KR102614707B1 - 아미노산 함량이 증가된 클로렐라 불가리스 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents
아미노산 함량이 증가된 클로렐라 불가리스 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아미노산 함량이 증가된 클로렐라 불가리스 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 발효 및 효소처리공정의 2단계의 전환 공정을 통하여 식물성 단백질을 다량 함유하고 있는 클로렐라 불가리스로부터 아미노산 함량이 증가된 추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.
Description
본 발명은 아미노산 함량이 증가된 클로렐라 불가리스 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 2단계의 전환 공정을 통하여 식물성 단백질을 다량 함유하고 있는 클로렐라 불가리스로부터 아미노산 함량이 증가된 추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.
피부의 각질층(stratum corneum, SC)은 피부 최외각 층에 존재하고, 외부환경에 직접 접하고 있어 인체에서 매우 중요한 역할을 한다. 정상적인 피부의 각질층에는 일정량의 수분이 함유되어 탄력성과 유연성을 유지한다. 각질층은 죽은 각질세포로부터 생성된 단백질과 각질세포 사이에 존재하는 각질세포간 지질로 이루어져 있으며, 그 외 표피지질, 천연보습인자(natural moisturizing factor, NMF)가 존재한다.
피부의 건조는 표피 상층부 중에서도 표피장벽의 역할을 하는 각질층에서 일어나는 변화가 중요한 원인으로 여겨지고 있다. 그 중에서 피지, 각질 세포간 지질, 각질 세포 내 NMF, 교소체(desmosome) 등이 관련되어 있다.
피부 각질 중 수분은 높은 흡습성과 수분보유능이 있는 천연보습인자(NMF) 성분에 의해 조절된다. 천연보습인자는 정상 피부 내의 각질층에 존재하는 수용성, 친수성 성분을 총칭하는 말로 외부로부터 수분을 흡수하고 각질층의 수분보유능을 증가시키며 피부가 건조해지는 것을 방지하여 피부의 유연성을 유지하는 기능을 한다. NMF는 필라그린이 분해되면서 생성된 아미노산과 아미노산의 대사산물로 구성되며 이외에 각종 무기 염류를 포함한다.
아토피 피부염, 건선 등의 피부질환 환자와 건조하거나 과각화된 피부의 각질에서는 NMF의 구성성분인 아미노산의 양이 비정상적으로 감소되어 있음이 보고된 바 있으며, 아미노산이 피부의 보습상태나 피부장벽강화에 중요한 역할을 한다는 연구가 다수 보고된 바 있다.
본 발명자들은 피부 보습 및 피부 장벽강화에 도움을 줄 수 있는 소재 개발을 위하여 연구하였으며, 식물성 단백질 함량이 높은 클로렐라 불가리스를 누룩균 등의 발효균주와 식물유래 단백질 분해효소를 사용하여 추출하는 2단계 복합 추출공정에 의하는 경우에 양질의 아미노산을 다량 함유하는 추출물이 얻어진다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 아미노산 함량이 증가된 클로렐라 불가리스 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 클로렐라 불가리스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,
(A) 클로렐라 불가리스를 멸균하고, 누룩균, 유산균 및 고초균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 접종하여 발효시키는 단계; (B) 추출용매를 가하여 추출하는 단계; (C) 상기 추출물에 식물유래 단백질 분해효소를 첨가하여 효소반응시키는 단계; (D) 에탄올 첨가 후 균체를 활성탄 필터로 여과하고, 0.22 ~ 0.45㎛ 멤브레인으로 여과하는 단계; 및 (E) 여과액을 감압농축 후 건조하는 단계를 포함하는 클로렐라 불가리스 추출물의 제조방법이 제공된다.
상기 (A)단계에서의 발효는 흑국균(Aspergillus niger)을 접종하고 35~40℃조건에서 3~5일간 발효시키는 것으로 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.
상기 (B)단계에서, 추출용매는 바람직하게는 물인 것을 특징으로 한다.
상기 (C)단계에서, 효소반응은 브로멜라인을 첨가 후, 40~60℃조건에서 1~2일간 반응시키는 것으로 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 상기 제조방법에 의하여 제조된 클로렐라 불가리스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.
상기 화장료 조성물은 피부 보습용 및 피부장벽 강화용인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추출방법에 의하면, 세포벽이 존재하여 그 내부에 함유된 단백질이나 아미노산을 추출하기 어려웠던 클로렐라 불가리스로부터 비필수아미노산 뿐 아니라 식물 소재에 부족할 수 있는 필수 아미노산을 효과적으로 추출할 수 있으므로, 아미노산 함량이 증가된 클로렐라 불가리스 추출물을 얻을 수 있으며, 이는 피부 보습 및 피부 장벽강화용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 발효 균주에 따른 발효추출물의 TLC 분석결과를 나타낸다.
도 2는 발효 균주에 따른 발효추출물의 피부 보습 및 장벽인자의 발현 증가효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 클로렐라 불가리스 추출물의 TLC 분석결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 피부 보습 및 장벽인자의 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 클로렐라 불가리스 추출물의 HPLC를 통한 아미노산 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 발효 균주에 따른 발효추출물의 피부 보습 및 장벽인자의 발현 증가효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 클로렐라 불가리스 추출물의 TLC 분석결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 피부 보습 및 장벽인자의 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 클로렐라 불가리스 추출물의 HPLC를 통한 아미노산 분석결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 추출물의 제조에 있어서, 흑국균 등을 사용하여 1차 발효시켜 추출하는 공정과, 상기 공정 중 누룩균 등의 발효균주에 의해 생성된 효소와 식물유래 단백질 분해효소를 사용하여 아미노산 함량을 증대시키는 추가 추출 공정으로 이루어지는 2 단계의 전환(2 step active conversion)공정을 통하여 피부 흡수가 용이하고, 피부 보습 및 피부 장벽강화에 도움을 주는 식물성 아미노산을 풍부하게 함유하는 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 기술적 특징으로 한다.
클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)는 녹조식물 클로렐라과에 속하는 담수조류이다. 클로렐라에는 단백질, 각종 비타민, 미네랄, 식이섬유, 엽록소가 고루 포함되어 있어 신체의 신진대사를 원활하게 하고 면역력을 증진시키며 체액의 산성화를 방지하여 건강 증진에 도움이 된다. 특히, 클로렐라의 약 60%를 차지하는 단백질은 달걀의 약 5배가 포함되어 있으며, 필수아미노산은 쇠고기의 2 ~ 4배, 칼슘, 아연, 무기질은 우유의 약 4배가 포함되어 있다. 또한 포화지방산, 단순불포화지방산, 다중불포화지방산과 같은 지방산이 30종 이상 함유되어 있으며, 포화지방산 중 카프릭산(Capric acid)과 라우르산(Lauric acid)은 체내에서 변형되어 면역력을 높이는데 사용되고 있다.
클로렐라는 다량의 단백질, 아미노산 등을 포함하고 있어 피부 건강에 도움을 주는 소재이다. 그런데 클로렐라에는 세포벽이 존재하여 그 내부의 단백질을 세포벽 밖으로 꺼내어 단백질 자체를 추출하거나 아미노산으로 분해하여 추출하는데 어려움이 있어서 화장료로의 이용이 용이하지는 않았다.
본 발명에 따르면 (A) 클로렐라 불가리스를 멸균하고, 누룩균, 유산균 및 고초균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 접종하여 발효시키는 단계; (B) 추출용매를 가하여 추출하는 단계; (C) 상기 추출물에 식물유래 단백질 분해효소를 첨가하여 효소반응시키는 단계; (D) 에탄올 첨가 후 균체를 활성탄 필터로 여과하고, 0.22 ~ 0.45㎛ 멤브레인으로 여과하는 단계; 및 (E) 여과액을 감압농축 후 건조하는 단계를 포함하는 클로렐라 불가리스 추출물의 제조방법이 제공된다.
먼저, 멸균된 클로렐라 불가리스에 발효 균주를 접종하고 배양시킨다. 상기 발효 균주로써 누룩균, 유산균, 고초균 등을 사용할 수 있다. 상기 발효 균주로써 바람직하게는 누룩균, 더욱 바람직하게는 흑국균(Aspergillus niger)을 사용한다. 얻어지는 추출물의 수율이나 아미노산의 함량에 있어서 흑국균이 가장 뛰어남을 확인하였다(시험예 1). 고체발효 특성상 호기성 진균류인 흑국균을 사용하는 것이 유리하며 흑국균은 클로렐라의 세포벽을 구성하는 펙틴을 분해하는 펙티네이즈를 생산하는 균주로 클로렐라의 세포벽을 파괴하여 다음 공정인 단백질 분해효소 공정에서 클로렐라에 포함되어 있는 단백질과 효소가 더 원활하게 접촉, 반응하여 아미노산을 더 많이 생산할 수 있게 도움을 준다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 멸균된 클로렐라 불가리스에 수분을 25~100%(w/v) 첨가 후, 흑국균을 접종하고 30~40℃조건에서 3~5일간 고체배양하여 클로렐라 불가리스를 발효시킨다.
이어서, 상기 클로렐라 불가리스 발효물에 추출용매를 가하여 추출한다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 추출용매로써 물을 5~10배 부피에 해당하는 양을 가하여 1~2일간 40~60℃ 조건에서 추출하여 1차 추출물을 제조한다. 추출용매로서 에탄올이 포함되었을 경우, 발효에 의해 생성된 효소를 파괴 또는 비활성화 시킬 수 있어서 바람직하지 않다.
이어서, 상기 추출물에 식물유래 단백질 분해효소를 첨가하여 효소반응시킨다. 바람직하게는 상기 식물유래 단백질 분해효소로서 브로멜라인(Bromelain)을 사용한다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 브로멜라인(bromelain) 효소를 첨가 후, 40~60℃조건에서 1~2일간 반응시켜 단백질을 아미노산으로 분해시킨다.
이어서, 에탄올 첨가 후 균체를 활성탄 필터로 여과하고, 0.22㎛ ~ 0.45㎛ 멤브레인으로 여과한다. 에탄올을 30%정도 첨가하면 공정 중, 특히 여과 중 발생하는 오염을 방지하고 여과 속도를 높일 수 있으므로 바람직하다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 아미노산 함량이 증가된 클로렐라 불가리스 추출물을 제조한다.
상기 방법에 의하여 제조된 클로렐라 불가리스 추출물은 발효공정을 거치지 않은 추출물, 단백질 분해효소를 가하여 반응시키는 추가 공정을 거치지 않은 추출물, 발효 및 추가 효소반응 공정을 거치지 않은 추출물에 비하여 악취를 내는 암모니아가 감소되면서도 다양한 필수, 비필수 아미노산이 더 많이 생성, 추출됨을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 방법에 의하여 제조된 클로렐라 불가리스 추출물은 피부 보습인자(AQP3)와 피부장벽 강화 인자(Filaggrin)의 발현을 증대시키는 효과가 우수하였다.
상기 클로렐라 불가리스 추출물은 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~20중량% 함유된다. 상기 화장료 조성물은 피부 보습용 및 피부장벽 강화용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조 될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 클로렐라 불가리스 유산균 발효 추출물의 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 멸균 클로렐라 불가리스에 수분 75%(w/v)첨가 후, 유산균(5×106 ~ 9.9×107 cfu/ml)을 0.5 ml 접종하고 37℃ 조건에서 5일간 배양하였다. 멸균 후 30% EtOH 500ml를 첨가하여 상온에서 하루 동안 추출하였다. 균체를 활성탄 필터로 여과한 후 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 유산균 발효추출분말을 회수하였다.
제조예 2: 클로렐라 불가리스 고초균 발효 추출물의 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 멸균 클로렐라 불가리스에 수분 75%(w/v)첨가 후, 고초균(5×106 ~ 9.9×107 cfu/ml)을 0.5 ml 접종하고 37℃ 조건에서 5일간 배양하였다. 멸균 후 30% EtOH 500ml를 첨가하여 상온에서 하루 동안 추출하였다. 균체를 활성탄필터로 여과한 후 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 고초균 발효추출분말을 회수하였다.
제조예 3: 클로렐라 불가리스 흑국균 발효 추출물의 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 멸균 클로렐라 불가리스에 수분 75%(w/v)첨가 후, 흑국균(5×106 ~ 9.9×107 cfu/ml)을 0.5 ml 접종하고 37℃ 조건에서 5일간 배양하였다. 멸균 후 30% EtOH 500ml를 첨가하여 상온에서 하루 동안 추출하였다. 균체를 활성탄필터로 여과한 후 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 흑국균 발효추출분말을 회수하였다.
비교예 1: 클로렐라 불가리스 추출물의 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 30% EtOH 500ml를 첨가하여 상온에서 하루 간 추출하였다. 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 추출분말을 회수하였다.
시험예 1: 추출 효율 확인
수율 확인
상기 제조예 및 비교예에서 얻어진 건조물의 수율을 평가하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
| 비교예 1 | 제조예 1 | 제조예 2 | 제조예 3 | |
| 수율 | 9% | 5.3% | 9.0% | 15% |
상기 표 1에서 확인되는 바와 같이 흑국균으로 배양한 후 추출(제조예 3)하는 경우에 가장 높은 수율을 나타내었다.
TLC 분석
상기 제조예의 발효추출물에 대한 TLC 분석을 하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인되는 바와 같이, TLC 분석결과 흑국균으로 배양한 후 추출하여 얻어진 발효추출물에서 가장 많은 아미노산이 검출되었다.
시험예 2: 피부 보습 및 장벽인자 발현 증가 확인
상기 제조예의 발효추출물의 피부 보습 및 장벽강화 활성을 평가하기 위하여 보습인자(AQP3)와 장벽인자(Filaggrin)의 발현을 증가시키는지 확인하였다.
HaCaT 세포를 60mm tissue culture dish에 2×105cell/well의 농도로 seeding한 후, 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지제거 후 DPBS로 세척한 뒤, 시험물질을 각각 250, 500 및 1,000μg/mL 농도별로 처리한 배지로 24시간 배양한 후, 다시 배지를 제거하고 DPBS로 세척해주었다. RNeasy Mini Kit를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 AccuPower RT PreMix를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 1μL cDNA, 1μL AQP3 primer 또는 1μL Filaggrin primer, 10μL SYBR Green PCR supermix와 혼합하여 Real-Time PCR 기기에 넣고 35~40 cycle을 실시간으로 확인하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인되는 바와 같이 흑국균과 고초균은 피부보습 및 장벽인자 발현증가 효능면에서는 비슷한 효과를 보였다.
다만, 추출효율 및 다음공정인 효소 공정에 유리하므로 발효균주로는 흑국균을 사용하는 것이 가장 바람직한 것으로 확인되었다.
실시예 1: 클로렐라 불가리스 발효 후 효소처리 추출물 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 멸균 클로렐라 불가리스에 수분 75%(w/v) 첨가 후, 흑국균(5×106 ~ 9.9×107 cfu/ml)을 0.5 ml 접종하여, 37℃ 조건에서 5일간 배양하였다. 물 350 ml를 첨가하여 50℃에서 하루 동안 추출하여 추출물을 제조하였다.
추출물에 브로멜라인을 0.5g첨가 후 50℃에서 하루 동안 반응시켰다. EtOH 150 ml를 첨가하고, 균체를 활성탄필터로 여과한 후 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 추출물을 제조하였다.
실시예 2: 클로렐라 불가리스 발효 후 효소처리 추출물 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 멸균 클로렐라 불가리스에 수분 75%(w/v) 첨가 후, 흑국균(5×106 ~ 9.9×107 cfu/ml)을 0.5 ml 접종하여, 37℃ 조건에서 5일간 배양하였다. 멸균 후, 물 350 ml를 첨가하여 50℃에서 하루 동안 추출하여 추출물을 제조하였다.
추출물에 브로멜라인을 0.5g 첨가 후 50℃에서 하루 동안 반응시켰다. EtOH 150 ml를 첨가하고, 균체를 활성탄필터로 여과한 후 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 추출물을 제조하였다.
실시예 3: 클로렐라 불가리스 발효 후 효소처리 추출물 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 멸균 클로렐라 불가리스에 수분 75%(w/v) 첨가 후, 흑국균(5×106 ~ 9.9×107 cfu/ml)을 0.5 ml 접종하여, 37℃ 조건에서 5일간 배양하였다. 추출용매로서 30% EtOH를 500 ml를 첨가하여 50℃에서 하루 동안 추출하여 추출물을 제조하였다.
추출물에 브로멜라인을 0.5g첨가 후 50℃에서 하루 동안 반응시켰다. 균체를 활성탄필터로 여과한 후 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 추출물을 제조하였다.
비교예 2: 클로렐라 불가리스 발효추출물 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 멸균 클로렐라 불가리스에 수분 75%(w/v) 첨가 후, 흑국균(5×106 ~ 9.9×107 cfu/ml)을 0.5 ml 접종하여, 37℃ 조건에서 5일간 배양하였다. 멸균 후, 추출용매로서 30% EtOH를 500 ml를 첨가하여 50℃에서 하루 동안 추출하여 추출물을 제조하였다. 균체를 활성탄필터로 여과한 후 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 추출물을 제조하였다.
비교예 3: 클로렐라 불가리스 발효추출물 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 멸균 클로렐라 불가리스에 수분 75%(w/v) 첨가 후, 흑국균(5×106 ~ 9.9×107 cfu/ml)을 0.5 ml 접종하여, 37℃ 조건에서 5일간 배양하였다. 추출용매로서 물 350 ml를 첨가하여 50℃에서 하루 동안 추출하여 추출물을 제조하였다. EtOH 150 ml 첨가후, 균체를 활성탄필터로 여과한 후 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 추출물을 제조하였다.
비교예 4: 클로렐라 불가리스 효소처리 추출물 제조
클로렐라 불가리스 50g을 121℃에서 20분간 멸균하였다. 추출용매로서 30% EtOH를 500 ml를 첨가하여 50℃에서 하루 동안 추출하여 추출물을 제조하였다.
추출물에 브로멜라인을 0.5g첨가 후 50℃에서 하루 동안 반응시켰다. 활성탄필터로 여과한 후 0.22~0.45㎛ 멤브레인으로 여과하였다. 여과액을 감압농축 후 건조하여 클로렐라 불가리스 추출물을 제조하였다.
시험예 3: 추출 효율 확인
수율 확인
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 건조물의 수율을 평가하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
| 실시예 | 비교예 | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 수율 | 39.68% | 23.44% | 16.00% | 9% | 13.08% | 20.18% | 14.98% |
TLC 분석
Ninhydrin 반응을 이용한 아미노산 TLC 분석을 하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
상기 표 2 및 도 3에서 확인되는 바와 같이, 발효 및 효소처리 공정을 거치지 않은 비교예 1의 추출물과 비교하였을 때, 발효공정 만을 거친 경우(비교예 2, 3) 또는 효소처리공정만을 거친 경우(비교예 4), 또는 두 공정을 모두 수행한 경우(실시예)에 아미노산 함량이 증가하였다.
발효공정 만을 수행하여 추출된 비교예 3과, 발효공정 후에 브로멜라인 효소처리 공정을 거쳐 추출된 실시예 1과 비교해 볼 때, 브로멜라인 효소 처리한 시료에서 약 2배의 추출효율을 나타내므로 브로멜라인 효소의 처리가 아미노산의 함량을 높이는데 큰 역할을 하였다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2의 추출물 시료는 실시예 1의 추출물 시료와 달리 발효가 끝난 후에 흑국균을 사멸시키기 위하여 121℃에서 20분간 멸균한 것이다. 표 2 및 도 3에서 확인되는 바와 같이 실시예 1의 추출물 시료가 수율과 TLC 결과면에서 모두 우수 하였다. 이는 흑국균 배양을 통하여 흑국균에서 생산된 효소가 멸균과정에서 같이 파괴된 것이 원인으로 보여 지며, 흑국균에 의해 생성된 효소를 파괴하지 않는 것이 공정에 더 유리하다는 것을 보여주는 결과이다.
실시예 3의 추출물 시료는 흑국균 발효 후 멸균 및 효소를 파괴시키지 않은 상태에서 30% EtOH를 첨가하여 50℃에서 추출물을 제조한 후, 효소 반응시켜 제조된 것이다. 그런데 흑국균 발효 후 물로만 추출하여 추출물을 제조한 후, 효소 반응시키고, 반응이 모두 끝나면 EtOH를 첨가해 30%로 만들어 준 실시예 1의 추출물 시료와 비교하였을 때, 수율 및 TLC 결과가 우수하지 못하였다. 이는 흑국균 발효에 의해 생성된 효소와 첨가된 브로멜라인이 30% EtOH에 의해 파괴 또는 비활성화 되어 발생한 결과로 흑국균 발효 후 추출과 효소 반응 완료 전에 EtOH가 포함되면 추출 효율을 저하시킨다는 것을 보여준다. 한편, 이는 효소반응 완료 후에 발효에 의해 생성된 효소와 브로멜라인의 반응을 임의적으로 비활성화 시킬 때 실시예 1에서와 같이 에탄올을 30%정도 첨가해 주는 것이 추출 효율을 높이는데 도움이 된다는 것을 나타내는 결과이다. EtOH를 30%정도 첨가함으로써 추출 공정 중, 특히 여과 중 발생하는 오염문제와 여과 속도에 좋은 영향을 준다.
시험예 4: 피부 보습 및 장벽인자 발현 증가 확인
상기 실시예 및 비교예의 추출물의 피부 보습 및 장벽강화 활성을 평가하기 위하여 보습인자(AQP3)와 장벽인자(Filaggrin)의 발현을 증가시키는지 확인하였다.
HaCaT 세포를 60mm tissue culture dish에 2×105cell/well의 농도로 seeding한 후, 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지제거 후 DPBS로 세척한 뒤, 시험물질을 각각 250, 500 및 1,000μg/mL 농도별로 처리한 배지로 24시간 배양한 후, 다시 배지를 제거하고 DPBS로 세척해주었다. RNeasy Mini Kit를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 AccuPower RT PreMix를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 1μL cDNA, 1μL AQP3 primer 또는 1μL Filaggrin primer, 10μL SYBR Green PCR supermix와 혼합하여 Real-Time PCR 기기에 넣고 35~40 cycle을 실시간으로 확인하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인되는 바와 같이 흑국균 발효 후, 브로멜라인 효소 처리하여 제조된 실시예의 시료에서 더욱 우수한 보습인자(AQP3)와 장벽인자(Filaggrin)의 발현 증가 효과를 나타내었다. 그 중에서도 발효 후 멸균과정을 거치지 않은 실시예 1의 시료에서 특히 우수한 발현 증가 효과를 나타내었다.
시험예 5: HPLC를 통한 아미노산 분석
가장 우수한 효율을 나타내는 실시예 1의 클로렐라 불가리스 추출물의 아미노산을 HPLC로 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인되는 바와 같이, 발효 및 효소처리 공정을 거치지 않은 추출물(비교예 1)과 비교해 볼 때, 악취를 내는 암모니아는 감소하지만 클로렐라 불가리스에 풍부하게 포함되어 있는 단백질을 분해하여 아미노산(필수, 비필수 아미노산)이 더 많이 생성, 추출됨을 확인할 수 있었다.
이는 본 발명의 추출공정이 분자량이 커서 추출하기 어렵고 피부에 흡수되기 어려운 단백질을 피부 보습과 장벽강화에 도움이 되며 분자량이 작아 피부 각질에 침투하는데 유리한 아미노산으로 효과적으로 분해함으로써 아미노산 함량이 증가된 클로렐라 불가리스 추출물을 얻을 수 있는 우수한 공정임을 확인할 수 있는 결과이다.
실시예 4: 클로렐라 불가리스 추출물을 함유하는 크림의 제조
클로렐라 불가리스 추출물(실시예 1)을 함유하는 크림을 하기 표 3의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 원료 | 함량(중량%) |
| 클로렐라 불가리스 추출물(실시예 1) | 2.0 |
| 시어버터 | 2.0 |
| 폴리솔베이트 60 | 1.5 |
| 솔비탄 세스퀴올레이트 | 0.8 |
| 미네랄 오일 | 10.0 |
| 디메치콘 | 3.0 |
| 소르비탄 스테아레이트 | 0.5 |
| 친유형 모노스테아린산 글리세린 | 1.0 |
| 세테아릴알코올 | 2.0 |
| 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트 | 1.0 |
| 프로필렌글리콜 | 3.0 |
| 카르복시폴리머 | 0.25 |
| 트리에탄올아민 | 0.25 |
| 페녹시에탄올 | 적량 |
| 정제수 | To 100 |
Claims (7)
- (A) 클로렐라 불가리스를 멸균하고, 흑국균(Aspergillus niger)을 접종하고 30~40℃조건에서 3~5일간 발효시키는 단계;
(B) 추출용매 물을 가하여 1~2일간 40~60℃ 조건에서 추출하는 단계;
(C) 상기 추출물에 식물유래 단백질 분해효소인 브로멜라인을 첨가 후, 40~60℃조건에서 1~2일간 반응시키는 단계;
(D) 에탄올 첨가 후 균체를 활성탄 필터로 여과하고, 0.22 ~ 0.45㎛ 멤브레인으로 여과하는 단계; 및
(E) 여과액을 감압농축 후 건조하는 단계를 포함하는 클로렐라 불가리스 추출물의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 제조방법에 의하여 제조된 클로렐라 불가리스 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 장벽강화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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