KR101768634B1 - 해파리 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 a) 해파리 및 탈지분유를 포함하는 해파리 발효배지를 제조하는 단계; b) 상기 a) 단계의 발효배지에 효모와 유산균을 접종한 후 30 내지 40℃에서 15 내지 30시간 동안 교반하면서 발효하는 1차 고온 교반 발효 단계; c) 상기 b) 단계의 1차 고온 교반 발효물을 20 내지 28℃에서 5 내지 15시간 동안 정치상태로 발효하는 2차 저온 정치 발효 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 2차 저온 정치 발효물을 2 내지 10℃에서 140 내지 240시간 동안 정치상태로 발효하는 3차 초저온 정치 발효 단계;를 포함하는 해파리 발효 배양물의 제조방법, 및 상기 제조방법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 우수한 피부노화 또는 피부염증 개선효과를 나타내고, 세포독성 및 피부 부작용이 없으므로 화장료 조성물로서 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

해파리 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물{Compositions for improving skin conditions comprising fermented jellyfish culture products}

본 발명은 해파리 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 해파리 발효 배양물을 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 해파리 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부노화 또는 피부염증과 같은 피부상태를 개선하는 조성물에 관한 것이다.

해파리(jellyfish)는 자포동물문 해파리강에 속하는 무척추동물의 총칭으로 크기와 종류가 다양하며, 전 세계 대양에서 발견된다. 이러한 해파리는 대략적으로 물 96%, 단백질 0.3%, 지질 0.1%, 회분 2.6% 등으로 구성되어 있어 10kg의 해파리를 탈수할 경우 400g 중량의 해파리를 얻을 수 있는데, 이 중 단백질은 38%로 높은 단백질량을 포함하고 있다.

해파리의 기능성 단백질로는 콜라겐과 뮤신이 대표적이며, 콜라겐은 세포 외 기질의 주요 구성성분으로 포유동물의 체단백질(body protein) 중 약 30% 이상을 차지하며, 근육, 연골, 뼈, 혈관벽, 치아 등에 주로 분포하고 있다.

상기 콜라겐은 피부를 구성하는 중요한 단백질로서, 피부의 탄력과 노화와 밀접한 관계가 있다. 콜라겐 분자는 분자량이 약 30만이며, 분자량 10만의 폴리 펩타이드가 3가닥으로 묶여있는 3중 나선 구조의 섬유상 단백질로서 기본단위 분자인 트로포콜라겐(tropocollagen)간에 공유 결합성 교차결합에 의해 물리적·생물학적으로 안정한 구조를 이루고 있다(Marcel and Nimmi., 1988).

또한, 상기 뮤신은 당질과 결합된 복합 단백질로 콘드로이친이 주성분으로 아포뮤신이라는 폴리펩타이드가 중심뼈대를 이루며, 과당이 O-linked glycosylation으로 연결되어 있기 때문에 콜레스테롤 저하, 위벽 보호, 해독 작용, 또는 외부 환경으로부터 수분손실을 막아 피부의 건조를 막아주어 상처가 난 피부를 빠르게 재생시켜 주는 효능이 있다고 알려져 있다.

따라서, 해파리는 피로와 피부탄력 및 혈액순환의 조절을 비롯하여, 관절염, 고혈압, 기관지염, 천식, 궤양 치료에 효능을 나타내므로, 고단백 다이어트 식품, 화장품 및 의약품 등의 새로운 물질로 각광받고 있는 추세이다.

이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-1536215호에는 해파리 물추출물에 뉴트라아제와 주석산을 이용하여 2차에 걸쳐 가수분해하여 제조된 해파리 콜라겐 가수분해물의 항산화, 항염, 미백 및 주름개선 용도에 대해 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2014-0028149호에는 방사선을 이용하여 해파리 콜라겐을 분리하는 방법에 대해 개시되어 있다. 그러나, 상기 효소를 이용하여 해파리를 가수분해하는 경우 해파리의 농도가 높거나 외부환경(온도, pH 등)이 변화함에 따라 효소 반응이 저해되기 때문에 일정한 크기를 나타내는 가수분해물을 얻기 힘들며, 산처리 방법의 경우 산처리 후 반드시 중화과정이 필요하고, 반응 중 단백질 변성 등으로 인한 침전물이 발생할 수 있으므로 가수분해물의 수율이 낮다는 단점이 있다.

또한, 대한민국 등록특허 제10-1004539호에는 해파리, 한약재 및 질소원을 혼합한 배지에 희소 방선균을 접종하여 3차에 걸쳐 발효시킨 후 해파리 발효 조성물을 추출하는 해파리 발효 조성물의 제조방법에 대해 개시되어 있는데, 상기 방법에서 사용하는 배지는 구성 원료의 수가 다양하여 원료들을 전처리하는 공정이 번거로우며, 매 발효단계마다 질소원과 발효 미생물을 첨가해주어야 하므로 비용과 시간이 많이 소요되는 단점이 있다. 또한, 발효 이후 멸균단계에서 살균용 가스에서 배출되는 유해물질이 발효물에 잔류하기 때문에 장기간 섭취시 인체에 좋지 않은 영향을 줄 수 있는 문제가 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하면서 적은 시간과 비용으로 인체에 안전한 해파리 발효 배양물을 제조하고자 노력하던 중, 해파리 분쇄물과 탈지분유가 함유된 발효배지에 효모와 유산균을 접종하고 1차 고온 교반 발효, 2차 저온 정치 발효 및 3차 초저온 정치 발효하여 얻어진 해파리 발효 배양물이 우수한 항염 또는 항노화 효과를 나타낼 뿐만 아니라 피부에 대해 안정성을 가짐을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 피부노화 또는 피부염증과 같은 피부상태를 개선하는 효능을 가지는 해파리 발효 배양물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 제조방법으로 제조된 해파리 발효 배양물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 해파리 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 해파리 발효 배양물의 제조방법을 제공한다.:

a) 해파리 및 탈지분유를 포함하는 발효배지를 제조하는 단계;

b) 상기 a) 단계의 발효배지에 효모와 유산균을 접종하여 교반하면서 배양하는 1차 고온 교반 발효 단계;

c) 상기 b) 단계의 1차 고온 교반 발효물을 정치상태에서 배양하는 2차 저온 정치 발효 단계; 및

d) 상기 c) 단계의 2차 저온 정치 발효물을 정치상태에서 배양하는 3차 초저온 정치 발효 단계.

이하, 도 1을 참조하여 본 발명에 따른 해파리 발효 배양물의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.

a) 해파리 및 탈지분유를 포함하는 발효배지를 제조하는 단계이다.

구체적으로, 상기 발효배지는 해파리와 탈지분유를 정제수에 첨가한 후 교반하여 용해시켜 제조된 것으로, 이후 발효단계에서 효모와 유산균의 생장을 촉진시킴과 동시에 효모와 유산균으로부터 단백질 분해효소의 분비를 증가시킴으로써, 해파리로부터 피부노화 또는 피부염증을 개선시킬 수 있는 생리활성물질의 함량을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 해파리는 흐르는 물에 세척하여 염분을 제거하고, 동결건조한 후 0.3 내지 0.8mm 크기로 분쇄한 분말을 말한다.

상기 해파리는 발효배지의 총 중량에 대하여 1 내지 10 중량%를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 해파리를 1 중량% 미만으로 사용하는 경우 본 발명에서 목적으로 하는 해파리 발효 배양물을 제조할 수 없으며, 상기 해파리를 10 중량%를 초과하여 사용하는 경우 발효용 미생물의 활성을 저해하여 이후 발효단계가 원활히 이루어지지 않는 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 탈지분유는 이후 발효용 미생물의 배양을 촉진시키기 위한 영양분으로서, 발효배지의 총 중량에 대하여 0.05 내지 0.5 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 0.4 중량%를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 탈지분유를 0.05 중량% 미만으로 사용하는 경우 해파리에 함유된 생리활성물질의 분해가 이루어지지 않으며, 상기 탈지분유를 0.5 중량%를 초과하여 사용하는 경우 해파리에 함유된 생리활성물질이 과분해되어 생리활성물질의 효능이 감소할 우려가 있다.

본 발명의 발효배지는 유효성분으로서 해파리와 탈지분유 이외에 효모 및 유산균의 배양을 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 배지성분, 예를 들어 글루코스, 덱스트린, 말토오스, 펩톤, 육추출물, 효모 추출물, 트립톤 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들 배지성분을 추가로 포함하는 경우 그 함량은 본 발명에 따른 배지의 총 중량에 대하여 2 중량%를 초과하지 않는 것이 바람직하다.

b) 상기 a) 단계의 발효배지에 효모와 유산균을 접종하여 1차 고온 교반 발효 단계이다.

본 발명에 있어서, 상기 효모와 유산균은 상기 a) 단계의 발효배지를 섭취하여 자신이 가지고 있는 분해효소를 분비하여 해파리를 분해시키는 역할을 하는 발효용 미생물이라면 어느 것이나 사용 가능하다. 예를 들어, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces sp.), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces sp.), 토룰로프시스(Torulopsis sp.), 로도토룰라(Rhodotorula sp.) 및 칸디다(Candida sp.) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 미생물을 사용할 수 있으며, 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 스트렙토코쿠스(Streptococcus sp.), 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 미생물을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 1차 고온 교반 발효 단계는 상기 a) 단계의 발효배지에 효모와 유산균을 접종한 후 30 내지 40℃, 바람직하게는 32 내지 38℃의 온도에서 15 내지 30시간, 바람직하게는 15 내지 20시간 동안 교반하면서 이루어지는 것이 바람직하다. 여기서, 교반은 50 내지 300 rpm의 교반 속도, 바람직하게는 50 내지 200 rpm의 교반속도로 이루어진다.

상기 1차 고온 교반 발효 시 통기조건은 0.5 내지 2.0 vvm, 바람직하게는 0.8 내지 1.5vvm이며, pH는 4.0 내지 6.0, 바람직하게는 pH 5.0 내지 6.0인 상태를 유지하는 것이 바람직하다.

상기 효모와 유산균은 약 10³ 내지 10⁵ cell/ml 농도의 배양액을 발효배지의 총 중량에 대하여 1 내지 8중량%, 바람직하게는 2 내지 6 중량%의 함량으로 접종하는 것이 좋다.

이러한 1차 고온 교반발효단계는 단시간 내에 효모와 유산균의 균체량을 증가시키면서 효모 또는 유산균의 세포벽이 파괴되는 현상을 감소시킬 수 있다.

c) 상기 b) 단계의 1차 고온 교반 발효물을 정치상태에서 배양하는 2차 저온 정치 발효 단계이다.

본 발명에 있어서, 상기 c) 단계는 상기 1차 고온 교반 발효단계와 달리 발효 조건이 20 내지 28℃, 바람직하게는 22 내지 26℃에서 5 내지 15시간, 바람직하게는 5 내지 10시간이며, 교반이 아닌 정치상태에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기 2차 저온발효 시 통기조건은 0 내지 0.3 vvm, 바람직하게는 1 내지 0.1 vvm이며, pH는 3 내지 5, 바람직하게는 pH 3.5 내지 4.5인 상태를 유지하는 것이 바람직하다.

이러한 2차 저온 정치 발효 단계는 혐기성 발효로 인한 추가적인 발효 배양물을 생성함과 더불어 1차 고온 교반 발효 단계에서 급격한 기질 고갈 및 균체 가수분해를 통해 기질 저해 현상으로 인한 발효 배양물 내 유효성분의 생성 저하를 방지하기 위함이다.

d) 상기 c) 단계의 2차 저온 정치 발효물을 정치상태에서 배양하는 3차 초저온 정치 발효 단계이다.

본 발명에 있어서, 상기 d) 단계의 발효는 2 내지 10℃, 바람직하게는 3 내지 8℃에서 140 내지 240시간, 바람직하게는 150 내지 200시간 동안 정치하면서 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이때, 통기조건과 pH는 상기 c) 단계의 2차 저온 정치 발효 단계와 동일하다.

이러한 3차 초저온 정치 발효 단계는 가수분해된 효소들의 효소간 대사회로의 간섭을 최소화하며, 장기간 배양을 통해 발효배지 중에 남아 있는 잔여 기질을 완전히 대사하여 유효성분인 생리활성물질의 생산량을 향상시킬 수 있는 이점이 있다.

한편, 본 발명의 해파리 발효 배양물은 상기 d) 단계 이후에 필요에 따라 선택적으로 3차 초저온 정치 발효물로부터 균체를 제거하기 위한 여과 및 정제하는 공정을 추가할 수 있다.

상기 여과는 3차 초저온 정치 발효물로부터 균체를 제거할 수 있는 방법이라면 어느 것이나 사용 가능하며, 예를 들어 기공의 크기가 0.05 내지 1㎛의 제균필터를 사용하여 이루어질 수 있다.

상기 정제는 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 이루어질 수 있다.

상기 여과 및 정제 공정에 의하여 본 발명에 따른 해파리 발효 배양물을 별도의 살균처리 없이도 미생물에 의한 오염을 방지할 수 있으므로 더 안전하게 조성물의 성분으로 사용할 수 있다.

상기한 해파리 발효 배양물의 제조방법은 종래 효소 및/또는 산을 이용하거나 발효하여 제조하는 방법과 달리 해파리와 탈지분유가 함유된 발효배지에 발효용 미생물을 1회 접종하여 발효함으로써, 적은 시간과 비용으로 인체에 안전한 해파리에 함유된 주요 생리활성물질의 생성을 증가시킬 수 있는 효과가 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 해파리 발효 배양물의 제조방법에 의하여 제조된 해파리 발효 배양물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 해파리 발효 배양물은 본 명세서의 실시예에서 기재된 바와 같이 섬유아세포 내 콜라겐의 합성을 촉진하고, 콜라게네이즈의 활성을 억제하며, 염증반응에 관여하는 에오탁신-1, COX-2 및 아질산염의 생성을 억제시키는 효능을 나타낸다. 특히, 상기 해파리 발효 배양물은 발효하기 전 해파리에 비하여 현저히 우수한 콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 억제, 및 에오탁신-1, COX-2 및 아질산염 생성 억제 효과를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 해파리 발효 배양물은 피부노화 또는 피부염증을 개선하기 위한 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 해파리 발효 배양물을 포함하는 피부노화 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부노화 개선은 피부세포의 노화나 사멸 또는 외적인 압력에 의하여 생기는 손상, 잔주름 또는 굵은 주름 등을 감소시키거나 예방 또는 제거하는 것을 의미한다.

상기 피부염증의 개선은 외부의 자극에 의해 피부세포 내에서 염증반응에 의해 생기는 질환, 질병 또는 이상 상태를 예방 또는 개선하는 것을 의미한다. 여기서 상기 염증반응에 의해 생기는 질환은, 예를 들어, 수포성 유천포창, 전신성 홍반성 루푸스, 건선, 알러지 또는 아토피일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 유효성분인 해파리 발효 배양물이 전체 조성물의 총 분량을 기준으로 0.001 내지 15 중량%, 보다 바람직하게는 0.001내지 10 중량%, 보다 더 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 하나의 구체적 실시양태로서, 상기 화장료 조성물은 유효성분으로서 해파리 발효 배양물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 해파리 발효 배양물에 대한 피부누적 자극실시 결과 인체에 무해한 물질임이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 해파리 발효 배양물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같이 화장료 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 해파리 발효 배양물의 제조방법은 종래 효소 및/또는 산을 이용하거나 발효하여 제조하는 방법과 달리 해파리와 탈지분유가 함유된 발효배지에 발효용 미생물을 1회 접종하여 발효함으로써, 적은 시간과 비용으로 인체에 안전한 해파리에 함유된 주요 생리활성물질의 생성이 향상된 해파리 발효 배양물을 제공할 수 있으며, 그에 따른 향상된 피부노화 또는 피부염증 개선효과를 나타내고, 세포독성 및 피부 부작용이 없으므로 화장료 조성물로서 효과적으로 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 해파리 발효 배양물의 제조방법을 도시한 그림이다.
도 2은 해파리 발효 배양물에 의한 콜라겐 합성 증진 효과를 보여주는 그림이다.
도 3는 해파리 발효 배양물에 의한 콜라게네이즈 활성 저해 효과를 보여주는 그림이다.
도 4은 해파리 발효 배양물에 의한 에오탁신-1(eotaxin-1) 생성 저해효과를 보여주는 그림이다.
도 5는 해파리 발효 배양물에 의한 COX-2 발현 억제효과를 보여주는 그림이다.
도 6은 해파리 발효 배양물에 의한 아질산염(nitrite) 생성 저해 효과를 보여주는 그림이다.

이하, 제조예 및 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1: 해파리 발효 배양물의 제조

1-1. 해파리가 함유된 발효배지 제조

먼저, 염장 처리된 해파리 1 kg을 여러 차례 수세과정을 통하여 염분을 제거하고, 동결 건조하여 13g을 얻었다. 동결건조된 해파리는 마이크로 헤머밀(Culatti, Swiss)을 이용하여 시브 사이즈(sieve size)가 0.5 mm가 되도록 곱게 분쇄한 후, 분말 형태의 해파리 분쇄물을 제조하였다.

그 다음, 상기 해파리 분쇄물 1.3% (w/v)과 탈지분유 0.3%(조성 100g 당 탄수화물 52g, 당류 47g, 단백질 35g, 지방 1g, 포화지방 0.5g, 콜레스테롤 20mg, 나트륨 600mg, 칼슘 1,100mg) (w/v)를 정제수 95.7%(w/w)에 혼합한 뒤 교반한 뒤 용해시켜 발효배지를 제조하였다.

1-2. 발효 배양법의 의한 해파리 발효 배양물의 제조

상기 1-1에서 제조된 해파리 발효배지 조건을 기준으로 항노화, 항염 효과를 향상시키는 최적의 배양 조건을 확립하기 위해 조건별 발효를 수행하였다.

구체적으로, 상기 1-1에서 제조한 해파리 발효배지에 약 10³~10⁵ cell/ml 농도의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 각각 4중량% 접종한 뒤, 35℃의 온도에서 17시간 동안 150rpm의 교반속도로 1차 교반배양 하여 1차 발효 배양물을 제조하였다. 이때 통기조건은 1vvm이었고, pH는 5.5이었다.

다음으로, 상기 1차 발효 배양물을 25℃의 온도에서 7시간 동안 2차 정치배양 하여 2차 발효 배양물을 제조하였다. 이때 통기조건은 혐기조건으로 0~0.1vvm이었고 pH는 4.0이었다.

다음으로, 상기 2차 발효 배양물을 4℃의 온도에서 168시간 동안 초저온 장기 정치배양하여 3차 발효 배양물을 제조하였다. 이때 통기조건은 혐기조건으로 0~0.1vvm이었고, pH는 4.0이었다.

또한, 상기 3차 발효 배양물을 제균 필터로 멸균한 뒤 1 kDa 셀룰로오스 멤브레인이 장착된 한외 여과기를 사용하여 해파리 발효산물을 정제한 후 동결건조하여 3차 발효물 정제·분획물을 제조하였다.

비교예 1: 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 발효 배양물 제조

상기 제조예 1-1에서 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 발효배지를 제조한 다음, 상기 제조예 1-2와 동일한 방법으로 3차 발효하여 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효 배양물을 제조하였다.

실시예 1: 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물의 콜라겐 합성 증진 효과 측정

상기 제조예 1에서 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물 및 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효 배양물의 섬유아세포 내 콜라겐 합성능을 측정하였다.

구체적으로, 인체 유래 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 플레이트에 접종시키고(2×10⁵ 세포/웰), 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰의 배지를 새 배지로 교환하고, 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지, 제조예 1의 1차 발효물, 2차 발효물, 3차 발효물, 3차 발효물 정제·분획물, 또는 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효물을 각각 10 ppm(㎍/mL) 또는 100 ppm(㎍/mL)을 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.

콜라겐 합성능은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit MK101, 다카라, 일본)를 이용하여 타입 I 프로콜라겐(procollagen)의 양을 측정하였다. 자세한 실시방법은 (주)다카라의 키트 설명서에 따라 수행하였다. 측정된 표준치는 평균±표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 음성 대조군(-)으로는 아무것도 처리하지 않은 섬유아세포를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 TGF-beta를 10ng/ml 처리한 섬유아세포를 사용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보듯이, 제조예 1-2의 3차 해파리 발효 배양물과 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물은 제조예 1-1의 발효전 발효배지와 비교예 1의 해파리를 처리하지 않은 발효 배양물에 비하여 월등히 우수한 콜라겐 합성능을 나타내었으며, 처리농도가 증가할수록 콜라겐의 합성정도가 높아져 농도 의존적인 경향이 관찰되었다.

특히, 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물의 콜라겐 합성능은 3차 해파리 발효 배양물에 비해 약 1.6배 우수함을 알 수 있었다.

반면, 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지와 제조예 1-2의 1차 또는 2차 발효하여 제조된 해파리 발효 배양물을 처리한 섬유아세포는 음성 대조군에 비해 프로콜라겐의 함량이 약 20 내지 30 ng/ml 증가하였으나, 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효물을 처리한 섬유아세포 내 프로콜라겐 함량과 유의적인 차이를 보이지 않았다.

실시예 2: 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효배양물의 콜라겐 분해효소 억제 효과 측정

상기 제조예 1에서 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물 및 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효 배양물의 섬유아세포 내 콜라겐 분해효소 억제 효과를 측정하였다.

구체적으로, 인체 유래 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 × 10⁵ 세포/웰), 5% 농도의 CO₂ 배양기에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰의 배지를 새 배지로 교환하고, 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지, 제조예 1의 1차 발효물, 2차 발효물, 3차 발효물, 3차 발효물 정제·분획물, 또는 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효물을 각각 10 ppm(㎍/mL) 또는 100 ppm(㎍/mL)을 처리한 다음 TNF-α(종양괴사인자 알파)를 50 ng/mL 처리하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.

콜라게네이즈 활성은 타입 I 콜라게네이즈 어세이 키트(Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 판독기(Bio-Tek ELx808™ Series Ultra Microplate Reader, 영국)로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균±표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 음성 대조군(-)으로는 아무것도 처리하지 않은 섬유아세포를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 TNF-alpha를 20ng/ml 처리한 섬유아세포를 사용하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보듯이, 제조예 1-2의 3차 해파리 발효 배양물과 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물은 제조예 1-1의 발효전 발효배지와 비교예 1의 해파리를 처리하지 않은 발효 배양물에 비하여 월등히 우수한 콜라게네이즈 활성 억제 효능을 나타내었으며, 처리농도가 증가할수록 콜라게네이즈의 활성 정도가 낮아져 농도 의존적인 경향이 관찰되었다.

특히, 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물의 콜라게나에즈 활성 억제 효능은 3차 해파리 발효 배양물에 비해 약 1.3배 우수함을 알 수 있었다.

반면, 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지와 제조예 1-2의 1차 또는 2차 발효하여 제조된 해파리 발효 배양물을 처리한 섬유아세포는 양성 대조군과 유사한 콜라게네이즈 활성을 나타내었다.

실시예 3: 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물의 에오탁신 -1(eotaxin-1) 생성 억제효과 측정

에오탁신-1(eotaxin-1)은 염증반응에 관여하는 케모카인의 한 종류로 염증부위로 호산구를 응집시킴으로 인해, 호산구에 의한 분비된 과립에 의한 염증반응을 악화시키는 역할을 한다.

이에 상기 제조예 1에서 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물 및 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효 배양물의 에오탁신-1 발현 억제 효과를 비교하기 위하여, 섬유아세포주인 NIH/3T3을 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 웰당 약 5 × 10⁴ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 각 웰의 배지를 각 웰의 배지를 새 배지로 교환한 후 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지, 제조예 1의 1차 발효물, 2차 발효물, 3차 발효물, 3차 발효물 정제·분획물, 또는 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효물을 각각 10 ppm(㎍/mL) 또는 100 ppm(㎍/mL)을 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후, 세포배양액을 수집하여 에오탁신-1 ELISA 키트(eBioscience, 미국)를 이용하여 에오탁신-1의 분비정도를 측정하였다. 음성 대조군(-)으로는 아무것도 처리하지 않은 섬유아세포를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 IL-4를 50ng/ml 처리한 섬유아세포를 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보듯이, 제조예 1-2의 3차 해파리 발효 배양물과 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물은 제조예 1-1의 발효전 발효배지와 비교예 1의 해파리를 처리하지 않은 발효 배양물에 비하여 월등히 우수한 에오탁신-1 생성을 억제하는 효능을 나타내었으며, 처리농도가 증가할수록 에오탁신-1의 생성량이 감소하여 농도 의존적인 경향이 관찰되었다.

특히, 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물의 에오탁신-1 생성 억제 효능은 3차 해파리 발효 배양물에 비해 2배 우수함을 알 수 있었다.

반면, 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지와 제조예 1-2의 1차 또는 2차 발효하여 제조된 해파리 발효 배양물을 처리한 섬유아세포는 양성 대조군과 유사한 함량의 에오탁신-1을 생성하는 것으로 관찰되었다.

실시예 4: 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물의 COX-2 생성 억제 효과 측정

염증반응에 동반해서 그 발현정도가 높아지는 COX-2 (cyclooxygenase-2)생성에 상기 제조예 1에서 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물, 또는 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효 배양물이 효과가 있는지를 살펴보기 위해, 면역대식세포(macrophage)인 RAW264.7 세포를 이용하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.

구체적으로, RAW264.7 세포를 12-웰 플레이트에 24시간동안 배양 후 COX-2 luciferase vector를 형질주입(transfection)시켰다. 24시간 배양 후 각 웰의 배지를 새배지로 교환하고 상기 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지, 제조예 1의 1차 발효물, 2차 발효물, 3차 발효물, 3차 발효물 정제·분획물, 또는 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효물을 각각 10 ppm(㎍/mL) 또는 100 ppm(㎍/mL)을 처리한 다음 12시간 동안 다시 배양하였다. 12시간 후 세포를 수집하여 luciferase 기질과 반응시켜 luciferase 형광 발현정도를 측정함으로서 COX-2 생성정도를 측정하였다. 음성 대조군(-)으로는 아무것도 처리하지 않은 RAW264.7 세포를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 LPS를 200ng/ml 처리한 RAW264.7 세포를 사용하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보듯이, 제조예 1-2의 3차 해파리 발효 배양물과 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물은 제조예 1-1의 발효전 발효배지와 비교예 1의 해파리를 처리하지 않은 발효 배양물에 비하여 월등히 우수한 COX-2 발현 저해 효능을 나타내었으며, 처리농도가 증가할수록 COX-2의 발현이 감소하여 농도 의존적인 경향이 관찰되었다.

특히, 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물의 COX-2 발현 저해 효능은 3차 해파리 발효 배양물에 비해 약 1.6배 우수함을 알 수 있었다.

반면, 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지와 제조예 1-2의 1차 또는 2차 발효하여 제조된 해파리 발효 배양물을 처리한 섬유아세포는 양성 대조군과 유사한 함량의 COX-1을 발현하는 것으로 관찰되었다.

실시예 5: 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효배양물의 아질산염(nitrite, HNO ₂ ) 생성 억제 효과 측정

염증반응에 동반하는 아질산염(nitrite, HNO₂)의 생성에 상기 제조예 1에서 발효 배양법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물, 또는 비교예 1의 해파리 분쇄물이 효과가 있는지를 살펴보기 위하여, 면역대식세포(macrophage)인 RAW267.4 세포를 이용하여 아질산염의 생성정도를 측정하였다.

구체적으로, RAW264.7 세포를 24-웰 플레이트에 24시간동안 배양한 다음, 상기 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지, 제조예 1의 1차 발효물, 2차 발효물, 3차 발효물, 3차 발효물 정제·분획물, 또는 비교예 1의 해파리 분쇄물이 함유되지 않은 3차 발효물을 각각 10 ppm(㎍/mL) 또는 100 ppm(㎍/mL)을 처리하였다. 그 다음 24시간 동안 다시 배양한 후 세포배양액을 수집하여 Griess reagent와 반응시켜 아질산염의 생성정도를 측정하였다. 음성 대조군(-)으로는 아무것도 처리하지 않은 RAW264.7 세포를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 LPS를 200ng/ml 처리한 RAW264.7 세포를 사용하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보듯이, 제조예 1-2의 3차 해파리 발효 배양물과 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물은 제조예 1-1의 발효전 발효배지와 비교예 1의 해파리를 처리하지 않은 발효 배양물에 비하여 월등히 우수한 아질산염(nitrite) 생성을 억제하는 효능을 나타내었으며, 처리농도가 증가할수록 아질산염(nitrite)의 생성량이 감소하여 농도 의존적인 경향이 관찰되었다.

특히, 3차 해파리 발효 배양물을 정제한 3차 발효물 정제·분획물의 아질산염(nitrite)의 생성 억제 효능은 3차 해파리 발효 배양물에 비해 2.5배 우수함을 알 수 있었다.

반면, 제조예 1-1의 해파리가 함유된 발효배지와 제조예 1-2의 1차 또는 2차 발효하여 제조된 해파리 발효 배양물을 처리한 섬유아세포는 양성 대조군과 유사한 함량의 아질산염(nitrite)을 생성하는 것으로 관찰되었다.

상기한 결과로부터, 해파리 분쇄물이 함유된 발효배지에 효모 및 유산균을 접종한 다음, 1차 고온 교반배양, 2차 저온 정치배양 및 3차 초저온 정치배양 한 후 여과 및 정제하여 제조된 3차 발효물 정제·분획물이 1차 고온 교반배양 또는 2차 저온 정치배양하여 제조된 배양물에 비해 월등히 우수한 항노화 및 항염증 효능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

실시예 6: 본 발명에 따른 해파리 발효배양물의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험

상기 제조예 2-1에서 제조한 3차 해파리 발효 배양물을 해파리 발효 배양물이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 피부 안전성 검증으로 피부누적자극시험을 실시하였다.

6-1. 해파리 발효 배양물을 함유한 피부 외용제 제조

상기 제조예 2-1에서 제조한 3차 해파리 발효 배양물이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 10, 100 또는 200ppm의 3차 해파리 발효 배양물을 함유한 피부 외용제를 제조하였다. 구체적으로, 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜을 혼합하고, 70℃에서 용해하였으며(물파트), 상기 세 성분과 트리메탄올아민을 제외한 나머지 성분을 70℃에서 용해하였다(오일파트). 그 다음 상기 오일파트를 물파트에 첨가하고 호모믹서(일본 Tokushu Kika사)로 교반하여 1차 유화하였고, 여기에 트리메탄올아민을 최종 첨가하였다. 다음으로, 상기 혼합액에 생성된 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 피부 외용제를 제조하였다.

6-2. 피부누적 자극 실험

상기 6-1에서 제조한 3차 해파리 발효 배양물이 함유된 피부 외용제를 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회, 24시간 누적 첩포를 시행하여 해파리 발효 배양물이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 대조군으로는 해파리 발효 배양물 대신 스쿠알렌이 함유된 피부 외용제를 사용하였다.

첩포 방법은 핀 챔버 (Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였으며, 챔버에 상기 피부 외용제를 15 ㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 수학식 1을 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[수학식 1]

평균반응도 = [[{(반응지수 × 반응도)/(총 피검자수 × 최고점수(4점)}] × 100] / 검사회수(9회)

반응도에서 a는 1점, b는 2점, c는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정하였다.

시험물질	반응이 나타난 피검자 수									평균 반응도
	1주			2주			3주
	1차	2차	3차	4차	5차	6차	7차	8차	9차
	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c	a/b/c
대조군 (스쿠알렌)	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	1/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.09
해파리 발효 배양물 (10 ppm)	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
해파리 발효 배양물 (100 ppm)	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
해파리 발효 배양물 (200 ppm)	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	1/-/-	-/-/-	-/-/-	0.09

상기 표 1에서 보듯이, 3차 해파리 발효 배양물이 10 또는 100 ppm 함유된 피부 외용제를 처리한 시험군은 모두 a, b 및 c에 해당하는 사람의 수가 각각 0명, 0명 및 0명으로 평균 반응도는 각각 0.00, 0.00, 0.00 이였다. 반면, 해파리 발효 배양물이 200 ppm 함유된 피부 외용제를 처리한 후 3주차에 a, b 및 c에 해당하는 사람의 수가 각각 1명, 0명 및 0명으로, 평균반응도는 각각 0.00, 0.00, 0.09이었다.

상기 기재된 식에 따라 계산하면 3차 해파리 발효 배양물이 함유된 피부 외용제의 평균반응는 3 이하의 반응도를 나타내므로, 해파리 발효 배양물은 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않는 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1: 화장료 제제

1-1. 유연 화장수(함량: 중량%)

원료명	함량 (%)
해파리 발효 배양물	0.1
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로펠렌 글리콜	2.0
카복시비닐폴리머	0.1
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량 정제수	잔량
총계	100.0

1-2. 영양화장수(함량: 중량%)

원료명	함량 (%)
해파리 발효 배양물	0.1
밀납	4.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	5.0
스쿠알렌	5.0
카프릴릭/카프릭 트리그리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
카복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량 정제수	잔량
총계	100.0

1-3. 영양크림(함량: 중량%)

원료명	함량 (%)
해파리 발효 배양물	0.1
밀납	10.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알렌	5.0
카프릴릭/카프릭 트리그리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량 정제수	잔량
총계	100.0

1-4. 마사지 크림 (함량: 중량%)

원료명	함량 (%)
해파리 발효 배양물	0.1
밀납	10.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알렌	5.0
카프릴릭/카프릭 트리그리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량 정제수	잔량
총계	100.0

1-5. 팩 (함량: 중량%)

원료명	함량 (%)
해파리 발효 배양물	0.1
폴리비닐알콜	13.0
소듐카복시메틸셀룰로스	0.2
알란토인	0.1
에탄올	5.0
노닐페닐에테르	0.3
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량 정제수	잔량
총계	100.0

Claims (7)

1. a) 해파리 및 탈지분유를 포함하는 해파리 발효배지를 제조하는 단계;
   b) 상기 a) 단계의 발효배지에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 접종한 후 30 내지 40℃에서 15 내지 30시간 동안 교반하면서 발효하는 1차 고온 교반 발효 단계;
   c) 상기 b) 단계의 1차 고온 교반 발효물을 20 내지 28℃에서 5 내지 15시간 동안 정치상태로 발효하는 2차 저온 정치 발효 단계; 및
   d) 상기 c) 단계의 2차 저온 정치 발효물을 2 내지 10℃에서 140 내지 240시간 동안 정치상태로 발효하는 3차 초저온 정치 발효 단계;를 포함하는 해파리 발효 배양물의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 d) 단계 이후 d) 단계의 3차 초저온 정치 발효물을 여과 및 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 해파리 발효 배양물의 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 a) 단계의 해파리 발효배지는 해파리가 발효배지의 총 중량에 대하여 1 내지 10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 해파리 발효 배양물의 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 a) 단계의 해파리 발효배지는 탈지분유가 발효배지의 총 중량에 대하여 0.05 내지 0.5 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 해파리 발효 배양물의 제조방법.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 해파리 발효 배양물.
   
6. 제5항의 해파리 발효 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
   
7. 제5항의 해파리 발효 배양물을 유효 성분으로 포함하는 피부염증 개선용 화장료 조성물.
   

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