KR101966503B1 - 갈색거저리(Tenebrio molitor, mealworm) 유충의 단백 가수분해물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항산화, 간 보호용 및 스트레스 감소용 식품 조성물 - Google Patents
갈색거저리(Tenebrio molitor, mealworm) 유충의 단백 가수분해물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항산화, 간 보호용 및 스트레스 감소용 식품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 기능성 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물은 뛰어난 항산화 효과를 가지고 있는 바, 특히 본 발명의 제조방법에 따라 제조하는 경우 항산화 효과를 나타내는 생리활성 펩타이드를 높은 수율로 획득할 수 있으며, 이를 이용한 기능성 식품 조성물은 높은 항산화 효과, 간 세포 보호 효과 및 스트레스 감소 효과를 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
최근 국제식량농업기구(FAO)에서는 질병이나 환경오염으로 인한 식량부족 문제를 해결하기 위한 정책으로 미래 식량자원으로서의 식용곤충의 활성화방안을 발표한 바 있고, 이에 대한 관심이 전 세계적으로 증대되고 있다. 이와 발맞추어 국내에서는 농림수산식품부가 "곤충산업육성 5개년 종합계획"을 발표하였고, 그에 따라 곤충 산업에 대한 지원이 이루어져 왔다.
곤충은 약 100만 종 이상 보고되었음에도 100만 종 이상이 아직 보고되지 않은 상태로 남아있다고 예측될 정도로 지구상에서 가장 다양성이 풍부한 종이다. 예로부터 곤충은 약용으로 사용해 왔으며, 그 중 누에, 메뚜기, 굼벵이, 지네 등은 당뇨, 염증성 질환, 간질환 및 동맥경화 등의 만성 질환 치료에 효과적이라는 연구결과가 보고되었다.
갈색거저리(Tenebrio molitor , mealworm)는 딱정벌레목 거저리과의 곤충으로 "갈색쌀거저리"라고도 불리며 현재 한국을 비롯한 전 세계에 분포되어 있고, 강한 적응력을 가지고 있으며 변태 기간이 짧아 쉬운 사육기술로도 연중 사육이 가능하여 산업화에 용이하다. 또한, 갈색거저리의 영양성분은 수분이 2.90%, 조단백질이 50.32%, 조지방 33.70%, 조회분 3.76%, 조섬유 4.81%로, 매우 높은 영양성분들을 가지고 있다. 이와 관련하여, 갈색거저리가 단백질 함량이 매우 높은 고단백질 소재로 2016년 식용곤충원료로 식품공전에 등록됨으로써 갈색거저리의 활용에 대한 관심이 높아지고 있다. 갈색거저리 유충은 대두보다 필수 아미노산을 많이 함유하고 있고, 육류에 비해 불포화 지방산 함량이 높으며, 비타민 A와 철, 식이섬유 등이 비교적 풍부한 편으로 영양적인 장점이 많다. 더욱이, 가축 사육과는 달리 곤충 사육에 필요한 땅을 개선할 필요가 없고, 적은 사료만으로도 간편하게 많은 양의 곤충을 사육하여 보급할 수 있으므로 경제적 부담이 적은 장점도 있다.
국내에서 이루어진 갈색거저리 유충에 관한 연구로는 갈색거저리 유충 추출물의 간암세포에 대한 세포 독성효능, 갈색거저리 에탄올 추출물의 멜라닌 생성 저해 효과 등 갈색거저리 추출물을 이용한 연구들을 들 수 있는데, 이와 달리 갈색거저리 유충의 생리활성 펩타이드에 대한 연구는 부족한 실정이다.
생리활성 펩타이드는 일반적으로 생리적 활성을 가지는 분자량이 작은 펩타이드로 정의되며, 보통 3-20개의 아미노산으로 구성되고 아미노산의 조성이나 서열에 따라 그 활성이 다양하다. 또한, 크기가 작아 생체 내로 쉽게 흡수될 수 있으며, 다양한 기능적 특성을 나타낸다. 지금까지 연구된 생리활성 펩타이드의 효과로는 우유 단백질 가수분해물의 체내 항산화 기능 향상과 가공 식품에서의 산화 반응 방지, 달걀흰자 가수분해물의 새로운 항균 펩타이드 등이 있으며, 그 외에도 항 고혈압, 항 혈전, 면역 조절 등의 생리활성 펩타이드의 기능성 연구가 활발하게 진행되고 있다.
한편, 항산화제란 산화에 의해서 일어나는 식품의 냄새나 풍미의 변화, 유지의 산패, 식품의 변색을 방지하거나 지연할 수 있는 기능을 가진 화합물을 총칭하며 인공합성물을 비롯하여 동식물체 내에도 이런 기능을 갖는 물질이 많이 알려졌다. 이렇듯 산화 반응을 억제할 수 있는 항산화제에 대한 관심이 증대되면서 다양한 합성 항산화제인 뷰틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene; BHT), 뷰틸레이티드 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole; BHA), 뷰틸하이드로퀴논(tert-butylhydroquinone; TBHQ) 등이 널리 이용되고 있다.
그러나 이러한 합성 항산화제들의 안전성 논란이 꾸준히 제기되어 허용량에 대한 법적 규제가 엄격한 바, 이를 대체하기 위하여 상대적으로 안전한 천연 항산화제에 대한 연구가 활발하게 이루어지는 중이다.
이에, 전술한 바와 같이, 갈색거저리 유충은 사육이 용이하고 매우 많은 영양소들을 가지고 있으므로 대량 생산이 가능하며 천연 항산화제로 이용할 수 있는, 갈색거저리 유충에서 획득한 생리활성 펩타이드 획득을 위한 기술 개발 및 이를 이용한 새로운 천연 항산화제 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 항산화 효과가 뛰어난 단백 가수분해물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 효과가 뛰어나 다양하게 활용 가능한 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항산화 효과가 뛰어난 단백 가수분해물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 단백질 가수분해효소인 알칼라아제(Alcalase)로 가수분해된 갈색거저리( Tenebrio molitor , mealworm) 유충의 단백 가수분해물 또는 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 펩신(Pepsin), 서브틸리신(Subtilisin) 및 판크레아틴(Pancreatin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 가수분해효소와 알칼라아제(Alcalase)로 가수분해된 갈색거저리(Tenebrio molitor, mealworm) 유충의 단백 가수분해물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물을 포함하는 항산화용 기능성 식품 조성물, 간 보호용 기능성 식품 조성물 또는 스트레스 감소용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, (a) 기질인 건조된 갈색거저리( Tenebrio molitor, mealworm) 유충의 분말을 물 또는 완충용액에 1 내지 10%(w/v)로 혼합하여 기질 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 기질 용액을 가열하여 기질 용액에 포함된 자가 효소를 불활성화하는 단계; (c) 상기 기질 용액에 단백질 가수분해 효소를 갈색거저리 유충 분말 대비 0.1 내지 5%(w/v)가 되도록 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계; (d) 상기 혼합액에서 단백질 가수분해 효소와 갈색거저리 유충 분말을 반응시켜 반응 혼합액을 제조하는 단계; (e) 상기 반응 혼합액을 가열함으로써 단백질 가수분해 효소를 불활성화시켜 반응이 완료된 혼합액을 얻는 단계; (f) 상기 단계 (e)에서 얻어진 혼합액을 원심분리하여 상등액을 취하는 단계; (g) 상기 상등액을 여과막을 이용하여 원심분리하는 단계; 및 (h) 중량 평균 분자량이 0.01 kDa 이상 3 kDa 이하인 단백 가수분해물을 분리하는 단계;를 포함하는 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 갈색거저리 유충 단백 가수분해물은 특정 효소를 사용함으로써 3 kDa 이하의 생리활성 펩타이드를 포함하여 항산화 효과가 매우 뛰어나므로, 상기 단백 가수분해물을 포함하는 기능성 식품 조성물은 스트레스를 감소시키거나, 활성 산소로부터 간 세포를 보호하여 활성 산소와 관련이 있는 질환을 예방 또는 개선하는 데에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 하나의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물을 제조하는 방법을 모식도로 표현한 것이다.
도 2는 본 발명의 다른 하나의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 SDS-PAGE 실험 결과이다.
도 3은 도 2의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 수율을 측정한 것이다.
도 4는 도 2의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 단백질 가수분해도를 측정한 것이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 하나의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물에서, 생리활성 펩타이드들의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과이다.
도 6은 도 5의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물에서, 생리활성 펩타이드들의 ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과이다.
도 7은 도 5의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질의 가수분해물에서, 생리활성 펩타이드들의 과산화수소 소거활성을 측정한 결과이다.
도 8은 도 5의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질의 가수분해물에서, 생리활성 펩타이드들의 리놀레산 산화 방지 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 또 다른 하나의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 간 세포 보호 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 다른 하나의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 SDS-PAGE 실험 결과이다.
도 3은 도 2의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 수율을 측정한 것이다.
도 4는 도 2의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 단백질 가수분해도를 측정한 것이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 하나의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물에서, 생리활성 펩타이드들의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과이다.
도 6은 도 5의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물에서, 생리활성 펩타이드들의 ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과이다.
도 7은 도 5의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질의 가수분해물에서, 생리활성 펩타이드들의 과산화수소 소거활성을 측정한 결과이다.
도 8은 도 5의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질의 가수분해물에서, 생리활성 펩타이드들의 리놀레산 산화 방지 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 또 다른 하나의 실시예에 따른 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 간 세포 보호 효과를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본 발명은 단백질 가수분해효소인 알칼라아제(Alcalase)로 가수분해된 갈색거저리( Tenebrio molitor, mealworm) 유충의 단백 가수분해물을 제공한다.
본 발명에서 "알칼라아제(Alcalase)"는 박테리아나 진균에서 생성되는 단백질 가수분해 효소로, pH 7-9 부근의 조건에서 강한 단백질 분해능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 알칼라아제로 가수분해된 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물은 매우 높은 항산화 효과 및 활성산소로부터의 간세포 보호 효과를 나타낸 바, 상기 단백 가수분해물은 다양한 기능성 식품으로 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 펩신(Pepsin), 서브틸리신(Subtilisin) 및 판크레아틴(Pancreatin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 가수분해효소와 알칼라아제(Alcalase)로 가수분해된 갈색거저리(Tenebrio molitor , mealworm) 유충의 단백 가수분해물을 제공하며, 이때, 상기 단백질 가수분해효소들은 플라보르자임, 뉴트라아제, 펩신, 서브틸리신 및 판크레아틴에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 "플라보르자임(Flavourzyme)"은 진균류에서 얻을 수 있는 단백질 가수분해 효소로, pH 6-7 부근의 조건에서 단백질 분해능을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 "뉴트라아제(Neutrase)"는 바실러스 균에서 얻을 수 있는 단백질 가수분해 효소로, pH 5.5-7.5 부근의 조건에서 단백질 내부의 펩타이드 본드를 가수분해함으로써 단백질 분해능을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 “펩신(Pepsin)”은 동물의 위(stomach)의 주세포(chief cell)에서 분비되는 단백질 가수분해 효소로, 단백질에서 페닐알라닌과 타이로신과 같은 방향족 아미노산이 있는 부분을 가수분해할 수 있다.
본 발명에서 “서브틸리신(Subtilisin)”은 바실러스 균에서 얻을 수 있는 세린 단백질 가수분해효소로, 중성에서 알칼리성 정도의 최적 활성 pH를 가진다.
본 발명에서 “판크레아틴(Pancreatin)”은 동물의 췌장에서 만들어지는 단백질 가수분해 효소로, 대략 pH 8.0 전후에서 단백질 분해능을 나타낼 수 있다.
이때, 상기 단백 가수분해물은 0.01 kDa 이상 3 kDa 이하의 펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 펩타이드는 생리활성 펩타이드로도 불릴 수 있다.
이와 같이, 상기 생리활성 펩타이드를 포함하고 있는 상기 단백 가수분해물은 항산화 효과를 나타낼 수 있다.
더욱이, 본 발명은 상기 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물을 포함하는 항산화용 기능성 식품 조성물 또는 간 보호용 기능성 식품 조성물 또는 스트레스 감소용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
즉, 상기 단백 가수분해물이 생리활성 펩타이드를 포함하고 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물들은 뛰어난 항산화효과, 활성 산소로부터의 간 보호 효과 및 세포의 스트레스를 감소시키는 효과를 나타낼 수 있다.
상기 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있고, 그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 더 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존 료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
상기 기능성 식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 기능성 식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
더불어, 본 발명은 (a) 기질인 건조된 갈색거저리( Tenebrio molitor , mealworm) 유충의 분말을 물 또는 완충용액에 1 내지 10%(w/v)로 혼합하여 기질 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 기질 용액을 가열하여 기질 용액에 포함된 자가 효소를 불활성화하는 단계; (c) 상기 기질 용액에 단백질 가수분해 효소를 갈색거저리 유충 분말 대비 0.1 내지 5%(w/v)가 되도록 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계; (d) 상기 혼합액에서 단백질 가수분해 효소와 갈색거저리 유충 분말을 반응시켜 반응 혼합액을 제조하는 단계; (e) 상기 반응 혼합액을 가열함으로써 단백질 가수분해 효소를 불활성화시켜 반응이 완료된 혼합액을 얻는 단계; (f) 상기 단계 (e)에서 얻어진 혼합액을 원심분리하여 상등액을 취하는 단계; (g) 상기 상등액을 여과막을 이용하여 원심분리하는 단계; 및 (h) 중량 평균 분자량이 0.01 kDa 이상 3 kDa 이하인 단백 가수분해물을 분리하는 단계;를 포함하는 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물 제조방법을 제공한다. 상기와 같은 방법으로 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물을 제조할 때, 가장 높은 수율의 생리활성 펩타이드를 얻을 수 있으므로 바람직하다.
이때, 바람직하게는 상기 단계 (a)에서 건조된 갈색거저리 유충의 분말을 물 또는 완충용액에 3 내지 7%(w/v)로 혼합하여 기질 용액을 제조할 수 있고, 보다 바람직하게는 4%(w/v)로 혼합하여 기질 용액을 제조할 수 있다.
상기 완충용액은 바람직하게는 인산 나트륨 버퍼일 수 있다.
또한, 바람직하게는 상기 단계 (c)에서 단백질 가수 분해효소를 상기 갈색거저리 유충 분말 대비 0.5 내지 3%(w/v)가 되도록 혼합하여 혼합액을 제조할 수 있고, 보다 바람직하게는 1%(w/v)로 혼합하여 혼합액을 제조할 수 있다.
더욱이, 상기 단계 (b) 또는 단계 (e)에서 상기 반응 혼합액을 60℃ 내지 100℃에서 가열함으로써 자가 효소 또는 단백질 가수분해 효소를 불활성화시킬 수 있고, 바람직하게는 75℃ 내지 95℃, 보다 바람직하게는 90℃에서 가열함으로써 자가 효소 또는 단백질 가수분해 효소를 불활성화시킬 수 있다.
상기 단백질 가수분해 효소는 알칼라아제(Alcalase)일 수 있다.
또는, 상기 단백질 가수분해 효소는 알칼라아제(Alcalase)와 플라보르자임(Flavourzyme), 뉴트라아제(Neutrase), 펩신(Pepsin), 서브틸리신(Subtilisin) 및 판크레아틴(Pancreatin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 본 발명에 따른 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 기능성 식품 조성물은 특정한 종류의 단백질 가수분해 효소를 사용함으로써 항산화 효과를 나타내는 생리활성 펩타이드의 수율을 높이고, 이를 유용하게 활용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<준비예 1> 시료의 준비
실험을 위해, 2016년 3월 18일에 농업법인회사 (주)MG내츄럴(전남 담양군 무정면)에서 생산, 판매된 것으로, 진공건조된 갈색거저리의 유충을 구입하여 동결고에 보관하였고 실험에 사용하였다.
또한, 모든 실험 데이터는 최소 3번 반복하여 평균과 표준오차(평균±표준오차)로 나타내었으며, 통계 분석을 위해 SPSS Statistics 23(Version 23.0, Inc, Chicago, IL, USA)가 사용되었다. 그룹 간의 유의성 차이 검증에는 일원 배치 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하였으며, Scheffe의 다중 범위 검정 방법을 통한 사후 검증을 시행하였다. 유의 확률(P-value)이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
<실시예 1> 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 제조
도 1에 나타난 바와 같이, 상기 준비예 1에서 준비한 동결 건조된 갈색거저리 유충 분말을 10 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.0)에 용해하여 4%(w/v)의 기질 용액으로 제조한 후, 90℃에서 20분 동안 자가 효소를 불활성화시켰다. 다음 기질 대비 단백질 가수분해 효소들(알칼라아제(alcalase), 플라보르자임(flavourzyme), 뉴트라아제(neutrase), 브로멜라인(bromelain), 파파인(papain))이 1%(w/v)이 되도록 각 효소들을 처리하고, 각 효소별 최적온도인 55℃에서 24시간 반응시켰다. 이때, 각 펩타이드들을 대상으로 TNBS 및 SDS-전기영동을 수행하기 위해 시간별로 반응혼합액 5 mL씩 채취하였다. 24시간 이후, 최종 반응혼합액을 90℃에서 20분간 가열시켜 효소를 불활성화시켰다. 그 후 반응액을 13,000 xg에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었으며, 상등액을 추가적으로 한외여과막을 이용하여 2시간 동안 원심분리(5,000 xg)함으로써 최종적으로 분자량 3 kDa 이하의 단백 가수분해물을 얻었다. 이렇게 얻어진 단백 가수분해물은 동결건조한 후 20℃에 보관하면서 실험에 사용되었다.
<실시예 2> 갈색거저리 유충 단백질 가수분해물의 물리적 특성 확인
(1) 나트륨
도데실
설폰산염
폴리아크릴아미드
겔 전기이동(Sodium
dodecylsulfate
polyacrylamide
gel electrophoresis, SDS-PAGE)
단백질 가수분해효소 종류에 따른 갈색거저리 유충의 펩타이드를 확인하기 위해, 단백질의 SDS-PAGE 패턴을 측정하여 각각의 가수분해물에서 나타난 단백질의 분해 패턴을 조사하였다. SDS-PAGE은 Laemmli(Laemmli, UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. nature 227: 680-685.)의 방법으로 실시하였으며, 사용된 분리 겔은 15%를 사용하였고, 가수분해된 단백질에서 12000 rpm, 4℃, 10분 원심분리 후 상등액 20 ㎕을 겔에 로딩하여 80V에서 약 2시간 전기 영동하였다. 이후, 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)를 사용하여 밴드들을 염색하고 10% 아세트산이 함유된 30% 메탄올을 이용하여 탈색하였다. 대조군으로는 효소를 처리하지 않은 기질 용액을 사용하였고, 단백질 패턴의 분석은 Gel Logic 2200 PRO를 이용하여 폴리아크릴아미드 겔을 스캐닝한 후 이미지로 영상화시켜 수행하였다. 이때, 분자량 마커(molecular weight marker)는 BIO-RAD(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)의 제품을 이용하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 효소를 처리하지 않은 대조군(도 2의 [6])에 비해 알칼라아제 단백 가수분해물의 경우(도 2의 [1]), 크기가 10 kDa 이상인 것들은 모두 분해되어 이 크기의 밴드들은 나타나지 않았다. 이로부터 알칼라아제를 처리한 용액에 저분자 펩타이드가 많으며, 알칼라아제의 가수분해도가 우수함을 확인하였다. 뉴트라아제(도 2의 [4])는 알칼라아제를 이용한 단백 가수분해물보다 10 kDa 이상의 밴드가 뚜렷하였다. 플라보르자임(도 2의 [3])은 알칼라아제, 뉴트라아제 단백 가수분해물보다 밴드의 수가 증가하여 큰 분자량의 펩타이드가 보였다. 반면 브로멜라인(도 2의 [2]) 및 파파인(도 2의 [5]) 단백 가수분해물에서는 10 kDa - 25 kDa 사이의 단백질 띠가 선명하여, 이 분자량 크기의 펩타이드를 많이 함유한 것을 확인할 수 있었다.
이러한 SDS-PAGE 결과를 종합해 보았을 때, 효소별 단백 가수분해물 중 알칼라아제, 뉴트라아제, 플라보르자임, 브로멜라인, 파파인의 순서로 가수분해물에서 저분자 펩타이드가 많이 함유된 것을 알 수 있었다.
(2) 가수분해물의 수율 측정
상기 실시예 1에서 효소를 이용해 갈색거저리 유충의 단백질 가수분해물을 제조하기 위해 최적 분해 조건하에서 24시간까지 효소 분해를 실시하였다. 즉, pH 7.0의 완충용액을 혼합한 갈색거저리 유충 시료와 알칼라아제, 플라보르자임, 뉴트라아제, 브로멜라인, 파파인을 첨가하여 24시간 효소 분해하였고, 효소를 불활성화 하기 위해 100℃에서 20분간 반응시켜 이를 원심 분리기를 이용해 상등액을 채취하였으며, 8℃의 5,000 xg, 2시간 한외여과막을 이용하여 3 kDa 이하의 펩타이드들을 분리하였다. 그 후, 동결건조하여 갈색거저리 유충 단백질의 가수분해물을 제조하였는 바, 10 mM 인산 나트륨 버퍼에 의한 염을 고려하여 하기 식 1에 나타난 바와 같이 갈색거저리 유충 단백질의 가수분해물을 갈색거저리 고형분에 대한 비로 나타내어, 가수분해물의 수율을 계산하였다.
[식 1]
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 알칼라아제를 첨가한 단백 가수분해물의 수율이 44.71%로 가장 높았으며, 뉴트라아제 34.33%, 플라보르자임 23.17%, 브로멜라인 15.75%, 파파인 11.82% 순으로 나타났다. 이는 알칼라아제를 처리한 단백 가수분해물의 3 kDa 이하 펩타이드의 수율을 확인한 SDS-PAGE 실험 결과와 일치하는 것이다. 따라서 수율이 높은 알칼라아제, 플라보르자임, 뉴트라아제 효소를 처리한 단백 가수분해물을 경제적, 생산적으로 유용하게 사용할 수 있다.
(3) 단백질의 가수분해도 측정
상기 효소들에 의해 얼마만큼의 단백질이 가수분해되는지를 확인하기 위해, 트리니트로벤젠설폰산(Trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS) 방법(G-Biosciences Co.)을 이용하여 시간에 따른 갈색거저리 유충 단백 가수분해물에서 펩타이드의 함량을 측정하였다. 단백질이 가수분해되면 가수분해도에 비례하여 유효성 아미노기의 농도가 증가하는 원리를 이용하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1과 같이 세 종류의 효소 및 기질 혼합액을 제조한 후 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 및 24시간마다 시간에 따른 갈색거저리 유충 단백질의 가수분해도를 측정하였다. 10 mM 중탄산나트륨(sodium bicarbonate; pH 8.5) 990 ㎕와 1% TNBS 10 ㎕를 혼합(v/v)하여 0.01% TNBS를 제조하고, TNBS 50 ㎕와 시간별로 취한 반응혼합액 100 ㎕를 섞어 37℃에서 2시간 반응시킨 후 반응을 정지시키기 위해 10% 도데실 황산나트륨(sodium dodecylsulfate; 10% SDS)과 1N 염화수소(hydrogen chloride; 1N HCl)를 첨가하였다. 그리고 마이크로플레이트 분광 광도계(microplate spectrophotometer)를 이용하여 335 nm에서 각 혼합액들의 흡광도를 측정하였다. 이후 이 결과를 타이로신 함량으로 환산하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 플라보르자임 5429.35 ㎍/mL, 알칼라아제 4781.38 ㎍/mL, 뉴트라아제 3155.55 ㎍/mL, 브로멜라인 1800.00 ㎍/mL, 파파인 1782.61 ㎍/mL 순으로 나타났다. 이는 SDS-PAGE 및 수율 측정결과와 유사한 결과이다.
이후, 가수분해도가 우수하였던 알칼라아제, 플라보르자임 및 뉴트라아제 단백 가수분해물을 이용하여 항산화 활성을 조사하였다.
<실시예 3> 획득한 펩타이드들의 항산화 활성 측정
1) DPPH 라디칼 소거활성 측정
DPPH 라디칼은 항산화 물질이 수소 원자나 전자를 공여할 수 있는 능력을 평가할 때 사용되는 물질로서 수소 혹은 전자를 받음으로써 안정한 형태의 화합물로 전환되어 라디칼 특유의 보라색이 옅은 노란색으로 변한다. 이러한 원리를 이용하여, 단백 가수분해물의 α,α-디페닐-β-피크릴히드라질(α,α-diphenyl-ß-picryhydrazyl, DPPH)에 대한 환원력을 측정함으로써 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 확인하였다.
구체적으로, 99% 메탄올을 이용하여 상기 실시예 1에서 얻은 단백 가수분해물 시료들을 0, 100, 250, 500 또는 1000 ㎍/mL으로 희석하고, 희석된 각 시료들을 96 웰 플레이트에 160 ㎕씩 분주하였다. 그 다음, 메탄올에 녹인 0.2 mM DPPH 용액 40 ㎕를 시료가 분주된 웰에 분주하여 실온에 30분간 방치한 후, 마이크로플레이트 분광광도계를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 하기 [식 2]를 이용하여 각각의 효소별 갈색거저리 유충 단백 가수분해물의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50값으로 나타내었다. 이때 활성 비교를 위하여 양성대조군으로서 트롤록스(Trolox)를 사용하였다.
[식 2]
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 알칼라아제 단백 가수분해물의 RC50값은 339.34 ㎍/mL, 플라보르자임은 379.35 ㎍/mL, 뉴트라아제는 398.93 ㎍/mL로 나타나 알칼라아제 단백 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거활성이 가장 높았다.
Yoon 등(2007. Antioxidant activity and physiological function of the Anomala albopilosa extracts. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 36(6): 670-677.)의 연구 결과와 비교해보면, 청동풍뎅이 유충의 에탄올 추출물의 RC50 값이 483.39 ㎍/mL로 나타나 갈색거저리 유충 단백 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거활성이 훨씬 우수한 것을 알 수 있었다.
또한, Yu 등(2008. 번데기 가수분해물의 ACE 저해활성과 항산화활성. 한국식품영양과학회지 37(2): 136-140.)이 누에 번데기에 뉴트라아제, 알칼라아제, 트립신 및 펩신을 처리하여 단백 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거활성을 확인한 결과, 알칼라아제 단백 가수분해물의 RC50값이 396.09 ㎍/mL, 뉴트라아제가 352.75 ㎍/mL, 트립신이 677.44 ㎍/mL, 펩신이 626.09 ㎍/mL으로 나타났다. 즉, 이 결과에서 알칼라아제 및 뉴트라아제의 결과는 갈색거저리 유충 단백 가수분해물과 유사한 경향을 보였고 트립신 및 펩신의 경우 소거활성이 다소 낮은 경향을 보였다.
2) ABTS 라디칼 소거활성 측정
ABTS 라디칼 소거활성 측정법은 표준물질인 트롤록스의 값과 비교하여 나타낼 수 있으며, in vivo에서의 항산화능 측정뿐만 아니라 in vitro에서 항산화능을 측정하기 위한 방법으로 널리 이용되고 있다. ABTS와 과황화칼륨(potassium persulfate)을 암소에 방치하면 ABTS 라디칼이 생성되며, 시료 속 항산화물질로 인해 라디칼이 소거되면 짙은 청록색의 ABTS 라디칼이 탈색되는데 이를 흡광도로 측정하는 방법이다.
구체적으로, 최종 농도가 7 mM인 ABTS와 2.45 mM 과황화칼륨을 각각 혼합한 후 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 라디칼을 형성시켰다. 이후, ABTS 용액의 농도가 734 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 인산 완충 생리 식염수(PBS, pH 7.4)로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 180 ㎕에 각 효소별 단백 가수분해물 20 ㎕를 가하여 1분 동안 30℃에 방치한 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 하기 [식 3]을 이용하여 이렇게 측정된 각각의 효소별 갈색거저리 유충 단백 가수분해물의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50값으로 나타내었다. 이때 활성비교를 위하여 양성대조군으로서 트롤록스를 사용하였다.
[식 3]
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 뉴트라아제 처리를 통해 얻은 단백가수분해물의 RC50은 29.84 ㎍/mL, 알칼라아제는 31.71 ㎍/mL, 플라보르자임은 56.03 ㎍/mL순으로 뉴트라아제 단백 가수분해물의 라디칼 소거 활성이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 Lee 등(2008. 아보카도 추출물의 Apoptosis 유도와 항산화 활성. 한국식품영양과학회지 37(3): 269-275.)의 연구에 따른 아보카도의 80% 메탄올 추출물을 이용하여 ABTS 라디칼 소거활성과 비교해본 결과, 아보카도의 과육은 200 ㎍/mL에서 38.4%로 나타났고, 본 연구에서 사용한 갈색거저리 유충 알칼라아제 단백 가수분해물은 50 ㎍/mL에서 69.80%, 플라보르자임은 49.38% 및 뉴트라아제는 71.41%로, ABTS 라디칼 소거 활성능이 훨씬 우수한 것으로 나타났다.
3) 과산화수소(Hydrogen peroxide, H
2
O
2
) 소거활성 측정
산소의 환원 대사물질인 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)는 다양한 외부요소에 자극받아 정상세포의 미토콘드리아와 퍼록시좀에서 형성되는데, DNA 및 단백질 손상을 유발하거나 불포화지방산과 같은 생체막의 구성성분을 공격하여 과산화지질을 생성함으로써 생체 기능의 저하나 노화 및 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 퍼록시다아제의 기질인 ABTS를 이용하여 갈색거저리 유충 단백 가수분해물의 H2O2 소거활성을 측정하였다. 구체적으로, Muller HE 등(1985. Detection of hydrogen peroxide produced by microorganisms on an ABTS peroxidase medium. Zentralblatt fur Bakteriologie , Mikrobiologie und Hygiene. Series A: Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology 259(2): 151-154.)의 방법에 따라 증류수에 농도별로 희석한 각 효소별 단백 가수분해물을 20 ㎕, PBS 100 ㎕, 1 mM H2O2 20 ㎕를 96 웰 플레이트에 가한 후 37℃ 인큐베이터에서 5분간 반응시켰다. 이후, 1.25 mM ABTS 30 ㎕와 1 U/mL 퍼록시다아제 30 ㎕를 가하고 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 분광 광도계를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성비교를 위하여 양성대조군으로서 트롤록스를 사용하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 알칼라아제 단백 가수분해물의 RC50값은 65.94 ㎍/mL였으며, 뉴트라아제 121.67 ㎍/mL 및 플라보르자임 70.38 ㎍/mL로 나타났다. 이러한 결과를 지금까지 수행된 연구 결과와 비교해보면, Hwang 등(2014. 건조방법에 따른 아로니아(Aronia melancocarpa) 열수 추출물의 항산화 성분 함량 및 항산화 활성. 한국식품과학회지 46(3): 303-308.)은 아로니아 추출물의 H2O2 소거능을 RC50값으로 나타낸 결과 172.05 ㎍/mL로 개재하고 있는 바, 천연물인 아로니아 추출물보다 갈색거저리 유충 단백 가수분해물의 H2O2 소거능이 우수한 것으로 나타났다.
4) 리놀레산(linoleic acid) 산화에 대한 산화 방지 효과 확인
지질산화 초기에 발생하는 과산화물은 염화제일철(ferrous chloride)와 반응하여 빨간색에 가까운 염화제이철(ferric chloride) 색소를 생성하게 되며, 지질의 산화가 계속 진행되면 말론알데하이드(malonaldehyde)와 같은 저분자의 화합물이 생성되는데 이것은 다시 티오바르비툴산(thiobarbituric acid, TBA)와 결합하여 빨간색의 화합물을 형성한다. 따라서 본 실험에서는 불포화지방산인 리놀레산을 기질로 하여 갈색거저리 유충 단백 가수분해물의 산화방지 효과를 평가하였다.
구체적으로, 상기 3가지 항산화 실험 중 비교적 항산화 활성이 가장 높았던 알칼라아제 단백 가수분해물을 이용하였다. 먼저 리놀레산 반응기질 용액을 제조하기 위해서 50 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.0) 2 mL와 2.52% 리놀레산 1 mL, 무수 알코올(absolute alcohol) 1 mL, 각 농도별 알칼라아제 단백 가수분해물 1 mL을 혼합한 후 40℃에서 100 rpm으로 진탕하였다. 이후, 20% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA; w/v) 100 ㎕, 0.8% TBA 100 ㎕와 리놀레산 반응기질 용액 50 ㎕을 잘 혼합하여 95℃ 이상에서 20분 반응시킨 후, 실온에서 10분간 냉각시키고 3000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 180 ㎕의 상등액을 흡광도 532 nm에서 측정하였다. 이러한 과정은 하루 간격으로 총 3번 수행되었고, 활성비교를 위하여 양성대조군으로서 트롤록스를 사용하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 시간이 지날수록 음성 대조군(단백 가수분해물을 넣지 않음)의 지질 과산화물이 증가하였으며, 음성 대조군의 3일째 흡광도 값을 100%로 봤을 때, 알칼라아제 단백 가수분해물의 농도가 100, 200, 400 및 800 ㎍/mL로 높아짐에 따라 지질 과산화물의 산화 또한 각각 약 27, 33, 40 및 68%를 나타내며 유의적으로 억제됨을 확인하였다.
<실시예 4> 활성 산소(ROS, H
2
O
2
)로부터의 간 세포 보호 효과
(1) 세포 배양
마우스 유래의 정상 간세포인 AML-12 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였으며, 분양받은 후 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 1% 인슐린-트랜스퍼린-셀레늄(insulin-transferrin-selenium; ITS), 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신) 및 덱사메타손(40 ng/mL)을 함유하는 DMEM/F-12 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
(2) 세포생존율 측정
활성산소로 인한 세포독성으로부터 갈색거저리 유충 단백 가수분해물의 간세포 보호효과를 알아보기 위하여, AML-12 세포를 2×104 cells/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하고 24시간 배양 후, 알칼라아제, 플라보르자임 및 뉴트라아제 처리 단백 가수분해물을 각 농도 별로 24시간 처리하였다. 이후 7 mM의 H2O2를 1시간 처리하고, MTT 시약(2.5 mg/mL)을 각 웰에 20 μL씩 첨가하여 3시간 배양한 다음, 상층액을 제거하고 각 웰에 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 다이메틸설폭사이드(Dimethyl sulforxide, DMSO)로 용해시켜 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 간세포 보호 효과는 H2O2 무처리군(대조군)의 생존율을 기준으로 각 처리군의 상대적인 세포생존율(cell viability)을 평가하여 계산하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 7 mM H2O2에 의해 AML-12 세포의 생존율은 21% 정도로 낮아졌으나, 각 단백 가수분해물을 처리한 세포의 경우 세 가지 효소 처리군 모두 유의적인 세포생존율의 증가를 보였다. 특히 그중 알칼라아제 처리 단백 가수분해물은 1, 2.5, 5 mg/mL의 농도에서 각각 53, 68 및 75%의 세포생존율을 보여 활성산소에 의한 세포독성으로부터 간세포를 보호하는 효과가 가장 큰 것으로 나타났다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
Claims (10)
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- 알칼라아제(Alcalase)로 가수분해되고, 0.01 kDa 이상 3 kDa 이하의 펩타이드를 포함하는 갈색거저리 유충의 단백 가수분해물을 포함하는 간 보호용 기능성 식품 조성물.
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-
2016
- 2016-11-16 KR KR1020160152535A patent/KR101966503B1/ko active IP Right Grant
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180055120A (ko) | 2018-05-25 |
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