KR102403578B1 - 인슐린 저항성 개선제 및 인슐린 저항성 질환 예방용의 건강 보조 식품 - Google Patents
인슐린 저항성 개선제 및 인슐린 저항성 질환 예방용의 건강 보조 식품 Download PDFInfo
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Abstract
전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 바실루스 서브틸리스 AK(FERM P-18291)를 접종하고, 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 유효 성분으로서 함유하는 인슐린 저항성 개선제로 한다. 여러가지 인슐린 저항성을 개선하여, 예컨대 지질 대사 이상 또는 당 대사 이상, 염증성 아디포사이토카인의 산생 항진 또는 항염증성 아디포사이토카인의 산생 저하의 조정, 염증 또는 매크로파지의 침윤에 의한 인슐린 저항성을 개선하여, 산화 스트레스의 항진에 의한 인슐린 저항성 개선제가 되고, 또한 인슐린 저항성에 의한 여러가지 질환을 예방할 수 있는 건강 보조 식품이 된다.
Description
본 발명은, 내장 비만에 의한 인슐린 저항성에 의해 초래되는 질환, 예컨대 지질 대사 이상, 당 대사 이상, 아디포사이토카인의 산생 밸런스 이상, 지방 조직에 대한 산화 스트레스의 항진 등을 예방하고 개선하기 위한 인슐린 저항성 개선제 및 인슐린 저항성 질환 예방용의 건강 보조 식품에 관한 것이다.
메타볼릭 신드롬은, 내장 비만, 내당능 이상, 고혈압 및 지질 이상증을 특징으로 하는 병태이고, 2형 당뇨병이나 동맥 혈전증의 주요한 원인으로도 되는 것이 알려져 있다.
내장 비만과 인슐린 저항성은, 메타볼릭 신드롬의 단서라고 생각되고 있어, 비만과 인슐린 저항성을 예방함과 동시에, 그 치료도 가능한 신규 물질의 개발은 매우 중요하다.
또한, 비만의 병태에는 만성 염증이 확인되고, 전신의 염증 마커의 상승은, 비만과 인슐린 저항성에 깊게 관련하고, 임상적으로는 동맥 경화의 주요한 예측 마커로서 염증 마커가 이용된다.
지방 조직은, 렙틴, 아디포넥틴, 종양 괴사 인자(TNF-α), 단구 주화 인자(MCP-1) 및 플라스미노겐 액티베이터 인히비터 1(PAI-1) 등, 아디포사이토카인이라고 총칭되는 많은 생리 활성 물질을 방출하는 중요한 내분비 장기인 것이 최근의 연구에서 밝혀졌다.
그리고, 내장 비만으로 축적한 지방 조직에는, 염증성 및 항염증성 아디포사이토카인의 산생 밸런스의 파탄이 확인되는 점에서, 지방 조직에 있어서의 염증성 변화가 메타볼릭 신드롬의 여러가지 증상의 진전에 관여하고, 특히 2형 당뇨병이나 혈전증의 원인이 되는 것으로 생각되고 있다.
그런데, 건강을 증진시키는 보건 영양 식품으로서, 생체에 필요한 여러가지 성분을 체내에서 효율적으로 생성하도록 대사 활성을 높이고, 또한 T 림프구를 유약화시켜 면역 기능을 증강하는 작용이 있는 발효 대사물 엑기스로서 시판되는 엔자민(등록 상표)이 알려져 있다(하기 특허문헌 1).
이 발효 대사물 엑기스인 엔자민(등록 상표)은, 고온 혹은 저온의 생육 환경, 자외선 혹은 X 선이 조사되고, 또는 산성화된 생육 환경 등에 있어서 계대 배양을 반복하여 선발된 특정한 바실루스 서브틸리스 AK주가 산생하는 추출물이고, 이 발효 대사물 엑기스에 대하여, 본원의 발명자들은, 마우스의 생체 내 레벨 및 혈관 내피 세포를 이용한 세포 레벨에서, 선용 활성 항진 작용 등의 항혈전 효과를 갖는 것을 개시했다(하기 특허문헌 2).
그러나, 상기한 바와 같이 공지 기술에서는, 상기한 발효 대사물 엑기스인 엔자민(등록 상표)에 대하여 내장 비만에 따르는 인슐린 저항성에 관한 지견은 없고, 인슐린 저항성의 개선 효과를 확실하게 갖고 있는 약제나 식품으로서 이용되고 있지 않았다.
그래서, 본 발명의 과제는, 상기한 문제점을 해결하여 소정 발효 대사물 엑기스를 신규한 용도로 실시가 가능하도록, 즉 소정의 발효 대사물 엑기스인 엔자민(등록 상표)이, 내장 비만에 의한 인슐린 저항성에 의한 질환에 대하여 개선 작용을 발휘하는 것을 밝히고, 인슐린 저항성에 의한 질환을 널리 예방할 수 있도록, 인슐린 저항성 개선제 및 그것을 이용한 인슐린 저항성 질환을 예방 가능한 건강 보조 식품을 만들어내는 것이다.
본원의 발명자들은, 비만 모델 마우스의 db/db 마우스를 이용하여, 인슐린 저항성이나 아디포사이토카인의 분비 파탄 상태에 대하여 소정 발효 대사물 엑기스를 함유하는 엔자민(등록 상표)의 작용을 상세히 연구하여, 지질 대사 이상, 당 대사 이상, 아디포사이토카인의 산생 밸런스 이상, 지방 조직에 대한 산화 스트레스의 항진 등을 개선하는 것을 증명하고, 새로운 용도에 적용 가능한 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성시킨 것이다.
즉, 본 발명에 있어서는, 상기 과제를 해결하여 소정의 발효 대사물 엑기스를 신규한 용도에 적용하여, 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 바실루스 서브틸리스 AK(수탁 번호: FERM P-18291)를 접종하고, 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 유효 성분으로서 함유하는 인슐린 저항성 개선제로 한 것이다.
본 발명에 관련된 상기 구성의 인슐린 저항성 개선제는, 소정의 조건에서 발효 및 숙성한 발효 대사물을 유효 성분으로서 함유하고, 그것에 의해 여러가지 요인에 의한 인슐린 저항성을 개선할 수 있다.
본 발명의 인슐린 저항성 개선제로서는, 예컨대 지질 대사 이상 또는 당 대사 이상에 의한 인슐린 저항성을 개선하는 것이고, 또한 지방 조직에 있어서의 염증성 아디포사이토카인의 산생 항진 또는 항염증성 아디포사이토카인의 산생 저하에 의한 인슐린 저항성을 개선하는 것이고, 또한 지방 조직에 있어서의 염증 또는 매크로파지의 침윤에 의한 인슐린 저항성을 개선하는 것이고, 또는 지방 조직에 대한 산화 스트레스의 항진에 의한 인슐린 저항성을 개선하는 인슐린 저항성 개선제가 된다.
이러한 인슐린 저항성 개선제를 함유하는 식품은, 안전하여 일상적으로 상기 유효 성분을 섭취할 수 있는 것이고, 인슐린 저항성에 의한 여러가지 질환을 예방할 수 있는 건강 보조 식품이 된다.
본 발명은, 소정 조건에서 발효 및 숙성한 발효 대사물을 유효 성분으로서 함유하는 인슐린 저항성 개선제로 했기 때문에, 소정의 발효 대사물 엑기스가 신규한 용도로 이용되게 되어, 예컨대 지질 대사 이상 혹은 당 대사 이상, 또는 지방 조직에 있어서의 염증성 아디포사이토카인의 산생 항진 혹은 항염증성 아디포사이토카인의 산생 저하, 지방 조직에 있어서의 염증 또는 매크로파지의 침윤, 또는 지방 조직에 대한 산화 스트레스의 항진이라는 인슐린 저항성에 의해 초래되는 질환에 대하여 개선 효과가 발휘되는 인슐린 저항성 개선제가 되는 이점이 있다.
또한, 이러한 인슐린 저항성 개선제를 함유하는 식품은, 인슐린 저항성에 의한 질환을 널리 예방할 수 있는 것이 되고, 상기 질환을 예방하는 신규한 건강 보조 식품이 되는 이점이 있다.
도 1의 (a)는, 각 시험 마우스군의 체중을 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 체지방률을 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 내장 지방량을 나타내는 도표, (d)는, 각 시험 마우스군의 시험 후의 피하 지방량을 나타내는 도표이다.
도 2의 (a)는, 각 시험 마우스군의 혈청 트리글리세리드 농도를 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 혈청 총콜레스테롤 농도를 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 혈장 글루코오스 농도를 나타내는 도표, (d)는, 각 시험 마우스군의 혈장 인슐린 농도를 나타내는 도표이다.
도 3의 (a)는, 글루코오스 부하 테스트의 결과를 나타내고, 각 시험 마우스군의 시험 시간과 혈장 글루코오스 농도의 관계를 나타내는 도표, (b)는, 인슐린 부하 테스트의 결과를 나타내고, 각 시험 마우스군의 시험 시간과 혈장 글루코오스 농도의 관계를 나타내는 도표이다.
도 4의 (a)는, 각 시험 마우스군의 TNF-α의 mRNA 발현량을 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 MCP-1의 mRNA 발현량을 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 IL-6의 mRNA 발현량을 나타내는 도표, (d)는, 각 시험 마우스군의 PAI-1의 mRNA 발현량을 나타내는 도표, (e)는, 각 시험 마우스군의 혈청 TNF-α 농도를 나타내는 도표, (f)는, 각 시험 마우스군의 혈청 아디포넥틴 농도를 나타내는 도표이다.
도 5의 (a)는, db+m 마우스(컨트롤군)의 지방 조직의 면역 염색 사진, (b)는, db/db 마우스(컨트롤군)의 지방 조직에 대한 면역 염색 사진, (c)는, db/db 마우스(엔자민 0.1％ 첨가군)의 지방 조직에 대한 면역 염색 사진, (d)는, db/db 마우스(엔자민 1.0％ 첨가군)의 지방 조직에 대한 면역 염색 사진이다.
도 6의 (a)는, 각 시험 마우스군의 F4/80 양성 세포율을 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 F4/80 mRNA 량을 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 CD68 mRNA 량을 나타내는 도표, (d)는, 각 시험 마우스군의 TLR-4 mRNA 량을 나타내는 도표이다.
도 7의 (a)는, 각 시험 마우스군의 Nox2 mRNA 량을 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 P22phox mRNA 량을 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 P47hox mRNA 량을 나타내는 도표이다.
도 8은, 각 시험 마우스군의 TNF-α mRNA 량을 나타내는 도표이다.
도 9의 (a)는, 각 시험 마우스군의 GLUT2 mRNA 량을 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 G6Pase mRNA 량을 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 CPT1a mRNA 량을 나타내는 도표, (d)는, 각 시험 마우스군의 GLUT4 mRNA 량을 나타내는 도표, (e)는, 각 시험 마우스군의 CPT1b mRNA 량을 나타내는 도표이다.
도 2의 (a)는, 각 시험 마우스군의 혈청 트리글리세리드 농도를 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 혈청 총콜레스테롤 농도를 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 혈장 글루코오스 농도를 나타내는 도표, (d)는, 각 시험 마우스군의 혈장 인슐린 농도를 나타내는 도표이다.
도 3의 (a)는, 글루코오스 부하 테스트의 결과를 나타내고, 각 시험 마우스군의 시험 시간과 혈장 글루코오스 농도의 관계를 나타내는 도표, (b)는, 인슐린 부하 테스트의 결과를 나타내고, 각 시험 마우스군의 시험 시간과 혈장 글루코오스 농도의 관계를 나타내는 도표이다.
도 4의 (a)는, 각 시험 마우스군의 TNF-α의 mRNA 발현량을 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 MCP-1의 mRNA 발현량을 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 IL-6의 mRNA 발현량을 나타내는 도표, (d)는, 각 시험 마우스군의 PAI-1의 mRNA 발현량을 나타내는 도표, (e)는, 각 시험 마우스군의 혈청 TNF-α 농도를 나타내는 도표, (f)는, 각 시험 마우스군의 혈청 아디포넥틴 농도를 나타내는 도표이다.
도 5의 (a)는, db+m 마우스(컨트롤군)의 지방 조직의 면역 염색 사진, (b)는, db/db 마우스(컨트롤군)의 지방 조직에 대한 면역 염색 사진, (c)는, db/db 마우스(엔자민 0.1％ 첨가군)의 지방 조직에 대한 면역 염색 사진, (d)는, db/db 마우스(엔자민 1.0％ 첨가군)의 지방 조직에 대한 면역 염색 사진이다.
도 6의 (a)는, 각 시험 마우스군의 F4/80 양성 세포율을 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 F4/80 mRNA 량을 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 CD68 mRNA 량을 나타내는 도표, (d)는, 각 시험 마우스군의 TLR-4 mRNA 량을 나타내는 도표이다.
도 7의 (a)는, 각 시험 마우스군의 Nox2 mRNA 량을 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 P22phox mRNA 량을 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 P47hox mRNA 량을 나타내는 도표이다.
도 8은, 각 시험 마우스군의 TNF-α mRNA 량을 나타내는 도표이다.
도 9의 (a)는, 각 시험 마우스군의 GLUT2 mRNA 량을 나타내는 도표, (b)는, 각 시험 마우스군의 G6Pase mRNA 량을 나타내는 도표, (c)는, 각 시험 마우스군의 CPT1a mRNA 량을 나타내는 도표, (d)는, 각 시험 마우스군의 GLUT4 mRNA 량을 나타내는 도표, (e)는, 각 시험 마우스군의 CPT1b mRNA 량을 나타내는 도표이다.
본 발명의 인슐린 저항성 개선제는, 전분을 소정의 균에 의해 발효 숙성시킨 액상 성분을 유효 성분으로서 함유하고, 그 유효 성분은, 콘스타치 등을 포함하는 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 질소원으로서 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 소정의 낫토균인 바실루스 서브틸리스 AK(수탁 번호: FERM P-18291)를 접종하고, 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 분리 채취한 것이다.
여기서, 발효용 배지의 기재로서 이용하는 당화물은, 옥수수 자실로부터 분리, 정제한 콘스타치 등을 포함하는 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 것을 이용할 수 있다. 또한, 정제한 콘스타치 대신에 조(粗)정제의 콘스타치를 사용할 수도 있다. 또한, 콘스타치 외에, 대두분이나 쌀겨 또는 이들의 혼합물을 가수 분해한 것을 배지용 기재로서 사용할 수도 있다.
우선, 발효용 배지의 질소원으로서 사용하는 효모 엑기스는, 맥주 효모(Saccharomyces cerevisiae Meyen)의 균체를 소화하여 추출한 수용성 성분을 건조한 것 등, 일반적으로 식품의 발효나 양조 등의 세균 배양에 있어서 질소원으로서 첨가할 수 있는 것을 사용할 수 있다.
또한, 유효 성분의 제조에 이용하는 발효용 배지에는, 상기한 당화물 및 효모 엑기스 외에도, 필요에 따라 단백질 등의 유기물이나 무기 염류 등을 배합할 수 있다. 유기물로는, 대두 단백질이나 그 밖의 식물성 단백질을 들 수 있고, 무기 염류로는, 염화칼슘, 염화나트륨, 인산나트륨 등을 들 수 있다.
배지용 기재로서의 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물에 대하여, 더욱 당분을 첨가하는 것도 바람직하고, 그러한 당분으로는, 예컨대 자당, 글루코오스(포도당), 물엿 등을 들 수 있다.
전술한 바와 같이 조제된 발효용 배지에 접종하는 발효균은, 낫토균인 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AK이고, 바실루스 서브틸리스 AK는, 특허 미생물 기탁 센터(NPMD)에 「(수탁 번호) FERM P-18291」로서 기탁되어 있다.
또한, 소망에 따라, 바실루스 서브틸리스 AK의 증식을 저해하지 않는 젖산 간균인 락토바실루스(Lactobacillus)나 젖산 구균인 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 효모(Saccharomyces cerevisiae)나 누룩균(Aspergillus oryzae)의 균체, 균 추출물 또는 균 발효 엑기스를 바실루스 서브틸리스 AK에 첨가하여 접종할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품의 유효 성분의 제조에 이용하는 발효용 배지에는, 소망에 따라, 바실루스 서브틸리스 AK의 증식을 저해하지 않는, 배추, 양배추, 당근, 약용 당근, 파슬리, 셀러리, 양파 등의 식물 추출물을 첨가할 수 있다.
바실루스 서브틸리스 AK는, 통상의 낫토균인 바실루스 서브틸리스를, 자외선, X 선 조사, 고·저온 환경(100℃, 0℃), 유산균과의 경합, 아포를 만들기 쉬운 배지[미트 엑기스 5.0 중량％, 펩톤 10.0 중량％, 염화나트륨 5.0 중량％, 한천 15.0 중량％, 야채(양배추, 당근, 셀러리, 파슬리) 압착즙 65.0 중량％] 등의 여러가지 조건에 부여하여 계대 배양을 반복 선발하여 발견한 내성균이다.
이와 같이 하여 얻어진 바실루스 서브틸리스 AK 균주는, 이하와 같은 균학적 성질을 갖고 있어, 바실루스 서브틸리스인 것으로 확인할 수 있었다.
또, 본 발명에 이용하는 바실루스 서브틸리스 AK 균주(수탁 번호: FERM P-18291)는, 균학적 성질 등의 분류 지표의 차이에 의해 상동성의 평가에 차이가 확인되어 있고, 16s rRNA 유전자의 서열을 이용한 데이터베이스(MicroSeqID:ABI)에 의한 분류 검색에 있어서는, 파니에바실루스 폴리믹사(Paniebacillus polymyxa)와의 높은 상동성이 확인되어 있지만, 이하의 (a) 형태학적 성질, (b) 배양적 성질, (c) 생화학적 성질의 균학적 성질에 의한 계통 분류에서는 바실루스 서브틸리스라는 동정 결과가 얻어져 있다. 본 발명에서는, 후자의 결과를 이용하여 특허 미생물 기탁 센터(NPMD)에 기탁된 상기한 소정 균주를 이용하고 있다.
(a) 형태학적 성질
1 세포의 형 및 크기
간균 1.0∼1.2×3.0∼50 ㎛
2 세포의 다형성의 유무
없음
3 운동성의 유무
있음(주모성의 편모)
4 아포의 유무
있음 타원 균체의 거의 중앙
(b) 배양적 성질
1 육즙 한천 평판 배양
원형 집락 백탁
2 육즙 액체 배양
상부 또는 하부 균응체
(c) 생화학적 성질
1 그램 염색 양성
2 질산염의 환원 양성
3 MR 테스트 음성
4 VP 테스트 양성
5 인돌의 생성 음성
6 황화수소의 생성 음성
7 시트르산의 이용 양성
8 카탈라아제 양성
9 생육의 범위
pH 5.5∼7.0
온도 25℃∼40℃
본 발명에서 채용하는 것이 바람직한 발효 조건은, pH 4.5∼6.5, 28∼32℃의 조건에서 2개월 이상이다. 발효 조건이, 상기보다 강한 산성 영역이며 소정 온도 미만인 조건에서는, 2개월 이상 발효시켜도, 본 발명에 이용하는 소정의 낫토균이 효율적으로 당 및 질소원을 자화하지 않는 것으로 추정되고, 얻어진 식품에 소기한 효과가 충분히 얻어지지 않는다. 상기한 산성 영역을 넘어 중성 또는 알칼리성의 조건이며 소정 온도를 넘어 고온에서는 발효 불충분하여 소정의 낫토균이 효율적으로 당 및 질소원을 자화하지 않고, 얻어진 보건 영양 식품은 상기와 마찬가지로 소기한 효과가 충분히 얻어지지 않는 것이 된다.
또한, 본 발명에서 채용하는 것이 바람직한 숙성 조건은, pH 4.0∼6.0, 13∼17℃에서 4개월 이상이다. 상기보다 강한 산성 영역이며 소정 온도 미만인 조건에서는, 4개월 이상 숙성시켜도, 발효 생산물로서 각종 활성을 갖는 아미노산, 리포단백, 리포다당(리포폴리사카라이드), 리피드 등이 충분히 저분자량화되지 않는 것으로 추정되고, 소기한 효과가 충분히 얻어지지 않는 경우가 있다. 상기한 산성 영역을 넘어 중성 또는 알칼리성의 조건이며 소정 온도를 넘어 고온에서 숙성시키면, 활성이 저하되는 것으로 추정되고, 얻어진 건강 보조 식품은 소기한 효과가 충분히 얻어지지 않는 경우가 있다.
생성된 액상 성분을 분리 채취하려면, 여과 또는 원심 분리 등의 주지된 분리 수단을 채용하면 되고, 얻어진 식품용 원액은, 그대로 사용할 수 있지만, 유통이나 보존을 위해 농축해 두고, 적절히 희석하여 사용해도 좋다.
본 발명의 인슐린 저항성 개선제의 유효 성분은, 상기한 바와 같은 제조 공정으로 제조 가능한 것이지만, 시판품을 이용할 수도 있다. 그 경우에는, 주식회사 엔자민 연구소에 의해 제조된 엔자민(등록 상표)의 원액(ENM: 상품명) 외에, 그 20배 농축 엑기스인 엔자민 농축액(ENM-HL: 상품명)을 원액 농도로 환산하여 사용할 수 있다.
본 발명의 인슐린 저항성 개선제는, 상기한 엔자민 농축액(ENM-HL: 상품명)을 소정의 액상 성분으로 하여, 물 또는 부형제 등의 음식 가능한 재료에 0.1∼1.0 질량％ 배합하고, 마우스에 섭식시킬 때에 유효성이 확인되어 있다.
이 때, 엔자민 농축액(ENM-HL: 상품명)을 농도 0.1 질량％로 섭식시키면 평균 0.5 ㎎/kg 체중/일/마우스의 섭취량이 되고, 농도 1.0 질량％로 절식시키면 평균 5.0 ㎎/kg 체중/일/마우스의 섭취량이 되고, 각각 유효성이 확인된다.
이 섭취량을 인간의 경우에 대하여 환산하면, 체표면적으로부터 환산하여 마우스 용량의 15분의 1 정도가 되기 때문에, 성인(체중 60 kg)에서의 엔자민(등록 상표)의 원액(ENM: 상품명)의 1회/일의 섭취량은, 20×(2∼20 ㎎) 즉, 40∼400 ㎎이 확인된 유효 성분량이다.
본 발명의 인슐린 저항성에 의한 질환 예방용의 건강 보조 식품은, 상기와 같이 하여 조제한 유효 성분과 식품 분야에서 관용적으로 사용되고 있는 부형제(예컨대, 전분 혹은 덱스트린, 셀룰로오스, 젖당, 맥아당, 환원 젖당, 환원 맥아당, 소르비톨, 만니톨, 에리트리톨, 자일리톨 등)나 보조제(예컨대, 용매, 분산 매질, 피복제, 안정제, 희석제, 보존제, 방부제, 살균제, 항진균 시약, 등침투압 시약, 흡수 억제 시약, 붕괴제, 유화제, 결합제, 윤활제, 색소 등)와 혼합하고, 건강 보조 식품의 분야에서 관용적으로 사용되고 있는 제제 방법에 의해, 예컨대, 정제, 캡슐, 과립, 분말, 추출액, 용액, 시럽, 현탁액, 유탁액의 형태로 제조할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명의 인슐린 저항성에 의한 질환 예방용의 건강 보조 식품은, 상기한 소정의 액상 성분인 엔자민(등록 상표)의 원액(ENM: 상품명)을, 상기한 1일당의 유효 성분량을 기준으로 하여, 보조 식품 전체의 중량에 대하여, 예컨대 약 0.05∼100 질량％, 바람직하게는 약 0.1∼90 질량％, 보다 바람직하게는 약 1∼85 질량％, 더욱 바람직하게는 약 5∼80 질량％, 가장 바람직하게는 약 10∼50 질량％ 함유할 수 있다.
실시예
[인슐린 저항성 개선제의 유효 성분의 조제]
옐로우 콘스타치 2.3 kg, 대두 펩톤 0.5 kg, 쌀겨즙 0.5 kg, 염화칼슘 80 g, 식염 150 g에 정제수 50 kg을 첨가하고, 가열하여 용해했다. 계속해서 이것을 냉각하고, 아밀라아제 40 g을 첨가하여 충분히 당화시켰다. 당화 종료 후, 그래뉴당 1.5 kg, 글루코오스(포도당) 1.5 kg, 효모 엑기스 450 g, 물엿 1.5 kg, 인산나트륨 80 g, 야채의 압착즙(양배추, 당근, 셀러리, 파슬리의 합계) 5 kg, 및 정제수를 첨가하여 전량을 150 kg으로 했다.
그리고, 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 7.3∼7.8의 범위 내로 조정하고, 이것을 배양 캔에 넣어 120℃에서 20분간 고압 멸균했다. 이것을 냉각한 후, 바실루스 서브틸리스 AK주를 접종하고, 온도 30±2℃의 항온실에서 pH 4.5∼6.5로 60일간 발효시키고, 계속해서 온도 15±2℃의 항온실에서 pH 4.0∼6.0의 조건하에서 180일간 숙성시켜 배양액을 투명화시켰다. 이것을 필터에 의해 여과하고, 125 리터의 액상의 보건 영양 식품의 원액(이하, 배양 여과액이라고 함)을 얻었다.
얻어진 인슐린 저항성 개선제의 액상 유효 성분의 원액 100 g 중의 일반 분석 결과를 이하의 표 1 중에 나타낸다. 또, 표 중의 기호 φ는, 검출 한계 이하의 미량을 나타내고 있다.
또한, 얻어진 액상 성분 또는 동성분의 엔자민(등록 상표)이 포함되는 식품의 경구 안전성에 대해서는, 일본 특허공보 제3902015호의 단락 0031에도 기재되어 있는 바와 같이, 위스타계 래트를 이용한 경구 LD50 값이 암수 모두 42.0 ㎖/kg 이상으로 높은 것으로, 본 발명에 이용하는 유효 성분은 높은 안전성을 갖고 있는 것이 분명하다.
다음으로, 상기한 액상 성분의 원액의 20배 농축액(엔자민 연구소사 제조: ENM-HL, 이하의 실시예 1, 2, 비교예, 이들 시험의 설명 및 도표 중의 설명에 있어서, 이것을 엔자민이라고 칭함)을 유효 성분으로 하는 실시예 1, 2, 비교예(컨트롤)의 각 인슐린 저항성 개선제를 조제하고, 이들을 이하의 시험에 의해 평가했다.
또, 이하의 시험 결과는, 평균치±표준 오차로 나타내고, ％의 기재는 질량％이고, 유의차 검정은, 일원 배치 분산 분석법(one-way ANOVA)을 이용하고, 특별히 기재하지 않는 한 p ＜ 0.05를 유의차 있음으로 했다. 또한, 통계 해석은 모두 StatView version 5.0 소프트웨어(미국 SAS Institute사 제조)를 이용하여 행했다.
[실시예 1, 2, 비교예]
<지질 대사 이상의 인슐린 저항성 개선제, 당 대사 이상의 인슐린 저항성 개선제>
상기와 같이 하여 얻어진 유효 성분의 엔자민을 0.1 질량％ 농도로 함유하는 음료수(실시예 1), 엔자민의 1.0 질량％ 농도의 음료수(실시예 2), 엔자민을 전혀 포함하지 않는 물(비교예)을 조제하고, 마우스에의 경구 섭취에 의한 실시예 1, 2의 지질 대사 이상 또는 당 대사 이상의 인슐린 저항성 개선제로서의 적성을 평가했다.
[마우스의 경구 섭취]
니혼 찰스·리바사로부터 구입한 5주령의 웅성 db/db 마우스(비만 모델 마우스)와 헤테로의 db/+m 마우스(마른 모델 마우스) 중, db/db 마우스에 표준 고형식과 엔자민을 0.1％(평균 0.5 ㎎/kg 체중/일/마우스) 및 1.0％(평균 5.0 ㎎/kg 체중/일/마우스)로 섞은 음수(실시예 1, 2)를 6주령부터 8주간 급여했다. 비교예(컨트롤)로서, 엔자민을 전혀 포함하지 않는 물을 급여했다.
또, 사료 및 음수는 자유 섭취로 하고, 마른 컨트롤로서 db/+m 마우스를 이용하고, 이것에 표준 고형식과 음수를 동일한 기간, 자유롭게 섭취시켰다. 이들 마우스는, 12시간의 명암 사이클로 사육하고, 모든 동물 실험은, 학교법인 긴키 대학 의학부 동물 실험 지침에 따라 행했다.
상기한 실시예, 비교예의 발명의 효과를 평가함에 있어, 그 전제로서, 엔자민 투여에 의해 db/db 마우스의 체중 및 체지방량에 영향이 없는 것을 확인하기 위해, 공시(供試) 마우스에 대한 실시예 1, 2의 경구 섭취와 완전히 동일한 조건에서 경구 섭취한 마우스에 대하여, 체중, 체지방률, 피하 지방률의 증감을 조사하고, 그 결과를 도 1에 나타냈다. 또, 도면 중에 기재한 ％는 질량％이다. 또한, 체지방률, 내장 지방량, 피하 지방량의 측정에 대해서는, 이하의 체조성 해석 시험을 행했다.
[체조성 해석 시험]
체지방 조성의 해석을 컴퓨터 단층 촬영법(CT 해석)으로 행했다. 즉, 마우스를 이소플루란으로 마취한 후, 실험 동물 CT 해석 장치(히타치 알로카 메디컬사 제조: 라시타 LCT-200)를 이용하여 체지방 조성을 측정했다. 그 때, 실험 동물의 제1 요추부터 제5 요추의 사이를 1 mm의 간격으로 스캔하여, 연속한 슬라이스 단층 화상을 작성한 후, 라시타 소프트웨어(version 3.40)를 이용하여 정량화했다. 내장 지방과 피하 지방은, 복근의 위치에 의해 구별하고, 총지방량, 내장 지방 중량 및 피하 지방 중량은, 전슬라이스 화상을 적산함으로써 산출했다.
도 1에 도시된 결과에서도 알 수 있듯이, 0.1％ 농도 및 1％ 농도의 엔자민 투여에 의한 체중에의 영향은 확인되지 않고, CT 화상으로부터 계산한 체지방률, 내장 지방량 및 피하 지방량, 간 지방량에 있어서도 엔자민 투여에 의한 변화는 확인되지 않았다.
다음으로, 지질 대사 이상 또는 당 대사 이상의 인슐린 저항성 개선제에 의한 소기한 직접적인 인슐린 저항성에 의한 효과를 조사하기 위해, 실시예 1, 2, 비교예에 대하여, 이하의 대사 마커에 의한 해석 시험을 행하고, 그 결과를 도 2, 3에 나타냈다. 또, 도면 중, ％는 질량％이다.
[대사 마커에 의한 해석 시험(1)]
db/db 마우스를 이용한 실시예 1, 2, 비교예, 및 db/+m 마우스를 이용한 컨트롤에 대하여, 혈청 트리글리세롤, 혈청 총콜레스테롤, 혈장 글루코오스, 혈장 인슐린의 농도는, 각각 트리글리세리드 E 테스트(와코 쥰야쿠 공업사 제조), 콜레스테롤 E 테스트(와코 쥰야쿠 공업사 제조), 글루테스트에스(산와 화학 연구소 제조), 초고감도 마우스 인슐린 측정 키트(모리나가 생과학 연구소 제조)를 이용하여 측정했다.
[지질 대사 이상에 의한 인슐린 저항성의 개선]
도 2의 (a)에 나타낸 결과에서도 알 수 있듯이, db/db 마우스에 있어서의 혈청 트리글리세리드의 측정 결과로부터, db/db 마우스의 공복시의 혈청 트리글리세리드 농도(158.1±12.4 ㎎/㎖)는, db/+m 마우스(컨트롤군: 도면 중 m으로 나타냄)의 혈청 트리글리세리드 농도(59.9±6.7 ㎎/㎗)에 비교하여, 유의(p ＜ 0.01)한 높은 값을 나타냈다.
또한 도 2의 (a)로부터, 0.1％ 농도의 엔자민 투여에 의해, db/db 마우스에 있어서의 혈청 트리글리세리드 농도는 137.0±8.0 ㎎/㎗이고, 컨트롤군의 158.1±12.4 ㎎/㎗에 비교하여 유의차는 없지만 감소 경향을 나타내고, 또한 1％ 농도의 엔자민 투여군(122.0±8.4 ㎎/㎗)에서는, 엔자민 비투여의 db/db 마우스군에 비교하여 유의(p ＜ 0.05, 도면 중에 * 표를 부여함)한 감소가 확인되었다.
마찬가지로 도 2의 (b)에서도 알 수 있듯이, db/db 마우스의 공복시의 혈청 총콜레스테롤 농도(217.9±8.7 ㎎/㎗)와 비교하여, 0.1％ 농도의 엔자민 투여군(181.4±8.3 ㎎/㎗)에는 감소 경향이 확인되고, 1％ 농도 엔자민 투여군에는 유의(p ＜ 0.05)한 감소가 확인되었다.
이들 결과로부터, 유효 성분의 엔자민은, 혈청 트리글리세리드 및 총콜레스테롤 농도를 투여 농도 의존적으로 감소시키고 있고, 유효 성분의 섭취에 의해 db/db 마우스에 있어서의 지질 대사가 개선되는 것이 밝혀졌다.
<당 대사 이상에 의한 인슐린 저항성의 개선제>
다음으로, db/db 마우스의 당 대사 이상에 대한 엔자민의 효과를 검토했다.
도 2의 (c)에 나타내는 결과에서도 알 수 있듯이, db/db 마우스의 공복시 혈장 글루코오스 농도(758.7±24.7 ㎎/㎗)는, db/+m 마우스(컨트롤군 54.6±1.5 ㎎/㎗: 도면 중 m으로 나타냄)에 비교하여, 현저한 증가를 나타냈다(p ＜ 0.01).
또한, 0.1％ 농도의 엔자민 투여군의 db/db 마우스의 혈장 글루코오스 농도는 감소 경향을 나타내고, 1.0％ 농도의 엔자민 투여군(643.0±34.0 ㎎/㎗)은 유의(p ＜ 0.05)한 감소를 나타냈다.
도 2의 (d)에 나타내는 결과에서도 알 수 있듯이, 혈장 인슐린 농도는, db/+m 마우스(도면 중 m으로 나타냄. 0.12±0.04 ng/㎖)에 비교하여, db/db 컨트롤군에서 2.05±0.22 ng/㎖로, 현저한 높은 값을 나타냈지만(p ＜ 0.01), 0.1％ 엔자민 투여군 (2.72±0.27 ng/㎖), 1.0％ 엔자민 투여군 (2.72±0.30 ng/㎖)로, 엔자민 투여에 의한 혈장 인슐린값에 대한 영향이 확인되지 않았다.
또한, 엔자민의 당 대사에 대한 효과를 상세히 검토하기 위해, 글루코오스 부하 테스트(intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT)) 및 인슐린 부하 테스트(intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT))를 행하고, 이들의 결과를 도 3의 (a), (b)에 나타냈다.
우선, 글루코오스 부하 테스트를 행하기 위해, 마우스를 16시간 절식시키고, 그 후, 복강에 글루코오스를 1.5 ㎎/kg 체중의 농도로 투여했다. 이 결과를 도 3의 (a)에 나타냈다.
또한, 인슐린 부하 테스트를 행하기 위해서는, 마우스를 6시간 절식시킨 후, 복강에 레귤러 인간 인슐린을 1 U/kg 체중의 농도로 복강에 투여했다. 이 결과를 도 3의 (b)에 나타냈다. 혈액 샘플은, 투여 전과 투여 후에 채취하고, 혈중 글루코오스 농도는 글루테스트에스(산와 화학 연구소 제조)를 이용하여 측정하고, 투여 전(0분)과 투여 후(30∼90분)의 결과를 도 3의 (b)에 나타냈다.
또, 도 3의 꺾은선 그래프 중의 기호에 대해서는, ○: db/+m 마우스, ●: 엔자민 비투여 db/db 마우스(컨트롤), △: 0.1％ 엔자민 투여 db/db 마우스, □: 1.0％ 엔자민 투여 db/db 마우스의 각 군의 결과를 나타내고 있다.
도 3의 (a)의 결과에서도 알 수 있듯이, 복강 내에 대한 글루코오스 투여 후의 혈장 글루코오스 농도는, db/db 마우스에 있어서 db/+m 마우스에 비교하여 현저히 상승되어 있어, 현저한 내당능 이상을 나타냈다. 1.0％ 농도의 엔자민 투여에 의해, db/db 마우스에 있어서의 글루코오스 주입 30분 후, 60분 후 및 90분 후의 혈장 글루코오스 농도의 상승이 유의하게 억제되었다. 또, 0.1％ 농도의 엔자민 투여에서는 유의차는 없었지만, 혈장 글루코오스 농도의 상승의 억제 경향이 확인되었다. 이러한 점들로부터, 엔자민 투여에 의해, db/db 마우스에 있어서의 내당능 이상이 개선되어 있는 것을 알 수 있다.
또한, 도 3의 (b)의 결과에서도 알 수 있듯이, db/db 마우스에서는, 내당능 이상과 함께, 인슐린 감수성이 현저한 장해가 확인되었다. 즉, db/+m 마우스에 비교하여, db/db 마우스에서는 인슐린 투여 후의 혈장 글루코오스 농도의 저하가 현저히 억제되어 있었다. 0.1％ 농도의 엔자민 투여에서는 효과는 확인되지 않았지만, 1.0％ 농도의 엔자민의 투여(□ 표)에서는, 인슐린 투여 후의 db/db 마우스에 있어서의 혈장 글루코오스 농도의 저하가 30분, 60분, 90분 및 120분 후가 컨트롤군(● 표)에 비교하여 유의하게 항진되어 있었다. 이러한 점들로부터, 엔자민의 투여가 db/db 마우스에 있어서의 인슐린 저항성을 개선시키는 것을 알 수 있다.
<지방 조직에 있어서의 염증성 아디포사이토카인의 산생 항진 또는 항염증성 아디포사이토카인의 산생 저하에 의한 인슐린 저항성 개선제>
실시예 1, 2의 아디포사이토카인 발현·분비에 대한 엔자민의 효과를 조사하고, 이들 효과를 발휘하는 인슐린 저항성 개선제로서의 적성을 평가했다.
즉, 상기와 동일한 마우스에의 경구 섭취 시험을 행하고, db/db 마우스를 이용한 실시예 1, 2, 비교예, 및 db/+m 마우스를 이용한 컨트롤에 대하여, 이하의 시험을 행하고, 그 결과를 도 4에 나타냈다.
[대사 마커의 해석 시험(2)]
엔자민 투여(8주간)에 의한 인슐린 저항성 개선 효과의 기전을 검토하기 위해, 실시예 1, 2, 비교예의 db/db 마우스의 지방 조직에 있어서의 염증성 아디포사이토카인과 항염증성 아디포사이토카인의 발현 및 분비에 대한 엔자민의 효과를 검토했다. 혈청 아디포넥틴 및 혈청 TNFα 농도는, 각각 아디포넥틴 ELISA 키트(오츠카 제약사 제조) 및 Quantikine TNF-알파 ELISA 키트(미국 R&D 시스템즈사 제조)를 이용하여 측정했다.
도 4의 (a)∼(f)는, 순서대로 TNF-α, MCP-1, IL-6, PAI-1의 mRNA 발현량, 각 군의 마우스에 있어서의 혈청 TNF-α 농도, 혈청 아디포넥틴 농도를 나타내고, 각 도면 중의 m 표는 db/+m 마우스(마른 컨트롤(n = 6))의 지방 조직, － 표는 엔자민 비투여(n = 10) db/db 마우스의 지방 조직, 0.1은 엔자민 투여 0.1％(n = 9)의 실시예 1의 db/db 마우스의 지방 조직이고, 1.0은, 엔자민 투여 1.0％(n = 8)의 실시예 2의 db/db 마우스의 지방 조직이다. 이들 결과는 평균치±표준 오차로 나타내고, 엔자민 비투여 db/db 마우스에 대하여 p ＜ 0.05로 유의차가 있는 것은 * 표로 나타내고, p ＜ 0.01로 유의차가 있는 것은 ** 표로 나타냈다. 또, 도면 중, ％는 질량％를 나타내고 있다.
도 4의 (a)의 결과에서도 알 수 있듯이, db/db 마우스의 지방 조직에 있어서의 TNFα의 발현은 db/+m 마우스의 그것에 비교하여, 5배로 증가되어 있어, db/db 마우스의 지방 조직에 있어서 염증이 유발되어 있는 것을 확인했다.
특필해야 할 것은, 투여한 엔자민의 농도 의존적으로 db/db 마우스의 지방 조직에 있어서의 TNF-α의 mRNA의 발현량의 억제가 확인된 것인다. 특히, 1.0％ 농도의 엔자민 투여에서는, 컨트롤군에 비교하여, TNF-α의 mRNA의 발현을 40％ 억제했다.
또한, 도 4의 (b), (c)의 결과에서도 알 수 있듯이, 1.0％ 농도의 엔자민 투여에 의해, 단구 주화 인자(Monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1))와 인터류킨 6(IL-6)의 발현이, 컨트롤군에 비교하여 각각 50％, 60％ 억제되었다.
또한, 도 4의 (d)의 결과에서도 알 수 있듯이, 플라스미노겐 액티베이터 인히비터 1(Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1))의 발현은, 0.1％ 및 1.0％ 농도의 엔자민 투여의 양쪽에서 유의한 억제가 확인되었다.
이들 결과로부터, 엔자민의 투여는 db/db 마우스의 지방 조직에 있어서의 염증을 억제하는 것으로 확인된다.
또한, 전신의 염증 상태에 대한 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제의 효과를 검토하기 위해, db/db 마우스에 있어서의 혈중 TNF-α 농도를 측정했다. 도 4의 (e)의 결과에서도 알 수 있듯이, 컨트롤군(－ 표)의 45.2±6.5 pg/㎖에 비교하여 1.0％ 농도의 엔자민 투여를 한 실시예 2에서는, 혈중 TNF-α 농도가 27.2±6.4 pg/㎖로 된다는 유의한 억제가 확인되었다(p ＜ 0.05). 따라서, 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제는, 지방 조직의 염증 억제 효과와 마찬가지로, 전신의 염증도 억제하는 것을 알 수 있다.
도 4의 (f)의 결과에서도 알 수 있듯이, 항염증성 아디포사이토카인인 혈중 아디포넥틴 농도는, 엔자민의 투여 농도 의존적으로 증가하고, 특히 1.0％ 농도의 엔자민의 투여에 있어서는, 11.4±0.8 ㎍/m으로 되어 있고, db/db 컨트롤군의 8.1±0.7 ㎍/㎖에 대하여 l1.4배의 증가가 확인되었다. 이러한 점들로부터, 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제가, 비만 마우스에 있어서의 아디포사이토카인의 산생 파탄을 개선하고 있는 것을 알 수 있다.
<지방 조직에 있어서의 매크로파지의 침윤에 의한 인슐린 저항성의 개선제>
다음으로, 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제의 지방 조직에의 매크로파지 침윤에 대한 인슐린 저항성의 효과를 검토하기 위해, 비만 마우스의 지방 조직에 있어서의 F4/80(성숙 매크로파지의 마커)에 대한 조직 면역학적 해석을 행했다.
[조직 면역학적 해석]
마우스의 정소 상체 백색 지방 조직을 4℃의 조건하에서 12∼16시간, 4％ 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 4 ㎛ 두께의 파라핀 절편을 제작하고, 래트 모노클로날 항F4/80 항체(미국 AbD Serotec사 제조)와 반응시켰다. 그리고, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제를 결합한 2차 항체와 반응시켰다. 티라미드 시그널 증폭 시스템(미국 파킨엘마사 제조)을 이용하여, 양성 시그널을 가시화했다. 또한, 절편을 4',6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 후염색하고, 형광 현미경(캐논사 제조: E800)과 CCD 카메라(키엔스사 제조)를 이용하여 관찰했다. 각각의 마우스 개체로부터 제작한 파라핀 절편 중의 10 시야를 관찰하여, F4/80 발현 양성 세포의 핵의 수와 모든 세포의 핵의 수를, 화상 해석 소프트(NIH 이미지)를 이용하여 카운트하고, 전세포수에 대한 F4/80 양성 세포의 비율을 산출했다.
도 5의 면역 염색상이 나타내는 바와 같이, 우선, db/+m 마우스(도 5의 (a))에 비교하여, db/db 마우스(도 5의 (b))에서는, 지방 조직에 있어서의 F4/80 양성 세포의 수가 현저히 증가되어 있고, 이것은 매크로파지의 지방 조직에의 침윤이 현저히 증가되어 있는 것을 나타내고 있다.
그리고, 도 5의 (c), (d)에서도 알 수 있듯이, 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제의 0.1％, 1.0％ 투여에 의해, 농도 의존적으로 F4/80 양성 세포의 수의 감소가 관찰되었다.
또한 도 6의 (a)에 나타내는 바와 같이, F4/80 양성 세포의 수를 카운트하고, 전체 세포에 대한 비율을 산출한 바, 0.1％의 엔자민의 투여(47.4±5.1％)에서는, db/db 컨트롤군(54.5±2.4％)에 비교하여 유의차(p ＜ 0.05)는 확인되지 않았지만, 지방 조직에의 매크로파지 침윤을 억제하는 경향이 확인되고, 또한 1.0％의 엔자민 투여(42.8±2.3％)에서는, 매크로파지 침윤의 유의한 억제가 확인되었다.
또한, 매크로파지의 활성화 및 지방 조직의 염증을 확인하기 위해, 이하와 같이 「세포 배양」을 행하고, 「정량 리얼타임 폴리메라아제 연쇄 반응」에 의한 유전자 발현 정량 해석을 행했다.
[세포 배양]
마우스 매크로파지 배양 세포의 RAW264.7 세포(ATCC)를 10％ 소태아 혈청(FBS) 및 100 ㎎/mL의 페니실린스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 변법 배지에서 37℃, 5％ CO2 조건하에서 배양 유지했다. RAW264.7 세포를 1×106 세포/웰로 6웰 플레이트에 파주하고, 24시간 배양 후, 0.01％ 및 0.1％의 엔자민을 각각 첨가하고, 더욱 1 ㎍/㎖의 농도로 리포폴리사카라이드(LPS)를 첨가하고, 12시간 반응시켰다. 인산 생리 식염 완충액(PBS)으로 2회 세정 후, 세포로부터 RNA를 추출하고, 정량 리얼타임 폴리메라아제 연쇄 반응(정량 RT-PCR 반응)에 의한 유전자 발현 해석을 행했다.
[정량 리얼타임 폴리메라아제 연쇄 반응]
마우스의 정소 상체 백색 지방 조직(100 ㎎) 및 RAW264.7 세포로부터 RNA를 RNeasy Mini 키트(키아겐사 제조)를 이용하여 추출했다. 그리고, cDNA(환상 DNA)를 Super Script III 역전사 키트(라이프 테크놀로지즈사 제조)를 이용하여 합성했다. 발광 시약으로서 SYBR GREEN PCR Master Mix를 이용하고, StepOne Plus 리얼타임 PCR 장치(라이프 테크놀로지즈사 제조)로, 유전자 발현 정량 해석을 행했다. 유전자 발현 해석에 의해 정량화된 mRNA 량은, 내부 표준으로서 18s 리보소말 RNA에 의해 표준화하고, 단위는 임의 단위로 나타냈다.
도 6의 (b)에 나타내는 바와 같이, 상기한 마커 유전자의 발현 정량 해석의 결과는, 1.0％ 농도의 엔자민 투여군에서는, 컨트롤군에 비교하여, 지방 조직에 있어서의 Emr1 (F4/80) mRNA의 발현이 40％ 억제되어 있었다.
또한 도 6의 (c), (d)에 나타내는 바와 같이, 매크로파지의 활성화 마커 및 염증 상태의 마커인 CD68 및 톨 유사 수용체 4(Toll like receptor 4 (TLR4))의 발현도 각각 40％ 억제되어 있었다.
이들 결과로부터, 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제가 db/db 마우스의 지방 조직에의 염증성 매크로파지의 침윤을 억제하고 있는 것을 알 수 있다.
<지방 조직에 있어서의 산화 스트레스에 의한 인슐린 저항성의 개선제>
지방 조직에 있어서의 산화 스트레스에 대한 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제의 효과를 평가하기 위해, db/db 마우스의 정소 상체 백색 지방 조직에 있어서의 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH) 옥시다아제의 서브유닛(Nox2, p22phox 및 p47phox)의 유전자(mRNA) 발현량을 검토했다.
세포 배양 시험 및 정량 리얼타임 폴리메라아제 연쇄 반응에 대해서는, 상기한 「지방 조직에 있어서의 매크로파지의 침윤에 의한 인슐린 저항성의 개선」에 대한 실험 조작과 동일한 순서로 행하고, Nox2, p22phox 및 p47phox mRNA의 발현량을 조사했다.
도 7의 (a), (b), (c)에 나타내는 결과에서도 알 수 있듯이, Nox2, p22phox 및 p47phox의 각 mRNA의 발현량은, db/db 마우스에 있어서 db/+m 마우스에 비교하여, 현저히 증가되어 있어, db/db 마우스의 지방 조직에 있어서의 산화 스트레스가 항진되어 있는 것을 알 수 있다.
0.1％ 농도의 엔자민 투여에서는, 엔자민 비투여에 대한 유의차(P ＜ 0.05)는 확인되지 않았지만, 이들 NADPH 옥시다아제 서브유닛의 발현량을 억제하는 경향이 확인되었다. 또한 1.0％ 농도의 엔자민 투여에서는, Nox2, p22phox 및 p47phox의 유전자 발현 상승을 각각 40％, 30％ 및 40％ 정도 유의하게 억제했다.
이들 결과로부터, 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제가, db/db 마우스의 지방 조직에 있어서의 산화 스트레스를 억제하는 것을 알 수 있다.
<지방 조직에 있어서의 LPS 유도성의 염증 반응에 의한 인슐린 저항성의 개선제>
다음으로, 매크로파지에 있어서의 염증 반응에 대한 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제의 LPS 유도성의 염증 반응의 효과를 검토하기 위해, 마우스 매크로파지 배양 세포의 RAW264.7 세포를 이용하여, LPS 자극시의 TNF-α의 발현 상승에 대한 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제 첨가 효과를 검토했다.
세포 배양 시험 및 정량 리얼타임 폴리메라아제 연쇄 반응에 대해서는, 상기한 「지방 조직에 있어서의 매크로파지의 침윤에 의한 인슐린 저항성의 개선」에 대한 실험 조작과 동일한 순서로 행하고, TNF-α의 mRNA의 발현량을 조사했다.
즉, RAW264.7 세포에 있어서의 LPS(1 ㎍/㎖)의 존재하, 비존재하에 있어서의 0.01％ 및 0.1％ 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제의 12시간의 첨가 효과를 조사하고, 그 결과는, 도 8에 평균치±표준 오차로 나타내고, 도면 중의 **는 p ＜ 0.01(각 군 n = 3)로의 유의차가 있는 것을 나타내고 있다.
도 8의 결과에서도 알 수 있듯이, LPS 비존재하(－ 표)에 있어서는, 0.1％의 엔자민의 첨가에 의해, RAW264.7 세포에 있어서의 TNF-α의 발현량을 약간 증가했다.
그러나, LPS에 의해 현저히 발현이 유도된 TNF-α mRNA를 0.01％ 및 0.1％ 농도의 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제의 첨가군에서는 유의하게 억제되었다. 이러한 점들로부터, 엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제가 매크로파지에 있어서의 염증 반응을 억제하는 것을 알 수 있다.
[간장 및 근육에 있어서의 당 대사 및 지질 대사에의 영향]
엔자민을 유효 성분으로 하는 인슐린 저항성 개선제의 근육에 있어서의 당 대사 및 지질 대사에의 효과와, 간장에 대한 영향을 조사하기 위해, 상기와 동일하게 하여 db/db 마우스에 표준 고형식과 엔자민을 0.1％(평균 0.5 ㎎/kg 체중/일/마우스) 및 1.0％(평균 5.0 ㎎/kg 체중/일/마우스) 섞은 음용수(실시예 1, 2)를 6주령부터 8주간 사료와 함께 자유롭게 섭취시키고, 또한 비교예(컨트롤)로서 db/db 마우스에는 엔자민을 포함하지 않는 물을 급여했다. 또한, 다른 비교예(마른 컨트롤)로서 db/+m 마우스에는, 상기와 동일한 기간 동안에 표준 고형식과 물을 자유롭게 섭취시켰다.
상기 사육 시험된 각 마우스의 간장에 있어서의 GLUT2 유전자와 G6Pase 유전자(mRNA)의 발현, 또한 근육에 있어서의 GLUT4 유전자(mRNA)의 발현에 대하여, 또한 간장 및 근육에 있어서의 카르니틴·팔미토일·트랜스페라아제 1 유전자(mRNA)의 발현에 대하여, 유전적 수법(ELISA 법)에 의해 이하의 (a)∼(e)의 각 효소를 조사했다.
즉, (a) GLUT2(간장에 있어서 글루코오스를 세포 내에 도입하는 트랜스포터), (b) G6Pase(당 신생에 관한 효소), (c) CPT1a(지질 산화에 관련하는 미토콘드리아의 효소: 간장형), (d) GLUT4(근(筋)에 있어서 글루코오스를 세포 내에 도입하는 트랜스포터), (e) CPT1b(지질 산화에 관련하는 미토콘드리아의 효소: 근육형)에 대하여 각 mRNA의 발현량을 조사하고, 그 결과를 도 9 중에 나타냈다. 또, 동도면에는, 평균치±표준 오차를 부기하고, 도면 중의 **는 p ＜ 0.01(각 군 n = 3)로 유의차가 있는 것을 나타냈다.
도 9의 (a), (b)에 나타내는 결과에서도 알 수 있듯이, 엔자민 투여는, db/db 마우스의 간장에 있어서의 GLUT2 및 G6Pase의 mRNA 발현에 영향을 주지 않았다. 이 결과로부터, 엔자민이, 간장의 당 대사에 영향을 미치지 않는 것이 시사되었다.
도 9의 (d)에서도 알 수 있듯이, 근육에 있어서의 GLUT4의 mRNA 발현은, db/db 마우스에 있어서 db/+m 마우스에 비교하여 현저히 감소했다. 이것은 비만 마우스의 근육에 있어서의 글루코오스의 도입 관련 인자(GLUT4)의 발현이, 마른 마우스의 동인자의 발현에 비교하여 현저히 약했던 것을 나타내고, 한편, 1％ 농도의 엔자민 투여는, 비만 마우스의 근육에 있어서의 글루코오스 도입을 현저히 촉진했다.
다음으로, db/db 마우스의 간장과 근육 내에 있어서의 카르니틴·팔미토일·트랜스페라아제 1(CPT1: 지질 산화에 관련하는 미토콘드리아의 효소)의 유전자 발현에 대하여, 이하와 같이 평가했다.
도 9의 (c), (e)의 결과에서도 알 수 있듯이, CPT1a(간장형)와 CPT1b(근육형)의 mRNA 발현은, db/+m 마우스에 비교하여 db/db 마우스에 있어서 적었다. 또한, 도 9의 (c)와 같이, 비만 마우스의 간장에 있어서의 CPT1b의 mRNA 발현은, 엔자민의 투여 농도에 영향을 받지 않았다. 한편, 도 9의 (e)와 같이, 비만 마우스의 근육에 있어서의 CPT1b의 mRNA 발현은, 1％ 농도의 엔자민의 투여에 있어서 가장 현저했다.
이와 같이 비만 마우스의 간장과 근육 내에 있어서의 지방 연소에 관한 효소(CPT1a, b)의 발현은, 마른 마우스의 경우에 비교하여 유의하게 적었다. 이에 대하여, 1％ 농도의 엔자민의 투여는, 근육 내에 있어서의 지방 연소 효소를 증가시키고, 간장 내의 지방 연소 효소에는 영향을 주지 않는 것을 알 수 있다.
이들 시험 결과로부터 보아, 엔자민의 투여가, 간장에 영향을 미치지 않고, db/db 마우스의 근육 내에 있어서의 글루코오스 흡수와 지질 산화를 개선하는 것으로 확인되었다.
산업상 이용 가능성
인슐린 저항성 개선제는, 내장 비만에 의한 인슐린 저항성에 의해 초래되는 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있는 것이고, 예컨대 지질 대사 이상, 당 대사 이상, 아디포사이토카인의 산생 밸런스 이상, 지방 조직에 대한 산화 스트레스의 항진 등을 예방하고 개선하기 위한 인슐린 저항성 개선제가 되는 것이다. 보다 구체적으로는, 비만 세포 조직에 대한 지질 대사 이상의 억제제 또는 당 대사 이상의 억제제, 아디포사이토카인 산생 밸런스 조정제, 비만 지방 조직의 염증·산화 스트레스 억제제, 비만 세포 조직의 매크로파지 저해(침윤 억제)제 등이다.
또한, 본 발명의 인슐린 저항성 개선제를 여러가지 음식품에 함유시키면, 인슐린 저항성 질환 예방용의 건강 보조 식품이 되고, 예컨대 지질 대사 이상 예방용의 건강 보조 식품 또는 당 대사 이상 예방용의 건강 보조 식품, 아디포사이토카인 산생 실조 예방용의 건강 보조 식품, 비만 지방 조직의 염증·산화 스트레스 예방용의 건강 보조 식품, 비만 세포 조직의 매크로파지 저해(침윤 억제) 예방용의 건강 보조 식품 등이다.
Claims (6)
- 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AK(수탁 번호: FERM P-18291)를 접종하고, 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 유효 성분으로서 함유하는 아디포사이토카인의 산생 밸런스 조정제.
- 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AK(수탁 번호: FERM P-18291)를 접종하고, 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 유효 성분으로서 함유하는 지방 조직의 염증 또는 산화 스트레스 억제제.
- 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AK(수탁 번호: FERM P-18291)를 접종하고, 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 유효 성분으로서 함유하는 지방 조직의 매크로파지 침윤 억제제.
- 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AK(수탁 번호: FERM P-18291)를 접종하고, 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 유효 성분으로서 함유하는 아디포사이토카인의 산생 실조 예방용 건강 보조 식품.
- 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AK(수탁 번호: FERM P-18291)를 접종하고, 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 유효 성분으로서 함유하는 지방 조직의 염증 또는 산화 스트레스 예방용 건강 보조 식품.
- 전분을 아밀라아제로 가수 분해한 당화물을 배지용 기재로 하고, 이것에 효모 엑기스를 첨가하여 발효용 배지를 조제하고, 이 배지에 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) AK(수탁 번호: FERM P-18291)를 접종하고, 발효 및 숙성시킨 후, 생성된 액상 성분을 유효 성분으로서 함유하는 지방 조직의 매크로파지 침윤 예방용 건강 보조 식품.
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