KR101918692B1 - 항산화 효과를 가지는 광어 연육 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 항산화용 식품 조성물에 관한 것으로, 광어 연육의 가수분해물과 이에서 분리된 펩티드가 라디칼 소거 효과, 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 가지고 ROS 생성을 억제하고, 지질 과산화 그리고 세포사멸을 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들을 이용하여, 항산화용 식품 조성물에 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드를 포함하는 항산화용 식품 조성물, 상기 펩티드를 포함하는 광어의 연육, 연제품, 연육의 제조방법 및 연제품의 제조방법에 관한 것이다.
생체 내에서 안정한 상태로 존재하던 산소가 화학약품, 공해물질, 광화학 반응과 같은 환경적 및 생화학적 요인 등에 의해 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 (superoxide anion radical, O2-), 히드록실 라디칼 (hydroxyl radical, OH-), 과산화수소 (hydrogen peroxide, H2O2), 일중항산소 (singlet oxygen, 1O2) 등과 같이 반응성이 큰 활성산소 (reactive oxygen species: ROS)로 전환되면 인체의 세포구성 성분인 단백질, 지질 및 DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이와 같이, 산화적 스트레스가 각종 질환을 일으키는 중요한 원인임이 밝혀지면서 생체 내 활성산소를 효과적으로 제거하는 활성산소 소거제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 활성산소 소거활성이 탁월하면서 보다 안전한 새로운 천연 소재 기반의 활성산소 소거제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
따라서 천연물질로부터 항산화 효과를 가지는 연구에 대한 요구가 계속되었으며, 특히, 생리활성 펩티드(Bioactive peptide)들은 다양한 단백질 가수분해효소를 통해 만들어질 수 있고, 천연물 유래의 펩티드들은 음식이 장내에서 소화되는 동안 신진대사 과정에서 잠재적인 생리적 조절자로 기능할 수 있다. 또한 구조, 조성, 아미노산 서열에 따라 항산화, 항균, 항고혈압 효능 등을 기대할 수 있다.
종래 화학 합성 방법 등을 통하여 제조되었던 항산화 제제들이 부작용 등의 문제가 발생됨에 따라, 최근 세계 각국에서는 천연 물질로부터 항산화 효과를 갖는 물질을 얻기 위한 노력이 지속되고 있다. 또한, 각국에서는 의약품은 물론이고, 효소와 건강보조제와 같은 식품 소재 등 다양한 용도에 활용될 수 있는 새로운 물질을 탐색하기 위하여 자연 상태의 생물, 특히 대량 배양 및 번식이 용이한 생물에 대한 연구도 활발하게 진행하고 있다.
한편, 해양생물은 육상생물에 없는 특유의 대사과정과 독특한 환경으로 인하여 다양한 신규 생리활성물질의 탐색 기능성을 가지고 있다. 또한, 육상생물은 이미 많은 연구가 진행되었으나 해양생물은 아직 충분하게 연구되지 않아서 새로운 유용성을 가진 천연물질 개발에 대한 기대치가 높은 분야이기도 하다.
본 발명의 목적은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 항산화용 식품 조성물 을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 광어의 연육을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 광어의 연제품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 광어를 마쇄 및 수세한 다음 정제 처리하는 단계를 포함하는, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 광어 연육의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 연육의 제조방법에 의해 제조된 광어 연육과 식염을 혼합하는 단계를 포함하는, 광어 연제품의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는 광어(flounder)를 마쇄 및 수세한 다음 정제 처리하여, 광어 연육을 제조하였으며, 펩신을 포함하는 인공위액과 트립신, 알파-키모트립신을 포함하는 인공장액을 이용하여, 광어 연육의 가수분해물을 제조하였으며, 상기 가수분해물의 각 분자량별 분획물과 상기 분획물에서 분리된 특정 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 라디칼 소거 효과, 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 가지고 ROS 생성을 억제하고, 지질 과산화 그리고 세포사멸을 억제하는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들을 이용하여, 항산화용 식품 조성물에 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 Ile-Val-Asp-Arg (IVDR)이고, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 Val-Ala-Ser-Val-Ile (VASVI)이고, 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은 Trp-Tyr-Lys (WYK) 이며, 상기 항산화용 식품 조성물은 상기 서열번호 1로 표시되는 Ile-Val-Asp-Arg (IVDR), 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 Val-Ala-Ser-Val-Ile (VASVI), 또는 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열 Trp-Tyr-Lys (WYK) 로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함한다.
상기 펩티드는 광어(flounder) 연육의 가수분해물에서 분리될 수 있으며, 보다 구체적으로 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 분리될 수 있다.
본 발명에서 상기 가수분해물은 상기 광어(flounder) 연육을 소화효소를 이용하여 분해한 가수분해물일 수 있으며, 상기 소화 효소로는, 펩신(pepsin), 트립신(Trypsin) 또는 알파키모트립신(a-chymotrypsin)일 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 광어 연육의 가수분해물은 펩신, 트립신, 또는 알파-키모트립신의 가수분해물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 광어를 마쇄 및 수세한 다음 정제 처리하여, 광어의 연육을 제조하였다. 구체적으로, 제주 광어의 두부와 내장, 껍질, 뼈 등을 제거하고 어육만을 얻은 후, chopper (M-12S, 한국후지공업, 한국)로 마쇄한 후, 시료의 5배의 0.2% 중합인산염 (Na5P3O10, (주)이에스기술연구소, 한국)을 첨가하여 20분간 침지 후, 같은 부피의 냉수를 추가하여 수세한 후, 협잡물을 제거하고, 탈수기(W-110, (주)한일, 한국)로 탈수된 어육을 stephan mixer (774027-01, UMC 5 Electronic Co. LTD, Germany)를 이용하여 4% 솔비톨 ((주) 엘지생활건강, 한국), 0.2% 중합인산염을 혼합한 후, 정제처리하여 광어 연육을 제조하였다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 펩신을 포함하는 인공위액과 트립신, 알파-키모트립신을 포함하는 인공장액을 이용하여, 광어 연육의 가수분해물을 제조하였으며, 상기 제조된 광어 연육의 인공소화액을 이용한 가수분해물이 라디칼 소거 효과, 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 가지고 ROS 생성을 억제하고, 지질 과산화 그리고 세포사멸을 억제하는 것을 확인하였다.
본 발명에서, 상기 분획물은 광어 연육의 가수분해물을 크기배제크로마토그래피를 이용하여 분자량 사이즈별로 분획한 분획물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 광어 연육의 가수분해물을 Sephadex G-25와 크기배제크로마토그래피를 이용하여, 분자량 사이즈별로 분획하여 총 3개의 분획물을 얻었으며, 이 중에서 F2 분획물에서 알킬라디칼 소거능이 가장 우수하여 항산화 활성이 가장 우수한 것을 확인하였으며, 상기 F2 분획물에서 항산화 활성을 보이는 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 3개를 분리하였다.
본 발명에서 광어는 다른 이름으로 넙치라고 불리며, 넙치의 학명은 Paralichthys olivaceus이며, 몸길이는 60cm 가량이며, 모양은 위아래로 넓적한 긴 타원형이다. 입이 크고 이빨이 잘 발달되어 있으며, 눈은 몸의 왼쪽에 있다. 눈이 있는 쪽은 진한 황갈색 바탕에 흑색 및 백색 반점이 흩어져 있으나, 눈이 없는 쪽은 백색이다. 수심 10-200m 연안의 모래나 펄 지역에 서식하며, 2-6월에 산란한다. 우리나라 전 연안에 출현하며, 쿠릴 열도, 일본, 남중국해에 분포한다. 넙적한 체형 때문에 흔히 '광어'라고 부르며, 눈이 왼쪽에 있기 때문에 일반적으로 눈이 오른쪽에 있는 가자미류와 쉽게 구별된다.
본 발명에서, 용어, "항산화"는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. NO, HNO2, ONOO-와 같은 활성 질소종(reactive nitrogen species, RNS), ROS와 같은 활성산소는 체내에서 세포를 산화시켜 파괴시키며, 그에 따라 각종 질환에 노출되게 된다. 또한, 상기 항산화는 세포 내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성 산소종 (Reactive oxygen species, ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 기능을 의미하며, 자유 라디칼 또는 활성 산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 상기 펩티드들을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 상기 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있는 바, 본 발명에서 상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 상기 펩티드는 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 연육, 연제품, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 광어의 연육을 제공한다.
상기 연육(surimi)은 생선의 껍질과 내장 뼈를 제거한 고기를 냉수로 여러 차례 수세 후에 탈수하여 당과 인산염을 가하여 혼합한 것이다.
본 발명의 일실시예에서는 광어를 마쇄 및 수세한 다음 정제 처리하여, 광어의 연육을 제조하였다. 구체적으로, 제주 광어의 두부와 내장, 껍질, 뼈 등을 제거하고 어육만을 얻은 후, chopper (M-12S, 한국후지공업, 한국)로 마쇄한 후, 시료의 5배의 0.2% 중합인산염 (Na5P3O10, (주)이에스기술연구소, 한국)을 첨가하여 20분간 침지 후, 같은 부피의 냉수를 추가하여 수세한 후, 협잡물을 제거하고, 탈수기(W-110, (주)한일, 한국)로 탈수된 어육을 stephan mixer (774027-01, UMC 5 Electronic Co. LTD, Germany)를 이용하여 4% 솔비톨 ((주) 엘지생활건강, 한국), 0.2% 중합인산염을 혼합한 후, 정제처리하여 광어 연육을 제조하였다.
전술한 바와 같이, 상기 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 존재하는 것을 확인하였는 바, 광어 연육에도 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 존재한다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 광어의 연육을 제공할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 광어의 연제품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 광어를 마쇄 및 수세한 다음 정제 처리하여 광어의 연육을 제조하였으며, 상기 광어 연육을 식염과 혼합하여 광어의 연제품을 제조하였다. 구체적으로, 제조된 연육을 냉동한 후, 냉동된 연육을 4℃에서 저온해동 시킨 후, 20분간 stephan mixer에서 초벌갈이, 20분간 2% 식염 첨가 후 두 번갈이, 20분간 2% 전분 첨가 후 세 번갈이를 하였였으며, 이후 지름 2cm의 원통형 폴리에틸렌비닐에 주입하여 케이싱하고 24시간 동안 4℃에서 자연 응고시켜 광어의 연제품을 제조하였다.
상기 연제품이란, 어육에 식염을 가하여 고기갈이한 뒤 성형하여 가열한 식품의 총칭을 의미하여, 어묵, 튀김 어묵, 부들 어묵, 어육햄, 소시지 등이 이에 속한다.
전술한 바와 같이, 상기 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 존재하는 것을 확인하였는 바, 광어 연육을 식염과 혼합하여 제조된 광어 연제품에도 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 존재한다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 광어의 연육을 제공할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 광어를 마쇄 및 수세한 다음 정제 처리하는 단계를 포함하는, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 광어 연육의 제조방법을 제공한다.
상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 펩티드, 광어, 연육, 연육의 제조방법에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 광어 연육의 제조방법에 의해 제조된 광어 연육과 식염을 혼합하는 단계를 포함하는, 광어 연제품의 제조방법을 제공한다.
상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 펩티드, 광어, 연육, 연제품, 연제품의 제조방법에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명은 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 항산화용 식품 조성물에 관한 것으로, 광어 연육의 가수분해물과 이에서 분리된 펩티드가 라디칼 소거 효과, 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 가지고 ROS 생성을 억제하고, 지질 과산화 그리고 세포사멸을 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들을 이용하여, 항산화용 식품 조성물에 사용할 수 있다.
도 1은 광어 연육과 광어 연제품을 나타낸다.
도 2는 광어 연육 가수분해물의 라디칼 소거 활성을 측정한 것이다.
도 3은 Vero에서의 광어 연육 가수분해물의 산화적 스트레스 보호효과를 나타낸 것이다.
도 4는 광어 연육 가수분해물의 apoptosis 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 제브라피쉬를 이용한 광어 연육 가수분해물의 처리에 따른 생존률 및 심박수 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 제브라피쉬를 이용한 광어 연육 가수분해물의 처리에 따른 ROS 생성량, 지질 과산화, 세포사멸을 측정한 것이다.
도 7은 제브라피쉬에서 연육 가수분해불을 처리하였을 때 Pro-apoptosis mRNA 발현 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 Sephadex G-25컬럼을 이용한 광어 연육 가수분해물의 크기배제크로마토그래피을 나타낸 것이다.
도 9는 광어 연육 가수분해물의 분획물의 역상크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 크기배제크로마토그래피 분획물의 Alkyl 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 Fraction 2 분획물 유래 펩티드의 아미노산 서열, Ile-Val-Asp-Arg (IVDR)와 이의 분자량을 나타낸다.
도 12는 Fraction 2 분획물 유래 펩티드의 아미노산 서열, Val-Ala-Ser-Val-Ile (VASVI)와 이의 분자량을 나타낸다.
도 13은 Fraction 2 분획물 유래 펩티드의 아미노산 서열, Trp-Tyr-Lys (WYK)와 이의 분자량을 나타낸다.
도 2는 광어 연육 가수분해물의 라디칼 소거 활성을 측정한 것이다.
도 3은 Vero에서의 광어 연육 가수분해물의 산화적 스트레스 보호효과를 나타낸 것이다.
도 4는 광어 연육 가수분해물의 apoptosis 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 제브라피쉬를 이용한 광어 연육 가수분해물의 처리에 따른 생존률 및 심박수 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 제브라피쉬를 이용한 광어 연육 가수분해물의 처리에 따른 ROS 생성량, 지질 과산화, 세포사멸을 측정한 것이다.
도 7은 제브라피쉬에서 연육 가수분해불을 처리하였을 때 Pro-apoptosis mRNA 발현 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 Sephadex G-25컬럼을 이용한 광어 연육 가수분해물의 크기배제크로마토그래피을 나타낸 것이다.
도 9는 광어 연육 가수분해물의 분획물의 역상크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 크기배제크로마토그래피 분획물의 Alkyl 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 Fraction 2 분획물 유래 펩티드의 아미노산 서열, Ile-Val-Asp-Arg (IVDR)와 이의 분자량을 나타낸다.
도 12는 Fraction 2 분획물 유래 펩티드의 아미노산 서열, Val-Ala-Ser-Val-Ile (VASVI)와 이의 분자량을 나타낸다.
도 13은 Fraction 2 분획물 유래 펩티드의 아미노산 서열, Trp-Tyr-Lys (WYK)와 이의 분자량을 나타낸다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예
1: 원료구입 및 연육,
연제품
제조
본 발명에 사용된 연육은 제주 광어의 두부와 내장, 껍질, 뼈 등을 제거하고 어육만을 얻은 후, chopper (M-12S, 한국후지공업, 한국)로 마쇄하였다. 이 후 시료의 5배의 0.2% 중합인산염 (Na5P3O10, (주)이에스기술연구소, 한국)을 첨가하여 20분간 침지 후, 같은 부피의 냉수를 추가하여 수세하고, 수세수를 제거하는 공정을 4회 반복하였다. 이 후 체거르기하여 기타 협잡물을 제거하고, 탈수기(W-110, (주)한일, 한국)로 탈수하였다. 탈수된 어육을 stephan mixer (774027-01, UMC 5 Electronic Co. LTD, Germany)를 이용하여 4% 솔비톨 ((주) 엘지생활건강, 한국), 4% 설탕 ((주) 백설, 한국), 0.2% 중합인산염을 혼합한 후, 500g씩 케이스에 보관하여 -70℃에서 보관하였다. 연제품은 냉동된 연육을 4℃에서 저온해동 시킨 후, 20분간 stephan mixer에서 초벌갈이, 20분간 2% 식염 첨가 후 두 번갈이, 20분간 2% 전분 첨가 후 세 번갈이를 하였다. 이후 지름 2cm의 원통형 폴리에틸렌비닐에 주입하여 케이싱하고 24시간 동안 4℃에서 자연 응고시켰다. 이 후, 85℃ water bath에서 30분 동안 가열하고 4℃에서 저온냉각시켜 연제품의 물리적 특성 실험에 사용하였다. 도 1은 상기 방법으로 제조된 광어 연육과 광어 연제품을 나타낸다.
실시예
2: 광어를 이용하여 제조한 연육 및
연제품의
이화학적 특성 분석
1) 일반성분함량 분석
일반성분은 AOAC법 (1995)에 따라 수분은 상압가열건조법, 조단백질은 semimicro Kjeldahl 법, 조회분은 건식회화법 및 조지방은 Soxhlet법으로 각각 측정하였다. 중금속 중 총 수은은 시료를 동결건조한 다음 수은분석기(SP-3A, Nippon instrument Co., Tokyo, Japan)를 이용하는 combustion gold amalgamation법으로 분석하였고, 납은 질산으로 유기질을 습식 분해하여 시료를 조제한 다음 inductively coupled plasma spectrophotometer(ICP) (Atomscan 25, TJA, USA)로 분석하였다.
2) 중금속 함량 분석
구성아미노산 분석을 위하여 Agilent 6890N GC-FID 기기를 사용하였으며, 컬럼: ZB-AAA (10 meter * 0.25mm), 주입부 온도 250℃, 온도조건: 110℃ ~ 320℃, 검출기 320℃, 주입량: 2㎕, split ratio 5:1, 운반기체: Nitrogen, 1.5mL/min의 조건으로 분석하였으며, 표준용액은 phenomenex사의 Amino acid standard를 사용하였다.
실시예
3: 광어를 이용하여 제조한 연육 및
연제품의
물리적 특성 분석
1) 백색도 측정
백색도는 Park (1994)이 언급한 방법을 약간 변형하여 직시색차계 (NE4000, Nippon Denshoku Industries Co., Japan)로 측정하였다. 백색도는 해동한 수리미(surimi, 연육)의 경우 용기에 채워서, 그리고 원형 어묵(연제품)의 경우 표면이 일정한 크기 (2.5 x 2.5 cm)로 평형이 되게 절단한 전단면을 시료로 하여 색차계로 Hunter L, a 및 b값을 측정하였다. 이 때 직시색차계의 표준백판은 L값이 100.05, a값이 -0.03 및 b값이 0.01 이었다.
2) 겔 강도 측정
겔 강도는 Okada (1963)의 방법을 약간 변형하여 측정하였고, 시료는 원형 어묵(연제품)을 일정한 크기 (2.5×2.5 cm)로 절단하여 사용하였다. 즉, 겔 강도는 Sun rheometer (COMPAC-100, Sun Scientific Co., Japan)를 이용하여 시료의 하중과 깊이를 각각 측정한 다음, 하중 x 깊이로 나타내었다. 이 때, rheometer의 load는 1 kg으로 하였고, plunger의 속도는 20 mm/min로 하였으며, plunger는 직경 5 mm의 구형을 사용하였다.
실시예
4:
광어연육
섭취시의 생리활성 측정
1) 인공소화액 제조 및 인공소화액 처리
인공소화모델에 사용되는 인공위액과 인공장액은 Hur (2011)의 방법을 약간 변경하여 사용하였으며, 조성은 표 1에 나타내었다. 광어 연육 500g에 인공위액 1L를 첨가 후, pH를 1.5로 조정하고, 37℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 이 후 pH를 8로 조정 후, 인공장액 1L를 첨가하여, 37℃에서 4시간 동안 다시 교반하였고, 이 후 95℃에서 효소 불활성화 단계를 거쳐 잔사를 제거하고 실험에 사용하였다.
| 인공위액 | 인공장액 | |
| Inorganic solution | 15.7 mL NaCl 175.3 g/L 3.0 mL NaH2PO4 88.8 g/L 9.2 mL KCl 89.6 g/L 18 mL CaCl2·2H2O 22.2 g/L 10 mL NH4Cl 30.6 g/L 6.5 mL HCl 3.7% g/g |
40 mL NaCl 175.3 g/L 40 mL NaHCO3 84.7 g/L 10 mL KH2PO4 8 g/L 6.3 mL KCl 89.6 g/L 10 ml MgCl2 5g/L 180 ㎕ HCl 37% g/g |
| Organic solution | 10 mL glucose 65 g/L 10 mL glucuronic acid 2 g/L 10 mL glucosamine hydrochloride 33 g/L |
|
| Enzyme and etc | 2.5g Pepsin 907.6 mL DW |
9 ml CaCl2·2H2O2 22.2 g/L 8g Trypsin 2g a-Chymotrypsin 884.52 mL DW |
2) 라디칼 소거능 측정
ESR (Electron Spin Resonance Spectrometer, JES-FA ESR, JEOL, Japan)을 이용한 라디칼 소거능을 확인하기 위해 제주대학교 공동실험실습관에 보유하고 있는 ESR 기기를 사용하였으며, 실험방법은 Hiramoto (1993)의 방법을 변형하여 사용하였다. 시료 20 μL와 증류수 20 μL을 혼합 후, 40 mM AAPH 20 μL와 40 mM POBN 20 μL를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 모세관튜브로 옮긴 후 측정하였다. 분석에 사용된 조건은 central field 3475 G, modulation width 0.2 mT, amplitude 500 mT, scan width 10 mT, microwave power 8mW로 설정한 후 측정하였다.
3) 산화적 스트레스로부터 세포보호효과
산화적 스트레스로부터 세포보호효과를 측정하기 위해 monkey kidney fibroblast cell line (Vero, KCKB No. 10081)이 사용되었으며, 세포는 37℃의 인큐베이터에서 5%의 CO2를 공급해주며 배양하였다. 배양에 사용된 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA)와 streptomycin (100 μL/mL)을 첨가하여 사용하였다.
4) 세포에서의 apoptosis와 necrosis를 형태학적으로 확인
세포에서의 apoptosis와 necrosis를 형태학적으로 확인하기 위하여 McKeague의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. Vero cell을 24-well plates에 각 well 당 5×104으로 500 μL의 medium과 함께 분주하고 5% CO2가 공급되는 incubator에서 16시간 배양하였다. 그 후 샘플을 농도별로 처리한 후 48시간 동안 배양하고 Hoechst 33342 (1X)과 propidium iodide 염색약을 10분 동안 반응시켜 형광현미경으로 관찰하였다.
5) 제브라피쉬에서의 항산화 효과
24 well plate에 well 당 15-20개의 수정 후 7-9 hpf (hour post fertilization)가 지난 제브라피쉬 embryo를 넣고, embryo media 0.9 mL을 채웠다. sample을 1시간 처리한 후 AAPH를 50 μL을 처리하고, 3 dpf (day post fertilization)때에 형광 (ROS production, Lipid peroxidation production, Cell death)을 통하여 항산화 활성을 측정하고, 생존율은 7일까지 확인하였다.
6) 제브라피쉬에서 활성산소(ROS) 측정
제브라피쉬에서 활성산소(ROS)를 측정하기 위하여, 24 well plate에서 sample과 자극물질이 처리된 제브라피쉬를 한 마리씩 96 well plate에 옮기고, DCFH-DA 용액(20 μg/mL)을 1시간 동안 28.5℃의 암실에서 반응시켜, ROS 생성량을 측정하였다. 반응시간이 끝난 후 새로운 embryo media로 2차례 세척 후에 MS-222(0.003%)로 1분 동안 마취 시킨 후 현광현미경을 이용하여 형태학적으로 관찰하며 image J 프로그램을 이용하여 수치화시켰다
7) 지질과산화(Lipid peroxidation)의 생성량 측정
지질과산화(Lipid peroxidation)의 생성량을 측정하기 위해 24 well plate에서 sample과 자극물질이 처리된 제브라피쉬를 한 마리씩 96 well plate에 옮기고, DPPP(25 μg/ml)을 2시간동안 28.5℃의 암실에서 반응시켜 lipid peroxidation 생성량을 측정하였다. 반응시간이 끝난 후 새로운 embryo media로 2차례 세척 후에 MS-222(0.003%)로 1분 동안 마취 시킨 후 현광현미경을 이용하여 형태학적으로 관찰하며 image J 프로그램을 이용하여 수치화시켰다.
8) 제브라피쉬에서 세포사멸 측정
제브라피쉬에서 세포사멸을 측정하기 위해 24 well plate에서 sample과 자극물질이 처리된 제브라피쉬를 한 마리씩 96 well plate에 옮기고, Acridine orange 용액(7 μg/mL)을 30분 동안 28.5℃의 암실에서 반응시켜 세포사멸을 측정하였다. 반응시간이 끝난 후 새로운 embryo media로 2차례 세척 후에 MS-222(0.003%)로 1분 동안 마취 시킨 후 현광현미경을 이용하여 관찰하며 image J 프로그램을 이용하여 수치화시켰다.
9) 제브라피쉬에서의 독성(Toxicity) 측정
제브라피쉬에서의 독성(Toxicity) 측정은 24 well plate에 well 당 15-20개의 수정 후 3-4 hpf (hour post fertilization)이 지난 제브라피쉬 embryo를 넣고, embryo media 0.95 mL을 채워준 후 sample을 50 μL 처리하였다. 2 dpf (day post fertilization) 때에 심박수를 측정하며, 3 dpf에 세포사멸(Cell death)을 통하여 독성 정도를 측정하고, 생존율은 7일까지 확인하였다.
10) 제브라피쉬에서의 심박수 (Heart Beating rate) 측정
제브라피쉬에서의 심박수 (Heart Beating rate) 측정은 2 dpf의 제브라피쉬를 슬라이드 글라스 위에 올려놓고 현미경을 통하여 1분 동안 심장이 뛰는 횟수를 측정하였다.
11) 제브라피쉬에서의 real-time PCR을 통한 pre-apoptosis 사이토카인(cytokine) 측정
3 dpf의 제브라피쉬를 e-tube에 넣고 TRIzol Reagent를 넣어 lysis를 시켜주었다. 실온에서 5분간 반응 시킨 후 클로로포름 넣어 2-3분간 반응시킨 후 12,000 g, 4℃에서 20분간 원심 돌려 상층액을 얻어냈다. 얻어낸 상층액을 새로운 e-tube에 옮기고 100% isopropanol을 넣어 10분간 반응 후 12,000 g, 4℃에서 10분간 원심 돌려 상층액을 버렸다. 얻은 펠렛을 75% 에탄올로 씻어내 준 후 7500 g, 4℃에서 5분간 원심 분리 후 상층액을 버리고 5-10분간 공기 중에 드라이시켜주었다. RNA를 녹이기 위해 50 Μl의 RNase-free water을 넣고 60℃에서 10-15분간 녹여주었다. RNA를 정량 후에 cDNA를 합성시켜 제작된 p53, Bac, Bid, caspase8, caspase3 증폭용 프라이머와 반응시켜 real-time PCR을 통해 발현정도를 확인하였다.
실험예
1. 광어를 이용하여 제조한 연육의 일반성분분석 및 중금속 함량 분석
본 발명에 사용된 어종인 광어를 이용하여 냉동 연육을 제조하였으며, 제조한 연육의 일반성분 분석 결과는 표 1에 나타내었다. 그 결과, 광어 연육의 수분함량은 73.18%였으며, 단백질 함량은 18.93%를 나타내었다.
| 연육 | 일반성분 (g/100g) | ||||
| 수분 | 단백질 | 탄수화물 | 지방 | 회분 | |
| 광어연육 | 73.18±0.26 | 18.93±0.98 | 7.68±0.65 | 0.11±0.03 | 0.10±0.00 |
연육(surimi, 수리미)의 중금속 함량 규격 기준은 담수산 어·패류로 제조한 것은 중금속이 10.0 mg 이하/kg인 것으로 정의하고 있으며, 수은 함량의 경우 해산어·패류 (심해성 어·패류 및 참치류 제외)로 제조한 것은 총 수은이 0.5 mg 이하/kg인 것, 납 함량은 해산어·패류 (심해성 어·패류 및 참치류 제외)로 제조한 것은 납이 2.0 mg 이하/kg인 것으로 규정하고 있다.
광어 연육의 중금속 함량 분석 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 광어 연육에서 납, 카드뮴, 비소는 검출되지 않았으며, 수은은 기준치 미달인 0.02 mg/kg을 나타내는 것을 확인하였다.
| 중금속 함량 (ppm) | ||||
| 납(Pb) | 카드뮴(Cd) | 수은(Hg) | 비소(As) | |
| 광어연육 | 비검출 | 비검출 | 0.02±0.00 | 비검출 |
| SA급 시판명태연육 | - | - | 0.01±0.00 | - |
광어 연육 500g에 인공위액 1L를 첨가 후, pH를 1.5로 조정하고, 37℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 이 후 pH를 8로 조정 후, 인공장액 1L를 첨가하여, 37℃에서 4시간 동안 다시 교반하였고, 이 후 95℃에서 효소 불활성화 단계를 거쳐 잔사를 제거하고 실험에 사용하였다.
광어 연육과 광어 연육 가수분해물의 구성 아미노산을 분석한 결과는 표 4에 나타내었다. 주요 아미노산인 Leucine, Glutamic acid와 Lysine이 많은 함량을 차지하는 것은 변하지 않았으며, Lysine의 경우 가수분해 후 감소하였고, Cystine의 경우 가수분해 후 검출되는 것을 확인하였다.
| 광어연육 | 광어연육가수분해물 | |
| Alanine | 11570 (2.52) | 7926 (3.02) |
| Glycine | 8710 (1.89) | 6398 (2.45) |
| Valine | 19866 (4.33) | 14619 (5.59) |
| Noraline | - | 2459 (0.96) |
| Leucine | 47553 (10.35) | 28789 (11.02) |
| Isoleucine | 18951 (4.13) | 10680 (4.09) |
| Threonine | 7818 (1.70) | 5660 (2.18) |
| Serine | 5661 (1.24) | 4497 (1.72) |
| Proline | 7164 (1.57) | 5017 (1.91) |
| Aspartic acid | 28490 (6.20) | 15290 (5.86) |
| Methionine | 10656 (2.33) | 4248 (1.61) |
| 4-Hydroxyproline | - | - |
| Glutamic acid | 51177 (11.14) | 26597 (10.18) |
| Phenylalanine | 41741 (9.07) | 24203 (9.26) |
| Lysine | 135164 (29.41) | 66251 (25.37) |
| Histidine | 34825 (7.57) | 18136 (6.93) |
| Hydroxylysine | - | - |
| Tyrosine | 30097 (6.55) | 17916 (6.85) |
| Cystine | - | 2650 (1.00) |
실험예
3: 광어
냉동연육의
백색도
동결 연육의 일반적인 아시아의 등급기준에는 수분함량, 겔강도, 전단변형, 탄력관능검사, 백색도 등의 항목이 있으며, 그 중, 백색도는 45 이상이 A등급, 47 이상 SA등급, 49 이상 3A 등급으로 분류된다. 따라서 백색도는 냉동연육의 등급을 결정짓는 중요한 항목으로 백색도가 높은 연육은 프리미엄 연제품에 사용되는 고급 소재로 사용되고 있다. Heu (2010)의 연구결과에 따르면, 일반적으로 시판 연육은 SA, FA, AA, A KA, KB, RA 등급이 사용되고 있으며, 이들의 등급은 백색도가 높을수록 연육의 등급이 높아졌다고 보고하고 있다.
본 발명에 사용된 연육은 SA급으로 삼진어묵에서 사용되고 있는 연육을 제공받았으며, 백색도를 측정하여 L-3b로 환산하였을 때, 26.56을 나타내어 KB급의 백색도를 나타내었다. 이는 연육의 저장기간과 저장방법 등에서 백색도의 저하가 나타난 것으로 보이며, 광어 연육의 경우 63.6의 높은 수치를 나타내어 SA급 시판 연육보다 백색도가 우수한 것으로 나타났다.
| 백색도 | |||
| L (Whiteness) |
a (Redness) |
b (Yellowness) |
|
| 광어연육 | 63.60±0.98 | 0.13±0.01 | 1.18±0.03 |
| SA급 시판명태연육 | 54.70±1.13 | - 0.74±0.0.9 | 9.38±0.09 |
실험예
4: 광어
연제품의
백색도 및
겔강도
연제품의 겔 강도는 연제품의 등급을 결정짓는 중요한 요인으로 제품의 식감을 상승시키는 요인으로 평가되고 있다. Heu (2010)의 연구 결과에 따르면, SA급 명태 연제품의 겔강도는 SA급 945.2 g×cm, FA급 782.0 g×cm, AA급 747.3 g×cm, A급 611.1 g×cm, KA급 628.1 g×cm, KB급 444.5 g×cm, RA급 256.8 g×cm의 겔 강도를 나타내며, 연제품의 등급별로 상이한 겔 강도를 가지고 있다고 보고되었다.
명태 연제품의 겔 강도는 1012 g×cm로 SA급과 유사한 겔 강도를 보였으며, 연제품 제조조건에 차이에 따라 약간의 겔 강도 차이가 있는 것으로 보인다.
광어 연제품의 경우 1064 g×cm의 겔 강도를 보였고, 또한 가열 및 냉각 과정을 거쳐 단백질의 특성상 변성이 잘 되므로 가열 및 조리과정을 거치며 색도가 떨어지는 현상이 나타날 수 있어 연제품을 만든 후 백색도를 다시 측정하였다. 그 결과, 조리과정을 거치며 연육 상태에서의 값과 차이점이 큰 것을 확인할 수 있었으며, 광어 연제품은 89.32의 값을 나타내어 명태 연제품보다 우수한 백색도를 나타내었다.
| Surimi | -헌터색차 | 겔 강도 (g × cm) |
||
| L (Whiteness) |
A (Redness) |
B (Yellowness) |
||
| 광어 연제품 | 89.32±1.26 | 1.22±0.23 | 11.82±0.89 | 1064±8.63 |
| SA급 시판명태연제품 | 63.60±1.23 | 1.42±0.36 | 4.39±1.10 | 1012±11.3 |
실험예
5:
광어연육
섭취시 생리활성 측정
가) ESR을 이용한 광어 연육 가수분해물의 라디칼 소거능 활성
Free radical은 생물학적 손상의 주요 요인으로 잘 알려져 있는데, DPPH와 Alkyl radical은 항산화 활성 평가를 하는데 주로 사용하는 라디칼 중 하나이다. 따라서 광어 연육이 소화되었을 때 체내에서 어떠한 항산화 활성을 갖는지 평가하였고, DPPH와 alkyl radical 소거능 결과는 도 2에 나타내었다. 전반적으로 농도가 높아짐에 따라 활성이 증가하는 경향을 보였으며, 농도별로 유의적으로 라디칼 소거능이 증가하는 것을 확인하였다. DPPH radical 소거능의 경우 10.61 mg/mL의 IC50 값을 나타내었으며, alkyl radical의 경우 1.09 mg/mL의 IC50값을 나타내었다.
나) Vero에서의 광어 연육 가수분해물(surimi digest)의 산화적 스트레스 보호효과
ESR 기기를 이용하여 라디칼을 소거하는 결과를 얻고, 다음으로 세포에서 산화적 스트레스를 유도시킨 후 연육 가수분해물이 얼마나 ROS로부터 세포를 보호하는지 MTT법을 이용하여 측정하였으며 결과는 도 3에 나타내었다. 세포에서 AAPH만 처리하여 자극을 주었을 때, 생존률이 70%인 반면, 광어 연육 가수분해물을 농도별로 처리하였을 때, 농도의존적으로 세포 생존률이 증가하는 경향을 보였다.
다) 광어 연육 가수분해물의 apoptosis 억제 효과
Vero 세포에서 시료의 농도가 증가함에 따라 세포의 생존률이 증가하는 것을 propidium iodid (PI)와 Hoechst 33342로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 도 4의 결과를 보면 Control군에선 Hoechst 33342에 의해 하얗거나 propidium iodid (PI)에 의해 붉은색으로 염색된 세포가 거의 보이지 않으나, AAPH를 처리하였을 때, 세포사멸이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 이렇게 산화적 스트레스를 일으켜 세포사멸이 유도된 세포에 광어 연육 가수분해물을 농도별로 처리하였을 때, 농도의존적으로 세포사멸이 감소하는 것을 확인하였다.
라) 광어 연육 인공소화액 가수분해물의 in vivo model에서 항산화 활성 평가
제브라피쉬는 실험동물모델인 마우스를 대체할 수 있는 실험동물로 각광받고 있는 모델이며, 빠른 생활사를 갖고 있어 난에서 부화한지 6개월이면 성체로 성장하며, 한번에 200여개의 난을 낳기 때문에 많은 실험모델을 확보할 수 있다. 또한 인간의 장기시스템과 상당부분 유사하며, 유전자도 상동성이 높아 인간의 질병 및 기능성 연구에 많이 사용되고 있는 모델이다. 실험을 위하여 수온은 28℃로 유지하였으며, pH는 7.0~7.5, 하루 14시간씩 빛을 조사하였다.
① 제브라피쉬를 이용한 생존률 및 심박수 측정
본 발명에서는 제브라피쉬를 이용하여 in vivo에서 광어 연육 가수분해물의 항산화 실험을 진행하였다. 제브라피쉬에서도 역시 AAPH를 산화적 스트레스를 유도시키는 자극물질로 사용하였으며, 7일 동안 AAPH를 처리하였을 때 생존률이 60%로 감소하였고, 광어 연육 가수분해물을 처리함에 따라 생존률이 증가하였다 (도. 5). 심박수 역시 AAPH로 유발된 산화적 스트레스에 의해 심박수가 증가하는 것을 보인 반면, 광어 연육 가수분해물을 처리하였을 때, 심박수가 정상수치에 근접하는 결과를 확인할 수 있었다.
② 광어 연육 가수분해물의 ROS 생성 억제 활성 측정
광어 연육 가수분해물이 산화적 스트레스로 인한 ROS 생성량을 얼마나 감소시키는지 확인한 결과(도. 6A), AAPH만을 단독으로 처리하였을 때 ROS생성량이 30% 증가하였고, 광어 연육 가수분해물을 처리함에 따라 농도 의존적으로 ROS 생성량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 형광현미경을 이용하여 형태학적으로 관찰하였을 때, ROS가 발생함에 따라 발광하는 부분이 광어 연육 가수분해물을 처리함에 따라 감소하는 것을 육안으로도 관찰할 수 있었다.
산화적 스트레스에 의해 발생하는 지질과산화 역시 광어 연육 가수분해물의 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며(도. 6B), 세포사멸 또한 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(도. 6C).
따라서, 본 발명에서는 상기 In vitro와 In vivo 실험들을 통해, 사람이 광어 연육을 실제로 섭취하고 위장관을 거치며 소화액에 의해 소화를 하였을 때, 체내에서의 항산화 활성을 갖는 것을 확인한 것이다.
③ 광어 연육 가수분해물의 Pro-apoptosis mRNA 발현 저해 효과
제브라피쉬에 광어 연육 가수분해물을 처리하였을 때, pro-apoptosis에 관여하는 mRNA가 저해되는지 확인하였으며, 결과는 도 7에 나타내었다. 세포의 apoptosis에 관여하는 주요 경로로는 세포가 외부에서 데미지를 받게 되면 p53을 통해 Bax가 발현되고 이는 Caspase 3, 6, 7의 증가로 이어지며, 다시 caspase 8, 10과 Bid가 발현하는 것으로 알려져 있다. 따라서 세포의 apoptosis에 관여하는 인자들의 변화를 측정하기 위해, 광어 연육 가수분해물을 농도별로 처리하였다.
모든 mRNA에서 AAPH를 처리하였을 때 수치가 상승하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 자극 물질 AAPH가 제브라피쉬에 산화적스트레스를 유도시킨다고 예상할 수 있다. 또한, 광어 연육 가수분해물 시료를 농도별로 처리하였을 때, p53, Bax, Bid가 농도 의존적으로 감소하였으며, caspase 8과 caspase 3 역시 농도의존적으로 감소하진 않지만 광어 연육 가수분해물에 의해 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
마) Sephadex G-25 컬럼을 이용한 광어 연육 가수분해물 유래 항산화 활성 펩타이드의 분리
Sephadex G-25와 크기배제크로마토그래피를 이용하여, 광어 연육 가수분해물을 분자량 사이즈별로 분획하여 총 3개의 분획물을 얻었으며, 도 8은 Sephadex G-25컬럼을 이용한 광어 연육 가수분해물의 크기배제크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. 각 분획물들의 역상크로마토그램은 도 9에 나타내었으며, 각 분획물들은 220nm와 280nm의 파장에서 측정하였다. 분획물 1은 매우 많은 피크들이 검출되어 분획물 내에 다량의 물질들이 함유된 것으로 보이며, 분획물 2는 주요 피크 1개외에 작은피크가 검출되어 90% 이상의 순도를 나타내었고 분획물 3은 주요 피크 1개 외에 피크들이 검출되지 않아 95% 이상의 순도를 나타내었다.
바) 크기배제크로마토그래피 분획물의 Alkyl 라디칼 소거능 측정
상기 Sephadex G-25를 이용하여 얻어진 3개의 분획물의 Alkyl 라디칼 소거능을 측정하였다. 표 7을 참고하면, 분획물 1은 5 kDa을 초과하는 단백질을 포함하며, 분획물 2는 1 kDa 이하, 분획물 3은 1 Kda 미만의 단백질을 포함하는 것을 알 수 있었다.
도 10은 Sephadex G-25를 이용한 크기배제크로마토그래피 분획물의 alkyl 라디칼 소거능을 측정한 결과를나타낸 것이다. 그 결과, F2와 F3의 분획물에서 우수한 알킬 라디칼 소거능을 나타내었다.
다음으로, 분획물 중에서 수율이 높고, 알킬 라디칼 소거능이 높은 F2 분획물을 이용하여 펩티드들의 분자량 및 아미노산 서열을 Q-TOF mass spectrometer (Micromass, Altrincham, UK) electrospray ionization (ESI)을 사용하여 측정하고 그 결과를 도 11 내지 13에 나타내었다. 도 11 내지 13은 Fraction 2 분획물 유래 펩타이드들의 아미노산 서열과 분자량을 나타낸다. 도 11을 참고하면, Fraction 2 분획물 유래 펩티드의 아미노산 서열은 Ile-Val-Asp-Arg (IVDR) 이고, 분자량은 502.30 Da으로 나타났다. 도 12를 참고하면, Fraction 2 분획물 유래 펩티드의 아미노산 서열은 Val-Ala-Ser-Val-Ile (VASVI) 이고, 분자량은 488.32 Da으로 나타났다. 또한, 도 13을 참고하면, Fraction 2 분획물 유래 펩티드의 아미노산 서열은 Trp-Tyr-Lys (WYK) 이고, 분자량은 496.25 Da으로 나타났다.
광어 연육 가수분해물의 분획물 2에서 분리된 3가지 펩티드들의 항산화 효과를 확인하기 위하여 알킬라디칼 소거능을 측정하였다. 그 결과는 표 8에 나타내었으며, IVDR은 68 ㎍/ml의 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 나타내었고, WYK 펩티드는 40 ㎍/ml, VASVI 펩티드는 77 ㎍/ml의 농도에서 50%의 소거능을 나타내었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Flounder surimi with anti-oxidant effect and manufacturing method
thereof
<130> DP20170138
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Paralichthys olivaceus
<400> 1
Ile Val Asp Arg
1
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Paralichthys olivaceus
<400> 2
Val Ala Ser Val Ile
1 5
<210> 3
<211> 3
<212> PRT
<213> Paralichthys olivaceus
<400> 3
Trp Tyr Lys
1
Claims (8)
- 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 항산화용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 광어의 가수분해물에서 분리된 것인, 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 광어 연육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 것인, 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것인, 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 광어의 연육인 것인, 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 광어의 연제품인 것인, 식품 조성물.
- 광어를 마쇄 및 수세한 다음 정제 처리하는 단계를 포함하는, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 항산화용 식품 조성물의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 식품 조성물은 광어의 연육 또는 광어의 연제품인 것인, 식품 조성물의 제조방법.
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|---|---|---|---|
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| KR (1) | KR101918692B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112521477A (zh) * | 2021-01-20 | 2021-03-19 | 福建农林大学 | 一种天然肉制品抗氧化护色剂的制备方法及应用 |
-
2017
- 2017-09-01 KR KR1020170111944A patent/KR101918692B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Bin Wang 외 4명, ‘Preparation and evaluation of antioxidant peptides from ethanol-soluble proteins hydrolysate of Sphyrna lewini muscle’, Peptides 36, 240-250, 2012.* |
| Food and Chemical Toxicology 52(2013), 113-120.* |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112521477A (zh) * | 2021-01-20 | 2021-03-19 | 福建农林大学 | 一种天然肉制品抗氧化护色剂的制备方法及应用 |
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