KR101539820B1

KR101539820B1 - 혈전성 질환 예방 식품

Info

Publication number: KR101539820B1
Application number: KR1020120003850A
Authority: KR
Inventors: 오사무 마츠오; 기요타카 오카다; 유키노리 다무라; 겐지 고토
Original assignee: 오사무 마츠오; 가부시키가이샤 엔자민겡큐쇼
Priority date: 2011-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2015-07-27
Also published as: JP5722052B2; JP2012143187A; KR20120081954A; CN102578584A; TW201233339A; TWI590766B

Abstract

(과제) 간편하고 일상적으로 섭취함으로써 혈전성 질환의 발증을 유효하게 예방할 수 있는 식품을 제공하는 것.
(해결 방법) 옥수수 전분을 포함하는 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 야채즙 및 질소원으로서 이스트를 첨가하여 발효용 배지를 조정하고, 이 배지에 낫토균인 바실러스·서브틸러스 AK (수탁 번호 : FERM BP-11451 (FERM P-18291)) 및 유산균을 포함하는 발효균을 접종하여 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 분취한 성분을 유효 성분으로서 함유하는 혈전성 질환 예방 식품.

Description

혈전성 질환 예방 식품{A FOOD FOR PREVENTING THROMBOTIC DISEASES}

본 발명은 건강 보조 식품 등으로서 간편하게 섭취 가능한 혈전성 질환 예방 식품, 보다 상세하게는 특정 미생물에 의한 발효물을 유효 성분으로서 함유하는 혈전성 질환 예방 식품에 관한 것이다.

후생노동성 발표의 상병 (傷病) 분류별 진료 의료비를 보면, 고혈압성 질환, 허혈성 질환 및 뇌혈관 질환으로 이루어지는 순환기계 질환의 진료 의료비가 제일 많아, 진료 의료비 전체의 21.2 ％ 를 차지하고 있다. 그리고, 이들 질환은 모두 혈관에 있어서의 혈전의 비정상적인 형성이 관여하고 있다.

혈액에는 응고계와 선용계의 2 가지 작용이 있다. 혈관벽이 손상되면 혈소판이 응집되어 1 차 지혈이 일어나고, 그 후 응고계 인자인 트롬빈은 혈중 피브리노겐에 작용함으로써 피브린이 형성되어 지혈이 완료된다. 한편, 이와 같이 혈관 내에서 형성된 피브린을, 혈관 내피 세포로부터 분비되는 선용계 인자인 조직 플라스미노겐 액티베이터 (tPA) 가 혈중에 존재하는 효소원인 플라스미노겐을 플라스민으로 변환하고, 그 플라스민이 피브린을 분해한다. 응고계와 선용계의 밸런스의 파탄은 뇌경색이나 심근경색 등의 혈전성 질환의 원인이 되는 것이 알려져 있어, 새로운 선용계 항진 물질의 개발은 이들 질환의 예방·치료에 크게 공헌할 수 있을 것으로 생각된다.

본 발명자들은 낫토균류를 배양함으로써 산출되는 효소나 미량 성분을 안정적인 상태로까지 가역적으로 저분자화한 물질에 관한 제법의 특허권 (특허문헌 1) 을 취득하였다.

일본 특허 제3902015호

본 발명의 목적은 tPA 활성을 항진시킴과 함께 혈관 내피 세포로부터의 tPA 의 방출을 야기시킴으로써 혈전성 질환을 예방하는 기능성 식품을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 이러한 과제하에 낫토균류가 생성하는 효소나 미량 성분을 안정적인 상태까지 가역적으로 저분자화한 저분자 펩티드 성분을 혈관 내피 배양 세포에 첨가한 결과, 배양액 중의 tPA 활성이 항진되고, 또 마우스에 경구 섭취시킨 결과, 혈중의 tPA 활성이 항진되는 것을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은,

[1] 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 낫토균인 바실러스·서브틸러스 AK (수탁 번호 : FERM BP-11451 (FERM P-18291)) 를 접종하여 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 분취한 성분을 유효 성분으로서 함유하는 혈전성 질환 예방 식품 ;

[2] 발효가 pH 4.5 ∼ 6.5, 28 ∼ 32 ℃ 의 조건에서 2 개월 이상 실시하는 발효인 상기 [1] 에 기재된 혈전성 질환 예방 식품 ;

[3] 숙성이 pH 4.0 ∼ 6.0, 13 ∼ 17 ℃ 의 조건에서 4 개월 이상 실시하는 숙성인 상기 [1] 또는 [2] 에 기재된 혈전성 질환 예방 식품 ;

[4] 혈전성 질환이 심부정맥 혈전증, 문맥 혈전증, 신정맥 혈전증, 경정맥 혈전증, 버드·키아리 증후군, 액와-쇄골하정맥 혈전증, 뇌정맥동 혈전증 및 폐혈전 색전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그것을 초과하는 정맥 혈전증, 또는 뇌경색, 심근경색, 장간막동맥 혈전증, 하지 급성 동맥 혈전증, 간동맥 혈전증, 신동맥 혈전증, 비동맥 혈전증 및 폐색 동맥 경화증으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그것을 초과하는 동맥 혈전증인 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 혈전성 질환 예방 식품 ; 및

[5] 유효 성분을 식품 전체의 중량에 대해 0.05 ∼ 100 중량％ 함유하는 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 혈전성 질환 예방 식품을 제공한다.

본 발명에 의하면, 일상 생활에 있어서 간편하게 경구 섭취가 가능한 혈전성 질환 예방 식품을 제공할 수 있다.

도 1 은 본 발명의 유효 성분의 분자량 분포를 나타내는 그래프이다.
도 2 는 플라스민 특이적 절단 부위를 갖는 합성 기질 S-2251 을 사용하여 측정한, 본 발명의 유효 성분에 의한 tPA 활성의 항진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3 은 피브린 평판을 사용하여 측정한, 본 발명의 유효 성분에 의한 tPA 활성의 항진 효과를 나타내는 사진 (A) 및 그래프 (B) 이다.
도 4 는 마우스 뇌혈관 내피 유래 세포 bEnd.3 을 사용하여 측정한, 배양액 중의 tPA 활성을 나타내는 사진 (A) 및 세포 내 tPA 의 유전자 발현량을 나타내는 그래프 (B) 이다.
도 5 는 생체 분자간 상호 작용 해석 장치 (IASYS) 를 사용하여 측정한, tPA 에 대한 본 발명의 유효 성분의 결합성을 나타내는 그래프이다.
도 6 은 본 발명의 유효 성분을 마우스에 섭취시키고, 그 2 시간 후에 채혈한 혈중의 tPA 활성을 나타낸 사진과 그래프이다.
도 7 은 본 발명의 유효 성분을 마우스에 섭취시킨 경우의 마우스 혈중에 있어서의 tPA 활성의 항진 효과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 8 은 유산균 발효 엑기스를 마우스에 섭취시키고, 그 2 시간 후에 채혈한 혈중의 tPA 및 uPA 활성의 항진 효과를 나타낸 사진이다.
도 9 는 낫토균 발효 엑기스를 마우스에 섭취시키고, 그 2 시간 후에 채혈한 혈중의 tPA 및 uPA 활성의 항진 효과를 나타낸 사진이다.

본 발명의 식품에 유효 성분으로서 함유되는 것은, 옥수수 전분을 포함하는 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 질소원으로서 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 낫토균인 바실러스·서브틸러스 AK (수탁 번호 : FERM BP-11451 (FERM P-18291)) 를 접종하여 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 분취한 성분이다.

여기에, 발효용 배지의 기재로서 사용하는 당화물은, 옥수수 자실 (子實) 로부터 분리, 정제한 옥수수 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 것을 사용할 수 있는데, 정제한 것 대신에 미정제 옥수수 전분을 사용할 수도 있다. 또, 옥수수 전분 외에, 대두 분말이나 쌀겨 또는 이들의 혼합물을 가수 분해한 것을 배지용 기재로서 사용할 수 있다.

발효용 배지의 질소원으로서 사용하는 효모 엑기스는 맥주 효모 (Saccharomyces cerevisiae Meyen) 의 균체를 소화시켜 추출한 수용성 성분을 건조시킨 것 등, 일반적으로 세균 배양에 질소원으로서 첨가하는 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 식품의 유효 성분 제조에 사용하는 발효용 배지에는, 상기한 당화물 및 효모 엑기스 이외에, 필요에 따라 단백질 등의 유기물이나 무기염류 등을 배합할 수 있다. 유기물로는 대두 단백질이나 그 밖의 식물성 단백질을 들 수 있고, 무기염류로는 염화칼슘, 염화나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다.

또, 배지용 기재로서의 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물에 대해, 추가로 당분을 첨가하는 것도 바람직하며, 이들 당분에는, 예를 들어 자당 (그라뉴당), 글루코오스 (포도당), 물엿 등을 들 수 있다.

상기 서술한 바와 같이 조제한 발효용 배지에 접종하는 발효균은 낫토균인 바실러스·서브틸러스 (Bacillus subtilis) AK 이며, 바실러스·서브틸러스 AK 는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소에 「(수탁 번호) FERM BP-11451 (FERM P-18291)」로서 기탁되어 있다. 또, 원하는 바에 따라, 바실러스·서브틸러스 AK 의 증식을 저해하지 않는 유산간균인 락토바실러스 (Lactobacillus) 나 유산구균인 스트렙토코커스 (Streptococcus), 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 나 국균 (Aspergillus oryzae) 의 균체, 균 추출물 또는 균발효 엑기스를 바실러스·서브틸러스 AK 에 첨가하여 접종할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품의 유효 성분 제조에 사용하는 발효용 배지에는, 원하는 바에 따라 바실러스·서브틸러스 AK 의 증식을 저해하지 않는 배추, 양배추, 당근, 인삼, 파슬리, 샐러리, 양파 등의 식물 추출물을 첨가할 수 있다.

바실러스·서브틸러스 AK 는 통상적인 낫토균인 바실러스·서브틸러스를 자외선, X 선 조사, 고·저온 환경 (100 ℃, 0 ℃), 유산균과의 경합, 아포를 만들기 쉬운 배지 [고기 엑기스 5.0 중량％, 펩톤 10.0 중량％, 염화나트륨 5.0 중량％, 한천 15.0 중량％, 야채 (양배추, 당근, 샐러리, 파슬리) 압착즙 65.0 중량％] 등의 여러 조건에 적용시켜 발견한 내성균을 계대 배양을 반복 선발하여 얻은 것이다.

이와 같이 하여 얻어진 바실러스·서브틸러스 AK 균주는 이하와 같은 균학적 성질을 갖는다.

(a) 형태학적 성질

1 세포의 모양 및 크기

간균 1.0 ∼ 1.2 × 3.0 ∼ 50 ㎛

2 세포의 다형성의 유무

없음

3 운동성의 유무

있음 (주모성의 편모)

4 아포의 유무

있음 타원 균체의 대략 중앙

(b) 배양적 성질

1 육즙 한천 평판 배양

원형 집락 백탁

2 육즙 액체 배양

상부 또는 하부 균응체 (菌凝體)

(c) 생화학적 성질

1 그램 염색 양성

2 질산염의 환원 양성

3 MR테스트 음성

4 VP 테스트 양성

5 인돌의 생성 음성

6 황화수소의 생성 음성

7 시트르산의 이용 양성

8 카탈라아제 양성

9 생육의 범위 pH 5.5∼7.0, 온도 25 ℃ ∼ 40 ℃

바실러스·서브틸러스 AK 균주는, 원하는 바에 따라 유산균을 포함하는 다른 발효균과 함께, 상기한 발효용 배지 상, 약 4.5 ∼ 6.5 의 pH, 약 28 ∼ 32 ℃ 의 조건에서 2 개월 이상 발효시킨다. 이들 영역보다 낮은 pH 영역이나 온도영역에서는, 2 개월 이상 발효시켜도 이 발명에 사용하는 소정의 낫토균이 효율적으로 당 및 질소원을 자화하지 않는 것으로 추정되어, 얻어지는 tPA 방출 항진 물질에 소기 한 효과가 충분히 얻어지지 않는다. 한편, 상기 영역보다 높은 pH 영역이나 온도영역에서는, 발효 불충분에 의해 소정의 낫토균이 효율적으로 당 및 질소원을 자화하지 않아, 얻어지는 tPA 방출 항진 물질에 소기한 효과가 충분히 얻어지지 않는다.

발효에 이어서, 균류는 동 배지 상, 약 4.0 ∼ 6.0 의 pH, 약 13 ∼ 17 ℃ 의 조건에서 4 개월 이상 숙성시킨다. 이들 영역보다 낮은 pH 영역이나 온도영역에서는, 4 개월 이상 숙성시켜도 발효 생산물로서 각종 활성을 갖는 아미노산, 리포 단백, 리포 다당 (리포폴리사카라이드), 리피드 등이 충분히 저분자량화되지 않는 것으로 추정되어, 얻어지는 tPA 방출 항진 물질에 소기한 효과가 충분히 얻어지지 않는다. 한편, 상기 영역보다 높은 pH 영역이나 온도영역에서는 활성이 저하되는 것으로 추정되어, 얻어지는 tPA 방출 항진 물질에 상기와 마찬가지로 소기한 효과가 충분히 얻어지지 않는다.

발효 및 숙성 단계를 거쳐 생성된 액상 성분을 분취하려면, 여과 또는 원심분리 등 주지의 분리 수단을 채용할 수 있고, 분취한 식품용 원액은 그대로 또는 농축 혹은 희석시켜 본 발명의 혈전성 질환 예방 식품의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 혈전성 질환 예방 식품의 유효 성분으로는, 예를 들어, 주식회사 엔자민 연구소에 의해 제조된 엔자민 원액 (ENM) 이나 그 20 배 농축 엑기스인 엔자민 농축액 (ENM-HL) 을 배합할 수 있다.

덧붙여서, 이와 같이 하여 얻어지는 유효 성분의 구성 성분으로는, 생체 내 효소 합성을 용이하게 하기 위한 물질, 즉 발효에 의해 얻어지는 효소를 가역적으로 절단하여 활성 아미노산 잔기로 한 프래그먼트를 함유하고, 그 외에 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실과 같은 생체 내에서 활용할 수 있는 유용 물질을 함유한다. 이와 같은 유용 물질은, 베스레드카 (Besredka) 가 제창한 안티 바이러스의 조직 활성 인자, 필라토프 (Filatov) 가 설명하는 생명원 자극소를 함유하고, 이들을 생물 화학적 반응에 의해 조합하여, 안전하고 유효하게 작용하도록 처리한 배양 여과액인 것으로 생각된다.

이와 같은 유효 성분을 함유하는 본 발명의 혈전성 질환 예방 식품은, 혈액에 의한 선용 작용이라는 생명 현상을 자극하여, 응고계와 선용계의 밸런스를 적정하게 조절함으로써 혈전성 질환의 발증을 예방한다.

본 발명의 혈전성 질환 예방 식품에 의해 예방할 수 있는 혈전성 질환은 혈전에서 기인하여 발생하는 질환이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 심부정맥 혈전증, 문맥 혈전증, 신정맥 혈전증, 경정맥 혈전증, 버드·키아리 증후군, 액와-쇄골하정맥 혈전증, 뇌정맥동 혈전증 및 폐혈전 색전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 정맥 혈전증, 또는 뇌경색, 심근경색, 장간막동맥 혈전증, 하지 급성 동맥 혈전증, 간동맥 혈전증, 신동맥 혈전증, 비동맥 혈전증 및 폐색 동맥 경화증으로 이루어지는 군에서 선택되는 동맥 혈전증 등을 들 수 있다.

본 발명의 혈전성 질환 예방 식품은 상기와 같이 하여 조제한 유효 성분과 식품 분야에서 관용적으로 사용되고 있는 부형제 (예를 들어, 전분 혹은 덱스트린, 셀룰로오스, 유당, 맥아당, 환원 유당, 환원 맥아당, 소르비톨, 만니톨, 에리트리톨, 자일리톨 등) 나 보조제 (예를 들어, 용매, 분산 매질, 피복제, 안정제, 희석제, 보존제, 방부제, 살균제, 항진균 시약 등 삼투압 시약, 흡수 억제 시약, 붕괴제, 유화제, 결합제, 윤활제, 색소 등) 와 혼합하여, 식품 분야에서 관용적으로 사용되고 있는 제제 방법에 의해, 예를 들어 정제, 캡슐, 과립, 분말, 추출액, 용액, 시럽, 현탁액, 유탁액의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 혈전성 질환 예방 식품은, 유효 성분으로서 균에 의해 생성된 액상 성분을 그 자체로 환산하여, 식품 전체의 중량에 대해 약 0.05 ∼ 100 중량％, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 90 중량％, 보다 바람직하게는 약 1 ∼ 85 중량％, 더욱 바람직하게는 약 5 ∼ 80 중량％, 가장 바람직하게는 약 10 ∼ 50 중량％ 함유할 수 있다.

또, 본 발명은, 그 밖의 양태로서 상기한 혈전성 질환 예방 식품을 제조하기 위한 옥수수 전분을 포함하는 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 질소원으로서 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 낫토균인 바실러스·서브틸러스 AK (수탁 번호 : FERM BP-11451 (FERM P-18291)) 를 접종하여 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 분취한 성분의 사용, 혈전성 질환 예방 식품을 제조하기 위한 바실러스·서브틸러스 AK 의 사용, 혈전성 질환 예방 식품을 섭취하는 것을 특징으로 하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료 방법에도 관한 것이다.

이하에, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

옐로우 옥수수 전분 2.3 ㎏, 대두 펩톤 0.5 ㎏, 쌀겨즙 0.5 ㎏, 염화칼슘 80 g, 식염 150 g 에 정제수 50 ㎏ 을 첨가하여, 가열하고 용해시켰다. 이어서 이것을 냉각시키고, 아밀라아제 50 g 을 첨가하여 충분히 당화시켰다. 당화 종료 후, 그라뉴당 1.5 ㎏, 글루코오스 (포도당) 1.5 ㎏, 효모 엑기스 (닛폰 제약 (주)) 450 g, 쌀엿 (米飴) 1.5 ㎏, 인산나트륨 80 g, 야채의 압착즙 (양배추, 당근, 샐러리, 파슬리) 5 ㎏, 및 정제수를 첨가하여 전체량을 150 ㎏ 으로 하였다.

그리고, 수산화나트륨을 첨가하여 pH 를 7.2 ∼ 7.6 의 범위 내로 조정하고, 이것을 배양캔에 넣어 120 ℃ 에서 20 분간 고압 멸균하였다. 이것을 냉각시킨 후, 바실러스·서브틸러스 AK 주를 접종하여, 온도 30±2 ℃ 의 항온실에서 pH 4.5 ∼ 6.5 에서 60 일간 발효시키고, 이어서 온도 15±2 ℃ 의 항온실에서 pH 4.0 ∼ 6.0 의 조건하에서 120 일간 숙성시켰다. 그 상청을 110 ℃ 에서 20 분간 멸균하고, 자연 방랭시켜 배양액을 투명화시켰다. 이것을 페이퍼 필터 여과한 후, 시트르산에 의해 pH 3.5 - 3.7 로 조정하고, 다시 95 ℃ 에서 살균한 후, 90 ℃ 이상의 온도에서 5 갤런 캔에 채웠다. 이와 같이 하여, 125 리터의 액상의 식품용 원액 (ENM) 을 얻었다.

얻어진 식품용 원액 (ENM) 100 g 중의 일반 분석 결과를 이하의 표 1 중에 나타낸다.

또, 상기 식품용 원액에 대해, 토소사 제조 칼럼 (TS㎏el G2500PWXL) 을 사용하여 이동상 (移動相) 을 물, 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산의 55 : 45 : 0.1 혼합액으로 하는 액체 고속 크로마토그램 (Shodex 사 제조 : GPC SYSTEM-21) 으로 사이즈 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 측정하여, 그 때의 검출기 감도 (자외 분광 광도계 : ㎷) 를 분자량이 이미 알려진 표준품의 용출 시간과 비교하여 분석한 분자량 분포를 도 1 에, 또한 이 도면에 있어서의 분자량 획분의 면적이 전체에서 차지하는 비율 (백분율) 을 표 1 에 나타낸다.

다음으로, 얻어진 식품용 원액 (ENM) 에 함유되는 저분자 물질이 열에 의해 변성이나 분해를 발생시키지 않는지를 평가하였다.

121 ℃ 에서 30 분간 가열한 ENM 의 분자량 분포를, TSK gel G2500PWXL 칼럼 (토소 주식회사 제조) 을 사용한 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 아울러, 고온에 노출시키지 않은 동 로트의 ENM (대조 ENM) 의 분자량 분포를 동일하게 하여 측정하였다. 그들 결과를 표 2 에 나타낸다.

분자량 분포 측정 결과, ENM 은 고온 조건에 노출시켜도 저분자 조성의 분자량 분포에 변화가 확인되지 않은 점에서, ENM 은 열에 대해 내성이 있는 것이 판명되었다.

또, 얻어진 식품용 원액 (ENM) 에 함유되는 저분자 물질이 강산 조건에 적용된 경우에, 변성이나 분해를 발생시키지 않는지를 평가하였다.

ENM (pH 3.7) 을 37 ℃ 로 유지하면서 교반하고, 염산을 첨가하여 pH 를 1.2 로 하였다. 15 분 방치 후, 수산화나트륨으로 원래의 pH 3.7 로 되돌린 시료의 분자량 분포를 TSK gel G2500PWXL 칼럼 (토소 주식회사 제조) 을 사용한 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 아울러, 강산에 노출시키지 않은 동 로트의 ENM (대조 ENM) 의 분자량 분포를 동일하게 하여 측정하였다. 그들 결과를 표 3 에 나타낸다.

분자량 분포 측정 결과, ENM 은 강산 조건에 노출시켜도 저분자 조성의 분자량 분포에 거의 변화가 확인되지 않은 점에서, ENM 은 강산에 대해서도 내성이 있어 경구 접종했을 때에도 위산에 대해 내성이 있는 것이 시사되었다.

이상의 결과로부터, ENM 은 고온이나 강산성 조건에 대해 안정적인 원료인 것이 증명되어, 식품 가공이나 경구 섭취한 경우에도 고온이나 산성 조건에 영향을 받지 않아 여러 가지 가공 처리나 이용이 가능하다는 것이 판명되었다.

다음으로, 조제가 완료된 ENM 을 농축 장치에 넣고 40 ℃ 이하의 온도에서 진공도 20 - 60 ㎝Hg 의 1 차 농축을 실시하여 90 ℃ 에서 30 분간으로 멸균하고, 재차, 농축 장치에 넣고 40 ℃ 이하의 온도에서 진공도 20 - 60 ㎝Hg 의 2 차 농축을 실시하여 농축비 20 배로 조정한 ENM-HL 을 얻었다.

합성 기질 S-2251 을 사용한 ENM-HL 의 플라스민 활성에 미치는 효과의 검토

다음으로 본 발명자들은, ENM-HL (주식회사 엔자민 연구소 제조) 의 조직형 플라스미노겐 액티베이터 (tPA) 에 의한 플라스민 활성에 대한 효과를 직접 검토하기 위하여, 플라스민에 의한 특이적 절단 부위를 갖는 합성 기질 S-2251 을 사용하여 검토를 실시하였다. ENM-HL 을 생리 식염수로 단계 희석시켜 (100 ∼ 0.13 용량％) 샘플로서 사용하였다.

이 샘플 10 ㎕ 에, tPA (10 IU/㎖) 90 ㎕ 와, Glu-plasminogen (200 ㎍/㎖) 20 ㎕ 및 S-2251 (1 mM) 100 ㎕ 를 첨가하고 반응시켜, 450 ㎚ 의 흡광도를 2.5 분 간격으로 2 시간 측정하고, 그 증가도 (ΔA 450 ㎚) 를 산출하여 tPA 활성을 평가하였다.

그 결과, ENM-HL 에 의한 tPA 활성의 유의한 항진이 확인되었다 (도 2).

(실시예 2)

피브린 평판을 사용한 ENM-HL 의 tPA 활성에 미치는 효과의 검토

다음으로 본 발명자들은 피브린 평판법을 사용하여 ENM-HL 의 tPA 활성에 대한 효과의 검토를 실시하였다. ENM-HL 을 생리 식염수로 단계 희석시켜 (100 ∼ 0.35 용량％) 샘플로서 사용하였다. 샘플 10 ㎕ 에 tPA (25 IU/㎖) 10 ㎕ 를 첨가한 것을 피브린 플레이트에 첨가하고, 24 시간 반응시켜 tPA 활성을 평가하였다.

그 결과, 피브린 평판법에 있어서도 ENM-HL 에 의한 tPA 활성 항진 효과가 확인되었다 (도 3).

(실시예 3)

혈관 내피 세포에 있어서의 tPA 의 활성 및 생성에 미치는 ENM-HL 효과의 검토

다음으로 본 발명자들은 ENM-HL 이 혈관 내피 세포에 있어서의 tPA 활성 및 tPA 생성능에 미치는 효과의 검토를 실시하였다. 혈관 내피 세포로서, 마우스 뇌혈관 내피 유래 세포 bEnd.3 세포를 사용하였다. 24 웰 플레이트에 bEnd.3 세포를 2 × 10⁵ cell/well 로 파종하고, 컨플루언트에 이르러 2 일 후에 ENM-HL 을 0.001 ∼ 0.1 용량％ 의 농도로 무혈청 배지에 첨가하여, 6 시간, 12 시간, 24 시간 배양하였다. 배양액 중의 tPA 활성을 fibrin zymography 로 평가를 실시하였다.

또, 배양 24 시간 후의 bEnd.3 세포로부터 RNA 를 추출하고 cDNA 를 합성하여, 리얼타임 PCR 법으로 tPA mRNA 의 발현량을 검토하였다. 내인성 컨트롤로서 GAPDH mRNA 발현량을 측정하여 보정을 실시하였다.

ENM-HL 의 첨가에 의해, 배양 상청 중의 tPA 활성은 배양 6 시간 후, 12 시간 후, 24 시간 후에 있어서 항진이 확인되었다 (도 4A). 또, ENM-HL 에 의해 tPA mRNA 발현량의 증가는 확인되지 않은 점에서, 혈관 내피 세포의 tPA 생성에는 영향을 주지 않는 것이 시사되었다 (도 4B).

(실시예 4)

생체 분자간 상호 작용 해석 장치 (IASYS) 를 사용한 ENM-HL 의 tPA 에 대한 결합성의 검토

본 발명자들은, ENM-HL 중에 tPA 에 직접 작용하는 물질이 함유되어 있다고 생각하여, 생체 분자간 상호 작용 해석 장치 (IASYS) 를 사용하여 ENM-HL 의 tPA 에 대한 결합성의 검토를 실시하였다. tPA 를 큐벳에 고상화시키고, ENM-HL (1 ∼ 20 용량％) 을 첨가하여 그 결합성을 평가하였다.

그 결과, ENM-HL 의 농도 의존적으로 tPA 에 대한 강한 결합성이 확인되었다 (도 5). 이러한 점에서 ENM-HL 중에는 tPA 에 강하게 결합하는 물질이 함유되어 있는 것이 시사되었다.

(실시예 5)

마우스의 혈중에 있어서의 ENM-HL 의 tPA 활성에 대한 효과의 검토

다음으로 본 발명자들은, 생체 내에 있어서의 ENM-HL 의 효과를 검토하기 위하여, C57BL6/J 마우스를 사용하여 검토를 실시하였다. 웅성 C57BL6/J 마우스 (12 주령, 체중 25±3 g, 각 군 3 마리) 에 ENM-HL (0.008 ∼ 25 용량％) 0.3 ㎖ 를 경구 투여하여 2 시간 후에 채혈을 실시하고, 혈장을 채취하여 유글로불린 분획을 단리하였다. 그 분획의 tPA 활성을 fibrin zymography 법으로 평가하였다.

그 결과, ENM-HL 1 용량％, 0.1 용량％ 의 농도에 있어서 tPA 활성의 항진이 확인되었다 (도 6).

마우스의 혈중에 있어서의 ENM-HL 의 tPA 활성에 대한 지속 효과의 검토

다음으로, 생체 내에 있어서의 tPA 활성 항진 효과의 지속 효과를 검토하기 위하여, tPA 활성 항진이 확인된 1 ％ 농도의 ENM-HL 을 C57BL6/J 마우스에 경구 투여하여, 1, 2, 3, 4 시간 후에 채혈을 실시하고, 유글로불린 분획을 단리하여 fibrin zymography 법으로 tPA 활성을 평가하였다.

그 결과, tPA 활성의 항진 효과는 2 시간 후를 최고치로 하여, 4 시간 이상 유지되는 것이 확인되었다 (도 7).

이상과 같은 실험 결과로부터, ENM-HL 은 혈중의 tPA 활성을 항진시키고, 또한 그 효과가 비교적 장시간 유지되는 것이 시사되었다.

(실시예 6)

마우스의 혈중에 있어서의 배지 첨가 성분의 tPA 활성에 대한 효과의 검토

(1) 유산균 발효 엑기스

다음으로 본 발명자들은 생체 내에 있어서의 다른 균발효 엑기스 효과의 검토를 실시하였다. 웅성 C57BL6/J 마우스 (12 주령) 에 생리 식염수로 희석시킨 유산균 발효 엑기스 (원액, 1 ∼ 50 용량％) 를 300 ㎕ 경구 투여하고, 2 시간 후에 채취한 혈장으로부터 유글로불린 분획을 단리하였다. 그 분획의 tPA 및 uPA 의 활성을 fibrin zymography 법으로 평가하였다.

그 결과, 유산균 발효 엑기스에는 tPA 및 uPA 의 활성을 증강시키는 효과는 확인되지 않았다 (도 8).

(2) 낫토균 발효 엑기스

다음으로 본 발명자들은 생체 내에 있어서의 다른 배지 첨가 성분 효과의 검토를 실시하였다. 웅성 C57BL6/J 마우스 (12 주령) 에 생리 식염수로 희석시킨 낫토균 발효 엑기스 (20 배 농축액, 0.2 ∼ 25 용량％) 를 300 ㎕ 경구 투여하여, 2 시간 후에 채취한 혈장으로부터 유글로불린 분획을 단리하였다. 그 분획의 tPA 및 uPA 의 활성을 fibrin zymography 법으로 평가하였다.

그 결과, 낫토균 발효 엑기스에는 tPA 및 uPA 의 활성을 증강시키는 효과는 확인되지 않았다 (도 9).

tPA 는 뇌경색 등의 혈전성 질환의 치료약으로서도 사용되고 있고, 그 활성 항진 (활성 증강) 은 이들 혈전성 질환의 치료 및 예방에 유효한 것으로 생각된다. 이번에, 낫토균 유래의 저분자 펩티드인 성분이 생체 내에서 tPA 의 활성을 증강시키는 것을 알 수 있었다. 이 성분은 이미 보건 영양 식품으로 되어 있는 점에서, 식품으로서 섭취함으로써 혈전성 질환의 예방으로 이어질 것이 기대된다.

본 발명의 혈전성 질환 예방 식품은 영양 기능 식품, 영양 보조 식품, 건강 보조 식품, 특정 보건용 식품, 특히 건강 보조 식품 분야에 속하는 것이다. 본 발명의 혈전성 질환 예방 식품은 종래부터 식품 등에 이용되어 와서 안전성이 확인되어 있는 미생물 배양물을 유효 성분으로 하는 것으로, 간편하게 섭취할 수 있다. 본 발명의 혈전성 질환 예방 식품은, 간편하고 일상적으로 섭취함으로써 혈전성 질환의 발증을 유효하게 예방하여, 혈전성 질환에 관련되는 다대한 의료비를 삭감할 수 있다.

독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터

FERMBP-11451

20010410

Claims

전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 낫토균인 바실러스·서브틸러스 AK (수탁 번호 : FERM BP-11451 (FERM P-18291)) 를 접종하여 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 분취한 성분을 유효 성분으로서 함유하는 혈전성 질환 예방 식품으로서, 그 유효 성분의 80 % 가 500 이하의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 혈전성 질환 예방 식품.
제 1 항에 있어서,
발효가 pH 4.5 ∼ 6.5, 28 ∼ 32 ℃ 의 조건에서 2 개월 이상 실시하는 발효인 혈전성 질환 예방 식품.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
숙성이 pH 4.0 ∼ 6.0, 13 ∼ 17 ℃ 의 조건에서 4 개월 이상 실시하는 숙성인 혈전성 질환 예방 식품.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
혈전성 질환이 심부정맥 혈전증, 문맥 혈전증, 신정맥 혈전증, 경정맥 혈전증, 버드·키아리 증후군, 액와-쇄골하정맥 혈전증, 뇌정맥동 혈전증 및 폐혈전 색전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그것을 초과하는 정맥 혈전증, 또는 뇌경색, 심근경색, 장간막동맥 혈전증, 하지 급성 동맥 혈전증, 간동맥 혈전증, 신동맥 혈전증, 비동맥 혈전증 및 폐색 동맥 경화증으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그것을 초과하는 동맥 혈전증인 혈전성 질환 예방 식품.
제 3 항에 있어서,
혈전성 질환이 심부정맥 혈전증, 문맥 혈전증, 신정맥 혈전증, 경정맥 혈전증, 버드·키아리 증후군, 액와-쇄골하정맥 혈전증, 뇌정맥동 혈전증 및 폐혈전 색전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그것을 초과하는 정맥 혈전증, 또는 뇌경색, 심근경색, 장간막동맥 혈전증, 하지 급성 동맥 혈전증, 간동맥 혈전증, 신동맥 혈전증, 비동맥 혈전증 및 폐색 동맥 경화증으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그것을 초과하는 동맥 혈전증인 혈전성 질환 예방 식품.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
유효 성분을 식품 전체의 중량에 대해 0.05 ∼ 100 중량％ 함유하는 혈전성 질환 예방 식품.
제 3 항에 있어서,
유효 성분을 식품 전체의 중량에 대해 0.05 ∼ 100 중량％ 함유하는 혈전성 질환 예방 식품.
제 4 항에 있어서,
유효 성분을 식품 전체의 중량에 대해 0.05 ∼ 100 중량％ 함유하는 혈전성 질환 예방 식품.
제 5 항에 있어서,
유효 성분을 식품 전체의 중량에 대해 0.05 ∼ 100 중량％ 함유하는 혈전성 질환 예방 식품.