KR100580332B1

KR100580332B1 - 민태 껍질로부터 유래한 항산화 펩티드를 유효성분으로함유하는 항산화제 조성물

Info

Publication number: KR100580332B1
Application number: KR1020040024926A
Authority: KR
Inventors: 김세권; 정원교; 제재영
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2004-04-12
Filing date: 2004-04-12
Publication date: 2006-05-16
Also published as: KR20050099747A

Abstract

본 발명은 민태 껍질로부터 분리한 항산화 펩티드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 민태 껍질로부터 항산화 효과를 가지는 펩티드를 분리하고 이를 유효성분으로 함유하는 항산화제 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 항산화 펩티드를 함유하는 기능성 조미료에 관한 것이다.

민태 껍질, 젤라틴 가수분해물, 참치내장유래 조효소(TICE), 항산화 조성물, 기능성 조미료

Description

민태 껍질로부터 유래한 항산화 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제 조성물{Composition for anti-oxidant containing hydrolysates from hoki skin}

도 1은 인체 내에 작용하는 여러가지 산화기작 및 방어(항산화) 기작, 그리고 상호작용에 따르는 결과를 보여주는 모식도이다.

도 2는 민태 껍질로부터 항산화 펩티드를 분리하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 3은 여러 가지 효소에 의한 민태 껍질 젤라틴의 가수분해 정도를 보여주는 그래프이다 (농도 1%(w/v), S/E=100 (w/w), 배양시간 8시간).

(A: α-키모트립신, B: TICE, C: 트립신, D: 알칼라아제, E: 파파인, F: 프로나아제 E, G: 펩신, H: 뉴트라아제).

도 4는 민태 껍질로부터 분리한 가수분해물의 항산화 활성을 보여주는 그래프이다.

도 5는 민태 껍질 젤라틴으로부터 분리한 TICE +α-키모트립신 가수분해물의 항산화 활성을 보여주는 그래프이다.

도 6은 민태 껍질 젤라틴으로부터 분리한 TICE +α-키모트립신 가수분해물과 천연 항산화제인 α-토코페롤의 항산화 활성에 대한 시너지 (synergy) 효과를 보여주는 그래프이다.

도 7은 SP-Sephadex C-25 컬럼에서 HSG Ⅰ의 양이온 교환 크로마토그래피 결과를 보여준다.

도 8은 Sephadex G-50에서 겔 크로마토그래피의 패턴을 보여준다.

도 9는 Sephadex G-75 겔 크로마토그래피로 용출한 G-3 활성 분획을 Primary 10 C-18 컬럼으로 용출한 역상 HPLC 패턴을 보여준다.

도 10은 리놀레산의 산화시스템에서 P-HSG의 항산화 활성을 보여주는 그래프이다.

도 11은 민태 껍질 젤라틴으로부터 분리한 항산화 펩티드의 분자량을 보여준다.

도 12는 민태 껍질 젤라틴으로부터 분리한 항산화 펩티드를 인간 정상 간세포에서 배양하였을 때 나타나는 세포독성을 보여주는 그래프이다 (5% CO₂ 및 37℃에서 배양, CCK-8 assay로 검출).

도 13은 민태 껍질 젤라틴으로부터 분리한 항산화 펩티드가 t-BHP 농도별로 세포괴사에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다 (5% CO₂ 및 37℃에서 배양).

도 14는 배양한 간세포에 t-BHP를 처리하여 유도되는 지질 과산화반응에 민태 껍질로부터 분리한 항산화 펩티드가 미치는 영향을 보여준다.

도 15는 배양한 간세포에 t-BHP를 처리하여 유도되는 카탈라아제 활성에 민태 껍질로부터 분리한 항산화 펩티드가 미치는 영향을 보여준다.

도 16은 배양한 간세포에 t-BHP를 처리하여 유도되는 슈퍼옥시드 디스뮤테이 즈 활성에 민태 껍질로부터 분리한 항산화 펩티드가 미치는 영향을 보여준다.

도 17은 배양한 간세포에 t-BHP를 처리하여 유도되는 글루타치온 퍼옥시다아제 활성에 민태 껍질로부터 분리한 항산화 펩티드가 미치는 영향을 보여준다.

도 18은 배양한 간세포에 t-BHP를 처리하여 유도되는 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 활성에 민태 껍질로부터 분리한 항산화 펩티드가 미치는 영향을 보여준다.

해양생물은 종의 다양성과 더불어 진화과정의 독자성 및 서식환경의 특이성이라는 요인에 의하여 기존의 육상생물이 보유·생산할 수 없는 화학물질 및 생체 분자들을 함유하고 있으며, 이들의 생합성·분해에 관여하는 특이한 신종효소(novel enzyme)와 보조인자(cofactor)들도 존재하고 있어서 신약물질과 새로운 생리기능성 물질의 소재로서 관심이 집중되고 있다. 더욱이 육상생물을 대상으로 활발히 진행되어 왔던 선도물질의 탐색 및 개발이 한계에 이르기 시작함에 따 라 자연히 관심대상이 해양생물로 전환되었다. 미국, 일본, 호주, 영국, 프랑스, 독일 등과 같은 해양 선진국들에 의해서 현재까지 밝혀진 해양생물 유래의 항암, 항산화성, 항곰팡이성, 항균성, 항종양성, 항바이러스성, 항염증을 나타내는 약리활성 물질들이 이미 다수 보고되어져 있다.

또한 해양생물자원으로부터 식량자원의 생산에 관한 연구의 중요성도 점점 증가하고 있다. 특히, 수산가공식품의 소비가 증가함에 따라 어류가공의 부산물로 발생되는 어뼈, 어피, 어두(魚頭), 내장, 비늘 등과 같은 비가식부도 현저하게 증가되고 있다. 이들 어류가공잔사 부위는 전체 어체의 약 40∼70%를 차지하고 있다. 따라서, 어뼈는 칼슘원으로서, 어피는 단백질원으로서, 그리고 내장은 산업용 효소로서 활용하기 위한 고부가가치화 연구가 이루어지고 있다.

특히 최근에는 동식물 단백질을 각종 효소를 이용하여 가수분해시킨 가수분해물의 올리고펩티드를 분리정제하여 이들의 생리활성 검토에 관한 연구가 진행되고 있다. 이들 올리고펩티드는 항산화활성 및 혈압강하작용이 있는 것으로 밝혀지면서 피부노화방지 및 고혈압 등의 성인병 예방치료제로서 이용도 가능하다는 결과가 보고되고 있다.

한편, 항산화제는 산화를 방지하는 물질을 통칭하는 것으로서, 도 1에서 보여지는 것과 같이 그 작용기작에 따라 자동산화의 연쇄반응을 제어하는 자유라디칼 소거제(scavenger), 과산화물을 비라디칼로 분해하여 불활성화시키는 과산화물 분해제, 미량금속의 산화 촉진작용을 불활성화하는 금속 불활성화제, 자동산화에 있어서 라디칼 저해제와 공존시 항산화작용을 증가시키는 상승제 및 각종 활성산소계 를 소거하는 단일산소 억제제(singlet oxygen quencher) 등으로 분류된다. 항산화제는 다시 크게 두 그룹으로 분류되는데, 일차 항산화제(primary antioxidants) 또는 연쇄절단형 항산화제(chain-breaking antioxidants)로서 지질라디칼과 반응하여 더욱 안정한 생산물로 바꾸는 그룹과 이차 항산화제(secondary antioxidants) 또는 예방적 항산화제(preventive antioxidants)로서 다른 메카니즘에 의해 자동산화를 지연시키는 그룹으로 분류된다.

일차 항산화제는 상대적으로 안정한 라디칼을 만들기 위해 지질 유리라디칼에 수소원자를 제공함으로서 연쇄반응의 연장을 저지하여 자동산화를 막는다. 이러한 형태의 항산화제는 대부분 페놀화합물로서 α-토코페롤, 몰식자산(gallic acid) 및 그 유도체, 쿠에르세틴(quercetin), 람네틴(rhamnetin), 캄페롤(kampferol), 루틴(rutin), 쿠에르시트린(quercitrin) 및 카페인산(caffeic acid) 등의 플라보노이드(flavonoid)계가 알려져 있다.

이차 항산화제는 순수한 지질에서 항산화 효과를 나타내지 않지만 일차 항산화제의 효과를 증대시키거나 산화촉진제(prooxidant)의 효과를 저해시킨다. 이러한 형태의 항산화제는 α-토코페롤과 같은 일차 항산화제와 상승작용을 나타내는 인지질과 산화촉진제 금속이온과 킬레이트 되는 시트르산 및 아스코르브산 등이 있다.

대표적인 산화반응인 지질의 산패는 주로 높은 온도나 빛에 의해 생성된 지질 라디칼이나 ¹O₂에 의해 과산화물의 생성과 분해가 연쇄적으로 일어나는 반응으로 이들 페놀성 항산화제가 존재할 경우, 페놀성 OH기가 유지의 유리기 수용체로서 작 용하여 유지산패의 초기 단계에서 생성된 유리기들이 안정한 공명 혼성체를 형성하도록 하여 산화 억제 작용을 하게 된다. 이러한 항산화제는 각종 식물 추출물, 향료, 발효생산물 등의 플라보노이드(flavonoid) 또는 페놀계 화합물로 존재한다.

또한 동식물의 단백질을 산이나 각종 효소를 이용하여 가수분해시켜 생산한 올리고펩티드도 항산화활성을 나타낸다고 보고되고 있다. 또한 이들 각종 단백질 가수분해물들은 저항원성, 칼슘흡수 촉진작용 및 항콜레스테롤작용 등의 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 대표적인 단백질 가수분해물로부터 얻어지는 펩티드로는 우유 카제인 펩티드, 난(卵)단백질 펩티드, 어육단백질 펩티드, 대두단백질 펩티드 및 소맥단백질 펩티드 등이 알려져 있다 (未綱, 1989 ; 本井, 1989).

이와 대별하여 합성 항산화제로는 입체장해를 나타내는 큰 치환기를 가져 안정한 라디칼을 형성하여 항산화성을 나타내는 페놀계 화합물과 sulfur계 화합물, 구연산과 그 유도체들, 인산과 그 유도체들 등이 알려져 있다. 동물실험의 결과, 합성 항산화제가 각종 효소군 등에 영향을 끼침으로써 부작용을 일으키며, 특히 BHT는 기형발생 또는 암발생에 관여하는 것으로 보고되어(Branen, 1975) 뛰어난 항산화 효과에도 불구하고 부작용으로 인해 문제시되고 있는 반면, 천연 항산화제는 부작용이 거의 없어 식품첨가물 또는 약품으로 현재 널리 이용되고 있다.

그러나, 천연 항산화제 중 가장 널리 이용되는 α-토코페롤의 경우 비싼 가격과 지용성이라는 이용상의 제약으로 대체 천연 항산화제의 개발이 요망되고 있다. 이와 같이 단백질 가수분해물이 갖는 생리활성 작용에 관한 연구는 최근에 큰 관심의 대상이 되고 있고, 영양원으로서 수산물 단백질에 의한 의존도가 높음에도 불구하고 이들의 생리활성 특히, 항산화 효과와 관련이 있는 연구는 미흡한 실정이다.

이에 본 발명자들은 수산가공공장에서 어육을 얻기 위해 필렛 작업 (filleting) 후 발생되는 민태 껍질(Hoki skin)을 막효소반응기에서 각종 단백질 가수분해효소로 가수분해하여 분자량별로 대량 분획하였으며, 이들로부터 항산화성이 높은 펩티드를 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피 및 HPLC로 정제하여 아미노산 배열을 결정함으로써 새로운 생리기능성을 갖는 펩티드를 얻었고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 민태 껍질로부터 분리한 항산화 활성을 가지는 펩티드 및 이를 함유하는 항산화제 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 펩티드를 함유하는 기능성 천연조미료를 제공하는 것이다.

본 발명은 수산물가공부산물인 민태 껍질로부터 분리한 항산화 펩티드에 관한 것이다.

본 발명에 의한 항산화 펩티드는 하기 (1) 내지 (5)의 특징을 가진다:

(1) 최적온도 45∼55℃;

(2) 최적 pH 9.0∼10.0;

(3) 온도 50℃ 및 pH 10.0 에서 24시간 이상 안정;

(4) 등전점 pI 6.5;

(5) 분자량 1,000∼5,000 Da.

또 본 발명은 상기 (1) 내지 (5)의 특징을 가지면서 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 펩티드에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 항산화 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균 상태의, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태 등의 피부 외용제 또는 경구용 제형으로 제형화할 수도 있고, 피하주사, 정맥주사 또는 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수도 있다.

피부 외용제의 경우는 본 발명의 피부외용제 조성물은 피부에 적용할 수 있는 통상적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 예를 들면 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스, 메이컵 베이스, 파운데이션, 보디 세정제, 치약 또는 구강청정액 등과 같은 화장품뿐만 아니라 액상비누, 고형비누, 세안 폼(foam)과 같은 인체세정제 등으로 제형화될 수 있다. 이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

경구용 제형의 경우는 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 부형제(forming agent)를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산 가능한 가루 혹은 입자, 유화액, 연질 혹은 경질 캡슐, 시럽, 일릭서와 같은 형태의 경구형 제형으로 제제화될 수 있으며, 이는 단위 투여량, 형태 등에 따라 알맞게 제조될 수 있다.

비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용 가능한 희석제 (diluent)나 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할 수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매로는 물, 링거액 그리고 등장성 식염수 용액이 있으며, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장 내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터 또는 폴리에틸렌글리콜 등과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여한다.

또한 본 발명은 상기 민태 껍질로부터 분리한 항산화 펩티드를 함유하는 기능성 조미료에 관한 것이다.

본 발명에 의한 기능성 조미료는 상기 펩티드를 조미료 총 중량에 대하여 10∼40 중량% 양으로 함유한다. 상기 펩티드의 함유량은 조미료의 맛과 향에 따라 조절가능하다.

본 발명에 의한 기능성 조미료는 통상적인 천연 조미료의 제조방법을 통해 제조할 수 있으며, 맛과 향을 위해 홍합 발효조미액을 함께 첨가하여 제조할 수 있다.

[실시예 1] 민태 껍질로부터 젤라틴 추출

젤라틴의 추출은 Kim 등 (1996)의 방법에 따라 동결된 어피를 수세한 후, 피하지방 및 콜라겐 이외의 이물질을 제거하기 위하여 수산화칼슘 용액에 3일간 침지하였다. 침지한 어피를 다시 12시간 수세, 중화 및 재수세하여 최적 온도, 첨가수량, 시간, pH조건에서 젤라틴을 추출하였다. 추출된 젤라틴을 원심분리(12,000×g, 20 min)한 후 상층액을 Whatman No. 1 여지로 여과하였다. 여과된 상층액은 탈취, 탈색하기 위하여 활성탄으로 처리한 다음, 이 용액을 양이온 교환수지(Amberlite IRA 200)와 음이온 교환수지(Amberlite IRA 900)로 정제한 다음 열풍건조(40℃에서 2일간)하여 4℃에 저장하여 두고 실험에 사용하였다.

수산가공공장에서 가공 후 발생되는 민태(Johnius belenegerii) 껍질을 이용하여 하기 표 1에 기재한 최적조건에서 젤라틴 성분을 추출하여 아미노산 조성을 분석한 후, 최적 효소적 수식에 의해 얻어지는 가수분해물들을 분자량별로 획분하였다.

민태 껍질 젤라틴의 아미노산 조성분석 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 즉, Gly, Glu 및 Ala의 함량이 각각 27.3%, 10.0%, 11.4% 및 33.3%, 7.1%, 11.2%로 전체 아미노산 함량의 절반 이상을 차지하였다. 특히, 필수아미노산의 함량이 20.6%로 Kim 등 (2001)이 보고한 육상동물인 우피(牛皮) 젤라틴의 12.2% 보다 2배정도 많이 함유되어 있었으며, 콜라겐 유래의 Hyp를 각각 3.5%와 9.8% 정도 함유하고 있었다.

이들 가수분해물의 생리활성을 검토한 후 도 2와 같은 과정을 거쳐 분리, 정제하여 구조 및 특성을 밝혔다.

조건	Degree
온도(℃)	50
pH	5.0
반응시간(h)	8
민태 껍질에 대한 물의 비율	10:1

(AA/100 g protein)

아미노산	민태 껍질 젤라틴
Hydroxyproline	3.5
Aspartic acid	7.5
*Threonine	3.1
Serine	4.6
Glutamic acid	10.1
Glycine	27.3
Alanine	11.5
Cysteine	2.0
*Valine	3.2
*Methionine	2.2
*Isoleucine	2.2
*Leucine	3.4
Tyrosine	2.1
*Phenylalanine	2.3
*Lysine	3.0
*Histidine	1.2
Arginine	5.2
Proline	5.6
필수 아미노산	20.6
총 아미노산	100

* 필수 아미노산

[실시예 2] 민태 껍질 단백질에 대한 최적 가수분해조건 검토

1. 일반성분 분석

일반성분은 상법에 따라 측정하였다. 즉, 수분은 상압 가열건조법, 조지방은 Soxhlet법, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl법, 조회분은 건식회화법으로 측정하였다.

각 시료를 회수한 다음, 민태 껍질 전체를 대상으로 일반성분 분석한 결과는 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 수분, 단백질, 지질 및 회분의 함량이 각각 82.51%, 14.67%, 2.07% 및 0.75%로 나타났다. 일반적으로 생선의 전체 수분함량이 약 70∼80% 가량으로 알려져 있으며, 특히 다량의 콜라겐 분자로 구성되어 있는 생선껍질의 경우에는 높은 보습력으로 육 부위보다 수분함량이 다소 높은 것으로 나타 났다.

민태 껍질의 일반성분 분석

구성성분	함량 (%, w/w)
수분	82.51 ( - )
단백질	14.67 (83.88)
지방	2.07 (11.84)
Ash	0.75 ( 4.29)

( ), percentage on dry basis.

2. 젤라틴의 최적 가수분해효소의 선별

민태 껍질 젤라틴의 최적 가수분해효소를 선정하기 위하여 상기 표 1에서 보여주는 최적 조건하에서 여러 가지 효소, 즉, 시판효소인 알칼라아제(Alcalase), 뉴트라아제(Neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 키모트립신(chymotrypsin), 트립신(trypsin), 프로나아제 E(pronase E), 참치 유문수 및 내장 유래의 조효소를 이용하여 가수분해시킨 후, 가수분해도를 10% TCA 용액으로 처리하고 원심분리 (2,370×g, 5 min)하여 상층액의 가용성 질소량을 Lowry법(1951)으로 측정하였다.

최적조건에서 가수분해를 실시한 결과를 도 3에 나타내었다. α-키모트립신에 의해 약 80%의 가수분해도(DH; degree of hydrolysis)를 보였으며 파파인의 경우에도 가수분해도가 매우 높음을 알 수 있었다.

Kim 등 (1995)은 연속식 3단계 효소막반응기 시스템을 이용하여 각 단계별로 다른 효소로써 가자미 피 젤라틴을 분해하였고, Turgeon과 Gauthier(1990)는 2단계 막(1단계 30,000 cut off, 2단계 1,000 cut off) 반응기에서 트립신과 키모트립신 으로 유청 단백질(whey protein)을 가수분해하였다. 이와 같이 1단계, 2단계 및 3단계 막반응기에서 각각 다른 효소를 사용하여 젤라틴을 가수분해하여도 저분자 펩티드 함량 및 유리아미노산 함량이 적은 것은 젤라틴 중에 Gly-Gly, Gly-Pro 사슬이 많고, 이들 사슬이 일반 단백질분해효소에 의해 분해되기 어렵기 때문이라고 판단된다(丹戶 등, 1984). 반면 민태 껍질 젤라틴을 대상으로 실시한 본 실험에서는 α-키모트립신 만으로도 높은 가수분해도를 보였다.

3. 가수분해도 측정

민태 껍질 유래의 젤라틴의 가수분해도(degree of hydrolysis: DH)는 젤라틴 1g을 완충용액 100 ml에 분산시켜 1% 기질용액으로 하여 기질 대 효소비가 100: 1이 되도록 한 후 40℃에서 1시간 반응시킨 후 반응혼합물에서 2 ml를 취하고 여기에 20% TCA를 동량 첨가하여 원심분리(2,370×g, 5 min)한 다음, 상층액의 일정량을 취하여 Lowry 법(1951)으로 10% TCA 가용성 질소량을 측정한 후 그 가수분해도를 계산하였다.

4. pH 효과

민태 껍질 젤라틴의 가수분해도에 대한 pH 효과는 0.1 M 글리신-HCl 완충액(pH 3.0-4.0), 0.1 M 소듐 아세테이트-아세트산(sodium acetate-acetic acid) 완충액(pH 5.0-6.0), 0.1 M 다이소듐 하이드로젠포스페이트-소듐 다이하이드로젠 포스페이트(disodium hydrogenphosphate-sodium dihydrogen phosphate) 완충액(pH 7.0), 0.1 M Tris-HCl 완충액(pH 8.0-9.0) 및 0.1 M 소듐 카보네이트-소듐 비카보네이트(sodium carbonate-sodium bicarbonate) 완충액(pH 10.0-12.0)을 각각 완충용액으로 하여 pH 효과를 검토하였다.

민태 껍질 젤라틴의 가수분해율은 pH 5.5 부근에서 활성이 높게 나타났으며, 이는 젤라틴 단백질의 특성상 산성영역의 가수분해도가 높은 것에 기인한 것으로 사료된다. 가수분해도는 pH 10 부근에서 50% 미만으로 나타났다.

5. 온도에 대한 효과

민태 껍질 젤라틴의 가수분해도에 대한 최적 pH 조건하에서 온도를 30-70℃까지 변화시키면서 이들의 최적 온도조건을 검토하였다.

그 결과, 민태껍질 젤라틴의 가수분해도가 55℃까지 약 80%까지 급격히 상승하였으며 이후로는 거의 일정한 수준을 보였다. 따라서, 젤라틴의 가수분해는 55℃이상에서 효율적으로 일어나며, 이는 젤라틴 단백질이 온도에 의해 쉽게 분해되는 특징과 일치하는 결과이다.

6. 기질농도에 대한 효과

민태 껍질 젤라틴의 가수분해도에 대한 최적 pH 및 온도 조건하에서 기질농 도를 0.2-3%까지 변화시키면서 가수분해에 대한 최적의 기질농도 효과를 검토하였다. 민태피 젤라틴에 대한 가수분해에서의 기질농도 효과는 1%의 기질농도에서 가장 효율이 높은 것으로 나타났다. 이 때의 가수분해율은 약 80%였다.

7. 기질 대 효소비에 대한 효과

민태 껍질 젤라틴의 가수분해도에 대한 최적 pH, 온도 및 기질농도 조건하에서 기질 대 효소비를 변화시키면서 그 가수분해도를 검토하였다. 기질 대 효소비가 500:1에서부터 급격히 증가하여 100:1에서 서서히 증가하였다. 따라서, 효소첨가량에 따른 가수분해물의 생산성을 감안해 본 결과, 최적의 기질 대 효소비를 100:1로 결정하였다. 최적의 기질 대 효소비는 1:50으로 검토되었으나, 1:100의 비에서도 유사한 가수분해도를 나타내어 경제성을 고려하여 1:100을 최종농도에서 선정하였다.

8. 반응시간에 대한 효과

민태 껍질 젤라틴의 가수분해도에 대한 최적 pH, 온도, 기질 농도 및 기질 대 효소비 조건하에서 반응시간을 1, 4, 8, 12 및 24 시간 동안 반응시킨 후 그들의 가수분해도를 검토하였다. 그 결과 반응시간이 6시간까지 뚜렷하게 증가하다가 그 이후로는 완만한 상승곡선을 나타내었다. 8시간까지 약 80%의 가수분해율을 보였다.

[시험예 1] 민태 껍질 젤라틴 가수분해물의 분자량별 분획 및 항산화 활성

< Ferric thiocyanate 법 >

민태 껍질 유래의 젤라틴 100 g(건조중량)을 가수분해 최적 조건하에서 가수분해시켰다. 본 발명에 의한 민태 껍질 젤라틴 가수분해물의 항산화 활성은 Mitsuda 등 (1966)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 리놀레산 에멀젼(linoleic acid emulsion)을 Osawa (1981)등의 방법에 따라 리놀레산 0.13 ml, 에탄올 10 ml, 50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 10 ml를 혼합하고, 이 혼합물에 가수분해물을 리놀레산에 대해 각각 1% (w/v)의 농도로 첨가하여 40±1℃로 조절된 항온기내에서 저장하면서 자동산화를 촉진시켰다. 리놀레산 0.1 ml에 75% 에탄올 4.7 ml를 가한 후, 30% 암모늄 티오시아네이트(ammonium thiocyanate) 0.1 ml를 혼합하였다.

그 다음, 20 mM FeCl₂/3.5% HCl 용액 0.1 ml를 가한 후, 3분 동안 상온에서 발색시켜 분광광도계로 흡광도(파장: 500 nm)를 측정하여 활성을 구하였다.

상기와 같이 Ferric thiocyanate 법에 의해 항산화 활성을 검토한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있듯이, 최적 가수분해효소인 TICE에 의해 가수분해된 획분을 첨가한 경우, 첨가하지 않은 대조구보다 가수분해물을 첨가한 획분이 전체적으로 약 40% 정도나 높은 항산화력 효과를 나타내었다.

또한 가수분해도가 높았던 α-키모트립신에 의해 분해된 가수분해물은 가수분해도에 의한 생산성에 비해 항산화활성이 떨어지므로 가장 높은 활성을 보이는 획분을 제조하기 위해 TICE로 2차 가수분해시켰다. 2차 가수분해 반응 후, 100℃에 서 효소로 불활성화시키고, 추출액을 원심분리(4,650×g, 10 min)하여 한외여과막 장치(ultrafiltration membrane system)를 이용하여 분자량 한계(molecular weight cut-off : MWCO) 범위가 각각 30, 10, 5, 3, 1 kDa인 막을 차례로 통과시켜 각각 분획하여 동결건조한 후 생리활성 물질의 시료로 사용하였다.

효소	완충액	pH	온도(℃)	시간(h)
알칼라아제	0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄	7.0	50	8
뉴트라아제	0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄	8.0	50	8
프로나아제 E	0.1M Citric acid-Na₂HPO₄	7.0	37	8
펩신	0.1M Glycine-HCl	2.0	37	8
파파인	0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄	6.0	37	8
α-키모트립신	0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄	8.0	37	8
트립신	0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄	8.0	37	8
TICE	0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃	10.0	50	8

α-키모트립신 및 TICE로 2 단계 가수분해하여 얻은 민태 껍질 젤라틴(hoki skin gelatin, HSG) 가수분해물을 한외여과막으로 분자량별로 분획하여 각각 HSGⅠ (10,000 Da 이상), HSGⅡ (10,000 - 5,000 Da), HSGⅢ (5,000 - 1,000 Da) 및 HSGⅣ (1,000 Da 이하)으로 나누었다. MALDI-TOP를 이용하여 각각의 분자량별 분포를 확인한 결과, HSGⅠ은 주로 14,000 - 10,500 Da의 범위에서 나타났으며, HSGⅡ의 경우는 8,600 - 6,500 Da의 범위에서 나타났다. 또한 HSGⅢ는 약 4,000 Da 부근에서 주요 피크가 확인되었으며, HSGⅣ는 900 Da 부근에서 나타났다.

<농도에 따른 항산화력 측정 >

가수분해물의 농도에 따른 항산화력 측정은 Ferric thiocyanate 법으로 측정하여 구하였다. 즉, 가수분해물을 유지 중량의 0.1-2%까지 되게 첨가하여 각각의 활성을 측정하였다. 그 결과, 0.1-1% 농도까지 증가곡선을 보이다가 1% 이상의 농도에서는 서서히 그 활성이 감소되어 1%의 농도에서 가장 높은 항산화활성을 보이는 것으로 나타났다.

< 분자량별 가수분해물의 항산화활성 효과 >

Ferric thiocyanate 법으로 한외여과막을 이용하여 획분한 분자량별 가수분해물(HSGI ~ HSGV)을 대상으로 항산화활성을 측정한 결과, HSGⅢ가 α-토코페롤 보다도 높은 항산화력을 나타내었다

도 5는 각 분자량별 가수분해물의 항산화 활성을 측정한 결과이다. HSGⅢ 획분에서 가장 높은 활성을 보였으며 이 획분을 대상으로 항산화활성 펩티드의 분리 및 정제를 수행하였다.

< 상승효과 측정 >

가수분해물의 상승효과는 Ferric thiocyanate 방법에 의해 결정하였다. 즉, 유지혼탁액에 α-토코페롤을 리놀레산에 대해 0.1%가 되게 첨가하고, 여기에 가수분해물을 유지중량의 1%가 되게 첨가하여 40±1℃로 조절된 항온기 내에 저장하면서 Ferric thiocyanate 값을 측정하여 대조구로서 가수분해물이 첨가되지 않은 α-토코페롤과 비교하였으며 그 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도 6의 결과로, 천연 항산화제인 α-토코페롤과 민태젤라틴 가수분해물들을 병용하였을 경우, α-토코페롤만을 첨가한 대조구의 활성보다 항산화활성이 증가함을 알 수 있었다. 이상의 결과에서 민태 껍질 젤라틴 가수분해물도 시판 천연항산화제인 α-토코페롤과 병용시 아주 높은 상승효과를 나타냄을 알 수 있었다.

[실시예 3] 항산화 활성 펩티드의 분리 및 정제

스크리닝을 통하여 항산화 활성을 나타내는 분자량별로 분획된 가수분해물의 특성을 파악하기 위하여 생리활성 물질의 분리 및 정제를 수행하였다. 즉 이온교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피 및 HPLC 등을 이용하여 각 정제 단계마다 생리활성을 측정하여 가장 활성이 높은 획분에서 기능성 물질을 분리 정제한 후, 생리기능성 물질의 생리화학적인 특성, 구조 및 기능을 파악하고자 하였다.

뛰어난 항산화력을 보이는 가수분해 획분인 HSG Ⅲ를 정제하기 위해 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 겔 크로마토그래피(gel chromatography) 및 HPLC를 이용하여 분리하였으며, 최종적인 정제도의 순도 확인은 MALDI-TOF mass를 사용하였다. 먼저 SP-Sephadex C-25 수지를 충진시킨 컬럼(ㆈ4.0×40cm)에 시료용액 5ml를 용리한 획분을 분리한 결과를 도 7에 나타내었다. 양이온 교환수지가 충진된 칼럼에 20mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.0)를 1ℓ로 용리하고 Fraction No. 50에서부터 1.0M NaCl용액 700ml와 동일한 완충용액 700ml를 사용하여 선형상 농도구배법으로 분리한 결과, 5개의 획분이 분리되었다. 각 획분을 동결건조한 후, Ferric thiocyanate법에 의한 항산화성을 측정한 결과 7번 획분(0.5 - 0.7 M NaCl)이 가장 뛰어난 항산화효과를 나타내었다.

양이온 교환 크로마토그래피의 분획물 중에서 항산화성이 뛰어난 펩티드가 함유되어 있는 7번 획분을 GradiFrac System (Pharmacia Biotech., Sweden)을 사용하여 5개의 획분을 얻었으며(도 8), 이들의 항산화성을 측정한 결과 획분 G-2에서 가장 항산화력이 높았다. G-2 획분을 동결건조 후, ODS 컬럼이 장착된 HPLC로 분리한 결과를 도 9에 나타내었다. 4개로 분획된 획분의 항산화성을 측정한 결과 B-2가 가장 뛰어난 항산화력을 보였고, 이 획분을 다시 HPLC를 이용하여 재분리하여 최종 단일 피크를 얻을 수 있었다. 최종 정제된 P-HSG의 활성은 도 10에서 나타난 것과 같이 아주 뛰어났으며, 이후 정제도 및 분자량 확인은 MALDI-TOF mass (도 11)를 통해 확인하였다.

1. 이온교환 크로마토그래피

미리 평형화시킨 SP-Sephadex C-25 컬럼(φ2.5×45 ㎝)에 가수분해시료를 주입하고, 동일한 완충용액 250 ml로 비흡착부분을 용출시킨 후, 흡착된 부분은 완충용액과 1 M NaCl용액을 사용하여 선형상 농도구배법으로 분별용출시켰다. 단백질 함량은 Lowry법으로 측정하였으며 분획별 단백질 함량이 동일하도록 희석하여 상기와 같은 방법으로 각 분획물의 항산화 활성을 측정하여 비교하였다. 용출된 획분 중 활성이 가장 높은 획분을 계속 정제하였다.

2. 겔여과 크로마토그래피

SP-Sephadex C-25를 충진시킨 컬럼에서 분리한 획분 중에서 각 활성이 높은 분획물을 완충용액으로 평형화시킨 Sephadex G-25 컬럼(φ2.5×98 cm)에 주입하고, 탈이온수로 용출시켰다. 각 분획물을 280 nm 및 220 nm에서 흡광도를 측정한 후, 동결건조한 후, 정평하여 각 분획물의 항산화 활성을 측정하였다. 용출된 획분 중 활성이 가장 높은 획분을 계속 정제하였다.

3. HPLC를 이용한 생리활성물질의 최종 분리 및 정제

겔 크로마토그래피를 이용하여 분리된 분획물 중에서 항산화 활성이 가장 높은 획분의 동결건조물을 0.1% TFA(trifloroacetic acid) 용액에 녹여 HPLC 에 주입하였다. HPLC (Dionex Co.)에서 ODS 역상 컬럼(Shodex Co.)을 사용하였으며, 이동상은 0.1% TFA/H₂O와 0.1% TFA/아세토니트릴(acetonitrile)로 하여 선형상 농도구배법(0∼50% acetonitrile, 40 min)으로 용출시킨 다음, 각 획분을 분리하였다. 분리된 획분을 대상으로 항산화 활성을 측정한 후 용출된 획분 중 활성이 가장 높은 획분을 대상으로 다음의 분석들을 실시하였다.

4. 생리활성 펩티드의 정제도 및 분자량 측정

항산화 펩티드의 분자량은 HPLC상에서 GPC 컬럼을 사용하여 측정하거나 Amersham Pharmicia사의 MALDI-TOF mass (PE Biosystems Voyager System 1000)를 이용한 고분자 질량분석법을 통해 측정하였다.

5. 생리활성 펩티드의 구성아미노산 분석

아미노산 분석은 시료 50 mg을 앰플(ampoule)에 넣고 6 N HCl 2 ml를 가하여 밀봉한 후 110℃에서 24시간 가수분해하였다. 분해액을 여과하고 감압건조하여 염산을 제거한 후 sodium loading buffer(pH 2.2)로 25 ml가 되게 적용하여 이 중 일부를 아미노산 자동분석기에 주입하여 정량하였다.

6. 생리활성 펩티드의 아미노산 서열분석을 통한 2차 구조해석

아미노산 서열은 N-말단으로부터 아미노산을 절단하는 Edman법으로 분해한 후, 기체상 자동서열분석기(Perkin Elmer, New Jersey, U.S.A.)로 분석하였다. 즉, 염기 조건하에서 해리를 억제시킨 아미노산을 PICT(phenylisothiocyanate)에 부착시켜 PTC(phenylthiocarbamyl) 펩티드로 과잉시약과 반응 유도체물을 제거한 후, 산성 조건하에서 절단하여 ATZ(anilinothiozoline) 유도체로 변환시키고, 더 안정한 유도체인 PTH(phenylthiohydantoin) 아미노산으로 변형시켜 동정하였다. 남은 펩티드의 N-말단에 대해서 위의 과정을 반복하여 서열을 결정하였다.

최종 정제된 P-HSG의 구조와 작용특성을 살펴보기 위하여 아미노산 서열분석을 실시한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열인 Asn-Leu-Thr-Glu-Val-Pro-His-Gln (M.W 1,060)로 이루어져 있었다.

Yamaguchi 등 (1975)은 펩티드의 성상에 따라 항산화활성이 다소 차이가 나타난다고 지적하면서 다이펩티드의 경우 알라닌(alanine)을 N말단으로 하였을 때 Ala-His, Ala-Met, Ala-Tyr 및 Ala-Try의 항산화력이 좋은 것으로 나타났으며, 이것은 특정 아미노산이 N말단에 위치하는가 C말단에 위치하는가에 의해 항산화력이 크게 영향을 받기 때문에 펩티드 중의 아미노산의 위치에 의한 입체배위가 항산화력에 크게 관여하였다고 보고하였다.

Yamaguchi 등 (1979)은 각종 다이펩티드와 이를 구성하는 아미노산의 항산화성 비교에서 다이펩티드를 구성하고 있는 아미노산 중 Met, His, Tyr, 및 Trp이 강한 항산화성을 나타낼 때 이 아미노산들의 위치에 대해 Met과 His은 C-말단에 Trp과 Tyr은 N-말단에 위치할 때 그 효과가 상승된다고 보고한 바 있고, Uchida 등 (1992)은 prolyl 폴리펩티드(polypeptide)가 산화에 민감한 반응을 나타낸다고 보고하였다. Chen 등 (1995)은 대두단백질인 β-콘글리시닌(β-conglycinin)을 효소적으로 가수분해한 가수분해물 중에서 항산화성을 가지는 펩티드는 N-말단에 소수성 아미노산인 발린(valine)이나 류신(leucine)을 포함하고 있으며, 배열 중에 프롤린(proline), 히스티딘(histidine) 및 티로신(tyrosine)을 가지는 5∼16의 아미노산 잔기로 이루어져 있다고 보고한 바 있다.

[시험예 2] 세포배양계에서의 항산화 효과

1. 세포배양

정상 간세포(human liver cell, Chang)를 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)이 10% 함유된 DMEM배지에서 배양하였다. 즉, 75-㎠ plastic flask (Falcon Co., England)에 정상 간세포를 10% FBS, 7.5% NaHCO₃ 150 μg/ml, 글루타민 58.4 μg/ml 및 항생제(antibiotic)/항진균제(antimycotics) 4.4 μl/ml 가 함유된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양하였다. 2∼3일마다 한번씩 2차 배양하여 세포주를 유지하였다.

2. 세포정량

세포가 자란 75-㎠ 플라스틱 플라스크에서 배지액을 제거하고, CMF-PBS (calcium magnesium free-phosphate buffered saline, pH 7.2)로 세척한 후, 0.25% trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 플라스크 바닥으로부터 떼어낸 후 세포배양액으로 중화시켜서 원심분리(80×g, 3min) 하였다. 남은 세포의 펠렛(pellet)에 배양액을 가한 다음, 멸균 피펫으로 반복흡입하여 단일 세포부유액을 만든 후 트립판 블루(trypan blue)를 세포부유액과 9:1의 비율로 혼합하여 광학현미경상에서 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 측정하였다.

3. 항산화활성물질의 세포독성 측정

가수분해물의 독성측정은 CCK-8 assay를 이용하였다. 즉, 정상세포(Chang cell)를 96-well plate에 5×10⁴ cells/well 되도록 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양한 후, 10 μl의 다양한 농도의 가수분해물을 첨가하여 48 시간동안 배양하였다. 세포생존율을 48시간 배양시간 정상세포를 대상으로 CCK-8 키트를 이용하여 가수분해물의 세포독성을 결정하였다.

P-HSG가 첨가된 배양 정상 간세포에서 세포독성을 측정한 결과를 도 12에 나 타내었다. 가수분해물을 첨가하지 않았을 경우, 세포 생존율을 100%로 볼 때 가수분해물을 첨가한 첨가군에서는 100% 이상으로 나타났으며 5mg/ml의 농도에서 130% 이상의 생존율을 보였다. 따라서, 본 실험에 사용한 가수분해물들은 배양 간세포에 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.

4. t-BHP 농도별 세포괴사에 대한 가수분해물의 효과

t-BHP의 농도별 세포괴사에 대한 가수분해물의 효과를 관찰하기 위하여, 먼저 96-well plate에 간세포를 5×10⁴ cells/well이 되도록 넣고 CO₂ 배양기에서 2시간 배양시킨 다음, 가수분해물의 농도를 well당 5 mg/ml씩 첨가한 후, 10% FBS-DMEM 배지로 전체부피를 100 ㎕로 조절하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 18시간 배양하였다. 이 배양액을 CMF-PBS로 세척하고 SFM (serum free medium)과 t-BHP를 0 μM에서부터 300 μM까지 농도별로 전체부피가 200㎕가 되게 첨가한 다음, 이를 다시 120분 배양시킨 후, CCK-8 kit로 흡광도를 측정하여 그 효과를 결정하였다.

t-BHP의 농도에 따른 정상 간세포의 생존력을 t-BHP 2시간 처리 후 측정한 결과, 225 μM의 t-BHP 처리군에서 50% 정도의 세포생존을 보였으므로 225 μM t-BHP를 IC₅₀으로 정하였다(도 13). t-BHP 농도별 세포괴사에 대한 민태 껍질 젤라틴 가수분해물의 항산화작용을 측정한 결과, 가수분해물 첨가군이 비첨가군에 비해 10~30% 정도 세포 생존율이 증가함을 볼 수 있었다.

5. t-BHP로 유도된 배양 간세포에서 lipid peroxidation에 대한 항산화 펩티드의 효과

배양 간세포에 항산화 펩티드를 전처리한 다음, t-BHP의 최적농도를 225 μM이 되도록 하여 2시간동안 배양한 후 배양액과 세포내의 MDA값을 측정한 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 알 수 있듯이, 항산화 펩티드를 첨가하지 않은 대조군은 2.9 μM로 항산화 펩티드를 첨가한 실험군에서의 1.7 μM보다 지질과산화물의 함량이 높게 나타났으며, 이로 인해 실험군에 첨가한 펩티드가 지질과산화물의 생성을 억제함을 알 수 있었다.

6. 세포배양계에서 항산화효소들에 대한 가수분해물의 효과

세포배양계에서의 민태 껍질 젤라틴으로부터 분리한 항산화 펩티드가 항산화 효소에 미치는 효과를 관찰하기 위하여 CAT, SOD, GPx 및 GST의 활성을 검토한 결과를 도 15 내지 도 18에 나타내었다.

도 15에서 알 수 있듯이, t-BHP로 유도된 실험군에서는 t-BHP를 첨가하지 않은 대조군에 비해 CAT 활성이 1.1배 증가하는데 불과하였지만, 항산화 펩티드와 t-BHP를 함께 첨가한 실험군에서는 대조군에 비해 1.7배 증가하였다.

SOD에 대한 활성은 t-BHP로 유도된 실험군에서는 t-BHP를 첨가하지 않은 대조군과 유사하게 나타났으며(1.05배 증가), 항산화 펩티드와 t-BHP를 함께 첨가한 실험군에서도 대조군(1.08배 증가)과 비슷하였다(도 16).

또한, GPx 활성의 측정에서는 t-BHP로 유도된 실험군에서는 대조군보다 1.4 배 효소활성이 증가하였지만, 펩티드와 함께 사용한 실험군은 1.6배 증가하였다 (도 17).

GST 활성의 측정에서도 t-BHP로 유도된 실험군에서는 t-BHP를 첨가하지 않은 대조군에 비해 활성이 1.5배 증가하였고, 항산화 펩티드와 t-BHP를 함께 첨가한 실험군에서는 대조군에 비해 1.9배 증가하였다(도 18).

이상의 결과로 볼 때 t-BHP처리에 의한 항산화 활성은 증가하였으며, 이 결과는 t-BHP에 의한 직접적인 독성효과 현상인 것으로 생각된다. 또한, t-BHP처리한 대조구에 비해 가수분해물을 함께 처리한 실험군에서 SOD 활성이 약간 증가하였다. 이상에서 배양세포계에서의 민태 껍질 젤라틴 가수분해물의 항산화 활성은 t-BHP로 유도된 지질과산화물의 생성과 세포괴사를 가수분해물의 첨가로 억제시킬 수 있었다.

[제형예 1] 홍합 발효조미액(FMS)의 제조

삼천포 어패류시장에서 구입한 진주담치(홍합, Mytilus coruscus)를 수회 수세한 후 30분 정도 물을 뺀 다음, 무게를 측정하여 소금을 25%(w/w)되게 첨가한 후 20℃에서 숙성시킨 후 월별로 달여서 발효조미액을 만들어 시료로 사용하였다.

막반응기에서 얻어진 가수분해물로부터 펩티드를 정제하기 위하여 사용된 Sephadex G-15 및 SP-Sephadex C-25 등의 펩티드 정제용 수지는 Sigma사, HPLC (Thermo Separation Products사, Model Spectra System P2000)로 펩티드를 분리·정제하는데 필요한 HPLC용 acetonitrile, ethanol 및 water 등은 Fisher Scientific사에서 구입하여 사용하였다. HPLC에서 최종적으로 분리·정제된 펩티드를 확인하기 위한 MALDI-TOF mass(Voyager system 1000)는 PE Biosystems 사의 것을 사용하였다.

단백질 가수분해물의 경우 맛과 향이 없으므로 홍합을 숙성시켜 발효조미액을 제조하여 맛과, 향이 우수한 성분을 첨가하였다. 6 개월 이후 홍합발효 조미액의 맛과 향이 가장 뛰어났으므로 6개월 이상 발효시킨 조미액을 사용하였다.

[제형예 2] 민태 껍질로부터 분리한 항산화 활성을 가지는 펩티드를 함유하는 기능성 조미료의 제조

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 항산화 펩티드 획분을 이용하여 홍합 발효조미액(FMS)과 함께 배합하여 복합조미료를 제조하였다. 복합조미료의 제조는 예비실험을 통하여 설정된 조건에 따라 다음과 같이 제조하였다. 즉, 제형예 1에서 제조한 FMS와 민태 껍질로부터 분리한 항산화 펩티드 획분 HGH Ⅲ과 발효조미액을 맛과 향에 혼합한 배합물 30g을 식염 20g, 핵산 [명신화성 (주) 제품] 5g, 포도당 [명신화성 (주) 제품] 10g, 고추분말 [태경농산 (주) 제품] 5g, 된장분말 [명신화성 (주) 제품] 3g, 양파분말 [명신화성 (주) 제품] 1g, 생강분말[명신화성 (주) 제품] 0.5g, 마늘분말 [명신화성 (주) 제품] 2g과 잘 혼합하여 마쇄한 것을 가수분해물의 복합조미료로 사용하였다.

[시험예 3] 복합조미료의 관능검사

가수분해물을 이용하여 제조한 복합조미료에 대한 관능검사는 대조구로서 시판 복합조미료 즉, 멸치복합조미료(anchovy complex seasoning, ACS), 조개복합조미료(shellfish complex seasoning, SCS) 및 쇠고기복합조미료(beef complex seasoning, BCS)와 함께 위의 방법과 동일하게 관능평가를 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

단백질을 프로테아제(protease)로 가수분해하면 쓴맛이 나는 것으로 알려져 있다. 그 예로 대두 단백질을 펩신 분해물에서 많은 쓴맛 펩티드가 분리되었고, 카제인의 트립신 분해물에서도 비교적 긴사슬의 쓴맛 펩티드가 분리되었다. 가수분해물도 평가점수에서 분자량이 적은 획분에서 비교적 높은 점수를 얻었다. Alder-Nissen (1986)은 단백질 가수분해물의 쓴맛은 사용한 효소보다는 단백질을 구성하는 소수성 아미노산의 함량과 관계가 있다고 보고한 바 있다.

복합 조미료	Total score	Mean score^**
복합 조미료	Total score	Taste	Odor	Color
HGS III	3.30ㅁ0.21 ^abcd	3.00ㅁ0.33 ^b	3.10ㅁ0.18 ^bc	3.60ㅁ0.22 ^b
ACS	3.00ㅁ0.26^d	3.10ㅁ0.18^b	3.00ㅁ0.26^c	2.70ㅁ0.21^b
SCS	3.80ㅁ0.13^ab	4.00ㅁ0.33^a	3.80ㅁ0.20^a	3.50ㅁ0.22^뮤
BCS	3.90ㅁ0.23^a	3.70ㅁ0.30^뮤	4.10ㅁ0.31^a	3.70ㅁ0.26^a

^**Means within each column followed by the same letter are not signigicantly different (P<0.05), 5 points scale (1: undesirable, 2:slightly undesirable, 3:slightly desirable, 4:desirable, 5:very desirable)

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 민태 껍질로부터 추출한 펩티드는 항산화 활성을 가지며, 이러한 펩티드를 항산화제 조성물 또는 기능성 조미료 등에 유효성분으로 함유할 수 있다.

< 참고 문헌 >

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Claims

민태 껍질로부터 추출되고, 하기 (1) 내지 (5)의 특징을 가지는 항산화 펩티드:

(1) 최적온도 45∼55℃;

(2) 최적 pH 9.0∼10.0;

(3) 온도 50℃ 및 pH 10.0 에서 24시간 이상 안정;

(4) 등전점 pI 6.5;

(5) 분자량 1,000∼5,000 Da.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것임을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항 또는 제 2항에 의한 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화용 조미료.
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