를 가짐을 알 수 있다. 특히 화합물 1, 3, 4 및 6은 현저한 타입-1-콜라겐 생합성 촉진 효과를 나타내므로 확실한 주름 개선 효과를 가짐을 알 수 있다.

Claims (13)

  1. 미성숙 사과의 추출물을 에틸아세테이트를 분획용매로 하여 수득된 분획물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물로서, 상기 미성숙 사과는 개화 수정 후 2 내지 3주 후에 적과된 사과인 것인, 주름 개선용 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 미성숙 사과를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 수득한 것인, 주름 개선용 화장료 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올인 것인, 주름 개선용 화장료 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 주름 개선용 화장료 조성물은 미성숙 사과의 추출물을 에틸아세테이트를 분획용매로 하여 수득된 분획물로부터 분리된 화합물을 추가로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물로서,
    상기 분리된 화합물은 하기 화학식 1 내지 8로 구성된 군에서 선택된 화합물인 것인, 주름 개선용 화장료 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112017041007172-pat00021

    (R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))

    [화학식 2]
    Figure 112017041007172-pat00022

    (R = Rha(α-L-람노피라노실, α-L-rhamnopyranosyl))

    [화학식 3]
    Figure 112017041007172-pat00023

    (R = Glc(β-D-글루코피라노실, β-D-glucopyranosyl))

    [화학식 4]
    Figure 112017041007172-pat00024

    (R = H)

    [화학식 5]
    Figure 112017041007172-pat00025

    (R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))

    [화학식 6]
    Figure 112017041007172-pat00026

    (R1 = H; R2 = H)

    [화학식 7]
    Figure 112017041007172-pat00027

    (R1 = CH3; R2 = OH)

    [화학식 8]
    Figure 112017041007172-pat00028

    (R1 = H; R2 = OH)
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 미성숙 사과의 추출물을 에틸아세테이트를 분획용매로 하여 수득된 분획물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 약학 조성물로서, 상기 미성숙 사과는 개화 수정 후 2 내지 3주 후에 적과된 사과인 것인, 주름 개선용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 주름 개선용 약학 조성물은 미성숙 사과의 추출물을 에틸아세테이트를 분획용매로 하여 수득된 분획물로부터 분리된 화합물을 추가로 포함하는 주름 개선용 약학 조성물로서,
    상기 분리된 화합물은 하기 화학식 1 내지 8로 구성된 군에서 선택된 화합물인 것인, 주름 개선용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112017041007172-pat00033

    (R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))

    [화학식 2]
    Figure 112017041007172-pat00047

    (R = Rha(α-L-람노피라노실, α-L-rhamnopyranosyl))

    [화학식 3]
    Figure 112017041007172-pat00034

    (R = Glc(β-D-글루코피라노실, β-D-glucopyranosyl))

    [화학식 4]
    Figure 112017041007172-pat00035

    (R = H)

    [화학식 5]
    Figure 112017041007172-pat00048

    (R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))

    [화학식 6]
    Figure 112017041007172-pat00036

    (R1 = H; R2 = H)

    [화학식 7]
    Figure 112017041007172-pat00049

    (R1 = CH3; R2 = OH)

    [화학식 8]
    Figure 112017041007172-pat00050

    (R1 = H; R2 = OH)
  10. 미성숙 사과의 추출물을 에틸아세테이트를 분획용매로 하여 수득된 분획물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 식품 조성물로서, 상기 미성숙 사과는 개화 수정 후 2 내지 3주 후에 적과된 사과인 것인, 주름 개선용 식품 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 주름 개선용 식품 조성물은 미성숙 사과의 추출물을 에틸아세테이트를 분획용매로 하여 수득된 분획물로부터 분리된 화합물을 추가로 포함하는 주름 개선용 식품 조성물로서,
    상기 분리된 화합물은 하기 화학식 1 내지 8로 구성된 군에서 선택된 화합물인 것인, 주름 개선용 식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112017041007172-pat00051

    (R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))

    [화학식 2]
    Figure 112017041007172-pat00052

    (R = Rha(α-L-람노피라노실, α-L-rhamnopyranosyl))

    [화학식 3]
    Figure 112017041007172-pat00053

    (R = Glc(β-D-글루코피라노실, β-D-glucopyranosyl))

    [화학식 4]
    Figure 112017041007172-pat00054

    (R = H)

    [화학식 5]
    Figure 112017041007172-pat00055

    (R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))

    [화학식 6]
    Figure 112017041007172-pat00056

    (R1 = H; R2 = H)

    [화학식 7]
    Figure 112017041007172-pat00057

    (R1 = CH3; R2 = OH)

    [화학식 8]
    Figure 112017041007172-pat00058

    (R1 = H; R2 = OH)
  12. 미성숙 사과의 추출물을 에틸아세테이트를 분획용매로 하여 수득된 분획물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 의약외품 조성물로서, 상기 미성숙 사과는 개화 수정 후 2 내지 3주 후에 적과된 사과인 것인, 주름 개선용 의약외품 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 주름 개선용 의약외품 조성물은 미성숙 사과의 추출물을 에틸아세테이트를 분획용매로 하여 수득된 분획물로부터 분리된 화합물을 추가로 포함하는 주름 개선용 의약외품 조성물로서,
    상기 분리된 화합물은 하기 화학식 1 내지 8로 구성된 군에서 선택된 화합물인 것인, 주름 개선용 의약외품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112017041007172-pat00059

    (R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))

    [화학식 2]
    Figure 112017041007172-pat00060

    (R = Rha(α-L-람노피라노실, α-L-rhamnopyranosyl))

    [화학식 3]
    Figure 112017041007172-pat00061

    (R = Glc(β-D-글루코피라노실, β-D-glucopyranosyl))

    [화학식 4]
    Figure 112017041007172-pat00062

    (R = H)

    [화학식 5]
    Figure 112017041007172-pat00063

    (R = Xyl(β-D-자일로피라노실, β-D-xylopyranosyl))

    [화학식 6]
    Figure 112017041007172-pat00064

    (R1 = H; R2 = H)

    [화학식 7]
    Figure 112017041007172-pat00065

    (R1 = CH3; R2 = OH)

    [화학식 8]
    Figure 112017041007172-pat00066

    (R1 = H; R2 = OH)
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