JP4688471B2 - 新規生理活性ペプチド - Google Patents
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Description
項1. 下記(i)又は(ii)のペプチド:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチド、
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列において1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ根毛形成促進活性を有するペプチド。
項2. 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
項3. 項1又は2に記載のペプチドを含有する、農園芸用組成物。
項4. 植物成長促進剤、根毛形成促進剤、土壌改善剤、又は土壌浄化微生物の活性化剤である、項3に記載の農園芸用組成物。
項5. 項1又は2に記載のペプチドを含有する、食品組成物。
項6. 代謝機能活性化用、免疫増強用、育毛用又は感染症防除用の食品である、項5に記載の食品組成物。
項7. 項1又は2に記載のペプチドを含有する、医薬組成物。
項8. 代謝障害による疾病、高血圧症、脱毛、又は免疫低下による疾病の予防又は治療剤である、項7に記載の医薬組成物。
項9. 項1又は2に記載のペプチドを含有する、飼料組成物。
項10. バチルス・サーキュランスHA12株によって産生されるアルカリプロテアーゼを含む、大豆タンパク質原料から項1又は2に記載のペプチドを生成するための酵素剤。
項11. アルカリプロテアーゼがセリンプロテアーゼである、項10に記載の酵素剤。
項12. アルカリプロテアーゼが下記性質を有するものである、項10又は11に記載の酵素剤:
(a)作用:大豆タンパク質原料を加水分解して項1又は2に記載のペプチドを生成する。
(b-1)作用pH:pH6〜12で活性を示す。
(b-2)至適pH:pH9〜12、最適pHは10である。
(c-1)作用温度:約55〜75℃で活性を示す。
(c-2)作用最適温度:70℃である。
項13. 更に、アルカリプロテアーゼが下記性質を有するものである項12に記載の酵素剤:
(d)分子量:28〜34kDa(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による)である。
(e)N末端のアミノ酸配列:配列番号2に示すアミノ酸配列を有する。
項14. アルカリプロテアーゼが下記性質を有するものである、項10又は11に記載の酵素剤:
(a)作用:大豆タンパク質原料を加水分解して項1又は2に記載のペプチドを生成する。
(b)至適pH:pH9〜12
(c)作用最適温度:70℃
(d)分子量:28〜34kDa(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による)
(e)N末端のアミノ酸配列:配列番号2に示すアミノ酸配列を有する。
項15.大豆タンパク質原料が大豆粕である、項10乃至14のいずれかに記載の酵素剤。
項16.大豆タンパク質原料がKunitzトリプシンインヒビターを含むものである、項10乃至15のいずれかに記載の酵素剤。
項17. 項10乃至16のいずれかに記載の酵素剤を大豆タンパク質原料に作用させることを特徴とする、下記(i)又は(ii)のペプチドの製造方法:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチド、
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列において1若しくは2以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ根毛形成促進活性を有するペプチド。
項18. 大豆タンパク質原料が大豆粕である、項17に記載の製造方法。
項19. 大豆タンパク質原料がKunitzトリプシンインヒビターを含むものである、項17又は18に記載の製造方法。
項20. 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるペプチドの製造方法である、項17乃至19のいずれかに記載の製造方法。
I.生理活性ペプチド(以下、「本発明ペプチド」と標記する)
本発明ペプチドは、配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチドである。
本発明ペプチドを含有する農園芸用組成物は、該ペプチドの作用に基づいて、植物の根毛形成を促進し、植物の成長を促進することができる。故に、当該農園芸用組成物は、植物成長促進剤又は根毛形成促進剤として有用である。当該農園芸用組成物によれば、例えば、野菜・果実等の場合はその収穫量を増大させ、切り花等の場合は長期に亘る生育を可能とし、更にカルス等の場合はその分化・生育を促進することが可能になる。
本発明ペプチドを含有する食品組成物は、該ペプチドの作用に基づいて、代謝機能の活性化、免疫増強、育毛及び感染症の防除等といった生理活性を発揮することができる。故に、当該食品組成物は、代謝機能活性化用、免疫増強用、育毛用又は感染症防除用の食品として利用でき、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品(サプリメント)、病者用食品等として有用である。
本発明ペプチドを含有する医薬組成物は、該ペプチドの作用に基づいて、代謝改善、血圧降下、育毛及び免疫増強等といった生理活性を発揮することができる。故に、当該医薬組成物は、代謝障害による疾病、高血圧症、脱毛又は免疫低下による疾病等の予防又は治療剤として有用である。
本発明ペプチドを含有する飼料組成物は、該ペプチドの作用に基づいて、免疫増強、消化吸収能の増強、毛並み・毛艶の質向上等といった生理活性を発揮し、家畜・家禽、ペットの健全な生育を促進することができる。故に、当該飼料組成物によれば、家畜や家禽の生産性を高めることができ、またペットの健全な成長や健康増進が図られる。
以下、本発明ペプチドを大豆タンパク原料を酵素分解することにより製造する方法について説明する。
(a)作用:大豆タンパク質原料を加水分解して本発明ペプチドを生成する
(b-1)作用pH:pH6〜12で活性を示す。
(b-2)至適pH:pH9〜12、最適pHは10である。
(c-1)作用温度:約55〜75℃で活性を示す。
(c-2)作用最適温度:70℃である。
(d)分子量:28〜34kDa(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による)である。
(e)N末端のアミノ酸配列:配列番号2に示すアミノ酸配列を有する。
(1)バチルス・サーキュランスHA12株由来のアルカリプロテアーゼ;変異型サーモリシン;バチルス・リケニフォルミス由来のアルカリプロテアーゼ;及び放線菌由来のケラチナーゼよりなる群から選択される少なくとも1種の酵素を含有することを特徴とする、大豆タンパク質原料から本発明ペプチドを生成するための酵素剤。
(2)本発明ペプチドが配列番号1に示すアミノ酸配列からなるものである、上記(1)に記載の酵素剤。
(3)大豆タンパク質原料が大豆粕である、上記(1)又は(2)に記載の酵素剤。
(4)大豆タンパク質原料が、Kunitzトリプシンインヒビターを含有するものである、上記(1)乃至(3)のいずれかに記載の酵素剤。
参考例1.大豆粕分解物(以下、「DSP」と表記する)の作製
LB液体培地5 mlにバチルス・サーキュランスHA12株を一白金耳植菌し、37 ℃で一晩振とう培養した。この前培養液を10 %(w/v)大豆ミール培地(ホーネン、東京)に1 %(v/v)植菌し、50 ℃、120 rpm、48時間培養した。培養液を遠心分離し、得られた上清のpHが9.0をこえたものをDSPとした。かくして得られたDSPを以下に記載の根毛形成促進活性の測定に使用した。
1.バチルス・サーキュランスHA12株由来アルカリプロテアーゼの製造
10 w/v%大豆ミール含有水溶液をオートクレーブ滅菌(121℃、15 分)し、20℃、10,000 rpm、10 分遠心分離した。上清を凍結乾燥(凍結乾燥機FDU-830、東京理化器械、東京)し、これを大豆ミール上清とした。
かくして精製したHA12株由来アルカリプロテアーゼをSDS−PAGEにより分子量分析に供した。得られた結果を図1に示す。この結果、HA12株由来アルカリプロテアーゼは、分子量が約30 kDaであることが明らかとなった。
HA12株由来アルカリプロテアーゼのN末端アミノ酸配列の10残基について、同定した結は、Ala-Gln-Thr-Val-Pro-Tyr-Gly-Ile-Pro-Leuであることが確認された。
HA12株由来アルカリプロテアーゼ1g及びカゼイン(終濃度1.0重量%)を、100mM酢酸緩衝液(pH4.0又は5.0)、100mMリン酸緩衝液(pH5.0、6.0又は7.0)、100mMTris-HCl緩衝液(pH7.0、8.0又は9.0)、及びグリシン−NaOH緩衝液(pH9.0、10.0、11.0又は12.0)の各緩衝液10mlに溶解し、37℃で活性測定を行った。該活性測定において、反応初期の1分間に遊離した可溶性低分子分解物に含まれるチロシンの量を測定することにより、HA12株由来アルカリプロテアーゼ活性のpHによる影響を調べた。
HA12株由来アルカリプロテアーゼ1g及びカゼイン(終濃度1.0重量%)を、100mMTris-HCl緩衝液(pH8.5)10mlに溶解し、10〜100℃の範囲内の各温度で活性測定を行った。当該活性測定において、反応初期の1分間に遊離した可溶性低分子分解物に含まれるチロシンの量を測定することにより、HA12株由来アルカリプロテアーゼ活性の温度による影響を調べた。
プロテアーゼは、その活性中心のアミノ酸残基や活性中心に有している金属イオンによって分類されていることから、HA12株由来アルカリプロテアーゼがどのタイプのプロテアーゼであるかについて調べるために、酵素活性阻害剤を使用することでその確認を行った。本試験では、バチルス属が主に生産するセリンプロテアーゼ、及び金属プロテアーゼの阻害剤を用いて阻害実験を行った。セリンプロテアーゼ阻害剤にはPMSF(フェニルメチルスルホニル=フルオリド)、金属プロテアーゼ阻害剤にはEDTAを使用した。具体的には、HA12株由来アルカリプロテアーゼ1g及びカゼイン(終濃度1.0重量%)と共に、PMSF(終濃度0、1.0、5.0及び10.mM)又はEDTA(終濃度0、1.0、5.0及び10.mM)を100mMTris-HCl緩衝液(pH8.5)10ml中で共存させ、37℃で活性測定を行った。当該活性測定において、反応初期の1分間に遊離した可溶性低分子分解物に含まれるチロシンの量を測定することにより、HA12株由来アルカリプロテアーゼ活性の各種阻害剤による影響を調べた。
1.Kunitzトリプシンインヒビターの精製
低変性脱脂大豆粉末(不二製油株式会社、大阪)に15倍量の蒸留水を加え、pH 7.5に調節したのち室温で1時間静置した。静置後、9,000×g、30分遠心分離した。得られた上清をpH 4.5調節した後に4 ℃、10,000 rpm、10分で遠心分離した。得られた上清をホエー画分とし、凍結乾燥(凍結乾燥機FDU-830、東京理化器械、東京)した。
100 mM Tris-HCl (pH8.5) 30 mlに、大豆由来トリプシンインヒビター(和光純薬工業株式会社、大阪)0.03 gを加え0.1 %(w/v)Kunitzトリプシンインヒビター培地を作製し、オートクレーブ滅菌(121℃、15 分)した。そこに、上記で得られたバチルス・サーキュランスHA12株由来アルカリプロテアーゼを約30,000 U加え、37 ℃で4 時間振とうした。
Darco G-60(活性炭)(和光純薬株式会社、大阪)2 gを蒸留水200 mlで30 分洗浄した。その後、溶液を静置し、上清を除去した。洗浄後の活性炭と上記で得られたKunitzトリプシンインヒビター分解物20 mlを混合し、1 時間撹拌した。その後、8,000 rpm、10 分で遠心分離し、上清と活性炭に分けた。上清をろ紙およびフィルターを用いてろ過した。これを活性炭非吸着画分とした。
植物生長用培地(表1)に微量栄養素溶液(表2)を0.1 %(v/v)加え、Agarを溶解させ試験管(同径×全長(mm) 18×180)に10 mlずつ分注し、オートクレーブ滅菌(121 ℃、15 分)した。そこに、ろ過滅菌した試験サンプルを加え、ボルテックスで撹拌した。なお、本方法において、試験サンプルとして水を添加したものをコントロールとした。
次いで、上記で得られた活性炭吸着画分に、下記の装置、カラム及び条件で、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。
検出器: UV-8020(東ソー株式会社、東京)
ポンプ: CCPS(東ソー株式会社、東京)
カラム: G2000SW(東ソー株式会社、東京)
溶媒: 20 mM Tris-HCl buffer (pH7.0)
検出: UV(220 nm)
流速: 1 ml/min
カラム温度: 35 ℃。
上記で得られたフラクション3について、下記の装置及び条件のMALDI-TOFMSを行い、質量分析を行った。
装置: AXIMA-CFR plus
イオン検出: 正イオン liner mode
引き出し電圧: 20 kV
マトリックス: α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 10 mg/ml (0.1%TFA、50%MeCN saturated solution) Pulse Extraction ON。
次いで、Kunitzトリプシンインヒビターのアミノ酸既知全配列から分子量1198 Daに相当するペプチドを検索した。
根毛形成促進活性を有する予測されたペプチド(GGIRAAPTGNER)を化学合成し、上記方法に従って、根毛形成促進活性を測定した。なお、根毛形成促進活性の測定におけるサンプルについて、DSPはペプチド・アミノ酸濃度30μg/mlとし、上記のペプチドはペプチド濃度0.5又は1μg/mlとした。ペプチドの化学合成は株式会社ベックスに委託し、ペプチドの分子量は1198 Da、Purity>70%であった。
実施例1で得られたペプチド(GGIRAAPTGNER) 5.0
微結晶セルロース 38.0
ブドウ糖 45.0
カルメロースカルシウム 10.0
ステアリン酸マグネシウム 0.3
香料 1.7
合計 100.0重量%。
(重量%)
実施例1で得られたペプチド(GGIRAAPTGNER) 3.0
果糖ブドウ糖液 25.0
蜂蜜 5.0
クエン酸 0.8
アスコルビン酸 0.5
香料 適量
水 残量
合計 100.00重量%。
実施例1で得られたペプチド(GGIRAAPTGNER)を、養豚用の配合飼料に5重量%となるように配合し、該ペプチドを含有する飼料を調製した。
Claims (4)
- 配列番号1に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドを含有する、農園芸用組成物。
- 植物成長促進剤又は根毛形成促進剤である、請求項2に記載の農園芸用組成物。
- 請求項1に記載のペプチドを含有する、食品組成物。
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