KR101373940B1

KR101373940B1 - 생리활성물질의 양이 증가된 누에고치 발효·효소 가수분해물의 제조 방법, 이로부터 얻어진 가수분해물 및 이러한 가수분해물의 항염 활성 용도

Info

Publication number: KR101373940B1
Application number: KR1020120115581A
Authority: KR
Inventors: 고창희; 이성권
Original assignee: 이성권; 고창희
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2014-03-12

Abstract

본 발명은 누에고치 가수분해물의 제조 방법 및 이러한 가수분해물의 항염 활성 용도에 관한 것으로서, 세절된 누에고치에 아스퍼질러스 균주배양액을 첨가하여 발효하고 이후 단백질분해효소를 넣어 가수분해시키는 핵심공정을 포함하여 누에고치 가수분해물을 제조하는 방법, 이로부터 얻어진 가수분해물 및 이에 따라 얻어진 가수분해물의 항염활성 용도에 관한 것이다. 본 발명은 가장 자연친화적인 발효방법으로 누에고치를 추출하였고 생리활성 물질의 파괴를 줄이고 유효성분의 함량을 증가시키며 생산성 또한 높일 수 있어, 다양한 분야에서 사용되는 누에고치 추출물의 제조 방법으로 유용하게 이용될 수 있다. 특히 본 발명은 항염 활성을 체계적으로 밝힘으로써 식품, 화장품 등에 널리 사용하기에 적합하다.

Description

생리활성물질의 양이 증가된 누에고치 발효·효소 가수분해물의 제조 방법, 이로부터 얻어진 가수분해물 및 이러한 가수분해물의 항염 활성 용도{METHOD OF PREPARING FERMENTED AND ENZYME TREATED SILKWORM SEGMENT EXTRACT HAVING HIGH BIOACTIVE SUBSTANCES, THE SILKWORM EXTRACT OBTAINED THEREBY, AND THE USE OF THE SILKWORM EXTRACT HAVING ANTIINFLAMMATORY EFFICACY}

본 발명은 누에고치에 존재하는 피브로인(Fibroin) 및 그 외 단백질을 발효 및 효소 분해과정을 통하여 저분자량의 실크아미노산·펩타이드 및 글리코사미노글리칸, 콘드로이친 설페이트 등을 함유하는 추출물을 제조하는 방법, 이로부터 얻어진 추출물 및 이러한 추출물의 항염 활성 용도에 관한 것이다.

현대 사회에서 기능성 식품 산업분야는 신소재를 찾아 인체 내에 꼭 필요한 유익 성분들만을 순수 정제·분리하여 영양학적 측면에서 우수한 원료들을 사용하고 있다.

누에고치는 세리신(Serisin)과 피브로인(Fibroin) 단백질을 포함하고 있으며 이 중 피브로인 단백질은 최근에 기능성 식·음료의 소재로 이용하기 위한 개발이 활발히 진행되고 있다.

이러한 누에고치를 이용한 종래 기술로는 누에고치로 채취되는 실크단백질을 별다른 처리 공정을 거치지 아니하고 원형 그대로 사용하거나 용해된 피브로인 수용액의 정제를 투석(Dialysis)에 의해 정제하는 방법을 사용하여 대량 양산시 생산의 수율이 저하되는 비경제적인 면이 있거나 실크단백질이 가지고 있는 섬유상의 구조적인 특징 및 아미노산의 배열 등으로 인체 내에서의 분해의 지연이나 분해가 어려워 흡수율이 저하되어 기능성 식품 소재로서의 가치가 떨어지는 등의 문제점을 내포하고 있다.

또한, 상기의 문제점을 해결하기 위하여 최근에는 누에고치를 100℃ 이상의 고온에서 염산을 이용하여 가수분해하는 공정을 개발하여 인체 흡수성이 뛰어난 실크 아미노산이나 펩타이드를 제조하게 되었으나 이 공정은 인체에 유해한 강산을 사용함으로써 반드시 중화과정이 필요하고 이로부터 발생되는 염이 짠맛을 유도하게 된다. 따라서 식품으로서 사용을 하려면 반드시 탈염 및 탈색, 탈취 과정이 요구되어지며 이로 인한 생산수율이 저하하게 된다.

또 다른 기술로, 대한민국 특허 등록번호 10-1115510 (2012년 2월 6일 등록)은 누에, 뽕잎, 뽕나무 가지, 뽕나무 뿌리, 오디, 잠분을 프로테아제 및 셀룰라아제로 36℃부터 55℃까지의 온도에서 효소분해 추출하는 방법을 개시한다.

또한, 대한민국 특허 공개번호 2012-0056138 (2012년 6월 1일 공개)은 누에 분말에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii) 배양액을 첨가하여 발효 누에 분말을 제조하는 방법, 이 방법에 의해 제조된 발효 누에 분말 및 이 누에 분말을 함유하는 고지혈증 및 지방간, 항산화 효능, 혈전용해 효능이 있는 약학 조성물 및 건강 보조 식품 조성물을 개시한다.

또한, 대한민국 특허 등록번호 10-721644 (2007년 5월 17일 등록)는 누에 분말을 에탄올 추출 및 열수 추출하여 숙취해소 활성을 향상시킨 건강기능성 식품을 개시한다. 대한민국 특허 등록번호 10-361085 (2002년 11월 1일 등록)는 누에분말의 에탄올 추출물을 함유하는 항당뇨병 건강보조식품 조성물을 개시한다. 대한민국 특허 등록번호 10-396986 (2003년 8월 22일 등록)은 누에 분말의 에탄올 추출물로부터 α-글루코시다제 억제물질인 1-디옥시노지리마이신을 제조하는 방법을 개시한다.

이와 같이 지금까지 누에고치를 이용한 기술로 발효 방법을 이용하거나, 효소 분해를 이용하거나, 용매 추출을 이용하는 방법 등, 매우 다양한 방법이 개시되어 있다. 이러한 방법들로 얻은 누에고치의 생리활성 물질도 고지혈증 및 지방간, 항산화 효능, 혈전용해 효능에서부터 숙취해소 및 당뇨병 치료제에 이르기까지 매우 다양하다.

그럼에도 불구하고, 여전히 당업계에서는 전술한 바와 같은 종래 기술의 문제점들을 해소하고 불필요한 단계들을 없애면서 단시간 내에 충분한 추출이 이루어지도록 함으로써 유효성분의 함량이 높은 누에고치 추출물을 수득할 수 있는 방법에 대한 개선이 여전히 필요한 실정이다.

본 발명은 무엇보다도 종래의 누에고치로부터 실크아미노산 및 펩타이드 추출 방법의 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 본 발명에서는 저온에서 발효 방법을 이용하여 실크단백질의 분해가 용이한 상태로 전환하고 이 상태에서 파파인과 같은 단백질 분해효소를 사용하여 기존의 효소가수분해방법으로는 실크단백질을 분해할 수 없었던 문제를 해결하는 동시에, 또한 강산에 의한 가수분해방법의 생리활성물질 파괴, 탈염, 탈색, 탈취공정 수반에 의한 경제성 상실 등 많은 문제점을 해결하면서 단시간 내에 충분한 추출이 이루어지도록 함으로써 유효성분의 함량이 높은 누에고치 발효·효소 가수분해물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에서는 이렇게 얻어진 누에고치 발효·효소 가수분해물이 항염 활성을 갖는 것을 발견하고, 항염성이 있는 기능성 건강식품 및 화장품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 세절된 누에고치에 정제수를 첨가하고 이 액상분에 아스퍼질러스 균주 배양액을 첨가하여 발효시킨 후 이 발효액에 단백질분해효소를 첨가하여 효소가수분해시켜 종래 산 가수분해법보다 다량의 생리활성 물질을 함유하는 누에고치 가수분해물을 수득하는 단계를 포함하는, 누에고치의 생리활성 물질의 양이 증가된 누에고치 발효·효소가수분해물의 제조방법을 제공한다.

구체적 양태로, 아스퍼질러스 균주 배양액이 아스퍼질러스 카제이(Aspergillus casei)를 함유하는 것이 바람직하다.

다른 구체적 양태로, 단백질분해효소는 파파인을 함유하는 것이 바람직하다.

다른 구체적 양태로, 상기 생리활성 물질은 실크아미노산·펩타이드, 글리코사미노글리칸 또는 콘드로이친 설페이트 등을 포함하는 것이 바람직하다.

또 다른 구체적 양태로, 상기 방법에서 세절된 누에고치 100 중량부 당 500 내지 1000 중량부의 정제수가 첨가되며, 10 내지 30 중량부의 아스퍼질러스 균주 배양액이 첨가되며, 발효가 30 내지 40℃에서 2 내지 3일 동안 수행되는 것이 바람직하다.

다른 구체적 양태로, 이 발효 혼합물 100 중량부 당 5 내지 20 중량부의 파파인을 투여한 후에, 60 내지 70℃에서 교반하고, 가수분해가 완료되면 이를 90℃까지 승온시켜 불활화시키는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기와 같이 발효 및 효소 가수분해된 누에고치 추출물을 여과하여 미반응 잔류물을 제거한 후 수득되는 누에고치 발효 및 효소 가수분해 생성물, 또는 이러한 본 발명의 누에고치 발효 및 효소 가수분해 생성물을 고압 멸균하여 수득한, 액상형의 누에고치 발효·효소 가수분해물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 생성물을 고압 멸균시키고 이를 동결건조시켜 얻어진 분말형의 누에고치 발효·효소 가수분해물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 액상형 및 분말형의 누에고치 발효·효소 가수분해물 중에서 선택되는 적어도 하나의 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항염 효능을 갖는 건강식품을 제공한다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 액상형 및 분말형의 누에고치 발효·효소 가수분해물 중에서 선택되는 적어도 하나의 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장품을 제공한다.

본 발명은 기존의 효소가수분해방법으로는 제조할 수 없었던 누에고치 가수분해물을 아스퍼질러스 균주를 이용하여 발효 후 단백질분해효소로 활성화시킴으로써 누에고치의 유효성분을 충분히 추출하며 종래의 강산 또는 효소를 이용한 가수분해법의 생리활성물질의 파괴 또는 미분해에 대한 문제를 해소할 수 있으며, 생리활성물질의 함량이 증가된, 특히 항염 효능을 갖는 누에고치 가수분해물을 제공한다.

도 1은 전기영동(15% SDS-PAGE) 결과 누에고치 추출물(경시적)의 분자량 크기를 도시한 사진이다. 내부 표준 분자량별 단백질은 다음과 같다: MW 66200 - 혈청알부민 ; MW 55400 - 글루타믹 디하이드로게나제 ; MW 36500 - 락테이트 디하이드로게나제 ; MW 18500 - 트립신 억제제 ; MW 14400 - 라이소팀 ; MW 6000 - 아프로티닝.
도 2는 LPS 동시처리 후 혈청에서 IL-6 생산에 대한 발효·효소가수분해물의 효과를 도시한 그래프이다. 세로축은 IL-6 수준(pg/ml)을, 가로축은 정상군(LPS 미처리군); 대조군(LPS 처리 후 본 발명의 누에고치 발효효소 가수분해물 미처리군); 실험예1(LPS 처리 후 산가수분해물 처리군); 실험예2 (LPS 처리 후 본 발명의 누에고치 발효·효소가수분해물 처리군)을 나타낸다.
도 3은 LPS 동시 처리 후 혈청에서 MCP-1 생산에 대한 발효·효소 가수분해물의 효과를 도시한 그래프이다. 세로축은 MCP-1 수준(pg/ml)을, 가로축은 정상군(LPS 미처리군); 대조군(LPS 처리 후 본 발명의 누에고치 발효효소 가수분해물 미처리군); 실험예1(LPS 처리 후 산가수분해물 처리군); 실험예2 (LPS 처리 후 본 발명의 누에고치 발효·효소가수분해물 처리군)을 나타낸다.
도 4는 LPS 동시 처리 후 혈청에서 IL-1β 생산에 대한 발효·효소 가수분해물의 효과를 도시한 그래프이다. 세로축은 IL-1β 수준(pg/ml)을, 가로축은 정상군(LPS 미처리군); 대조군(LPS 처리 후 본 발명의 누에고치 발효효소 가수분해물 미처리군); 실험예1(LPS 처리 후 산가수분해물 처리군); 실험예2 (LPS 처리 후 본 발명의 누에고치 발효·효소가수분해물 처리군)을 나타낸다.
도 5는 LPS 동시 처리 후 혈청에서 TNF-α 생산에 대한 발효·효소 가수분해물의 효과를 도시한 그래프이다. 세로축은 TNF-α 수준(pg/ml)을, 가로축은 정상군(LPS 미처리군); 대조군(LPS 처리 후 본 발명의 누에고치 발효효소 가수분해물 미처리군); 실험예1(LPS 처리 후 산가수분해물 처리군); 실험예2 (LPS 처리 후 본 발명의 누에고치 발효·효소가수분해물 처리군)을 나타낸다.

본 발명은 이제까지의 기술들과는 달리 실크단백질이 가지고 있는 섬유상의 구조적인 특징 및 아미노산의 배열 등의 특성을 고려하여 종래 분해 방법의 문제점을 개선하기 위해 주요한 4가지 공정을 기본으로 한다. 4가지 공정으로는 발효, 효소가수분해, 여과, 건조를 포함한다.

세절된 누에고치에 정제수를 첨가하고 이 액상분에 아스퍼질러스 균주 배양액을 첨가하고 발효시킨 후 이 추출액에 단백질분해효소를 첨가하여 효소가수분해시켜 종래 산 가수분해법보다 다량의 생리활성 물질을 함유하는 누에고치 가수분해물을 수득하는 단계를 포함하는, 누에고치의 생리활성 물질의 양이 증가된 누에고치 발효·효소 가수분해물의 제조방법은 이하에서 각 단계별로 상세히 설명한다.

발효추출 단계

본 단계에서는, 세절된 누에고치 100 중량부 당 500 내지 1000 중량부의 정제수가 첨가되며, 10 내지 30 중량부의 아스퍼질러스 균주배양액, 바람직하게는 20 내지 25 중량부를 첨가하고 30℃ 내지 40℃, 바람직하게는 35℃ 내지 37℃에서 2일 내지 3일 동안 발효시킨다.

본 발효추출 단계에서 발효 온도는 상기 기술된 온도 범위보다 낮거나 높은 경우에는 발효가 진행되지 않거나 균주가 활성을 잃어버려 발효가 진행되지 않게 된다.

본 발효추출 단계에서는 아스퍼질러스 균주 배양액을 사용하는데, 이에 함유되는 발효균주로는 아스퍼질러스 카제이(Aspergillus casei), 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae), 아스퍼질러스 나이거(A. niger), 아스퍼질러스 글라우쿠스(A. glaucus), 그중에서도 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)가 적절하다.

일 예로서, 본 발명의 아스퍼질러스 균주 배양액은 하기와 같이 제조할 수 있다: 아스퍼질러스 나이거 KK2 균주를 PDA(potato dextrose agar) 사면배지에 접종하여 28℃에서 7일간 배양한 후 0.1% Tween 80 용액을 첨가하여 포자를 현탁시켰다. 포자현탁액(1.0 mL 당 3.5 × 10⁷ 포자) 10 mL를 90 mL의 맥아추출물(malt extract)이 들어있는 250 mL의 삼각플라스크에 접종한 후 28℃의 진탕배양기에서 200 rpm으로 48시간 종균 배양(seed culture)하였다. 본 배양 배지 47.5 mL가 들어있는 250 mL의 삼각플라스크를 121℃, 1.5 기압에서 20분간 멸균한 후 여기에 종균을 접종하였다. 2.5 mL을 접종하여 28℃의 진탕 배양기에서 200 rpm으로 5일간 배양하였다. 본배양 배지는 2.5%의 볏짚(rice straw, 0.3 mm 이하 크기), 1.25%의 밀기울(wheat bran, 0.4 mm 이하 크기), 4.5%의 옥수수 농침액(corn steep liquor), 0.125%의 산업종균 효모추출액(industrial yeast extract), 0.65%의 일염기 인산칼륨, 0.05%의 황산동 5수화물, 0.01%의 황산코발트 7수화물로 구성되었으며, 5N 수산화나트륨으로 pH를 7.0으로 조정되었다.

효소가수분해 단계

한 구체예로서, 본 발명의 누에고치 발효·효소 가수분해물을 제조하는 방법은 제2 단계로 효소 분해 단계를 포함한다. 이때 사용되는 단백질분해효소로는 파파인을 포함한다. 예컨대, 파파인은 상기 발효추출물 100 중량부 당 5 내지 20 중량부, 바람직하게는 10 내지 15 중량부로 투여한 후, 60 내지 70℃, 바람직하게는 64 내지 67℃에서 1일간 교반하여 누에고치의 가수분해가 완료되면 온도를 90℃까지 승온시켜 불활화 시키는 것이 바람직하다.

여과 및 건조 단계

가수분해 단계를 거친 후 미반응 고형분을 제거하기 위해 여과를 실시할 수 있다. 여과는 0.1 내지 3 ㎛ 필터를 사용하여 1회 이상 여과를 수행하는 것이 바람직하다. 필터의 기공 크기가 0.1 ㎛ 미만인 경우에는 필터가 초정밀하여 초고가이므로(한외여과법) 경제성이 떨어지는 문제가 있고, 3 ㎛ 를 초과하는 경우는 제균력이 없어 진균이나 세균이 최종 추출물에 포함되어 유통 중 오염될 가능성이 높다는 문제가 있다.

이와 같이 여과하여 수득한 본 발명의 누에고치 발효·효소 가수분해물은 고압멸균을 수행하여 얻어진 액상형 및 이를 동결건조한 분말형 제품으로 제조할 수 있다. 고압멸균은 121℃에서 30분간 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 액상형 또는 분말형의 누에고치 발효·효소 가수분해물은 강산 처리 및 장시간의 고온 처리를 하지 않은 것으로 생리활성물질의 파괴가 적고 강산의 중화에 의한 짠맛이 없어 건강 식품에 직접 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 전술한 바와 같이 수득한 누에고치 발효·효소 가수분해물이 항염 효능이 있는 것을 발견하여, 이 가수분해물을 함유하는 건강 식품 또는 기능성 화장품을 제공한다.

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

실시예

< 비교예 1> 강산을 이용한 누에고치 가수분해물의 제조

세절된 누에고치 1 ㎏을 5N 염산수용액 10 ㎏에 첨가한 후에 120℃, 8시간 가열하며 가수분해시켰다. 가수분해된 용액을 1차 여과시켜 미반응 고형분을 제거하였다. 또한, 이 혼합액에 산을 중화하기 위하여 가성소다를 넣고 pH가 7이 되도록 하는데, 이때 소금이 생성되어 맛이 매우 짜기 때문에 탈염기를 통하여 탈염 과정을 수행한다. 이후 탈색을 위해 활성탄 100g을 넣고 60℃에서 2시간 교반한 후 2차 여과를 수행한다. 이후 이 액을 분무건조하여 분말화시켜 520g의 분말을 얻었다. 이 때, 1차 여과는 2 ㎛ 필터로, 2차 여과는 0.45 ㎛ 필터로 수행하였다.

< 비교예 2> 단백질분해효소를 이용한 누에고치 가수분해물의 제조

건조되고 세절된 누에고치 10kg을 정제수 100 ㎏에 첨가하고 37℃에서 4시간 교반시킨 후, 이 교반 혼합물에 파파인 10kg을 넣고 65℃에서 1일간 가수분해시키고 90℃에서 불활화시켰다. 이후 이 가수분해물을 1 ㎛ 필터를 사용하여 여과를 수행하여 미반응 고형분을 제거하였다. 이와 같이 제조된 여과액을 동결건조하여 분말화하였다.

< 실시예 1> 발효를 통한 누에고치 효소가수분해물의 제조

건조되고 세절된 누에고치 10kg을 정제수 100 ㎏에 첨가하고 37℃에서 4시간 교반시킨 후에 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 배양액 2kg을 첨가한 후에 37℃에서 2일간 발효시켰다. 이 후 이 발효혼합물에 파파인 10kg을 넣고 65℃에서 1일간 가수분해시키고 90℃에서 불활화시켰다. 이후 이 가수분해물을 1 ㎛ 필터를 사용하여 여과를 수행하여 미반응 고형분을 제거하였다.

이와 같이 제조된 조성물을 동결건조하여 분말화하였다. 이때 얻어진 동결건조된 분말은 5.0kg 이상을 얻을 수 있었다.

상기에서 얻어진 누에고치 가수분해물의 분자량크기를 측정하기 위하여 전기영동 실험을 수행하였다. 전기영동 실험은 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 SDS-PAGE로 수행했다. 폴리아크릴아미드 겔의 농도는 15%로 했고, 100V, 30mA의 조건에서 95분간 진행했다. 전기영동이 종결된 폴리아크릴아미드 겔은 쿠마시 블루 R-250으로 염색했다. 염색 후, 겔은 메탄올:아세트산:증류수를 1:1:8의 비율로 배합한 탈색 시약을 이용하여 24시간 탈색시켰다. 내부 표준 단백질은 다음과 같다: 혈청 알부민(MW 66,200), 글루타믹 디하이드로게나제(MW 55,400), 락테이트 디하이드로게나제(MW 36500), 트립신 억제제(MW 18500), 라이소팀(MW 14400), 아프로티닝(MW 6000).

전기영동 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1로부터 발효를 통한 효소 가수분해방법이 생리활성물질의 저분자량화에 기여하여, 본 발명의 방법에 의해 인체에 흡수가 용이한 저분자량의 누에고치 생리활성물질이 다량으로 수득될 수 있다는 것을 알 수 있는 반면, 발효를 하지 않은 기존의 효소 가수분해방법은 저분자량화 반응이 거의 진행되지 않는다는 것을 비교 확인할 수 있었다.

< 실험예 1> 생리활성물질의 분석

① 단백질 정량

100 ug/ml의 표준 소혈청 알부민 (BSA) 용액에서 20, 40, 60, 80, 100 ul를 취하여 적정량의 증류수 (각각 780, 760, 740, 720, 700 ul) 및 200 ul의 단백질 검정 염료를 혼합하여 1 ml로 만들고, 이를 595 nm에서 UV 분광 광도계를 이용해서 흡광도를 측정하였다. 시료를 증류수에 녹여 단백질 검정 염료를 섞어 1 ml로 만들고, 이를 595 nm에서 UV 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하고 BSA에 대한 함유량으로 계산하여 함량을 결정하였다.

② 글리코사미노글리칸 정량 ( Carbazole assay )

NZP 콘드로이틴 설페이트를 표준물로 사용하여 카르바졸 반응에 의해 530 nm에서 UV 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

시료를 증류수에 녹여 카르바졸 반응에 의해 530 nm에서 UV 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하고 NZP 콘드로이틴 설페이트에 대한 함유량으로 계산하여 함량을 결정하였다.

③ 효소에 의한 콘드로이틴 설페이트의 분해

프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)에서 유래한 콘드로이티나제 (Chondroitinase) ABC (C2905, Sigma)를 50 mM Tris-HCl 60 mM 소듐 아세테이트 완충제 (pH 8.0)에 녹여서 1U/ml가 되게 하였다. NZP CS를 표준물로 사용하여 표준물과 샘플을 10 mg/ml로 녹여서 완충제와 섞어 효소를 30 mU 넣고, 이를 37 ℃에서 12시간 반응하여 콘드로이틴 설페이트의 함유량을 분석하였다.

누에고치 가수분해물별 생리활성물질 분석[단위(mg/g)]

성분 시료	단백질	글리코사미노글리칸	콘드로이틴 설페이트
산분해	730.4	2.67	1.3
효소가수분해	n.d.	n.d.	n.d.
발효·효소가수분해	882.8	9.35	4.6
n.d. : 검출불가능

상기 표 2에서와 같이 산가수분해된 누에고치 가수분해물보다 발효를 통한 효소가수분해 추출물이 생리활성물질을 다량 함유하고 있음을 알 수 있다. 발효를 거치지 않고 효소가수분해만 수행한 경우에는 분해가 거의 이루어지지 않아 저분자량의 생리활성물질의 검출이 불가능했다(도 1 참조).

<실시예 2> 누에고치 가수분해물의 항염 활성 시험

1)시료 : 누에고치 산분해 가수분해물 및 발효·효소 가수분해물

2)동물

실험동물은 대한실험동물센터에서 구입한 Balb/c계 생쥐를 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 통상적인 시스템으로 22 ± 2℃, 하루 중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 동물에 고형사료 (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 삼양사, 항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하였다.

3)시약 및 기기

본 실험에 사용된 시약중 지질다당류 (LPS)는 Sigma (Sigma Co., USA) 제품을, 생리식염수는 중외제약 제품을, IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 ELISA kit는 Millipore사 (USA) 제품을 사용하였으며, 기타 시약은 특급 시약을 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 원심분리기(Beckman Co., USA), 롤러 혼합기(Gowon scientific technology Co., Korea), 보텍스 혼합기(vortex mixer) (Vision scientific Co., Korea), Luminex (Millipore, Co., USA) 등을 사용하였다.

4)실험방법(in vivo 실험)

지질다당류 (LPS)로 유도된 염증 생쥐 모델 및 사이토카인 측정 정상군은 마리당 염수 200 ul를 경구투여하고, 산분해물 및 발효·효소가수분해물 투여군은 생쥐 마리당 각각 200 mg/kg을 경구용 바늘(oral zonde)을 이용하여 하루에 1회씩 7일간 경구 투여하였다. 7일 후 지질다당류 (LPS) 1 ㎎/㎏을 복강에 주사한 후 60분 후에 에틸에테르로 마취하고 심장 천자법으로 채혈하였다. 채혈 후 혈청을 분리하여 IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 생성량을 ELISA법으로 측정하였다. 각 웰에 생쥐의 혈청을 100 ㎕(1/100 희석)씩 분주한 후 항체-바이오틴 콘주게이트된 100 ㎕를 처리하고 2시간 실온에서 방치한 후 2회 세척 완충 용액으로 세척한 다음, 항체 아비딘-HRP 콘주게이트된 100 ㎕를 처리하고 2시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. 여기에 TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100 ㎕의 스톱(stop) 용액을 처리한 후 ELISA 판독기로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5) 통계처리

다양한 실험으로부터 얻은 결과는 평균 ± 표준편차로 기록하였고, 유의성 검증은 스튜던트(Student's) t- test 분석 방법을 이용하여 결정하였다.

6) 결과

6-1) IL-6

IL-6의 과잉 생산은 여러 가지 면역이상증, 염증성 질환, 림프계 종양의 발증과 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 LPS로 급성 염증을 유도한 동물 모델에서 IL-6 농도에 미치는 누에고치 가수분해물의 효과를 분석하여 본 발명의 유용성을 입증하고자 한다.

BALB/c 생쥐에 7일간 누에고치 가수분해물을 투여한 후 LPS로 유도된 급성 염증모델에서 혈청을 분리하여 IL-6를 측정한 결과 정상군은 123.2± 35.7(pg/ml), 대조군이 544.6± 37.1(pg/ml), 산분해 가수분해물 투여군은 301.6± 56.7(pg/ml), 발효·효소 가수분해물 투여군은 212.2± 9.8(pg/ml)로 나타나, 대조군은 정상군에 비해 유의성 있게 증가하였고 발효·효소 가수분해물 투여군에서는 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01, ***p<0.001) 감소하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

6-2) MCP-1

또한, 염증 반응의 신호 물질인 단구 주화성 케모카인 MCP-1의 농도를 측정하여 본 발명의 누에고치 가수분해물의 항염증 효과를 실험하였다.

BALB/c 생쥐에 7일간 누에고치 가수분해물을 투여한 후 LPS로 유도된 급성 염증모델에서 혈청을 분리하여 MCP-1를 측정한 결과 정상군은 124.1± 25.2(pg/ml), 대조군이 418.2± 88.1(pg/ml), 누에고치 산가수분해물 투여군은 214.8± 31.1(pg/ml), 누에고치 발효·효소 가수분해물 투여군은 198.2± 22.6 (pg/ml)로 나타나 대조군은 정상군에 비해 유의성 있게 증가하였고, 발효·효소 가수분해물 투여군에서는 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05, **p<0.01) 감소하였다. 그 결과는 도 3 에 나타내었다.

6-3) IL-1β

주요 염증성 사이토카인의 하나인 IL-1β의 농도를 측정하여 항염 활성을 평가하고자, BALB/c 생쥐에 7 일간 누에고치 가수분해물을 투여한 후 LPS로 유도된 급성 염증모델에서 혈청을 분리하여 IL-1β를 측정한 결과 정상군은 25.6± 5.6(pg/ml), 대조군이 116.8± 8.6(pg/ml), 누에고치 산가수분해물 투여군은 61.2± 11.1(pg/ml), 발효·효소 가수분해물 투여군은 51.6± 9.2(pg/ml)로 나타나 대조군은 정상군에 비해 유의성 있게 증가하였고 발효·효소 가수분해물 투여군에서는 대조군에 비하여 유의성 있게(**p<0.01, ***p<0.001) 감소하였다. 그 결과는 도 4 에 나타내었다.

6-4) TNF-α

또 다른 염증성 사이토카인 중 하나인 종양괴사인자(TNF-α)의 농도를 측정하여 항염 활성을 평가하고자, BALB/c 생쥐에 7일간 누에고치 가수분해물을 투여한 후 LPS로 유도된 급성 염증모델에서 혈청을 분리하여 TNF-α를 측정한 결과 정상군은 131.4± 36.0(pg/ml), 대조군이 397.0± 91.1(pg/ml), 누에고치 산가수분해물 투여군은 311.4± 54.5(pg/ml), 발효·효소 가수분해물 투여군은 143.2± 32.5 (pg/ml)로 나타나 대조군은 정상군에 비해 유의성 있게 증가하였고 발효·효소 가수분해물 투여군에서는 대조군에 비하여 유의성 있게(**p<0.01, ***p<0.001) 감소하였다. 그 결과는 도 5 에 나타내었다.

이상 상세한 설명과 실시예를 통해 비제한적으로 예시한 본 발명은 가장 자연친화적인 발효방법으로 누에고치를 추출하였고 누에고치의 생리활성 물질의 파괴를 줄이고 유효성분의 함량을 증가시키며 생산성 또한 높일 수 있어, 다양한 분야에서 사용되는 누에고치 추출물의 제조 방법으로 유용하게 이용될 수 있다. 특히 본 발명은 항염 활성을 체계적으로 밝힘으로써 식품, 화장품 등에 널리 사용하기에 적합하다. 본 발명의 이하 특허청구범위에 의해서만 한정된다.

Claims

세절된 누에고치에 정제수를 첨가하는 단계,
이 액상분에 아스퍼질러스 균주 배양액을 첨가하고 발효시키는 단계, 및
이 발효액에 단백질분해효소를 첨가하여 효소가수분해시켜 종래 산 가수분해 방법보다 다량의 생리활성 물질을 함유하는 누에고치 가수분해물을 수득하는 단계를 포함하여, 실크아미노산·펩타이드, 글리코사미노글리칸 또는 콘드로이친 설페이트를 포함하는 누에고치 생리활성 물질의 양이 증가된 누에고치 발효·효소 가수분해물의 제조방법.
제1항에 있어서, 아스퍼질러스 균주 배양액이 아스퍼질러스 카제이(Aspergillus casei) 또는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 배양액을 포함하는, 누에고치 발효·효소 가수분해물의 제조방법.
제1항에 있어서, 단백질분해효소가 파파인을 포함하는, 누에고치 발효·효소 가수분해물의 제조방법.
제1항에 있어서, 세절된 누에고치 100 중량부당 500 내지 1000 중량부의 정제수가 첨가되고, 10 내지 30 중량부의 아스퍼질러스 균주 배양액이 첨가되며, 30 내지 40℃에서 2 내지 3일 동안 발효가 수행되는, 누에고치 발효·효소 가수분해물의 제조방법.
제3항에 있어서, 발효액 100 중량부 당 5 내지 20 중량부의 파파인이 첨가되고, 60 내지 70℃에서 교반 하에 가수분해가 수행되는, 누에고치 발효·효소 가수분해물의 제조방법.
제1항에 있어서, 가수분해가 완료된 후 온도를 90℃까지 승온시켜 단백질분해효소를 불활화시키는 단계를 추가로 포함하는, 누에고치 발효·효소 가수분해물의 제조방법.
제1항에 기재된 방법에 의해 제조된 누에고치 발효·효소 가수분해물.
제7항에 있어서, 누에고치 발효·효소 가수분해물이 여과 또는 여과 후 고압 멸균한 액상형이거나 또는 동결건조한 분말형인 누에고치 발효·효소 가수분해물.
제7항에 기재된 누에고치 발효·효소 가수분해물을 유효 성분으로 함유하는 항염 효능이 있는 건강 식품.
제7항에 기재된 누에고치 발효·효소 가수분해물을 유효 성분으로 함유하는 항염 효능이 있는 기능성 화장품.