KR101723899B1 - 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치자(Gardeniae Fructus) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 조성물을 포함하는 피부 외용제, 개인위생용품, 건강기능식품 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.

Description

치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition comprising extract or fraction of Gardeniae Fructus for preventing or treating osteoporosis}
본 발명은 치자(Gardeniae Fructus) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 조성물을 포함하는 피부 외용제, 개인위생용품, 건강기능식품 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
뼈의 발생, 성장 및 대사과정에는 뼈의 형성(bone modeling)과 재형성(remodeling) 과정이 중요한 역할을 한다. 뼈의 형성은 태생기부터 시작하여 이후 골격이 성숙되어 성장이 끝나는 청장년기까지 지속되어 20대에서 30대 초반까지 최대 골량을 형성하게 된다. 이후 약 30년 동안은 뼈를 제거하고 다시 이를 보충하는 골재형성 과정을 반복하게 되는데 이때는 골형성과 골흡수가 서로 짝을 이루어 균형을 유지하게 된다. 이 시기가 지난 후에는 골흡수에 따른 골소실을 골형성이 충분히 따라갈 수 없어 결국 연 0.3 ~ 0.5 % 정도의 골량 감소를 겪게 되며, 특히 여성의 경우에는 폐경 초기에 연 2 ~ 3 %의 상당한 골손실을 겪게 된다.
골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포, 파골 세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다.
또한, 골조직은 조골세포에 의해 형성되고 파골세포에 의해 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직으로, 골다공증은 조골세포와 파골세포의 평형이 무너져 골 흡수가 골 형성보다 항진됨으로서 유발되는 질병으로, 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지게 되며, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다.
골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등이 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활 을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로겐 농도가 급속히 감소하는데, 이 때 IL-7(interleukin-7)에 의한 것처럼 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되어 골수(bone marrow)에 B 세포 전구체(pre-B cell)가 축적되고 이로 인해 IL-6의 양이 증가하여 파골 세포의 활성을 증가시키므로 결국 골량이 감소하게 된다.
이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 또한 전 세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에, 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있고 현재 골흡수 억제제의 개발이 활발히 진행되고 있다.
골다공증은 크게 3가지 유형으로 나눌 수 있는데, 첫째는 원인불명(idiopathic)의 골다공증, 둘째는 폐경기 이후 여성호르몬 부족에 의해 나타나는 타입 Ⅰ 골다공증, 셋째는 고령화된 노인층의 남녀에게 발견되는 타입 Ⅱ 골다공증이다. 이러한 타입 I 및 타입 Ⅱ 골다공증은 많은 경우 내분비 장애에 의하여 유발되고 이외에도 질병, 영양실조 또는 칼슘 이온의 흡수 감소로 인한 칼슘, 인산염 및 비타민 D 등의 결핍으로 생긴다고 알려져 있다.
골다공증 치료제로 널리 사용되는 칼슘 보강 제재가 최근에 그 효과가 유의하지 못함이 보고되었으며, 에스트로겐이나 칼시토닌을 이용한 호르몬 요법에 있어서도 역시 치료효과가 유의하지 못함이 보고되고 있다. 특히, 에스트로겐이나 칼시토닌을 포함한 호르몬 요법의 경우 골밀도를 증가시키고, 직장암의 발생을 감소시킨다는 보고도 있으나, 유방암, 심근경색, 정맥 혈전증 등의 부작용이 보고된 바 있다(JAMA 2002, 288, 872-881; J. Obstet . Bynaecol . Can. 2002, 24, 711-715). 또한, 골다공증 치료제로 널리 사용되는 비스포스포네이트는 파골세포를 억제하는 골흡수 억제제로써 새로운 대체 치료제로 주목받고 있으나, 올바르지 않은 경구 투여시 상기도에 병소가 관찰되기도 한다(Clin . Proc . 2002, 77, 1031-1043). 따라서, 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없고 약물의 장기 투여가 필수적인 질환이므로, 새로운 작용 및 골격구조를 가지면서 독성 및 부작용이 적어 골다공증의 예방 및 치료에 효과적인 신물질의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 독성 및 부작용이 적은 골다공증 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 치자 추출물 및 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 IL-6에 의해 활성화되는 STAT3의 인산화 저해 및 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제하여 골다공증 예방 및 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 치자(Gardeniae Fructus) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 피부외용제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치자 추출물 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개인위생용품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증 치료방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 치자(Gardeniae Fructus)추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "치자(Gardeniae Fructus)"란 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하는 식물로서 주성분은 크로신(Crocin), 크로세틴(Crocetin), 가르도닌(Gardonin), 제니핀(Genipin), 제니포사이드(Geniposide) 등이 있으며, 노란 색소에는 알파크로찐, 크산찔레틴, 프소랄렌, 파우쩨다놀메틸, 에스테르 등의 성분이 있다. 치자는 예로부터 민간요법에서는 타박상, 상처에 이용되며, 동의보감에서는 열대림, 피멎이약, 소염, 토혈, 각혈, 황달에 효과가 있다는 개시가 있었다. 그러나, 치자 추출물이 골다공증의 예방 또는 치료에 효과가 있다는 것은 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.
본 발명의 용어 "치자 추출물"이란 치자를 추출하여 수득한 추출물을 의미하는데, 본 발명의 목적상, 치자 추출물은 치자의 분쇄물을 탄소수 1 내지 6의 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 또는 부탄올로 추출한 것을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함된다.
본 발명에서 치자 추출물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 치자 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20 배, 바람직하게는 약 3 내지 5 배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 6(C6)의 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12 시간 내지 4 일, 바람직하게는 3 일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한다. 더욱 바람직하게는 냉침 추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과 추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100, 바람직하게는 실온에서 감압 농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 치자 조추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 용어 "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명에서는 바람직하게는 치자 추출물을 에탄올, n-헥산, 에틸아세테이트, 물의 용매를 이용한 용매분획방법으로 분획한 결과물일 수 있으며, 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 모두 포함하며, 구체적으로는 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물 등이 모두 사용될 수 있다. 또한 1차 컬럼 크로마토그래피에 의한 분획물일 수도 있다.
본 발명에서, 치자 추출물의 용매 분획물은 치자 추출물을 물로 현탁한 후 헥산, 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 각각 수득할 수 있다. 본 발명에서, 구체적인 일 양태로서 용매 분획물로는 헥산, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물이 제공된다.
본 발명에서 치자 추출물의 분획물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 상기에서 얻은 치자 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100 배, 바람직하게는 약 1 내지 5 배 부피의 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 가하여 1 회 내지 10 회, 바람직하게는 2 회 내지 5 회에 걸쳐 비극성 용매 가용 층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다 (Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. p6-7, 1998). 구체적으로, 상기 치자 조추출물을 물에 현탁한 후, 등량의 n-헥산 및 에틸아세테이트 용매를 이용하여 연속 추출로 치자 각 용매 가용 추출물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 치자 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.
본 발명에서 "1차 컬럼크로마토그래피 분획물"은 치자 추출물의 분획물을 컬럼크로마토그래피를 통해 수득한 분획물을 의미한다. 컬럼크로마토그래피는 치자로부터 골다공증 예방 또는 치료효과가 있는 성분을 포함하는 분획물을 분리할 수있는 공지의 컬럼을 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 치자추출물을 동량의 물과 n-헥산을 혼합하여 분획한 후 수득한 수가용성 분획물에 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 재분획한 후 수가용성 분획물과 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득하였고, 상기 에틸아세테이트 가용성 분획물을 감압농축하여 수득한 에틸아세테이트 가용성 추출물을 n-헥산 및 에틸아세테이트의 혼합용매를 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silicagel column chromatography)에 적용하여 8개의 분획물을 수득한 후 감압 농축하여 1차 컬럼크로마토그래피 분획물을 수득할 수 있다.
본 발명에서 치자 헥산 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 60, 30, 10 ㎍/㎖ 농도에서 각각 87 %, 61 %, 25 % 저해하였으며, 치자 에틸아세테이트 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 60, 30, 10 ㎍/㎖ 농도에서 각각 90 %, 60 %, 24 % 저해하였다. 또한, 치자 물 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 60, 30, 10 ㎍/㎖에서 28 %, 13 %, 10 % 저해하였다(표 1). 또한 치자 추출물 및 분획물이 간암 세포주 Hep3B에서 IL-6에 의해 활성화되는 STAT3 인산화에 영향을 주는지 웨스턴 블롯(western blooting) 방법으로 확인해본 결과, 치자 에탄올 추출물, 헥산 및 에틸아세테이트 분획물은 IL-6에 의해 활성화되는 STAT3 인산화를 농도 의존적으로 저해하는 활성을 나타냈다(도 1). 따라서 본 발명의 치자 추출물 및 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 억제할 수 있으므로, 골다공증 예방 또는 치료에 적합함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 치자 추출물, 분획물 또는 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물이 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제함을 확인하였다(도 2 및 도 3). 따라서, 상기 치자 추출물, 분획물 또는 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물의 IL-6에 의해 유도되는 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)활성 저해 및 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제하는 효과에 의해 골다공증의 예방 또는 치료하는데 적합함을 알 수 있었다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하
게 선택될 수 있다. 그러나, 보다 효과적인 예방 또는 치료를 위하여, 본 발명의 상기 치자 추출물 또는 분획물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여함이 바람직하고, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한
경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구,직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 또는 약학적 조성물 역시 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 경피흡수제, 겔제, 로션제, 연고제, 크림제, 첩부제, 카타플라스마제, 페이스트제, 스프레이, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 또는 약학적 조성물을 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공한다.
치자 추출물, 분획물, 조성물 등은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 상기 조성물은 골다공증의 예방 또는 개선효과를 나타내는 피부 외용제에 포함될 수 있다. 상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명은 치자 추출물 또는 분획물을 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 개인위생용품을 제공한다.
치자 추출물, 분획물 등은 상기에서 설명한 바와 같다.
이때, 상기 개인위생용품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크-업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔, 세정 겔 등이 될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 치자 추출물 또는 분획물을 포함하는 식품 조성물을 이용하여 골다공증의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품을 제조할 수 있다.
치자 추출물, 분획물, 조성물 등은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, “기능성식품(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 본 발명에서 용어, “건강식품(health food)"은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다. 상기 식품은 간 기능 개선 및 회복에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
이러한 기능성 식품의 구체적인 예로, 상기 조성물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다. 상기 조성물을 포함하는 건강기능성 식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 마아가린, 지방 지속성(fat continuous) 또는 물 지속성(water continuous) 또는 양쪽 지속성(bicontinuous) 스프레드, 지방 감소된 스프레드, 초콜렛, 초콜렛 코팅, 초콜렛 속(fillings) 또는 베이커리 속인 과자류, 아이스크림, 아이스크림 코팅, 아이스크림 함유물, 드레싱, 마요네즈, 치즈, 크림 대체물, 건조 스프, 드링크, 시리얼 바, 소스, 스낵바, 유제품, 임상 영양식품, 소아용 식품 등의 형태로 제조된 것을 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명은 치자 추출물 또는 분획물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 의약외품 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 골다공증의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.
치자 추출물, 분획물, 조성물 등은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.
본 발명의 치자 추출물 또는 분획물은 골다공증의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 개인위생용품, 피부 외용제, 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제을 포함한다. 상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 물티슈, 휴지, 샴푸, 치약, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 골다공증 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골다공증의 치료 방법을 제공한다.
상기 조성물, 골다공증 및 치료에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 치료 방법은 구체적으로 상기 조성물을 약학적 유효량으로 골다공증 의심 개체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 래트, 닭 또는 인간을 포함한 포유류 전체를 의미하나, 상기 예에 의해 본 발명의 포유류가 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식은 정맥 주사,피하주사, 피내주사제, 근육주사 및 점적 주사이다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 애엽 추출물은 아토피에 있어서 안전하면서도 높은 효과를 나타내므로, 상기 애엽 추출물을 유효성분을 포함하는 약학적 조성물을 골다공증 의심 개체에 투여하여, 골다공증의 발생 또는 진행을 막아 골다공증을 치료할 수 있다.
본 발명의 치자(Gardeniae Fructus) 추출물 또는 분획물은 오랫동안 천연약재로서 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없으면서도, IL-6 에 의해 활성화되는 STAT3의 인산화 저해 및 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제할 수 있으므로, 골다공증의 예방 또는 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은, 치자(Gardeniae Fructus) 에탄올 추출물, 헥산 및 에틸아세테이트 분획물의 IL-6 처리에 의해 유도되는 STAT3 인산화를 저해하는 효과를 나타낸 그림이다.
도 2는, 치자(Gardeniae Fructus) 에탄올 추출물, 헥산 및 에틸아세테이트 분획물의 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타낸 그림이다.
도 3은, 치자(Gardeniae Fructus) 에틸아세테이트 층의 1차 컬럼크로마토그래피 분획물의 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타낸 그림이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 치자( Gardeniae Fructus ) 추출물 및 분획물의 제조
실시예 1-1. 치자( Gardeniae Fructus ) 추출물의 제조
치자(Gardeniae Fructus)는 물로 깨끗이 세척하여 그늘에서 건조한 후, 와링 브랜드로 분말화시켰다. 분말화된 치자 6 ㎏을 에탄올 50 ℓ에 넣고 실온에서 7 일간 냉침 추출한 후, 여지(와트만사, 미국)로 감압 여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 실온에서 에탄올 용매를 제거한 후 추출된 잔사로서 치자 추출물 1.2 ㎏을 제조하였다.
실시예 1-2. 치자( Gardeniae Fructus ) 분획물의 제조
상기 제조된 치자(Gardeniae Fructus) 추출물에서 활성 분획물을 분리하기 위하여, 치자 추출물을 물 1 ℓ에 현탁시키고 동량의 n-헥산을 가하여 혼합하여 분획하고, 이 과정을 3 회 반복하여 수가용성 분획물 1 ℓ와 n-헥산 가용성 분획물 3 ℓ를 수득하였다.
이어, 상기 n-헥산 가용성 분획물을 감압 농축하여 n-헥산 가용 추출물 306 g을 수득하였다.
또한, 상기 수가용성 분획물 1 ℓ에 동량의 에틸아세테이트를 가하여 혼합하여 분획하고, 이 과정을 3 회 반복하여 수가용성 분획물 1 ℓ와 에틸아세테이트 가용성 분획물 3 ℓ를 다시 수득하였다.
상기 수득한 에틸아세테이트 가용성 분획물을 감압농축하여 에틸아세테이트 가용 추출물 136 g을 수득하고, 남은 수가용성 분획물을 감압농축하여 750 g을 수득하였으며, 이를 물 분획물로 사용하였다.
상기 수득한 에틸아세테이트 추출물 136 g을 헥산 : 에틸아세테이트(100:0 내지 0:100 (v/v))의 혼합 용매를 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)에 적용하여 8개의 소분획(Fr. 1 내지 Fr. 8)을 수득하였다. 상기 수득한 분획물을 감압 농축하여 에틸아세테이트 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물로 사용하였다.
실시예 2: 치자( Gardeniae Fructus ) 추출물, 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물의 IL-6에 의해 유도되는 전사활성 억제효과
치자(Gardeniae Fructus) 추출물, 분획물 및 1차 컬럼 크로마터그래피 분획물의 IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 발현억제 효과를 확인하였다.
실시예 2-1. 형질전환체 제조
간암세포주 Hep3B(ATCC HB-8064)에 pStat3-Luc와 pcDNA3.1(+)(Clontech laboratories, Palo Alto, CA)를 리포펙타민 플러스(lipofectamin plus, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 함께 형질감염 시켰다. 이틀 후부터 하이그로마이신(hygromycin)을 처리(100 ㎍/㎖)하여, 루시퍼라제(luciferase)가 안정하게 발현되는 클론을 얻었다. 상기 클론에서 루시퍼라제가 안정하게 발현되는지는 루시퍼라제 분석법을 통해 확인하였다.
실시예 2-2. IL-6 반응성 STAT3 리포터 유전자 검사
상기 실시예 2-1에서 수득한 클론에 포함된 형질감염된 세포를 DMEM(GIBCO 119950965)으로 무혈청 배양(serum starvation)하고 시료를 하기와 같이 1시간 처리한 후 10 ng/㎖ IL-6(R&D system, USA)를 첨가하여 12시간 동안 배양하였다.
1: 음성대조군(비처리군);
2: 양성대조군(IL-6 10 ng/㎖); 및
3: 추출물 및 분획물(10, 30, 60 ㎍/㎖) 및 1차 컬럼 크로마터그래피 분획물물(10, 30 ㎍/㎖).
상기 배양된 세포를 PBS로 세척하고 50㎕ 용해 완충용액(luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 20 분간 교반한 후, 30 - 100 ㎕의 루시퍼라제 기질(luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 발색 정도를 루미노미터(luminometer; EG&G BERTHOLD, USA)로 5분 안에 측정하였다(표 1, 표 2 및 표 3). 상기 측정결과는 [표 1], [표 2] 및 [표 3]에 나타내었다.
Figure 112016090439095-pat00001
상기 표 1에서 보듯이, 치자 에탄올 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 60, 30, 10 ㎍/㎖ 농도에서 각각 84 %, 57 %, 17 % 저해하였으며, 치자 헥산 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 60, 30, 10 ㎍/㎖ 농도에서 각각 87 %, 61 %, 25 % 저해하였다. 상기 치자 에틸아세테이트 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 60, 30, 10 ㎍/㎖ 농도에서 각각 90 %, 60 %, 24 % 저해하였으며, 치자 물 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 60, 30, 10 ㎍/㎖ 농도에서 각각 60 %, 13 %, 10% 저해하였다.
Figure 112016090439095-pat00002
상기 표 2에서 보듯이, 치자 에탄올 추출물, 헥산, 에틸아세테이트 및 물 분획물의 세포독성 효과를 측정해본 결과, 50 및 25 ㎍/㎖에서 세포독성이 나타나지 않았다.
Figure 112016090439095-pat00003
상기 표 3에서 보듯이, 치자 에틸아세테이트 층에 대한 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물 1 내지 분획물 4는 L-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 30, 10 ㎍/㎖ 농도에서 각각 100 %, 75 % 이상 저해하였으며, 상기 분획물 5 내지 분획물 8은 30, 10 ㎍/㎖ 농도에서 각각 63%, 24% 이상 저해하였다.
상기 표 1, 표 2 및 표 3에서 보듯이, 치자 추출물, 헥산 및 에틸아세테이트 분획물 그리고 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물은 50 및 25 ㎍/㎖에서 세포독성이 나타나지 않았으며(표 2), 또한 치자 추출물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 활성을 60, 30, 10 ㎍/㎖에서 각각 84 %, 57 %, 17 % 저해함으로써 상기 치차 추출물이 농도의존적으로 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해함을 확인할 수 있었다(표 1 및 표 3)
실시예 2-3. IL-6 유도 STAT3 인산화 저해활성 검정
6 웰 플레이트에 각 웰 당 5 × 105 세포 수가 되도록 Hep3B 및 U266 세포를 분주하여 배양접시에 80% 정도로 배양한 후, 무혈청 배지로 교환하여 추가로 12시간 배양하고 하기와 같이 시료를 60분간 처리하였다.
1: 음성대조군(비처리군);
2: 양성대조군(IL-16 10 ng/㎖);
3: 추출물 및 분획물(25 또는 50 ㎍/㎖)
4: 제니스테인 처리군(100μM).
처리 후, 20 ng/㎖ IL-6를 처리하여 20 분간 반응한 뒤 40 ㎕ 용해 완충용액(pH 8, 20 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1 mM Na3VO4, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 20 mM 류펩틴(leupeptin), 20 ㎎ 아프로토닌(aprotonin); Sigma, USA)을 사용하여 세포를 용해시킨 후, 원심분리(13000 g, 15분)하여 단백질이 포함된 상등액을 수득하였다. 단백질의 농도는 DC 단백질 검사키트(Bio-Rad, USA)를 이용하여 정량하였고, 4 내지 12 % SDS 폴리아크릴아마이드겔(SDS-PAGE)에 단백질을 로딩하여 175 mA에서 2 시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후 겔의 단백질을 PVDF 멤브레인(Westran　S, pore size 0.2 ㎜; Whatman, USA)으로 35 V에서 90분 동안 전사시켰다. 전사된 멤브레인을 Tris-완충용액(T-TBS; 50 mM Tri-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.2 % Tween - 20, 5% skim milk; Sigma, USA)으로 상온에서 1 시간 차단하고 T-TBS로 5 번 세척하였다. 상기 멤브레인에 일차항체로 phospho-STAT3(1 : 1000 희석)의 다클론 항체를 4 ℃에서 12 시간 동안 처리하였다. T-TBS로 5 번 세척 후 이차항체로 HRP-결합 항-마우스 항체(1 : 5000 희석)를 1 시간 반응시켰다. T-TBS로 세척한 다음 암실에서 ECL 키트(Amersham, USA)를 이용하여 필름을 현상하였다(도 1).
도 1에서 나타난 바와 같이 치자 추출물, 헥산 및 에틸아세테이트 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 인산화를 농도의존적으로 저해하는 활성을 나타내었다.
실시예 3: 치자( Gardeniae Fructus ) 추출물, 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물의 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제효과
실험동물모델에 사용되는 마우스는 SLC, Inc.(Japan)으로부터 구입하였으며, 실험을 하기 위하여 이들 마우스를 일정한 온도(23±3 ℃), 습도(55±15 %) 및 조사량(7:00시부터 19:00 시까지) 하에서 사육하였다. 구입 후 생후 5주령 된 마우스를 SPF 동물 사육실에서 1주일 동안 안정시킨 후 실험에 사용하였다.
5주령 마우스의 넓적다리뼈와 정강이뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1 cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포를 웰 당 3.5 x 104 세포 수가 되도록 배양접시에 접종하여 37 ℃에서 3 일간 10 % FBS, 항생제, M-CSF(30 ng/㎖)가 포함된 α-MEM (a-minimum essential medium) 배지에서 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 상기 배양된 포식세포에 M-CSF(30 ng/㎖)와 RANKL(50 ng/㎖)을 전처리한 후, 각각 50 ㎍/㎖의 치자(Gardeniae Fructus) 추출물, 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물을 4일 동안 처리하였다. 4일 후, 상기 배양된 세포는 TRAP용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 분화된 뼈 파골세포로 판단하였다(도 2 및 도 3).
도 2에서 보듯이, 치자 에틸아세테이트 분획물은 50 ㎍/㎖ 농도에서 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제하는 활성이 우수함을 확인하였다. 또한 치자 에틸아세테이트 층에 대한 1차 컬럼크로마토그래피 분획물 1 내지 분획물 4는 50 ㎍/㎖ 농도에서 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제하는 우수한 활성효과를 나타내었다(도 3)
이상의 결과를 종합해 보면, 치자 추출물 및 분획물은 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 인산화 저해 및 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제시키는 것을 확인할 수 있으며, 이는 치자 추출물 또는 분획물이 골다공증 예방 또는 치료에 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
제제예 1. 산제의 제조
치자(Gardeniae Fructus) 추출물, 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물 0.1 g, 유당 1.5 g 및 탈크 0.5 g을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
치자(Gardeniae Fructus) 추출물, 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물 0.1 g, 락토스 7.9 g, 결정성 셀룰로오스 1.5 g 및 마그네슘 스테아레이트 0.5 g을 혼합하고, 직타법(direct tableting method)에 의해 유효성분을 50 ㎎으로 포함하는 500 ㎎짜리 정제를 제조하였다.
제제예 3: 분말제의 제조
치자(Gardeniae Fructus) 추출물, 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물 0.1 g, 옥수수전분 5 g 및 카르복시 셀룰로오스 4.9 g을 잘 혼합하여 분말을 제조하고, 경질 캡슐에 상기 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 치자(Gardeniae Fructus) 추출물, 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물 0.1 g과 적량의 주사용 멸균 증류수 및 pH 조절제를 포함하는 2 ㎖ 용량의 주사용 앰플을 제조하였다.
제제예 5: 액제의 제조
통상적인 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 치자(Gardeniae Fructus) 추출물, 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획물 0.1 g, 이성화당 10 g 및 만니톨 5 g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 치자(Gardeniae Fructus)의 탄소수 1 내지 6의 알콜 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 분획물은 치자 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 분획하여 수득된 것이고,
    상기 조성물은 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3) 저해활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 골다공증은 IL-6(interleukin-6)에 의해 유발되는 것인 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 알콜은 메탄올, 에탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 삭제
  9. 치자(Gardeniae Fructus)의 탄소수 1 내지 6의 알콜 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
    상기 분획물은 치자 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 분획하여 수득된 것이고,
    상기 건강기능식품은 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제활성을 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  10. 제9항에 있어서, 마아가린, 지방 지속성(fat continuous) 또는 물 지속성(water continuous) 또는 양쪽지속성(bicontinuous) 스프레드, 지방 감소된 스프레드, 초콜렛, 초콜렛 코팅, 초콜렛 속(fillings) 또는 베이커리 속인 과자류, 아이스크림, 아이스크림 코팅, 아이스크림 함유물, 드레싱, 마요네즈, 치즈, 크림 대체물, 건조 스프, 드링크, 시리얼 바, 소스, 스낵바, 유제품, 임상 영양식품 및 소아 제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 건강기능식품.
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KR1020160119436A KR101723899B1 (ko) 2016-09-19 2016-09-19 치자 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물

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대한예방한의학회지. 2006. 제10권, 제2호, 페이지 19-30*

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