KR101897701B1 - 배에서 추출된 효소를 포함하는 천연 소화제 조성물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 배를 분쇄 및 건조하여 배분말을 포함하는 재료를 제조하는 단계; (b) 재료를 시스테인 함유 용액과 혼합하여 단백질 분해효소를 용출하여, 조추출물을 포함하는 용액을 수득하는 단계; 및 (c) 조추출물을 포함하는 용액에 폴리에틸렌글리콜과 염을 첨가하여 정치시켜 층분리하고 상등액을 수득하는 단계; 및 (d) 상등액에서 염을 제거하여 단백질 분해효소 추출물을 수득하여 천연 소화제 조성물을 제조하는 단계;를 포함하는 천연 소화제 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 이에 의하여, 본 발명의 배 유래 천연 소화제 조성물의 제조방법은 추출의 조건을 조절하여 배에 포함된 식이섬유와 당의 함량을 최소화하고 단백질 분해효소의 함량을 최대화하여 순도를 80 내지 90%까지 향상시킬 수 있는 선택적 분리의 효과가 있다.

Description

배에서 추출된 효소를 포함하는 천연 소화제 조성물의 제조방법{METHOD FOR PREPARING NATURAL DIGESTANT COMPOSITION COMPRISING ENZYME EXTRACTED FROM PEAR}

본 발명은 소화제 조성물의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 배 유래의 단백질 분해 효소를 추출하는 방법을 도입한 천연 소화제 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

배(pear)는 다양한 생리활성물질 외에도 단백질 분해효소가 다량 함유되어 있다. 이와 같은 식물성 단백질 분해효소는 배에 포함된 프로테아제(protease), 파파야에 포함된 파파인(papain), 파인애플에 포함된 브로멜라인(bromelain), 키위에 포함된 액티니딘(actinidin), 무화과에 포함된 피신(ficin) 등이 있다.

단백질 분해효소를 함유하는 과일 또는 채소로부터 단백질 분해효소를 추출하는 방법으로 현재까지 알려진 방법은 통상적으로 단일방법이 아닌 2 내지 3 단계를 이용하는 방법으로서, 주로 고농도 염, 주로 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 이용하여 침전 및 투석(염제거) 후, 컬럼 크로마토그래피(ion-exchange, hydrophobic or affinity)를 이용하는 많은 노력과 시간이 소요되는 복잡한 과정을 이용해 정제하였다(Ojha, 1996; Karnchanatat et al., 2011; Costa et al., 2014).

이와 같이, 키위와 무화과 등의 과일 또는 채소로부터 단백질 분해효소를 단순 추출하는 기술은 알려져 있으나, 이를 통해 소화제(DIGESTAN)를 개발하는 기술에 대해서는 거의 알려져 있지 않고, 그 연구 또한 미미한 상태이다.

배의 추출물을 수득하여 소화제 조성물을 제조하는 경우 배 추출물에는 식이섬유와 당이 많아 단백질 분해효소의 순도가 낮아지는 문제점이 발생할 수 있으며, 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 식이섬유와 당을 침전시키는 방법을 사용하는 경우 단백질 분해효소도 함께 침전되어 제거되어 소화효소의 순도가 낮아지는 또 다른 문제점이 발생할 수 있다.

한국공개특허공보 제10-2015-0053574호

본 발명의 목적은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 국내에서 생산되는 배(pear) 유래의 천연효소가 주요성분으로 포함하여 인체의 유해성이 없고, 항산화 활성을 보유하며 아질산염의 제거능이 있으며, 원료를 국내산으로 충당할 수 있어 경제적인 면에서 유리한 효과를 가지는 천연 소화제 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 추출의 조건을 조절하여 배에 포함된 식이섬유와 당의 함량을 최소화하고 단백질 분해효소의 함량을 최대화하여 순도를 80 내지 90%까지 향상시킬 수 있는 선택적 분리를 할 수 있는 본 발명의 배 유래 천연 소화제 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

(a) 배를 분쇄 및 건조하여 배분말을 포함하는 재료를 제조하는 단계; (b) 상기 재료를 시스테인 함유 용액과 혼합하여 단백질 분해효소를 용출하여, 조추출물을 포함하는 용액을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 조추출물을 포함하는 용액에 폴리에틸렌글리콜과 염을 첨가하여 정치시켜 층분리하고 상등액을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 상등액에서 상기 염을 제거하여 단백질 분해효소 추출물을 수득하여 천연 소화제 조성물을 제조하는 단계;를 포함하는 천연 소화제 조성물의 제조방법이 제공된다.

단계 (a)의 상기 재료는 수분함량이 10중량% 이하가 되도록 건조할 수 있다.

단계 (b)의 상기 시스테인 함유 용액의 시스테인 농도는 0.1 내지 10mM일 수 있다.

단계 (b)에서 상기 시스테인 함유 용액에 상기 재료를 10 내지 15%(w/v) 함량으로 혼합할 수 있다.

단계 (b)는 2 내지 10℃에서 단백질 분해효소를 용출할 수 있다.

단계 (c)에서 상기 염은 알칼리금속염, 알칼리토금속염 및 암모늄염 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 염은 황산마그네슘(MgSO₄), 황산암모늄((NH₄)₂SO₄), 및 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

단계 (c)에서, 상기 조추출물을 포함하는 용액 100중량부를 기준으로, 폴리에틸렌글리콜과 염 20 내지 35중량부를 첨가할 수 있다.

단계 (c)에서, 상기 폴리에틸렌글리콜과 염은 폴리에틸렌글리콜 100중량부에 대하여 염 65 내지 135중량부를 혼합될 수 있다.

단계 (c)에서 상기 폴리에틸렌글리콜과 염을 첨가하여 정치시키는 것은 4 내지 16℃에서 4 내지 16시간 동안 이루어질 수 있다.

단계 (d)에서, 상기 염의 제거는 투석에 의해 수행될 수 있다.

상기 단백질 분해효소 추출물에는 분자량 32 내지 36kDa의 배 유래 단백질 분해효소가 포함될 수 있다.

단계 (d) 이후, 상기 천연 소화제 조성물에 효소활성 유지제를 첨가할 수 있다.

상기 효소활성 유지제는 덱스트린, 글루코스, 수크로스, 글리세롤 및 폴리에틸렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 효소활성 유지제는 상기 천연 소화제 조성물 100중량부에 대하여 3 내지 10중량부로 포함될 수 있다.

단계 (d) 이후, 상기 천연 소화제 조성물을 동결건조 또는 농축함으로써 분말 또는 액상의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

상기 방법에 따라 천연 소화제 조성물을 제조한 후 분말화하여 효소 분말을 준비하고, 부형제와 첨가제를 혼합한 후 타정하여 타블렛을 제조하는 천연 소화제 타블렛의 제조방법이 제공된다.

상기 효소 분말은 타정하기 전에 과립화할 수 있다.

상기 부형제는 키위 분말, 결정 셀룰로오스, 트레할로스(trehalose), 미분당(sugar powder) 및 올리고당 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 첨가제는 비타민 C, 치자액, 및 인공향료 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 천연 소화제 조성물의 제조방법에 따라 제조된 배 유래 천연 소화제 조성물은 국내에서 생산되는 배(pear) 유래의 천연효소가 주요성분으로 포함하여 인체의 유해성이 없고, 항산화 활성을 보유하며 아질산염의 제거능이 있으며, 원료를 국내산으로 충당할 수 있어 경제적인 면에서 유리한 효과가 있다.

또한, 본 발명의 배 유래 천연 소화제 조성물의 제조방법은 추출의 조건을 조절하여 배에 포함된 식이섬유와 당의 함량을 최소화하고 단백질 분해효소의 함량을 최대화하여 순도를 80 내지 90%까지 향상시킬 수 있는 선택적 분리의 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 배 유래 천연 소화제 조성물의 제조방법을 순차적으로 나타낸 흐름도이다.
도 2는 시스테인 농도별 배조추출액의 SDS-PAGE 분석 및 In gel activity 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 에탄올농도별 배효소 침전물의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 배 효소의 최적 사용 pH 조건을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 배 효소의 최적 사용 온도 조건을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 배소화제 타블렛의 사진이다.
도 7은 상업용 소화제와 배 소화제의 효능평가를 위한 처리 전 후의 소고기 사진이다.
도 8은 상업용 소화제와 배소화제의 액토마이신 분해능을 조사하기 위한 SDS-PAGE 분석결과이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 배 유래 천연 소화제 조성물의 제조방법을 순차적으로 나타낸 흐름도이다. 이하, 도 1을 참조하여 본 발명의 배 유래 천연 소화제 조성물의 제조방법을 설명하도록 한다.

먼저, 배를 분쇄 및 건조하여 배분말을 포함하는 재료를 제조한다(단계 a).

상기 배는 다양한 품종의 배를 사용할 수 있으나 바람직하게는, 배품종 중 신고배 또는 한아름배를 사용할 수 있고, 이 경우 추출된 단백질 분해효소의 단백질 분해능 및 콜라겐 제거능 측면에서 유리할 수 있다.

또한, 상기 과일은 과피와 과육을 모두 포함한 과일 자체를 사용할 수도 있고, 과피와 과육을 분리하여 각각 사용할 수 있으며, 특히, 과피에 비해 과육의 단백질 분해효소 함량이 많으므로, 과육을 사용할 경우, 단백질 분해효소 수율 측면에서 바람직할 수 있다.

상기 재료는 키위를 분쇄 및 건조하여 제조된 키위분말을 추가로 포함할 수 있다. 배분말과 키위분말을 혼합하여 사용할 때, 배분말과 키위분말은 1:0.5 내지 1:2의 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

배와 키위는 껍질을 제거하고 세척한 후 분쇄 및 건조할 수 있다.

상기 건조는 동결건조 또는 열풍건조할 수 있으며, 특히, 열풍건조할 경우 생산설비의 간소화, 공정의 효율성 및 비용 측면에서 상업적으로 더 유리할 수 있다.

상기 건조에 의해 수분이 제거되어, 수분 함량이 10 중량% 미만인 배분말을 얻을 수 있다. 상기 수분 함량이 10 중량% 이상일 경우 효소의 변성 방지를 위해 사용하는 시스테인 함유 용액이 과량 소비되므로 비용적인 측면에서 바람직하지 않다.

다음으로, 상기 재료를 시스테인 함유 용액과 혼합하여 단백질 분해효소를 용출하여, 조추출물을 포함하는 용액을 수득한다(단계 b).

상기 시스테인 함유 용액에서 시스테인의 농도는 0.1 내지 10mM인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5.0mM, 더욱 더 바람직하게는 1.0 내지 3.0mM 일 수 있다.

상기 시스테인의 농도는 추출 과정에서 단백질 분해효소의 변성을 방지하여 상기 단백질 분해효소의 활성을 유지한 채 추출할 수 있도록 하는 측면에서 바람직하다. 상기 시스테인의 농도가 0.1 mM 미만이면 추출 과정에서 상기 단백질 분해효소의 변성 방지 효과가 미미하고, 10 mM 초과이면 사용함량에 대비하여 효소활성 유지 기능의 더 이상의 상승을 기대하기 어렵다.

상기 시스테인 함유 용액에 상기 재료를 10 내지 15%(w/v) 함량으로 혼합하는 것이 바람직하다.

상기 시스테인 함유 용액은 시스테인과 완충용액을 포함할 수 있다.

상기 재료는 상기 재료와 시스테인 함유 용액의 총중량에 대하여 5 내지 15중량%가 되도록 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 혼합용액 중의 과일 분말의 농도가 5중량% 미만이면 단백질 분해효소 추출 효율이 저하될 수 있고, 15중량% 초과이면 액상화가 되지 않고 된 죽처럼 되어 추출 공정 진행이 어려울 수 있다.

상기 재료를 시스테인 함유 용액과 혼합한 후, 40 내지 50℃의 온도에서 교반하여 단백질 분해효소가 용출되도록 하는 것이 바람직하다.

상기 교반은 8 내지 15시간 동안, 80 내지 100rpm의 속도로 수행될 수 있다.

다음으로, 상기 조추출물을 포함하는 용액에 폴리에틸렌글리콜과 염을 첨가하여 정치시켜 층분리하고 상등액을 수득한다(단계 c).

상기 염은 알칼리금속염, 알칼리토금속염, 암모늄염 등일 수 있다.

구체적으로, 상기 염은 황산마그네슘(MgSO₄), 황산암모늄((NH₄)₂SO₄), 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 등일 수 있다.

상기 폴리에틸렌글리콜과 염은 상기 조추출물을 포함하는 용액 100중량부를 기준으로, 20 내지 35중량부를 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 조추출물을 포함하는 용액은 상기 폴리에틸렌글리콜과 염 처리를 함으로써 식이섬유와 당을 제거하고 단백질 분해효소의 순도를 높일 수 있다.

구체적으로, 상기 폴리에틸렌글리콜과 염의 처리시, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 100중량부에 대하여 염이 65 내지 135중량부 혼합될 수 있고, 더욱 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 100중량부에 대하여 염이 80 내지 120중량부, 더욱 더 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 100중량부에 대하여 염이 90 내지 110중량부 포함될 수 있다.

여기서, 상기 폴리에틸렌글리콜 100중량부에 대하여 염이 65중량부 이하로 포함되는 경우, 식이섬유와 당, 단백질 분해효소 모두 침전이 거의 일어나지 않아 단백질 분해효소의 순도를 높일 수 없으며, 상기 염이 135중량부 이상의 조성을 갖는 경우 식이섬유와 당의 침전율이 높아지지만, 이와 함께 단백질 분해효소의 침전도 함께 높아지는 경향을 나타내어 단백질 분해효소의 수득률이 낮아지는 문제점이 발생할 수 있다.

한편, 폴리에틸렌글리콜과 염을 첨가하여 정치시키는 것은 4 내지 16℃에서 4 내지 16시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다.

이후, 상기 상등액에서 상기 염을 제거하여 단백질 분해효소 추출물을 수득하여 천연 소화제 조성물을 제조한다(단계 d).

상기 염의 제거는 투석에 의해 수행될 수 있다.

상기 단백질 분해효소 추출물에는 분자량 32 내지 36kDa의 배 유래 단백질 분해효소가 포함될 수 있다.

또한, 상기 천연 소화제 조성물에 효소활성 유지제를 첨가하는 것이 바람직하다.

상기 효소활성 유지제는 덱스트린, 글루코스, 수크로스, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜 등일 수 있다.

상기 효소활성 유지제는 상기 천연 소화제 조성물 100중량부에 대하여 5 내지 7 중량부로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 천연 소화제 조성물을 동결건조 또는 농축함으로써 분말 또는 액상의 형태로 제조할 수 있다.

이하, 본 발명의 천연 소화제 타블렛의 제조방법을 설명하도록 한다.

본 발명의 천연 소화제 타블렛은 상술한 방법으로 제조된 천연 소화제 조성물을 분말화하여 효소 분말을 준비하고, 부형제와 첨가제를 혼합한 후 타정하여 제조할 수 있다.

상기 부형제는 키위 분말, 결정 셀룰로오스, 트레할로스(trehalose), 미분당(sugar powder), 올리고당 등을 사용할 수 있고, 상기 첨가제는 비타민 C, 치자액, 인공향료 등을 사용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않으며 타블렛의 제조에 일반적으로 사용되는 부형제 또는 첨가제가 모두 적용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약학으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

[실시예]

실시예

(1) 소화 효소 추출물 제조

배를 세척 후 분쇄하여 65℃에서 28시간(CE5F SHEL, Thomas Scientific, USA) 열풍건조하여 10% 이하의 수분 함유된 배분말을 제조하였다.

1-10mM L-Cysteine을 첨가한 해 용해한 용액에 배 건조분말을 10% ~ 15% (w/v)를 첨가하여 현탁한 후, 4℃에서 1-4시간 느린 속도로 교반(80-100 rpm)하여 배효소 용출하여 조추출물을 포함하는 용액을 수득하였다. 여기에 15% PEG-1000와 다양한 농도별로 M(MgSO₄), N((NH4)₂SO₄), K(K₂HPO₄)를 각각 첨가해 4℃에서 4 내지 16시간 정치 후 층분리하였다. 이후, 상등액만 덜어내어 5 mM Sodium-phosphate 버퍼로 하여 pH 7.0에서 12-24시간 투석을 통해 염을 제거하여 소화 효소를 추출물을 제조하였다.

(2) 소화 효소 분말 또는 액상화

상기 소화 효소 추출물에 효소활성 유지제를 1-10% 첨가 후, 감압농축 또는 동결건조하여 액상효소 또는 분말효소를 제조하였다. 여기서, 상기 효소활성 유지제는 글루코스, 수크로스, 덱스트린, 글리세롤, PEG-1000 등을 사용하였다.

(3) 소화 효소 추출물의 타블렛 제조

제조된 배 분말에 키위 분말을 기호도와 효능 증진을 위해 부형제로 첨가하였다. 배효소 분말과 키위 분말을 각각 60mesh 채로 내린 후 10% 주정을 이용해 과립화를 함으로써 고운 분말을 획득하였다. 이때, 얻어진 효소의 농도는 66 U/mg 단백질 분해능을 보유하였다. 여기서, 1U은 1mg 카세인 단백질을 분해할 수 있는 단백질분해 효능을 의미한다. 배효소 타블렛 제조는 주성분으로 배 효소 분말 10-50%, 키위 분말 15-55%, 부형제로 결정셀룰로스 9-19%, 트레할로스 10% 또는 미분당 20%를 첨가하였으며, 기타성분으로 이산화규소, 스테아린마그네슘, 비타민 C, 키위향을 첨가하였다. 배효소 타블렛의 균일화를 위해 배효소분말 10-50%, 키위분말 15-55%에 주정에 녹인 0.1% 치자추출액을 분사, 배합해 분말입자를 균일화시켰다. 배 효소 분말과 부재료를 혼합하고 60 mesh 체를 통과시킨 후 40℃ 건조기에서 2시간 건조 후 과립으로 성형하였다. 여기에 활택제로 스테아린산마그네슘(magnesium stearate) 일정량을 첨가한 후 성형틀에 0.5g을 넣고 유압 프레스로 일정압력을 가하여 일정시간 경과 후 타블렛을 제조하였다.

상기 실시예에 기재된 내용을 기준으로 아래의 시험예의 내용에 따라 세부적인 조건을 달리하여 실시하였다.

[시험예]

시험방법

<효소 함량 정량>

회수된 침전물에 함유된 단백질과 효소함량은 BCA 키트(kit)와 SDS-PAGE analysis로 분석하였다. 단백질 함량은 BSA(bovine serum albumin)단백질을 표준물질로 BCA(Bio-Rad)단백질 키트를 사용해 분광 광도계(Spectrophotometer)로 560nm에서 정량 측정하였다. 단백질량을 10~50mg/mL로 만든 후 5X SDS-loading buffer (0.5M Tris?l, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% b-mercaptoethanol)를 첨가해 비연속 SDS-PAGE 겔(12~14% resolving 4% stacking)에 단백질을 크기 별로 분리하여 commassie R-Blue staining으로 염색해 비쥬얼라이징(visualizing) 한 후 밀도측정 프로그램인 NIH-densitometry로 배효소는 32~36kDa, 키위효소는 17, 24, 28kDa 크기 단백질 함유량을 정량하였다.

<효소의 단백질 분해능 측정>

추출된 효소에 다양한 효소활성 유지제를 1-10% 첨가해 효능을 조사하였다. 물, Glucose, Sucrose, Dextrin, Glycerol, PEG-1000을 1-10%(w/v) 을 첨가 후 농축된 액상효소 또는 분말효소의 효능을 조사하였다. 이때 효소의 단백질 분해능은 Quanti-protease Assay kit(Thermo scientific Co.)를 이용해 숙시닐화 카세인(succinylated casein)의 단백질 분해정도를 트립신(Trypsin)을 표준곡선으로 이용해 측정하였다. 효소활성 단위(U)는 450 nm에서의 △A/min를 이용해 측정되었으며 1U은 1 mg 카세인 단백질을 분해할 수 있는 단백질분해 효능을 의미한다.

<효소의 최적 소화제 조건 측정>

추출된 효소를 분말, 또는 액상 소재화하기 위해 다양한 효소활성 유지제를 1-10% 첨가해 효능을 조사하였다. 이를 위하여, 물, Glucose, Sucrose, Dextrin, Glycerol, PEG-1000을 1-10% (w/v) 을 첨가 후 농축된 액상효소 또는 분말효소의 효능을 조사하였다. 이때, 효소의 단백질 분해능은 Quanti-protease Assay kit(Thermo scientific Co.)를 이용해 숙신화 카세인(succinylated casein)의 단백질 분해정도를 트립신을 표준곡선으로 이용해 측정하고, 효소활성 단위 (U)는 450 nm에서의 △A/min를 이용해 측정하였다.

<배 효소제의 최적 사용 조건 측정>

분말 및 액상 배효소를 pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 10에서 효소활성을 조사하였다. pH 3~4는 0.1M sodium citarte buffer, pH 5~8까지는 0.1M sodium phosphate buffer, pH 10은 0.1M Tris-Cl buffer로 사용하였으며 효소와 buffer를 1:1(v/v)로 혼합 후 10분 후에 활성을 측정하였다. 또한, 4℃, 25℃, 37℃, 45℃, 60℃, 80℃의 온도에서 0, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120분 동안 반응시킨 후 남아있는 효소활성을 측정하였다. 본 발명의 분말 및 액상 배효소와 베아제 (상업용)를 0-4 mg/mL 농도에서 카세인 단백질 분해능을 조사하였다.

<상업용과 시제품 소화제 품질특성 조사>

소화제들의 물리적 특성과 붕해성, 홉습성 및 경도(파손 강도) 와 같은 품질 특성을 조사하였다. 색도는 색차계(CR 200, Minolta, Japan)를 이용하여 L(li- ghtness), a(+: redness, -: greenness) 및 b(+: yellowness, -· blueness) 값을 각각 측정하였으며, pH는 시료 0.5 g에 증류수 30 mL을 가하고 균질화시킨 후 pH meter{Sllntex SP-701, Taiwan)로 측정하였다. 총당함량은 phenol sulfuric method (Dubois et al 1956)로 분석하였다. 즉, 시료 0.5 g에 50 mL의 증류수를 넣고 20분간 균질화한 후 여과액 1 mL에 5% phenol solution 1 mL를 넣고 H₂S0₄ 5 mL를 직하하여 20분 간 방치한 후 470 m에서 흡광도를 측정하여 표준곡선에서 당함량을 구하였다. 붕해성 및 홉습성 측정 타블렛의 붕해성은 시료 0.5 g을 20 ℃ 증류수 50 mL에 1 분간 용해시키고 8,000 rpm으로 20분간 원심분리하고 남은 고형분량으로 나타내었다. 홉습성은 시료 일정량을 증류수를 채운 데시케이터에 넣고 l시간 간격으로 무게를 측정하여 무게 변화량으로 나타내었다. 타블렛의 파손 강도는 rheometer(COMPAC-100, Sun Scientific Co., Japan)를 이용하여 파괴실험으로서 측정하였으며, 이때 시료의 직경과 높이는 13 mm와 3 mm 이었으며 플런저(plunger)는 직경 10 mm, 테이블 이송속도(table speed)는 60 mm/s였다.

<상업용 소화제와 배 소화제의 소화성능 측정>

배효소 소화제의 고기조직에 대한 분해 정도를 살펴보기 위해 1% 농도에서 16℃에서 12시간 침지 후 가수분해도인 아미노태질소 함량을 측정하였다. 가수분해도는 수용성 질소정량법과 아미노산태 질소 정량법을 사용하였다. 소화제에 절인 고기는 표면에 남아 있는 성분을 제거하기 위하여 소량의 증류수로 표면을 씻은 후 100℃ 오토클레이브(MG-6845, Mega science, Seoul, Korea)에서 10분간 가열하였고 근섬유 방향이 장축이 되도록 0.6 cm × 0.6cm × 2 cm의 고기표본을 취하여 Texture analyzer를 사용하여 TPA(Texture profile analysis) 테스트를 실시하였다.

근원섬유를 만들기 위해 소고기의 우둔살 30g을 채취하고 그 중량의 5배량의 pyrophosphate relaxing buffer(PRB : 0.1 M KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 1mM DTT, 2 mM Na₄P₂O₇, 0.01 M Tris-maleate buffer/pH 6.8-NaOH)을 가하였고 그 후 5,000 rpm에서 1분간 homogenize(T25, Janke & Kunkel IKA-laboratechnik, Germany)를 하고, 1,000×g에서 10분 동안 원심 분리하여 침전물을 채취, 5배량의 pyrophosphate relaxing buffer용액으로 현탁하였다. 근원섬유 단백질 10~30 mg/mL로 만든 후 5X SDS-loading buffer (0.5M Tris?l, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% b-mercaptoethanol)를 첨가해 비연속 SDS-PAGE gel (12~14% resolving 4% stacking)로 크기별로 분리하여 commassie R-Blue staining으로 염색해 액토마이오신(근원섬유) 분해정도를 확인하였다.

<상업용 소화제와 배 소화제의 기능성 평가>

항산화력 검정은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 이용 Blois (1958)법에 의해 측정했는데, 일정무게 과일을 착즙하여 여과한 여액 1.0ml에 60㎛ DPPH 2ml와 대조구로 0.01%BHT, ascorbic acid, α-tocopherol 각각 2㎖를 가해 5분간 섞고 37℃에서 30분 방치 후 VERSA MAX microplate reader(Molecular Device, USA)를 이용해 분광광도계 515nm에서 측정하였다.

아질산염소거능은 Gray and Dugan(1975)법 에 의해 10mM sodium nitroprusside 수용액 2mL에 0.01M phosphate buffer (pH 7.4) 0.5 ㎖와 시료 용액 0.5㎖를 가하여 25℃에서 100 분간 반응시킨 후 반응액 1㎖ 취해 sulfanilic acid (0.33% in 20% acetic acid) 1㎖와 혼합한 후 5분간 방치한 다음 여기에 0.1 % (w/v)naphthylethylene-diamine dihydrochloride 용액(in 20% acetic acid)를 1㎖ 가하여 30분간 방치 후 540nm에서 흡광도 측정하였다.

단백질 분해능은 Quanti-protease Assay kit(Thermo scientific Co.)를 이용해 succylated casein의 단백질 분해정도를 Trypsin을 표준곡선으로 이용해 측정. 효소활성 단위(U)는 450 nm에서의 △A/min를 이용해 측정되었다. 효소활성단위는 (U)은 1㎖가 1분간 분해되는 1mg의 카세인 함량을 기준으로 하였다.

<관능검사 및 통계처리>

관능검사는 식품공학과 대학원생 10명으로 구성된 관능검사 요원이 타블렛의 색, 맛, 향, 씹힘성, 견고성, 기호성에 대하여 5점 채점법으로 평가하였다. 실험에서 얻어진 data는 SAS program (Package relwase 8.01)을 이용하여 분산분석을 실시하여 다중범위검증(Duncan's multiple range test)에 의하여 유의성 검정을 실시하였다.

시험예 1: 단백질 분해효소 추출률, 단백질 분해능 분석

도 2는 시스테인 농도별 배조추출액의 SDS-PAGE 분석 및 In gel activity 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 2에 따르면, 배로부터 조추출액은 추출 용액의 시스테인 함량을 1mM cysteine, 10 mM cysteine으로 하고, 배분말 제조시 동결건조 또는 열풍건조(65℃, 28h)에 의해 준비하여 SDS-PAGE 및 효소, 단백질을 측정하여 최적 조추출 조건을 확립하였다. caseine SDS Gel 상에서 배효소가 카세인을 분해하는 것을 확인했으며, 화살표에 표기된 36~38kDa 크기가 단백질분해효소로 확인되었다.

효소를 추출하기 위한 최적 추출조건은 10mM 시스테인을 함유한 버퍼로 동결 건조한 시료가 효소가 가장 많이 추출되었다. 10mM 시스테인을 함유한 시료가 효소 추출률이 2배, 단백질 분해 효능은 3배 높았으며 추출물의 건조방법은 시스테인 농도보다는 영향이 적었으나, 동결건조가 열풍건조보다 약간 효소함량과 효능에서 우수한 것으로 나타났다.

시험예 2: PEG 에 대한 염 농도별 효소 함량 및 단백질 분해능 비교 분석

도 3은 신고배 조추출액의 염과 PEG를 이용한 분리 후 상등액의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기서, M은 molecular weight marker; S는 조추출액; 15% PEG-1000에 M(MgSO₄), N((NH4)₂SO₄), K(K₂HPO₄)의 10%, 15%, 20% 첨가한 것을 나타내었다.

시료는 신고배를 이용했으며 15% PEG (polyethylene glycol)에 3가지 물질, 마그네슘설페이트, 암모니움설페이트, 포타슘 포스페이트를 각 10%, 15%, 20% 첨가해 혼합 후 16℃에서 4시간 정치 후 상등액을 분리하고, 5mM sodium phosphate, pH 7.0 용액 투석을 통해 염 제거하였다.

아래의 표 1에는 배건조 분말을 염과 PEG 처리를 하지 않은 추출물과 15% PEG 와 MgSO₄의 함량을 달리한 조건에서 효소량, 당량, 식이섬유 함량 등을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

추출조건	총단백질량 (mg)	총활성(Total Activity) (U)	특이활성 (Specific activity) (U/mg)	당함량 (%)	식이섬유함량 (%)	수율 (%)
배건조 분말	9.69±0.14	165.8±11.9	17.1±1.4	58.4±9.4	30.2±3.5	100.0±0.0
15% PEG+5% MgSO4	1.60±0.20	139.4±6.8	22.5±2.6	34.9±7.4	24.9±2.1	72.5±5.5
15% PEG+10% MgSO4	1.98±0.30	142.5±7.3	62.5±5.7	23.4±6.9	20.4±2.7	79.8±8.7
15% PEG+15% MgSO4	2.05±0.15	146.7±3.6	65.0±2.7	19.5±1.8	15.7±2.7	84.8±7.5
15% PEG+20% MgSO4	2.27±0.29	151.5±7.7	66.7±8.3	13.8±1.7	9.4±1.8	91.8±11.5
15% PEG+25% MgSO4	3.05±0.35	159.4±5.3	30.5±5.0	12.5±1.0	9.8±1.7	95.4±8.8

표 1에서, 상기 배건조 분말은 추출버퍼 (10 mM cysteine, 50 mM sodium phosphate, pH 6.5)를 이용해 4℃에서 1시간 shaking 후 10,000 xg 원심분리 상등액을 사용한 것이다. 또한, 단백질 정량은 Bio-Rad 단백질 측정시약 이용 bovine serum albumin 표준물로 595nm에서 정량하였다. 단백질분해능은 Quanti-protease Assay kit(Thermo scientific Co.)를 이용해 숙신화 카세인(succylated casein)의 단백질 분해정도를 Trypsin을 표준곡선으로 이용해 측정하였으며, 효소활성 단위 (U)는 450 nm에서의 △A/min를 이용해 측정되었다.

총당은 시료 1g에 50ml 증류수를 첨가 후, 80℃ 항온수조에서 3시간 shaking. 균질화하여 여과한 여액을 whatman No2. 여과지로 여과 후 여액을 시액으로 사용하였다. 시료 0.5ml + 5% phenol 0.5ml와 황산용액 2.5ml를 실온에서 20~30분간 반응시킨 후 470nm에서 흡광도를 측정해 글루코스를 기준하여 정량하였다.

식이섬유는 시료 1g씩을 정확히 달아 phosphate buffer(pH 6.0) 50 mL를 가한 후 효소(Megazyme kit, Chicago, Illinois, USA)를 이용해 amylase, protease, amyloglucosidase를 이용하여 차례로 가수분해 후 각각의 단백질 및 회분량을 측정값에서 빼서 식이섬유 함량을 구하였다.

표 1의 결과에 따르면, 15% PEG와 MgSO₄ 의 처리에서 MgSO₄ 함량이 높을수록 총단백질량, 총활성, 수율이 함량의 증가에 따라 점차 증가하는 것으로 나타났으나, 효소의 비활성(Specific activity)에서는 15% PEG + 10% MgSO₄ 과 15% PEG + 20% MgSO₄의 조건에서 매우 높은 수치를 나타냈으며, MgSO₄의 함량이 10% 보다 낮거나, 20%보다 높은 구간에서는 비활성이 상대적으로 매우 낮게 나타났다.

배분말에 함유된 당함량은 MgSO₄ 농도와는 무관하게 12~14% 함유되는 것을 볼수 있으나 배소화제 분말 제조시 텁텁한 목넘김의 원인이 되는 식이섬유는 MgSO₄ 함량이 20%~25% 첨가 조건에서 현저히 제거되는 것을 알 수 있었다. 즉, 폴리에틸렌글리콜과 염의 처리시 염의 함량을 조절함으로써 배추출물로부터 효소의 활성을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.

시험예 3: 배 효소의 최적 사용 조건 분석

1) pH 조건

분말 및 액상 배효소 소재의 pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 10에서 효소활성을 조사한 결과, pH 3~4는 0.1M sodium citarte buffer, pH 5~8까지는 0.1M sodium phosphate buffer, pH 10은 0.1M Tris-Cl buffer로 사용하였으며 효소와 buffer를 1:1(v/v)로 혼합 후 10분 후에 활성을 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 효소의 활성은 동결건조 분말과 농축액상 모두 pH 6.5가 가장 높았고 pH 5-8범위 내에서 가장 단백질 분해능이 높은 것으로 나타났다.

2) 온도조건

배효소를 6개 온도별, 4℃, 25℃, 37℃, 45℃, 60℃, 80℃에서 0, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120분 동안 반응시킨 후 남아있는 효소활성을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 따르면, 온도 조건별로는 1시간 반응시 분말과 액상효소 모두다 60℃까지 65% 이상의 효능을 유지하였으며. 이를 통해서 효소가 높은 온도에 비교적 안정적임을 확인할 수 있었다.

3) 효소농도 조건

아래의 표 2는 상업용 소화제(베아제, 대웅제약)과 본 발명의 실시예에 따른 배 효소의 농도별 효소 활성을 비교하여 나타낸 것이다.

함량 (mg/mL)	상업용소화제(U)	분말효소(U)	액상효소(U)
0.1	0.21±0.02f	0.06±0.01b	0.07±0.00c
0.2	0.68±0.13e	0.40±0.04b	0.24±0.02b
0.4	1.09±0.12d	0.51±0.05a	0.26±0.05ab
1.0	1.27±0.11c	0.53±0.04a	0.31±0.04a
2.0	1.48±0.11b	0.55±0.01a	0.30±0.01a
4.0	1.77±0.09a	0.51±0.01a	0.21±0.01b

표 2에 따르면, 배분말 효소와 액상효소 모두 1mg/mL 농도에서 가장 효율이 높았고 분말효소가 액상효소보다는 2.5배 높은 것으로 나타났다. 특히, 분말효소는 상업용 소화제와 비교하여 배분말 효소가 동일농도 조건에서 약 50% 정도의 단백질 분해능을 보유하는 것으로 나타났다.

시험예 4: 배소화제 타블렛의 이화학적 특성

본 발명의 배 소화제 타블렛을 성분을 다양한 배합비로 제조하였으며, 구체적인 배합비를 정리하여 아래의 표 3에 나타내었고, 이에 따라 제조된 타블렛의 사진을 도 6에 나타내었다.

성분	1차 제조				2차 제조
	I	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	S11 )	S21 )	S3
배효소분말	10	20	30	50	40	40	40
키위과육분말	55	45	35	15	25	25	25
결정셀룰로오스	19	19	19	19	9	9	9
이산화규소	2	2	2	2	2	2	2
스테아린 마그네슘	2	2	2	2	2	2	2
키위향분말	1	1	1	1	1	1	1
트레할로스	10	10	10	10	20	20	0
미분당	0	0	0	0	0	0	20
비타민C	1	1	1	1	1	1	1
전체(%)	100	100	100	100	100	100	100

상기 표 3에서, 2차 제조는 치자색소를 0.1% 추가하였고, S1은 치자색소를 물에 녹인 것이고, S2, S3은 주정으로 녹인 것이다.

배효소 타블렛은 주성분으로 배효소 분말 10-50%, 키위 분말 15-55%, 부형제로 결정 셀룰로스 9-19%, 트레할로스 10% 또는 미분당 20%을 첨가하였으며 기타성분으로 이산화규소, 스테아린마그네슘, 비타민 C, 키위향 등이 첨가되도록 하였다. 배효소 타블렛의 균일화를 위해 배효소분말 10-50%, 키위분말 15-55%에 주정에 녹인 0.1% 치자추출액을 분사, 배합해 분말입자를 균일화시켰다. 또한 배효소외에 기호도와 효능을 높이기 위해 첨가된 배건조분말 또는 키위분말을 첨가시 배분말은 높은 식이섬유 함량으로 인해 텁텁한 식감이 크고 타블렛 제조시 쉽게 부서지는 특징을 보여 키위분말을 혼합하였다. 기호도를 고려 당산비를 맞추기 위해 키위의 신맛에 대한 보당성분으로 결정셀룰로오스를 줄이고 첨가된 트레할로스나 미분당 중 미분당이 타블렛의 윤택이나 기호도가 높은 것으로 나타났다.

아래의 표 4는 상업용 소화제와 상기 표 3의 조건에 따라 제조된 배 효소 타블렛의 이화학적 특성을 비교하여 나타낸 것이다.

구분	상품명	코드	높이 (mm)	두께 (mm)	경도 (g)	무게 (mg)	pH	당도 (Brix)	산도 (%)
소화제	베아제	A1	5.80bc	2.55b	23800d	603a	5.15b	4.56f	0.29cd
	까스활명수	A2	-	-	-	-	4.21c	9.40a	0.31cd
소화보조제	오리지널파파야	B1	5.33bcd	2.60b	43166a	528cd	5.85ab	6.10f	0.10f
	엔자임	B2	4.7def	1.75c	45766a	525cd	6.76a	9.13a	0.10f
	엔자임클롤필	B3	5.03cde	2.50b	37433bc	492e	5.94ab	6.10f	0.11f
	츄어블	B4	6.10b	1.43cd	41666ab	615a	4.34c	8.96b	0.24e
1차	10% 효소	I	4.13f	1.43cd	44333a	560bc	3.65de	5.63e	0.39c
	20% 효소	II	4.6def	1.32cd	41866ab	557bc	3.56de	6.53d	0.53b
	30% 효소	III	5.76bc	2.54b	41600ab	547cd	3.44e	6.70d	0.59b
	50% 효소	IV	7.03a	3.38a	29933c	531cd	3.38e	7.00c	0.63b
2차	40% 효소	S1	4.21f	0.77e	40666b	532cd	3.48de	6.81d	0.49c
	40% 효소	S2	4.42ef	1.12de	42733ab	584ab	3.80de	6.85d	0.49c
	40% 효소	S3	5.50bc	2.22b	42800ab	598a	4.21c	7.06c	0.51b

표 4에 따르면, 상업용 소화제(까스명수, 베아제)와 소화보조제 (파파야 효소 추출 분말이 주로 첨가된 설탕이 90%이상 함유된 타블렛)를 조사하였으며 배효소 소화제로는 1차로는 배효소함유량 10-50%로 전체 65%가 되도록 키위분말을 보충하였다. 2차로는 배효소를 40%, 키위분말 25%를 기준으로 치자액으로 색상과 품질을 균일화 하였고(S1 vs S2, S3), 타블렛의 식감이 텁텁함이 남아 뒷맛의 불쾌감을 줄이고 단맛과 신맛의 비율로 기호도를 높이기 위해 결정 셀룰로스 함량을 줄이고 트레할로스나 미분당으로 대체하였다(I-IV vs S1,2,3). 이때, 첨가된 미분당은 트레할로스 보다는 타블렛의 푸석한 느낌을 감소시키고 표면광택을 높이는 것으로 나타났다.

타블렛의 경도는 상업용 소화보조제와 유사하였으며, 특히 30%에서 50%로 효소함량 증가시 타블렛이 경도가 크게 낮아져, 40%로 효소함량을 조정하였다. 또한 산함량이 높은 키위분말 함량 증가로 인해 산도가 상업용 대비 약간 높으나 당도는 약간 높거나 유사한 것으로 나타났다.

시험예 5: 배소화제 타블렛의 품질 특성

아래의 표 5는 상업용 소화제와 본 발명의 배 효소 타블렛의 품질 특성을 비교하여 나타낸 것이다.

구분	상품명	코드	붕해도 (%)	흡습성 (1h) (%)	흡습성 (12h) (%)
소화제	베아제	A1	5.41e	0.31h	2.47h
소화보조제	오리지널파파야	B1	9.19ab	1.12g	11.2f
	엔자임	B2	9.52ab	1.12g	9.40g
	엔자임클롤필	B3	9.58ab	1.96e	9.87g
	츄어블	B4	14.4a	1.67f	17.4c
1차제조	10% 효소	I	7.23cd	6.81a	25.0a
	20% 효소	Ⅱ	7.76cd	5.09b	19.2b
	30% 효소	Ⅲ	8.23b	4.43c	16.7d
	50% 효소	Ⅳ	8.66b	2.82d	13.2e
2차제조	40% 효소	S1	5.76e	5.30b	19.1b
	40% 효소	S2	8.11c	4.64c	18.3c
	40% 효소	S3	10.0b	2.05e	9.66g

표 5에 따르면, 타블렛의 품질특성을 조사한 결과, 붕해도는 상업용 소화보조제들(B1-3) 과 배효소 소화제 S3가 붕해도가 가장 높았으며 흡습성은 베아제 다음으로 상업용 소화보조제들(B1-3)과 배효소 소화제 S3가 낮은 흡습성을 나타냄으로써 품질이 우수함을 보였다.

시험예 6: 상업용 소화제와 배 소화제 효능 및 관능평가

도 7은 상업용 소화제와 배 소화제의 효능평가를 위한 처리 전 후의 소고기 사진이고, 아래의 표 6은 효능평가 결과를 나타낸 것이다.

상업용 소화제, 소화보조제 및 배효소 소화제들의 단백질 분해능을 조사하기 위해 소고기 우둔살에 1% 처리, 16℃에서 12시간 침지 후 가수분해도를 측정하기 위하여 수용성질소정량법과 아미노산태 질소 정량법을 사용하였다. 소화제에 절인 고기는 표면에 남아 있는 성분을 제거하기 위하여 소량의 증류수로 표면을 씻은 후 100℃ 오토클레이브(MG-6845, Mega science, Seoul, Korea)에서 10분간 가열하였고 근섬유 방향이 장축이 되도록 0.6 cm × 0.6cm × 2 cm의 고기표본을 취하여 Texture analyzer를 사용하여 TPA(Texture profile analysis) 테스트를 실시하였다.

구분	상품명	코드	Hardness (g)	Springiness	Gumminess (g)	Chewiness (g)	Cohesiveness	아미노태질소 (mg/100g)
소화제	베아제	A1	861h	0.47d	3.68f	2.09c	0.36e	131a
	까스활명수	A2	1059e	0.49d	4.37e	2.18c	0.41c	114c
소화 보조제	오리지널파파야	B1	1220d	0.55b	5.29c	2.25c	0.42c	105cd
	엔자임	B2	1612b	0.55b	6.16b	3.37b	0.41c	104b
	엔자임클롤필	B3	1825a	0.60a	7.49a	4.18a	0.43b	99.7d
	츄어블	B4	1407c	0.51c	4.33e	2.58bc	0.41c	105cd
1차 제조	10%	I	1235d	0.55b	4.87d	2.63bc	0.46a	99.7d
	20%	II	1037e	0.53bc	4.11e	2.14c	0.42c	105cd
	30%	III	1017e	0.52c	3.20g	1.63de	0.40d	105cd
	50%	IV	782h	0.52c	2.71	1.51de	0.36e	118c
2차 제조	40%	S1	1205de	0.53bc	4.94d	2.67bc	0.41c	98.3de
	40%	S2	934g	0.54bc	3.18g	1.70d	0.40d	102b
	40%	S3	893h	0.52c	3.11g	1.28e	0.37e	125b

표 6에 따르면, 소화제 처리된 소고기의 물리적 특성결과, 배효소 처리 소고기는 소화제인 베아제보다 경도가 높고, 가스활명수와 유사하였으며 소고기 분해율 정도를 나타내는 아미노태 질소함량도 이와 유사한 결과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 배 소화제의 소화력이 베아제나 가스활명수와 유사하며 소화보조제 상업용 제품들보다는 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

도 8은 상업용 소화제와 배소화제의 액토마이신 분해능을 조사하기 위한 SDS-PAGE 분석결과이다.여기서 “0”은 증류수 처리한 것을 의미한다.

도 8에 따르면, 소고기로부터 근원섬유조직, 액토마이신을 분리 종류별 소화제 또는 소화보조제로 처리한 결과, 베아제는 근원섬유를 모두 녹일 만큼 강한 분해력을 보였고, 가스활명수나 상업용 소화보조제들과 비교시 분해정도가 뛰어났으며, 이는 다른 배효소 소화제들과 비교해서도 분해력이 높은 경향을 나타내었다.

아래의 표 7은 상업용 소화제와 본 발명의 단백질 분해능, 항산화능 및 아질산염소거능을 비교하여 분석한 결과이다.

구분	상품명	코드	단백질분해능 (mU)	항산화능		아질산염소거능
				(%)	vit C (mM)	(%)
소화제	베아제	A1	270.3a	11.3h	0.12h	39.6d
	까스활명수	A2	197.7bc	77.2a	1.39a	4.13i
소화 보조제	오리지널파파야	B1	73.4f	14.2fg	0.17fg	34.4d
	엔자임	B2	22.1g	13.7h	0.16fg	29.7e
	엔자임클롤필	B3	11.1h	13.3h	0.15fg	26.9e
	츄어블	B4	88.6ef	14.5fg	0.18fg	33.6de
1차제조	10%	I	72.3f	18.3ef	0.25ef	4.23h
	20%	II	124.0de	19.5ef	0.27ef	14.9f
	30%	III	160.0cd	23.4de	0.35de	16.9f
	50%	IV	242.5ab	41.5b	0.70b	69.0a
2차제조	40%	S1	149.9cd	27.3d	0.43d	49.1c
	40%	S2	191.1c	33.1c	0.54c	55.2b
	40%	S3	196.5bc	41.6b	0.70b	57.6b
재료	키위분말		20.2g	28.3cd	0.45cd	8.61g
	배효소분말		162.3cd	38.8b	0.64b	35.8d

표 7에 따르면, 소고기를 이용한 연육효과, 카세인을 이용한 단백질 분해능 및 액토마이신 추출액 처리후 SDS-PAGE 분석결과도 이와 유사한 경향을 보였으며 단백질 분해능은 상업용 베아제의 72%, 까스활명수의 98%로 우수하였다. 또한, 40% 배효소와 25% 키위분말을 첨가한 배효소제는 항산화효과가 베아제의 320%, 까스활명수의 53%로, 아질삼염 소거능은 모든 상업용 소화제보다 우수하며, 특히 베아제보다 40% 높은 소거능을 보였다.

표 8은 배 소화제의 관능평가 결과를 나타낸 것이다.

구분		색	향	맛	씹힘성	경도	전체적선호도
소화보조제 (B2)		4.71a	2.57e	2.85d	3.28b	3.00b	3.01c
배소화제	I	3.57b	4.28b	3.42b	2.85bc	2.71c	2.85d
	II	3.14c	3.85c	3.14c	3.14bc	3.00b	2.85d
	III	2.57e	3.85c	3.14c	2.42d	2.57d	3.11c
	IV	2.85d	4.14a	2.42d	2.42d	2.85c	3.57b
	S3	3.42b	3.71d	4.28a	4.00a	3.57a	4.42a

종합적 결과, 타블렛중 40% 배효소와 25% 키위분말을 첨가한 것이 붕해도, 흡습성, 품질특성 및 기호도 조사에서 상업용 소화제 보다 우수한 것을 알 수 있었다.

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. (a) 배를 분쇄 및 건조하여 배분말을 포함하는 재료를 제조하는 단계;
   (b) 상기 재료를 시스테인 함유 용액과 혼합하여 단백질 분해효소를 용출하여, 조추출물을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
   (c) 상기 조추출물을 포함하는 용액에 폴리에틸렌글리콜과 염을 첨가하여 정치시켜 층분리하고 상등액을 수득하는 단계; 및
   (d) 상기 상등액에서 상기 염을 제거하여 단백질 분해효소 추출물을 수득하여 배효소 추출물을 제조하는 단계;
   (e) 상기 배효소 추출물을 분말화하여 효소 분말을 준비하고, 상기 배분말과 키위과육분말을 체에 내린 후 주정을 이용해 과립화한 후,
   과립화된 배분말, 과립화된 키위과육분말, 결정 셀룰로오스, 및 미분당(sugar powder)을 40:25:9:20의 중량비로 배합한 것에 첨가제를 혼합한 후 타정하여 타블렛을 제조하는 단계; 를 포함하고,
   상기 단계 (c)에서, 상기 조추출물을 포함하는 용액 100중량부를 기준으로, 폴리에틸렌글리콜과 염 20 내지 35중량부를 첨가하고, 상기 폴리에틸렌글리콜과 염은 폴리에틸렌글리콜 100중량부에 대하여 염 65 내지 135중량부를 혼합하고,
   상기 염은 황산마그네슘(MgSO₄), 황산암모늄((NH₄)₂SO₄), 및 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 중에서 선택된 어느 하나인, 천연 소화제 타블렛의 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   단계 (c)에서 상기 폴리에틸렌글리콜과 염을 첨가하여 정치시키는 것은 4 내지 16℃에서 4 내지 16시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 천연 소화제 타블렛의 제조방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 단백질 분해효소 추출물에는 분자량 32 내지 36kDa의 배 유래 단백질 분해효소가 포함된 것을 특징으로 하는 천연 소화제 조성물의 제조방법.
8. 제1항에 있어서,
   단계 (d) 이후, 상기 천연 소화제 조성물에 효소활성 유지제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 천연 소화제 타블렛의 제조방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 효소활성 유지제는 덱스트린, 글루코스, 수크로스, 글리세롤 및 폴리에틸렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 천연 소화제 타블렛의 제조방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 제1항에 있어서,
    상기 첨가제는 비타민 C, 치자액, 및 인공향료 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 천연 소화제 타블렛의 제조방법.
    
    

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