KR102385224B1

KR102385224B1 - 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102385224B1
Application number: KR1020200004708A
Authority: KR
Inventors: 안긴내; 지영흔; 전유진; 한의정
Original assignee: 전남대학교 산학협력단; 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2022-04-13
Also published as: KR20210091849A

Abstract

모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시된다.

Description

알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergic diseases}

본 발명은 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 염증 반응을 억제하는 유효성분인 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

비만세포는 다양한 알러지 유발 매개물질들을 함유한 과립을 세포내에 포함하고 있다. 항원에 의해 비만세포가 활성화되면 과립이 세포막과 융합되면서 그 내부에 있던 histamine, β-hexosaminidase 및 tryptase 등을 세포 외로 분비되는데, 이는 제 1 형 알러지 반응의 주요한 원인이 된다.

알레르기성 질환의 치료제는 염증 반응을 억제하는 스테로이드제가 주로 사용되고 있으나, 장기간 사용시 부작용 문제가 있고, 알레르기가 발생하는 면역반응 자체를 차단하는 것은 아니므로 근본적인 해결책이 될 수 없다. 따라서 비만세포의 탈과립 현상을 억제함으로써 알레르기를 근본적으로 차단할 수 있는 치료제가 필요하다.

괭생이모자반(Sargassum horneri)은 갈조강(Phaeophyceae), 모자반목(Fucale), 모자반과(Sargassaceae)에 속하는 황갈색의 식물체로 얇고 주걱 모양의 잎을 지닌 조간대의 갈조류이다. 괭생이모자반 추출물은 골다공증 방지 효과(Yakugaku Zasshi. 2006, 126, 1117-1137), 혈액응고 방지 효과(Bioresour. Technol. 2007, 98, 1711-1716), 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus type 1)의 억제효과(Chem. Pharm. Bull. 2001, 49, 484-485. ; Biol. Pharm. Bull. 1998, 21, 730-734) 및 항염증 효과가 있다는 것이 보고되었다. 그러나 괭생이모자반에서 어떤 성분이 이러한 역할을 하는지에 대해서는 명확히 밝혀지지 않은 실정이다.

대한민국 공개공보 제10-2019-0087199호(2019.07.24)

일 구체예에 따르면 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 구체예에 따르면 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 화장품 조성물을 제공한다.

또 다른 구체예에 따르면 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

일 양상은 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명자는 모자반크로마놀 또는 HTT(6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one)를 비만세포에 처리하면 탈과립 현상을 억제함으로서 알레르기성 질환을 예방, 개선, 및 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기 "유효성분으로 포함하는"은 투여하고자 하는 개체에 대한 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 양을 포함하는 것을 의미하며, 당업자가 다양한 변수를 고려하 여 양적 상한을 적절히 조정할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 모자반크로마놀은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 1]

일 구체예에서, 상기 HTT는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 2]

.

상기 모자반크로마놀 및 HTT는 통상적인 추출 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 통상적인 유기합성 방법을 이용하여 제조할 수도 있다. 통상적인 추출방법으로는 초음파 추출법, 여과법, 및 환류 추출법 등을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 모자반크로마놀 및 HTT는 괭생이모자반에서 추출한 것일 수 있다. 예를 들면 괭생이모자반을 세척하고 동결건조시킨 다음, 분쇄하여 저장하고, 물과 에탄올을 혼합한 용매에 침지시켜 상온 또는 가온 조건에서 추출할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 또는 알레르기성 천식일 수 있다.

상기 알레르기성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 모자반크로마놀 및 HTT의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태를 포함할 수 있다. 상기 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 사용될 수 있다. 상기 산 부가염은 통상의 방법, 예컨대 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 수혼화성 유기 용매(예컨대, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴)로 침전시켜 제조할 수 있다. 또한, 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예컨대, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나 석출된 염을 흡인 여과할 수 있다. 상기 유리산은 유기산 및 무기산이 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 또는 인산일 수 있으며, 상기 유기산은 구연산(Citric acid), 초산, 젖산, 주석산(Tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(Fumaric acid), 포름산, 프로피온산(Propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄 설폰산, 글리콜산, 숙신산(Succinic acid), 4-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 살리실산, 니코틴산, 이소니코틴산, 피콜린산, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다. 상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 모자반크로마놀 또는 HTT와 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.

다른 양상은, 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 화장품 조성물을 제공한다.

상기 모자반크로마놀 및 HTT에 대한 내용은 상술한 바와 동일하다.

상기 '화장품'은 인체를 청결미화하여 용모를 밝게 변화시키거나 피부의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 물품을 의미하며, 인체에 대한 작용이 경미한 것을 말한다. 통상적인 의미로서 로션, 크림, 오일, 세정용 제품 및 기능성 화장품을 모두 포함한다. 기능성 화장품이란 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 화장품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 화장품군이나 화장품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 화장품을 의미한다.

상기 화장품 조성물은 예를 들면, 크림, 로션, 앰플, 스킨, 에센스, 샴푸, 비누 등으로 제공될 수 있으며, 다른 측면에서 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스), 또는 마스크 팩 또는 팩의 형태로 제조될 수 있다.

상기 화장품 조성물이 적용될 수 있는 부위는 피부 염증이 유발될 수 있는 부위에 사용될 수 있으며, 이러한 알레르기성 질환증이 유발될 수 있는 피부를 포함하는 신체 부위를 포함하며, 예를 들면, 얼굴, 목, 손등, 두피 등을 포함할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 적용되는 부위에 다양한 투여 경로, 예를 들면 전신 또는 국소, 특히 국소 투여, 경피, 또는 주사, 특히 경피 경로로 투여될 수 있다.

상기 화장품 조성물은 필수 성분으로서 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 화장품, 예를 들면 크림의 경우, 식물성 오일, 유화제, 증점제, 향료, 물, 산화방지제, 및 UV 흡수제를 포함할 수 있다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 모자반크로마놀 또는 HTT의 함량은 목적하는 제품의 구체적 용도 또는 제형 등에 따라 달라질 수 있으나, 전체 조성물 중에 약 0.001 내지 약 50 중량%로 포함될 수 있으나, 이 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다.

상기 화장용 조성물은 필수 성분과 더불어 필요에 따라 다른 성분이 배합될 수 있으며, 예를 들면 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

또 다른 양상은, 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등 모든 형태의 식품 조성물을 포함할 수 있다. 상기 유형의 식품 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 식품 조성물은 건강기능식품 형태로 제공될 수 있다. 상기 건강기능식품은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 상기 기능성은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 의미한다.

상기 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 적합성 여부를 판단할 수 있다. 상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목은 예컨대 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연 첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류를 들 수 있다.

상기 식품 조성물은 알레르기성 질환 예방 또는 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물은 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함함으로서 알레르기성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

다른 구체예에 따른 화장품 조성물은 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함함으로서 알레르기성 질환을 예방 또는 개선할 수 있다.

또 다른 구체예에 따른 식품 조성물은 모자반크로마놀 및 HTT 중 하나 이상을 포함함으로서 알레르기성 질환을 예방 또는 개선할 수 있다.

도 1은 모자반크로마놀 및 HTT의 NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2은 일 실시예에 따른 비만세포 탈과립 현상의 지표인 β-hexosaminidase의 분비량을 측정함으로서 MC 또는 HTT가 활성화된 BMCMC의 탈과립 현상을 억제하는 효과가 있음을 확인한 결과이다.
도 3은 MC 처리에 의해 IgE/BSA 자극에 의해 증가한 비만세포의 IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-13의 발현량이 억제된 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HTT 처리에 의해 IgE/BSA 자극에 의해 증가한 비만세포의 IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-13의 발현량이 억제된 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 MC 처리에 의해 비만세포의 FcεRI의 발현량이 감소한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 MC 처리에 의해 비만세포의 FcεRI와 IgE 결합능이 감소한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 HTT 처리에 의해 비만세포의 FcεRI의 발현량이 감소한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 HTT 처리에 의해 비만세포의 FcεRI와 IgE 결합능이 감소한 결과를 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 실험결과는 PASW statistics 19.0 software(SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하여 통계적 유의성에 대해 평가하였으며, 각 실험군 간의 평균치의 유의성을 P < 0.05 수준에서 Duncan's test를 사용하여 비교하였다.

실시예 1: 괭생이모자반으로부터 모자반크로마놀 및 HTT 분리

괭생이모자반(Sargassum horneri)를 45 내지 55℃의 공기로 건조시키고 분쇄하였다. 괭생이모자반 분말을 10 내지 80 μm 기공의 메쉬로 통과시키고, 70% 에탄올 용매에 침지시키고 암실에서 진탕 배양기에서 연속 교반하면서 65 내지 80℃에서 12시간 동안 추출하였다. 얻어진 추출물을 70℃에서 농축하여 용매를 제거하고 동결 건조하여 괭생이모자반 70% 에탄올 추출물(미정제 추출물)을 획득하였다.

상기 미정제 추출물은 95% 에탄올 용액에 침지시키고 백색 점토와 혼합하여 2시간 동안 교반하여 잔류물 및 중금속을 제거하였다. 이어서, 용액을 실온에서 12000 rpm에서 원심분리하고, 상층액을 농축시켜 동결 건조하여 괭생이모자반 70% 에탄올 추출물을 얻었다(이하 괭생이모자반 에탄올 추출물로 지칭할 수 있다).

괭생이모자반 에탄올 추출물로부터 유용성분인 모자반크로마놀(mojabanchromanol, MC) 및 6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one(HTT)를 분리 및 정제하였다.

모자반크로마놀 분리 및 정제는 다음과 같이 수행하였다. 괭생이모자반 에탄올 추출물을 증류수에 용해시키고, n-헥산 및 에틸 아세테이트를 사용하여 극성에 따라 분배(partition)하였다. 생성된 용매 분획(fraction)을 회전 증발기를 사용하여 농축시켰다. 괭생이모자반 에탄올 추출물은 90:10(F1), 80:20(F2), 70:30(F3), 60:40(F4), 50:50(F5)의 연속비율로 헥산/에틸 아세테이트 단계 구배 용리(step-gradient elution)에 의해 ODS 오픈 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분별하였다. 각 분획은 회전식 증발기를 사용하여 증발시켰다. 5개의 ODS 컬럼 분획 중에서 높은 β-hexosaminidase 방출을 나타내는 F4를 Prep HPLC를 사용하여 추가 정제하여 순수한 화합물을 수득하였다. 반정제 C18 컬럼(semipreparative C18 column)을 이용하여 역상 HPLC(reverse-phase HPLC)를 실시하였다. 역상 HPLC는 YL9120 UV/Vis detector가 장착된 YL900 HPLC 시스템을 사용하였고, HPLC 등급 용매를 사용하였다. 이동상(mobile phase)는 0.01% TFA의 증류수 및 0.01% TFA의 아세토니트릴이고, 구배용리(gradient elution)는 10ml/분의 유속으로 254nm에서 자외선 흡광도를 측정하고, 0-5 min 50 : 50 - 50 : 50 v/v; 5-25 min 50 : 50 - 0 : 100 v/v; 25-45 min 0 :100 - 50 : 50 v/v; 45-50 min 50 : 50 - 50 : 50 v/v 으로 수행되었다. 각 정제 공정의 단계는 비만세포(mast cell)로부터 β-hexosaminidase 방출에 대한 생물 활성의 평가와 함께 생물 검정 유도 분별법(bioassay-guided fractionation)으로 수행되었다.

HTT 분리 및 정제는 다음과 같이 수행하였다. 괭생이모자반 에탄올 추출물을 증류수로 용해시키고, n-헥산, 클로로포름, 및 에틸 아세테이트를 사용하여 극성에 따라 분별하였다. HPCPC를 사용하여 n-헥산/에틸 아세테이트/물(5:5:5:5 v/v) 2상 비혼화성 용매 시스템(a two phase immiscible solvent system)에 의해 클로로포름에 용해된 괭생이모자반 에탄올 추출물을 분별하고, 상부 용매상(upper solvent phase)을 정지상(stationary phase)으로, 하위 용매상(lower solvent phase)을 이동상(mobile phase)로 하였다. 이동상이 컬럼을 통과하는 동안 압력은 3.7MPa이고, 240nm UV로 공정을 모니터링하였다.

5개의 HPCPC 분획 중에서 우수한 항염증 활성을 나타내는 2번째와 4번째 분획을 Prep HPLC를 사용하여 고수율로 추가 정제하여 순수한 화합물을 취득하였다. 반정제 C18 컬럼(semipreparative C18 column)을 이용하여 역상 HPLC(reverse-phase HPLC)를 실시하였다. 역상 HPLC는 Waters HPLC 시스템을 사용하였고, HPLC 등급 용매를 사용하였다. 이동상(Mobile phase)는 아세토니트릴, 증류수이고, 구배용리(gradient elution)은 0-60 min 5 : 95 - 100 : 0 v/v; 60-70 min 100 : 0 - 100: 0 v/v에서 수행하고, 유속 3 ml/min 및 자외선 흡광도 230 및 254nm에서 검출되었다.

화합물의 구조를 NMR에 의해 분석한 결과 모자반크로마놀과 HTT임이 확인되었다(도 1 의 NMR 분석 결과 참조).

모자반크로마놀(C₂₇H₃₆O₄, MW:424)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 명칭은 (2Z,6E)-6-(2-(6-hydroxy-8-methyl-2H-chromen-2-yl)ethyl)-2-(4-methylpent-3-en-1-yl)octa-2,6-dienoic acid일 수 있다.

HTT는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이다.

[화학식 2]

실시예 2: 골수유래 비만세포(BMCMC) 배양

6~8주령의 C57/BL6 마우스를 경추탈골로 희생시킨 뒤, 대퇴부를 절단하여 골수세포를 분리하였다. 분리된 세포의 생존율을 확인하고, 95% 이상의 생존율을 보이는 골수세포를 10% PWM-SCM(pokeweed mitogen-stimulated spleen cell-conditioned medium) 및 0.2% 2-ME(mercaptoethanol)가 첨가된 α-MEM 배지(10% FBS, 1% penicillin-streptomycin)에서 배양하였다. 4 내지 5주간 주 1회 계대 배양하였고, 비만세포(BMCMC, Bone marrow-derived cultured mast cells)가 90% 이상 분화된 후 실험에 사용하였다.

실시예 3: 활성화된 BMCMC로부터 분비되는 β-hexosaminidase 분비량에 대한 유용성분들의 억제 효능 평가

탈과립 현상의 지표물질인 β-hexosaminidase의 분비량에 대한 MC 및 HTT의 효능을 확인하였다. BMCMC (2×10⁵ cells)에 MC 및 HTT를 처리하여 2시간 동안 반응시켰고, anti-DNP-IgE (1μg/ml)를 처리하였다. 1시간 후, 0.1% BSA-Tyroide's buffer 500μl를 가하여 반응시킨 후, 상층액을 분리하였고, 세포에 0.5% triton 100-Tyroide's buffer 50μl를 처리하여 반응액을 분리하였다. 상층액과 반응액을 각각 β-hexosaminidase의 기질인 substrate buffer(4-p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide 1.3 mg/ml, 0.1 M sodium citrate, pH 4.5)와 혼합하여 37℃에서 40분 동안 반응시켰고 각 well당 0.2M glycine (pH 10.7)을 처리하여 반응을 종결시킨 뒤, ELISA reader기를 이용하여 405 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다.

β-hexosaminidase는 BMCMC 세포가 항원에 의해 활성화되어 발생하는 탈과립 현상에 의해 세포 밖으로 분비되는 물질로서 비만세포 활성화 정도를 측정하기 위한 지표이다. 도 2의 A 및 B를 참조하면, IgE/BSA를 처리한 비만세포는 아무것도 처리하지 않은 대조군보다 β-hexosaminidase의 분비량이 유의하게 증가하였으나, MC 또는 HTT를 함께 처리하였을 때는 농도의존적으로 β-hexosaminidase의 방출량을 감소시키는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 활성화된 BMCMC로부터 분비되는 사이토카인 발현 억제 효과 확인

BMCMC 세포의 염증 유발 사이토카인 발현량을 확인하기 위해 reverse transcription-PCR(RT-PCR)을 수행하였다. MCMC (2×10⁵ cells)를 6 well plate의 각 well에 동일하게 분주하고 MC 및 HTT를 농도별(15.6, 31.3, 62.5 μg/ml)로 처리한 다음, 2 시간 뒤에 anti-DNP-IgE를 처리하고 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 trizol reagent를 이용하여 수거하고, 클로로포름을 넣고 10초간 vortexing한 다음, 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액을 취하여 isopropanol을 혼합하여 교반하였다. 그리고 다시 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)을 DEPC water에 녹여 total RNA를 확보하였다. 확보한 total RNA와 cDNA synthesis kit를 이용하여 cDNA를 합성하고 RT-PCR에 사용하였다.

도 3 및 도 4를 참조하면, IgE/BSA로 자극한 비만세포는 아무것도 처리하지 않은 대조군보다 IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-13의 생성량이 증가하였으며, 생성량은 IL-4가 114.08 ± 0.34 ng/ml, IL-5가 152.08 ± 1.06 ng/ml, IL-6이 255.23 ± 17.70, IL-13이 404.80 ± 12.00 ng/ml로 나타났다.

도 3에 따르면, MC를 처리한 경우 IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-13의 생성량이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히 MC를 고농도인 62.5 μg/ml의 농도로 처리한 경우에는 IL-4 생성량이 114.08 ± 0.34 ng/ml에서 33.65 ± 0.04 ng/ml로, IL-5의 생성량이 152.08 ± 1.06 ng/ml에서 62.66 ± 1.10 ng/ml으로, IL-6의 생성량이 255.23 ± 17.70 ng/ml에서 63.72 ± 5.12 ng/ml으로, IL-13의 생성량이 404.80 ± 12.00 ng/ml에서 85.31 ± 0.86 ng/ml로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

도 4에 따르면, HTT를 처리한 경우에도 MC를 처리한 경우와 마찬가지로 IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-13의 생성량이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히, HTT를 고농도인 62.5 μg/ml의 농도로 처리한 경우에는 IL-4 생성량이 114.08 ± 0.34 ng/ml에서 25.53 ± 0.03 ng/ml로, IL-5의 생성량이 152.08 ± 1.06 ng/ml에서 37.04 ± 0.21 ng/ml으로, IL-6의 생성량이 255.23 ± 17.70에서 16.47 ± 0.02 ng/ml으로, IL-13의 생성량이 404.80 ± 12.00 ng/ml에서 87.23 ± 0.41 ng/ml로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: BMCMC의 Fc epsilon receptor(FcεRI) 발현 및 FcεRI와 IgE의 결합능에 대한 유용성분들의 억제 효과

BMCMC의 표면 리셉터인 FcεRI의 발현 및 IgE와의 결합능에 대한 MC 및 HTT의 억제 효과를 확인하기 위하여 flow cytometry 분석을 수행하였다.

먼저, FcεRI의 발현을 확인하기 위해 BMCMC(2×10⁶ cells)에 MC 및 HTT를 서로 다른 농도로(15.6, 31.3, 및 62.5 μg/ml) 처리하여 6시간 동안 배양한 뒤, DPBS로 washing한 다음 FITC-FcεRI 항체를 이용하여 세포를 염색하고, flow cytometry를 수행하였다.

또한, BMCMC에서 FcεRI와 IgE의 결합능을 확인하기 위해 BMCMC(2×10⁶ cells)에 MC 및 HTT를 농도별로 처리하여 2시간 동안 배양하였다. Anti-DNP-IgE (1μg/ml)를 세포에 처리하여 4시간 동안 반응시킨 후, FITC-IgE 항체를 이용하여 세포를 염색하였고 flow cytometry를 이용하여 분석하였다.

MC 또는 HTT가 FcεRI의 발현량에 미치는 영향을 살펴보면, MC를 처리한 BMCMC의 경우 아무것도 처리하지 않은 대조군(97.46%)에 비해 FcεRI 의 발현량이 각각 MC 15.6 μg/ml 처리시 87.95%, 31.3 μg/ml 처리시 85.61%, 62.5 μg/ml 처리시 77.03%로 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조). HTT를 처리한 경우, 아무것도 처리하지 않은 대조군(92.79%)에 비해 FcεRI의 발현량이 각각 HTT 15.6 μg/ml 처리시 86.09%, 31.3 μg/ml 처리시 79.22%, 62.5 μg/ml 처리시 58.22%로 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

FcεRI와 IgE 결합능을 확인한 결과, 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 IgE를 처리한 군은 IgE 결합능이 50.19%로 나타났다. MC를 농도별로 처리한 군에서는 MC 15.6 μg/ml 처리시 14.85%, 31.3 μg/ml 처리시 11.14%, 62.5 μg/ml 처리시 2.88%로 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조). HTT를 농도별로 처리한 군에서는 HTT 15.6 μg/ml 처리시 14.51%, 31.3 μg/ml 처리시 1.38%, 62.5 μg/ml 처리시 0.53%으로 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

정리하자면, MC 및 HTT는 비만세포의 FcεRI 발현 및 FcεRI와 IgE와의 결합을 억제함으로써 알레르기를 유발하는 사이토카인 등의 물질이 탈과립에 의해 방출되는 것을 감소시킬 수 있음이 확인되었다.

Claims

하기의 화학식 1로 표시되는 모자반크로마놀을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
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제 1 항에 있어서,
상기 모자반크로마놀은 괭생이모자반에서 추출한 것인,
알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 또는 알레르기성 천식인,
알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기의 화학식 1로 표시되는 모자반크로마놀을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 개선용 화장품 조성물.
[화학식 1]
하기의 화학식 1로 표시되는 모자반크로마놀을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]