WO2016067360A1 - インスリン抵抗性改善剤およびインスリン抵抗性疾患予防用の健康補助食品 - Google Patents

インスリン抵抗性改善剤およびインスリン抵抗性疾患予防用の健康補助食品 Download PDF

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WO2016067360A1
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insulin resistance
mice
enzamin
insulin
improving agent
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理 松尾
行識 田村
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株式会社エンザミン研究所
理 松尾
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/328—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having effect on glycaemic control and diabetes

Definitions

  • This invention improves insulin resistance to prevent and ameliorate diseases caused by insulin resistance due to visceral obesity, such as abnormal lipid metabolism, abnormal glucose metabolism, abnormal production balance of adipocytokines, increased oxidative stress on adipose tissue, etc.
  • the present invention relates to an agent and a health supplement for preventing insulin resistance disease.
  • Metabolic syndrome is a pathological condition characterized by visceral obesity, impaired glucose tolerance, hypertension and dyslipidemia, and is known to be a major cause of type 2 diabetes and arterial thrombosis. Visceral obesity and insulin resistance are considered to be the beginning of metabolic syndrome, and it is extremely important to develop new substances that can prevent and treat obesity and insulin resistance.
  • inflammation markers are used as major predictive markers for arteriosclerosis.
  • Adipose tissue is composed of many physiologically active substances collectively called adipocytokines such as leptin, adiponectin, tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), monocyte chemotactic factor (MCP-1) and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1). Recent studies have revealed that it is an important endocrine organ that releases.
  • adipocytokines such as leptin, adiponectin, tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), monocyte chemotactic factor (MCP-1) and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1).
  • adipose tissue accumulated by visceral obesity has a disruption in the production balance of inflammatory and anti-inflammatory adipocytokines, inflammatory changes in the adipose tissue are involved in the development of various symptoms of metabolic syndrome, In particular, it is thought to cause type 2 diabetes and thrombosis.
  • Enzamin (registered trademark), which is this fermented metabolite extract, is a specific bacillus selected by repeated subculture in a high or low temperature growth environment, ultraviolet light or X-ray irradiation, or an acidified growth environment. -This is an extract produced by the subtilis AK strain. About this fermented metabolite extract, the inventors of the present application have demonstrated anti-fibrinolytic activity-enhancing action at the in vivo level of the mouse and the cell level using vascular endothelial cells. It has been disclosed that it has a thrombus effect (Patent Document 2 below).
  • the problem of the present invention is to solve the above-described problems so that the predetermined fermented metabolite extract can be implemented for a novel use, that is, the predetermined fermented metabolite extract, Enzamin (registered trademark), Clarify insulin resistance due to visceral obesity, and can prevent insulin resistance disease and insulin resistance disease using it, in order to broadly prevent diseases due to insulin resistance To make health supplements.
  • the predetermined fermented metabolite extract Enzamin (registered trademark)
  • Clarify insulin resistance due to visceral obesity Clarify insulin resistance due to visceral obesity, and can prevent insulin resistance disease and insulin resistance disease using it, in order to broadly prevent diseases due to insulin resistance To make health supplements.
  • the inventors of the present application use obese model mice, db / db mice, to study in detail the effects of Enzamin (registered trademark) containing a specific fermented metabolite extract on insulin resistance and the state of adipokine secretion failure
  • Enzamin registered trademark
  • lipid metabolism abnormality, glucose metabolism abnormality, adipocytokine production balance abnormality, oxidative stress increase to adipose tissue, etc. are improved and found to be applicable to new applications, It has been completed.
  • a predetermined fermented metabolite extract is applied to a novel use, and a saccharified product obtained by hydrolyzing starch with amylase is used as a base material for culture medium, and yeast extract is added thereto.
  • a medium for fermentation is prepared, inoculated with Bacillus subtilis AK (accession number: FERM P-18291), fermented and matured, and then the insulin resistance improving agent containing the produced liquid component as an active ingredient It was.
  • the insulin resistance improving agent having the above-described configuration according to the present invention contains a fermented metabolite that has been fermented and matured under predetermined conditions as an active ingredient, thereby improving insulin resistance due to various factors.
  • the insulin resistance improving agent of the present invention is for improving insulin resistance due to, for example, abnormal lipid metabolism or abnormal glucose metabolism, and increases production of inflammatory adipocytokines or decreases production of anti-inflammatory adipocytokines in adipose tissue.
  • Insulin resistance improvement by improving oxidative stress on adipose tissue, improving insulin resistance by inflammation or macrophage infiltration in adipose tissue, or improving insulin resistance Become an agent.
  • a food containing such an insulin resistance ameliorating agent is safe and can take the above-mentioned active ingredient on a daily basis, and becomes a health supplement that can prevent various diseases caused by insulin resistance.
  • the present invention is an insulin resistance improving agent containing a fermented metabolite fermented and aged under predetermined conditions as an active ingredient
  • the predetermined fermented metabolite extract will be used for new applications, for example, lipid metabolism.
  • an advantage of becoming an insulin resistance ameliorating agent that is effective for improving the disease.
  • a food containing such an insulin resistance improving agent can widely prevent a disease caused by insulin resistance, and has an advantage of becoming a new health supplement for preventing the disease.
  • the insulin resistance improving agent of this invention contains a liquid component obtained by fermenting and ripening starch with a predetermined fungus as an active ingredient, and the active ingredient is a saccharified product obtained by hydrolyzing starch containing corn starch or the like with amylase.
  • a yeast extract is added as a nitrogen source to prepare a fermentation medium. This medium is inoculated with a predetermined Bacillus subtilis AK (accession number: FERM P-18291), fermented and After aging, the produced liquid component is fractionated.
  • starch obtained by hydrolyzing starch containing corn starch or the like separated and purified from corn grain with amylase can be used.
  • crude corn starch can be used in place of the purified corn starch.
  • soy flour, rice bran, or a mixture of these can be used as a medium substrate.
  • yeast extract used as a nitrogen source for fermentation medium is generally used for fermenting or brewing foods, such as dried water-soluble components extracted by digesting cells of Saccharomyces cerevisiae Meyen. What can be added as a nitrogen source in bacterial culture can be used.
  • an organic substance such as protein, inorganic salts, and the like can be blended in the fermentation medium used for the production of the active ingredient.
  • organic substances include soybean protein and other vegetable proteins
  • inorganic salts include calcium chloride, sodium chloride, and sodium phosphate.
  • sugars include sucrose, glucose (glucose), and starch syrup.
  • the fermenting bacteria inoculated into the fermentation medium prepared as described above is Bacillus subtilis AK, which is Bacillus natto. ) Deposited as “FERM P-18291”.
  • Lactobacillus Lactobacillus that does not inhibit the growth of Bacillus subtilis AK, Streptococcus lactic acid cocci, Streptococcus yeast, Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus oryzae cells Can be inoculated with Bacillus subtilis AK.
  • the fermentation medium used for the production of the active ingredient of the food of the present invention if desired, does not inhibit the growth of Bacillus subtilis AK, plant extracts such as Chinese cabbage, cabbage, carrot, medicinal carrot, parsley, celery, onion Can be added.
  • Bacillus subtilis AK is an ordinary natto bacterium, Bacillus subtilis, UV, X-ray irradiation, high / low temperature environment (100 ° C, 0 ° C), competition with lactic acid bacteria, spore-forming medium [meat extract 5.0 wt. %, Peptone 10.0%, sodium chloride 5.0%, agar 15.0%, vegetable (cabbage, carrot, celery, parsley) press juice 65.0% by weight] It is a resistant bacterium that was discovered.
  • the Bacillus subtilis AK strain thus obtained had the following mycological properties and could be confirmed to be Bacillus subtilis.
  • the Bacillus subtilis AK strain (Accession No .: FERM P-18291) used in the present invention has a difference in homology evaluation due to differences in classification indices such as mycological properties, and the sequence of the 16s rRNA gene In the classification search using the database (MicroSeqID: ABI) using the database, high homology with Paniebacillus polymyxa has been recognized, but the following (a) morphological properties, (b) cultural According to the phylogenetic classification of the nature and the (c) mycological nature of the biochemical properties, an identification result of Bacillus subtilis is obtained.
  • the above-mentioned predetermined strain deposited at the Patent Microorganism Deposit Center is utilized using the latter result.
  • Morphological properties 1 Cell shape and size Neisseria gonorrhoeae 1.0-1.2 ⁇ 3.0-50 ⁇ m 2 No presence or absence of cell polymorphism 3 Presence or absence of motility (periflagellate flagella) 4 With or without spore Ellipse Almost the center of the cell
  • Biochemical properties 1 Gram staining Positive 2 Nitrate reduction Positive 3 MR test Negative 4 VP test Positive 5 Indole production Negative 6 Hydrogen sulfide production Negative 7 Use of citric acid Positive 8 Catalase positive 9 Growth range pH 5.5-7.0 Temperature 25 °C ⁇ 40 °C
  • the fermentation conditions preferably employed in the present invention are pH 4.5 to 6.5 and 28 to 32 ° C. for 2 months or longer. If the fermentation conditions are higher than the above in the acidic range and below the predetermined temperature, it is estimated that the predetermined Bacillus natto used in the present invention will not efficiently assimilate the sugar and nitrogen sources even if it is fermented for more than 2 months. The desired effect is not obtained sufficiently. Exceeding the above acidic range, exceeding a predetermined temperature under neutral or alkaline conditions, and at a high temperature, fermentation is insufficient and the predetermined Bacillus natto does not efficiently assimilate the sugar and nitrogen sources, and the obtained health nutrition food is the above Similarly, the desired effect cannot be obtained sufficiently.
  • the aging conditions preferably employed in the present invention are pH 4.0 to 6.0 and 13 to 17 ° C. for 4 months or longer.
  • amino acids, lipoproteins, lipopolysaccharides (lipopolysaccharides), lipids, etc. that have various activities as fermentation products are sufficiently low molecular weight even after aging for 4 months or more. In some cases, the expected effect is not sufficiently obtained.
  • the above-mentioned acidic range is exceeded under a neutral or alkaline condition and the temperature is aged at a high temperature, the activity is estimated to decrease, and the resulting health supplement does not provide the desired effect There is.
  • a well-known separation means such as filtration or centrifugation may be employed, and the obtained food stock solution can be used as it is, but is concentrated for distribution and storage. It may be used after appropriately diluted.
  • the active ingredient of the insulin resistance improving agent of the present invention can be manufactured by the manufacturing process as described above, but commercially available products can also be used.
  • Enzamin registered trademark
  • Enzamin concentrate EPM-HL: trade name
  • It can be used in conversion.
  • the insulin resistance-improving agent of the present invention comprises 0.1 to 1.0% by mass of a food or drinkable material such as water or an excipient, using the above-described enzamine concentrate (ENM-HL: trade name) as a predetermined liquid component. %, And its effectiveness has been confirmed when fed to mice.
  • ENM-HL trade name
  • the Enzamin concentrate ENM-HL: trade name
  • the average intake is 0.5 mg / kg body weight / day / mouse, and the concentration is 1.0% by mass.
  • the average intake is 5.0 mg / kg body weight / day / mouse, and the effectiveness is recognized.
  • the health supplement for disease prevention due to insulin resistance of the present invention comprises an active ingredient prepared as described above and excipients conventionally used in the food field (for example, starch or dextrin, cellulose, lactose, Maltose, reduced lactose, reduced maltose, sorbitol, mannitol, erythritol, xylitol, etc.) and adjuvants (eg, solvents, dispersion media, coatings, stabilizers, diluents, preservatives, preservatives, fungicides, antifungal reagents, Isoosmotic reagents, absorption inhibitors, disintegrating agents, emulsifiers, binders, lubricants, dyes, etc.) and mixed with pharmaceutical preparations conventionally used in the field of health supplements, such as tablets, capsules, It can be produced in the form of granules, powders, extracts, solutions, syrups, suspensions, emulsions
  • the health supplement for preventing diseases due to insulin resistance of the present invention is the above-mentioned prescribed liquid component of Enzamin (registered trademark) stock solution (ENM: trade name), and the amount of active ingredient per day described above.
  • Enzamin registered trademark
  • EMM trade name
  • the amount of active ingredient per day described above for example, about 0.05 to 100% by mass, preferably about 0.1 to 90% by mass, more preferably about 1 to 85% by mass, and further preferably about 5 to It can be contained in an amount of 80% by mass, most preferably about 10-50% by mass.
  • [Preparation of active ingredient of insulin resistance improving agent] 50 kg of purified water was added to 2.3 kg of yellow corn starch, 0.5 kg of soybean peptone, 0.5 kg of rice bran juice, 80 g of calcium chloride, and 150 g of sodium chloride, and dissolved by heating. Next, this was cooled, and 40 g of amylase was added to allow sufficient saccharification. After completion of saccharification, 1.5 kg of granulated sugar, 1.5 kg of glucose (glucose), 450 g of yeast extract, 1.5 kg of starch syrup, 80 g of sodium phosphate, 5 kg of pressed vegetables (total of cabbage, carrot, celery, parsley), and Purified water was added to bring the total volume to 150 kg.
  • Example 1 and 2 comparative example
  • ⁇ Insulin resistance improving agent with abnormal lipid metabolism, insulin resistance improving agent with abnormal sugar metabolism> Drinking water containing 0.1% by mass of the active ingredient enzamine obtained as described above (Example 1), 1.0% by mass of drinking water of Enzamine (Example 2), and completely containing Enzamine. Water not containing (Comparative Example) was prepared, and the suitability as an insulin resistance ameliorating agent of abnormal lipid metabolism or abnormal glucose metabolism in Examples 1 and 2 by oral ingestion to mice was evaluated.
  • mice Out of 5-week-old male db / db mice (obese model mice) and heterogeneous db / + m mice (lean model mice) purchased from Charles River, Japan, db / db mice were fed with standard solid food and enzamin. Drinking water (Examples 1 and 2) mixed at 0.1% (average 0.5 mg / kg body weight / day / mouse) and 1.0% (average 5.0 mg / kg body weight / day / mouse) at 6 weeks of age More than 8 weeks. As a comparative example (control), water containing no enzamin was given.
  • mice were used as a lean control, and a standard solid food and drinking water were freely ingested for the same period. These mice were bred in a 12-hour light-dark cycle, and all animal experiments were conducted according to the animal experiment guidelines of the Kinki University School of Medicine.
  • Example 1 for test mice was used.
  • mice that were orally ingested under exactly the same conditions as ingestion of 2 the changes in body weight, body fat percentage, and subcutaneous fat percentage were examined, and the results are shown in FIG.
  • % described in the figure is mass%.
  • body composition analysis tests were conducted for the measurement of body fat percentage, visceral fat mass and subcutaneous fat mass.
  • Body fat composition was analyzed by computed tomography (CT analysis). That is, after anesthetizing the mouse with isoflurane, the body fat composition was measured using a laboratory animal CT analyzer (manufactured by Hitachi Aloka Medical, Inc .: Lacita LCT-200). At that time, the first lumbar spine to the fifth lumbar vertebra of the experimental animal were scanned at 1 mm intervals to create continuous slice tomographic images, and then quantified using Lasita software (version 3.40). Visceral fat and subcutaneous fat were distinguished by the position of abdominal muscles, and total fat mass, visceral fat weight and subcutaneous fat weight were calculated by integrating all slice images.
  • CT analysis computed tomography
  • the serum triglyceride concentration in db / db mice is 137.0 ⁇ 8.0 mg / dl by administration of 0.1% enzamin, which is significantly different from 158.1 ⁇ 12.4 mg / dl in the control group
  • the 1% concentration of enzamin-treated group (122.0 ⁇ 8.4 / mg / dl) was significant (p ⁇ 0.05, marked with * in the figure) compared to the db / db mouse group not administered with enzamin. A decrease was observed.
  • the plasma insulin concentration was 2.05 in the db / db control group compared to db / + m mice (indicated by m in the figure. 0.12 ⁇ 0.04 ng / ml). Although it was ⁇ 0.22ng / ml, showing a markedly high value (p ⁇ 0.01), 0.1% enzamin administration group (2.72 ⁇ 0.27ng / ml), 1.0% enzamin administration group (2.72 ⁇ 0.30ng) / ml), and no effect on plasma insulin levels due to enzamin administration was observed.
  • IPGTT intraperitoneal glucose tolerance test
  • IPITT insulin tolerance test
  • mice were fasted for 16 hours, and then glucose was administered intraperitoneally at a concentration of 1.5 mg / kg body weight. The result is shown in FIG.
  • mice were fasted for 6 hours, and then regular human insulin was intraperitoneally administered at a concentration of 1 U / kg body weight. The result is shown in FIG.
  • Blood samples are collected before and after administration, and blood glucose concentration is measured using Glutest Ace (manufactured by Sanwa Chemical Laboratory), before administration (0 minutes) and after administration (30 to 90 minutes). The results are shown in FIG.
  • the effects of Enzamin on the expression and secretion of adipocytokines in Examples 1 and 2 were examined, and the suitability as an insulin resistance improving agent having these effects was evaluated. That is, the same orally ingestion test to mice as described above was conducted, and the following tests were conducted on Examples 1 and 2, comparative examples using db / db mice, and controls using db / + m mice. Is shown in FIG.
  • the expression of TNF ⁇ in the adipose tissue of db / db mice increased 5-fold compared to that of db / + m mice. It was confirmed that inflammation was induced in adipose tissue. It should be noted that suppression of the expression level of TNF- ⁇ mRNA in the adipose tissue of db / db mice was observed depending on the concentration of enzamin administered. In particular, administration of 1.0% enzamin suppressed the expression of TNF- ⁇ mRNA by 40% compared to the control group.
  • monocyte chemoattractant protein 1 MCP-1
  • interleukin 6 monocyte chemoattractant protein 6
  • Expression of (IL-6) was suppressed by 50% and 60%, respectively, compared with the control group.
  • Example 2 in which 1.0% concentration of enzamin was administered compared to 45.2 ⁇ 6.5 pg / ml in the control group (-mark), blood TNF- ⁇ Significant suppression was observed at a concentration of 27.2 ⁇ 6.4 pg / ml (p ⁇ 0.05). Therefore, it can be seen that the insulin resistance improving agent containing enzamin as an active ingredient also suppresses inflammation of the whole body as well as the inflammation suppressing effect of adipose tissue.
  • the blood adiponectin concentration which is an anti-inflammatory adipocytokine
  • the sections were post-stained with 4 ′, 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) and observed using a fluorescence microscope (Canon: E800) and a CCD camera (Keyence). Observe 10 fields in the paraffin section prepared from each mouse individual, count the number of nuclei of F4 / 80 expression positive cells and the number of nuclei of all cells using image analysis software (NIH image), The ratio of F4 / 80 positive cells to the total number of cells was calculated.
  • DAPI 6-diamino-2-phenylindole
  • the db / + m mouse As shown in the immunostained image of FIG. 5, first, compared with the db / + m mouse (FIG. 5 (a)), the db / db mouse (FIG. 5 (b)) is positive for F4 / 80 in the adipose tissue. The number of cells has increased significantly, indicating that macrophage infiltration into adipose tissue has increased significantly. As is clear from FIGS. 5 (c) and 5 (d), administration of 0.1% and 1.0% of an insulin resistance improving agent containing enzamin as an active ingredient is positive for F4 / 80 in a concentration-dependent manner. A decrease in the number of cells was observed.
  • RAW264.7 cells (ATCC) of cultured mouse macrophages were cultured and maintained in Dulbecco's modified medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 100 mg / mL penicillin streptomycin at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • RAW264.7 cells are seeded on a 6-well plate at 1 ⁇ 10 6 cells / well, cultured for 24 hours, 0.01% and 0.1% enzamine are added, and lipoproteins at a concentration of 1 ⁇ g / ml are added.
  • Polysaccharide (LPS) was added and allowed to react for 12 hours. After washing twice with phosphate physiological saline buffer (PBS), RNA was extracted from the cells, and gene expression analysis was performed by quantitative real-time polymerase chain reaction (quantitative RT-PCR reaction).
  • RNA was extracted from mouse epididymal white adipose tissue (100 mg) and RAW264.7 cells using RNeasy Mini kit (Qiagen). Then, cDNA (circular DNA) was synthesized using a Super Script III reverse transcription kit (manufactured by Life Technologies). SYBR GREEN PCR Master Mix was used as a luminescence reagent, and gene expression quantitative analysis was performed with a StepOne Plus real-time PCR apparatus (manufactured by Life Technologies). The amount of mRNA quantified by gene expression analysis was normalized with 18s ribosomal RNA as an internal standard, and the unit was expressed in arbitrary units.
  • the results of quantitative analysis of the expression of the marker gene described above show that the expression of Emr1 (F4 / 80) mRNA in the adipose tissue is greater in the 1.0% concentration of enzamin administration group than in the control group. Was suppressed by 40%. Furthermore, as shown in FIGS. 6 (c) and 6 (d), the expression of macrophage activation marker and inflammatory state marker CD68 and Toll like receptor 4 (TLR4) was also suppressed by 40%, respectively. From these results, it can be seen that an insulin resistance improving agent containing enzamin as an active ingredient suppresses infiltration of inflammatory macrophages into the adipose tissue of db / db mice.
  • ⁇ Improvement of insulin resistance by oxidative stress in adipose tissue In order to evaluate the effect of an insulin resistance improving agent containing enzamin as an active ingredient against oxidative stress in adipose tissue, a subunit of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase in epididymal white adipose tissue of db / db mice The gene (mRNA) expression level of (Nox2, p22phox and p47phox) was examined.
  • NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the cell culture test and quantitative real-time polymerase chain reaction were carried out in the same manner as the experimental procedure for “improving insulin resistance by macrophage infiltration in adipose tissue” described above, and the expression levels of Nox2, p22phox and p47phox mRNA were examined. .
  • db / db mice were treated with 0.1% standard solid food and enzamin as described above. Feeding drinking water (Examples 1 and 2) mixed with (average 0.5 mg / kg body weight / day / mouse) and 1.0% (average 5.0 mg / kg body weight / day / mouse) from 6 weeks of age for 8 weeks.
  • db / db mice were given water not containing enzamin.
  • db / + m mice were allowed to freely take a standard solid food and water during the same period.
  • GLUT2 gene and G6Pase gene mRNA
  • mRNA GLUT4 gene
  • mRNA carnitine palmitoyltransferase 1 gene
  • GLUT4 mRNA expression in muscle was significantly reduced in db / db mice compared to db / + m mice. This indicates that the expression of glucose uptake-related factor (GLUT4) in the muscles of obese mice was significantly weaker than that of lean mice, whereas administration of 1% concentration of enzamin resulted in the muscles of obese mice. Significantly promoted glucose uptake.
  • CPT1 carnitine palmitoyltransferase 1
  • Insulin resistance improving agents can be used for the prevention or treatment of diseases caused by insulin resistance due to visceral obesity, such as abnormal lipid metabolism, abnormal glucose metabolism, abnormal production balance of adipocytokines, oxidative stress on adipose tissue It becomes an insulin resistance improving agent for preventing and improving hypersensitivity. More specifically, an inhibitor of abnormal lipid metabolism or an inhibitor of abnormal glucose metabolism, an adipocytokine production balance regulator, an inhibitor of inflammation / oxidative stress in obese adipose tissue, macrophage inhibition (invasion of mast cell tissue) Inhibitor).
  • diseases caused by insulin resistance due to visceral obesity such as abnormal lipid metabolism, abnormal glucose metabolism, abnormal production balance of adipocytokines, oxidative stress on adipose tissue It becomes an insulin resistance improving agent for preventing and improving hypersensitivity. More specifically, an inhibitor of abnormal lipid metabolism or an inhibitor of abnormal glucose metabolism, an adipocytokine production balance regulator, an inhibitor of inflammation / oxidative stress in obese adipos
  • the insulin resistance improving agent of the present invention becomes a health supplement for preventing insulin resistance disease, for example, a health supplement for preventing lipid metabolism abnormality or a sugar metabolism disorder prevention Health supplements for preventing adipocytokine production malfunction, health supplements for preventing inflammation and oxidative stress in obese adipose tissue, health supplements for preventing macrophage inhibition (infiltration suppression) in mast cell tissues, etc. .

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Abstract

　澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物を培地用基材とし、これに酵母エキスを添加して発酵用培地を調製し、この培地にバチルス・ズブチリスＡＫ（ＦＥＲＭ　Ｐ－１８２９１）を接種し、発酵および熟成させた後、生成した液状成分を有効成分として含有するインスリン抵抗性改善剤とする。様々なインスリン抵抗性を改善し、例えば脂質代謝異常または糖代謝異常、炎症性アディポサイトカインの産生亢進または抗炎症性アディポサイトカインの産生低下の調整、炎症またはマクロファージの浸潤によるインスリン抵抗性を改善し、酸化ストレスの亢進によるインスリン抵抗性改善剤になり、またインスリン抵抗性による様々な疾患を予防できる健康補助食品となる。

Description

インスリン抵抗性改善剤およびインスリン抵抗性疾患予防用の健康補助食品
　この発明は、内臓肥満によるインスリン抵抗性によってもたらされる疾患、例えば脂質代謝異常、糖代謝異常、アディポサイトカインの産生バランス異常、脂肪組織に対する酸化ストレスの亢進などを予防し改善するためのインスリン抵抗性改善剤およびインスリン抵抗性疾患予防用の健康補助食品に関する。
　メタボリックシンドロームは、内臓肥満、耐糖能異常、高血圧および脂質異常症を特徴とする病態であり、２型糖尿病や動脈血栓症の主要な原因ともなることが知られている。
　内臓肥満とインスリン抵抗性は、メタボリックシンドロームの端緒と考えられており、肥満とインスリン抵抗性を予防すると共に、その治療も可能な新規物質の開発は極めて重要である。
　また、肥満の病態には慢性炎症が認められ、全身の炎症マーカーの上昇は、肥満とインスリン抵抗性に深く関連し、臨床的には動脈硬化の主要な予測マーカーとして炎症マーカーが利用される。
　脂肪組織は、レプチン、アディポネクチン、腫瘍壊死因子（TNF-α）、単球走化因子（MCP-1）およびプラスミノゲンアクチベータインヒビター１（PAI-1）など、アディポサイトカインと総称される多くの生理活性物質を放出する重要な内分泌臓器であることが近年の研究で明らかになった。
　そして、内臓肥満で蓄積した脂肪組織には、炎症性および抗炎症性アディポサイトカインの産生バランスの破綻が認められることから、脂肪組織における炎症性変化がメタボリックシンドロームの様々な症状の進展に関与し、特に２型糖尿病や血栓症の原因になると考えられている。
　ところで、健康を増進させる保健栄養食品として、生体に必要な諸成分を体内で効率よく生成するように代謝活性を高め、またＴリンパ球を幼若化させて免疫機能を増強する作用のある発酵代謝物エキスとして市販のエンザミン（登録商標）が知られている（下記特許文献１）。
　この発酵代謝物エキスであるエンザミン（登録商標）は、高温もしくは低温の生育環境、紫外線もしくはＸ線が照射され、または酸性化された生育環境などにおいて継代培養を繰り返して選抜された特定のバチルス・ズブチリスＡＫ株が産生する抽出物であり、この発酵代謝物エキスについて、本願の発明者らは、マウスの生体内レベルおよび血管内皮細胞を用いた細胞レベルで、線溶活性亢進作用などの抗血栓効果を有することを開示した（下記特許文献２）。
特許第３９０２０１５号公報 特開２０１２－１４３１８７号公報
　しかし、上記したように公知技術では、上記の発酵代謝物エキスであるエンザミン（登録商標）について内臓肥満に伴うインスリン抵抗性に関する知見はなく、インスリン抵抗性の改善効果を確実に有している薬剤や食品として利用されていなかった。
　そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して所定発酵代謝物エキスを新規な用途で実施が可能であるように、すなわち所定の発酵代謝物エキスであるエンザミン（登録商標）が、内臓肥満によるインスリン抵抗性による疾患に対して改善作用を奏することを明らかにし、インスリン抵抗性による疾患を広く予防できるように、インスリン抵抗性改善剤およびそれを用いたインスリン抵抗性疾患を予防可能な健康補助食品を作出することである。
　本願の発明者らは、肥満モデルマウスのdb/dbマウスを用い、インスリン抵抗性やアディポサイトカインの分泌破綻状態に対して所定発酵代謝物エキスを含有するエンザミン（登録商標）の作用を詳細に研究し、脂質代謝異常、糖代謝異常、アディポサイトカインの産生バランス異常、脂肪組織に対する酸化ストレスの亢進などを改善することを証明し、新たな用途に適用可能であることを見出すことにより、この発明を完成させたものである。
　すなわち、この発明においては、上記課題を解決して所定の発酵代謝物エキスを新規な用途に適用し、澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物を培地用基材とし、これに酵母エキスを添加して発酵用培地を調製し、この培地にバチルス・ズブチリスＡＫ（受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ－１８２９１）を接種し、発酵および熟成させた後、生成した液状成分を有効成分として含有するインスリン抵抗性改善剤としたのである。
　この発明に係る上記構成のインスリン抵抗性改善剤は、所定の条件で発酵および熟成した発酵代謝物を有効成分として含有し、それによって種々の要因によるインスリン抵抗性を改善できる。
　この発明のインスリン抵抗性改善剤としては、例えば脂質代謝異常または糖代謝異常によるインスリン抵抗性を改善するものであり、また脂肪組織における炎症性アディポサイトカインの産生亢進または抗炎症性アディポサイトカインの産生低下によるインスリン抵抗性を改善するものであり、また脂肪組織における炎症またはマクロファージの浸潤によるインスリン抵抗性を改善するものであり、または脂肪組織に対する酸化ストレスの亢進によるインスリン抵抗性を改善するインスリン抵抗性改善剤になる。
　このようなインスリン抵抗性改善剤を含有する食品は、安全であって日常的に上記有効成分を摂取することができるものであり、インスリン抵抗性による様々な疾患を予防できる健康補助食品となる。
　この発明は、所定条件で発酵および熟成した発酵代謝物を有効成分として含有するインスリン抵抗性改善剤としたので、所定の発酵代謝物エキスが新規な用途で利用されることになり、例えば脂質代謝異常もしくは糖代謝異常、または脂肪組織における炎症性アディポサイトカインの産生亢進もしくは抗炎症性アディポサイトカインの産生低下、脂肪組織における炎症またはマクロファージの浸潤、または脂肪組織に対する酸化ストレスの亢進というインスリン抵抗性によってもたらされる疾患に対して改善効果が奏されるインスリン抵抗性改善剤になる利点がある。
　また、このようなインスリン抵抗性改善剤を含有する食品は、インスリン抵抗性による疾患を広く予防できるものとなり、当該疾患を予防する新規な健康補助食品となる利点がある。
（ａ）各試験マウス群の体重を示す図表、（ｂ）各試験マウス群の体脂肪率を示す図表、（ｃ）各試験マウス群の内臓脂肪量を示す図表、（ｄ）各試験マウス群の試験後の皮下脂肪量を示す図表 （ａ）各試験マウス群の血清トリグリセリド濃度を示す図表、（ｂ）各試験マウス群の血清総コレステロール濃度を示す図表、（ｃ）各試験マウス群の血漿グルコース濃度を示す図表、（ｄ）各試験マウス群の血漿インスリン濃度を示す図表 （ａ）グルコース負荷テストの結果を示し、各試験マウス群の試験時間と血漿グルコース濃度との関係を示す図表、（ｂ）インスリン負荷テストの結果を示し、各試験マウス群の試験時間と血漿グルコース濃度との関係を示す図表 （ａ）各試験マウス群のTNF-αのmRNA発現量を示す図表、（ｂ）各試験マウス群のMCP-1のmRNA発現量を示す図表、（ｃ）各試験マウス群のIL-6のmRNA発現量を示す図表、(ｄ)各試験マウス群のPAI-1のmRNA発現量を示す図表、(e)各試験マウス群の血清TNF-α濃度を示す図表、(e)各試験マウス群の血清アディポネクチン濃度を示す図表 （ａ）db+ｍマウス（コントロール群）の脂肪組織の免疫染色写真、（ｂ）db/dbマウス（コントロール群）の脂肪組織に対する免疫染色写真、（ｃ）db/dbマウス（エンザミン0.1％添加群）の脂肪組織に対する免疫染色写真、（ｄ）db/dbマウス（エンザミン1.0％添加群）の脂肪組織に対する免疫染色写真 （ａ）各試験マウス群のF4/80陽性細胞率を示す図表、（ｂ）各試験マウス群のF4/80mRNA量を示す図表、（ｃ）各試験マウス群のCD68mRNA量を示す図表、（ｄ）各試験マウス群のTLR-4 mRNA量を示す図表 （ａ）各試験マウス群のNox2 mRNA量を示す図表、（ｂ）各試験マウス群のP22phoxmRNA量を示す図表、（ｃ）各試験マウス群のP47hoxmRNA量を示す図表 各試験マウス群のTNF-α mRNA量を示す図表 （ａ）各試験マウス群のGLUT2 mRNA量を示す図表、（ｂ）各試験マウス群のG6Pase mRNA量を示す図表、（ｃ）各試験マウス群のCPT1a mRNA量を示す図表、（ｄ）各試験マウス群のGLUT4 mRNA量を示す図表、（ｅ）各試験マウス群のCPT1b mRNA量を示す図表
　この発明のインスリン抵抗性改善剤は、澱粉を所定の菌によって発酵熟成させた液状成分を有効成分として含有し、その有効成分は、コーンスターチ等を含む澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物を培地用基材とし、これに窒素源として酵母エキスを添加して発酵用培地を調製し、この培地に所定の納豆菌であるバチルス・ズブチリスAK（受託番号：FERM　P－18291）を接種し、発酵および熟成させた後、生成した液状成分を分取したものである。
　ここで、発酵用培地の基材として用いる糖化物は、トウモロコシ子実から分離、精製したコーンスターチ等を含む澱粉をアミラーゼで加水分解したものを用いることができる。また、精製したコーンスターチの代わりに粗精製のコーンスターチを使用することもできる。また、コーンスターチの他に、大豆粉や米糠またはこれらの混合物を加水分解したものを培地用基材として使用することもできる。
　先ず、発酵用培地の窒素源として使用する酵母エキスは、ビール酵母（Saccharomyces　cerevisiae　Meyen）の菌体を消化して抽出した水溶性成分を乾燥したものなど、一般的に食品の発酵や醸造などの細菌培養において窒素源として添加できるものを使用できる。
　また、有効成分の製造に用いる発酵用培地には、上記した糖化物および酵母エキスの他にも、必要に応じてタンパク質等の有機物や無機塩類などを配合することができる。有機物としては、大豆タンパク質やその他の植物性タンパク質が挙げられ、無機塩類としては、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　培地用基材としての澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物に対して、さらに糖分を添加することも好ましく、そのような糖分としては、例えばショ糖、グルコース（ブドウ糖）、水飴などが挙げられる。
　上述したように調製された発酵用培地に接種する発酵菌は、納豆菌であるバチルス・ズブチリス（Bacillus　subtilis）AKであり、バチルス・ズブチリスAKは、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に「（受託番号）FERM　P－18291」として寄託されている。
　また、所望により、バチルス・ズブチリスAKの増殖を阻害しない乳酸桿菌であるラクトバチルス（Lactobacillus）や乳酸球菌であるストレプトコッカス（Streptococcus）、酵母（Saccharomyces　cerevisiae）や麹菌（Aspergillus　oryzae）の菌体、菌抽出物または菌発酵エキスをバチルス・ズブチリスAKに加えて接種することができる。さらに、本発明の食品の有効成分の製造に用いる発酵用培地には、所望により、バチルス・ズブチリスAKの増殖を阻害しない、ハクサイ、キャベツ、ニンジン、薬用ニンジン、パセリ、セロリ、タマネギなどの植物抽出物を添加することができる。
　バチルス・ズブチリスAKは、通常の納豆菌であるバチルス・ズブチリスを、紫外線、X線照射、高・低温環境（100℃、0℃）、乳酸菌との競合、芽胞を作りやすい培地［肉エキス5.0重量％、ペプトン10.0重量％、塩化ナトリウム5.0重量％、寒天15.0重量％、野菜（キャベツ、ニンジン、セロリ、パセリ）圧搾汁65.0重量％］などの諸条件に付して継代培養を繰り返し選抜して発見した耐性菌である。
　このようにして得られたバチルス・ズブチリスAK菌株は、以下のような菌学的性質を有しており、バチルス・ズブチリスであると確認できた。
　なお、この発明に用いるバチルス・ズブチリスAK菌株（受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ－１８２９１）は、菌学的性質等の分類指標の違いにより相同性の評価に差異が認められており、１６s　ｒＲＮＡ遺伝子の配列を利用したデータベース（MicroSeqID:ABI）による分類検索においては、パニエバチルス・ポリミキサ（Paniebacillus polymyxa）との高い相同性が認められているが、以下の（ａ）形態学的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生化学的性質の菌学的性質による系統分類ではバチルス・ズブチリスであるとの同定結果が得られている。この発明では、後者の結果を用いて特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託された上記の所定菌株を利用している。
（ａ）形態学的性質
　１　細胞の形および大きさ
桿菌　1.0～1.2×3.0～50μm
　２　細胞の多形性の有無
無し
　３　運動性の有無
有り　（周毛性の鞭毛）
　４　芽胞の有無
有り　楕円　菌体のほぼ中央
（ｂ）培養的性質
　１　肉汁寒天平板培養
円形集落　白濁
　２　肉汁液体培養
上部または下部　菌凝体
（ｃ）生化学的性質
　１　グラム染色　陽性
　２　硝酸塩の還元　陽性
　３　ＭＲテスト　陰性
　４　ＶＰテスト　陽性
　５　インドールの生成　陰性
　６　硫化水素の生成　陰性
　７　クエン酸の利用　陽性
　８　カタラーゼ　陽性
　９　生育の範囲
　　pH　5.5～7.0
　　温度　25℃～40℃
　この発明で採用することが好ましい発酵条件は、ｐＨ４．５～６．５、２８～３２℃の条件で２ヶ月以上である。発酵条件が、上記より強い酸性域で所定温度未満の条件では、２ヶ月以上発酵させても、この発明に用いる所定の納豆菌が効率よく糖および窒素源を資化しないと推定され、得られた食品に所期した効果が充分得られない。上記の酸性域を越えて中性またはアルカリ性の条件で所定温度を超えて高温では発酵不充分で所定の納豆菌が効率よく糖および窒素源を資化せず、得られた保健栄養食品は上記同様に所期した効果が充分得られないものになる。
　また、この発明で採用することが好ましい熟成条件は、ｐＨ４．０～６．０、１３～１７℃で４ヶ月以上である。上記より強い酸性域で所定温度未満の条件では、４ヶ月以上熟成させても、発酵生産物として各種の活性を有するアミノ酸、リポ蛋白、リポ多糖（リポポリサッカライド）、リピッドなどが充分に低分子量化しないと推定され、所期した効果が充分得られない場合がある。上記の酸性域を越えて中性またはアルカリ性の条件で所定温度を超えて高温で熟成させると、活性が低下すると推定され、得られた健康補助食品は所期した効果が充分に得られない場合がある。
　生成した液状成分を分取するには、ろ過または遠心分離などの周知の分離手段を採用すればよく、得られた食品用原液は、そのまま使用できるが、流通や保存のために濃縮しておき、適宜に希釈して使用してもよい。
　この発明のインスリン抵抗性改善剤の有効成分は、前記したような製造工程で製造可能なものであるが、市販品を利用することもできる。その場合は、株式会社エンザミン研究所により製造されたエンザミン（登録商標）の原液（ＥＮＭ：商品名）の他、その２０倍濃縮エキスであるエンザミン濃縮液（ＥＮＭ－ＨＬ：商品名）を原液濃度に換算して使用することができる。
　この発明のインスリン抵抗性改善剤は、上記したエンザミン濃縮液（ＥＮＭ－ＨＬ：商品名）を所定の液状成分として、水または賦形剤等の飲食可能な材料に０．１～１．０質量％配合し、マウスに摂食させるときに有効性が確認されている。
　このとき、エンザミン濃縮液（ＥＮＭ－ＨＬ：商品名）を濃度０．１質量％で摂食させると平均０．５mg/kg体重/日/マウスの摂取量になり、濃度１．０質量％で節食させると平均５．０mg/kg体重/日/マウスの摂取量になり、それぞれ有効性が認められる。
　この摂取量をヒトの場合について換算すると、体表面積から換算してマウス用量の１５分の１程度になるので、成人（体重６０ｋｇ）でのエンザミン（登録商標）の原液（ＥＮＭ：商品名）の１回／日の摂取量は、２０×（２～２０ｍｇ）すなわち、４０～４００ｍｇが確認された有効成分量である。
　この発明のインスリン抵抗性による疾患予防用の健康補助食品は、上記のようにして調製した有効成分と食品分野で慣用的に使用されている賦形剤（例えば、澱粉あるいはデキストリン、セルロース、乳糖、麦芽糖、還元乳糖、還元麦芽糖、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、キシリトール等）や補助剤（例えば、溶媒、分散媒質、被覆剤、安定剤、希釈剤、保存剤、防腐剤、殺菌剤、抗真菌試薬、等浸透圧試薬、吸収抑制試薬、崩壊剤、乳化剤、結合剤、潤滑剤、色素等）と混合し、健康補助食品の分野で慣用的に使用されている製剤方法によって、例えば、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、抽出液、溶液、シロップ、懸濁液、乳濁液の形態に製造し得るものである。
　また、この発明のインスリン抵抗性による疾患予防用の健康補助食品は、上記した所定の液状成分であるエンザミン（登録商標）の原液（ＥＮＭ：商品名）を、上記の１日当たりの有効成分量を目安にして、補助食品全体の重量に対して、例えば約０．０５～１００質量％、好ましくは約０．１～９０質量％、より好ましくは約１～８５質量％、さらに好ましくは約５～８０質量％、最も好ましくは約１０～５０質量％含有することができる。
［インスリン抵抗性改善剤の有効成分の調製］
　イエローコーンスターチ２．３ｋｇ、大豆ペプトン０．５ｋｇ、米糠汁０．５ｋｇ、塩化カルシウム８０ｇ、食塩１５０ｇに精製水５０ｋｇを加え、加熱して溶解した。次いでこれを冷却し、アミラーゼ４０ｇを加えて充分に糖化させた。糖化終了後、グラニュー糖１．５ｋｇ、グルコース（ブドウ糖）１．５ｋｇ、酵母エキス４５０ｇ、水飴１．５ｋｇ、リン酸ナトリウム８０ｇ、野菜の圧搾汁（キャベツ、ニンジン、セロリ、パセリの合計）5ｋｇ、および精製水を加えて全量を１５０ｋｇにした。
　そして、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．３～７．８の範囲内に調整し、これを培養缶に入れて１２０℃で２０分間高圧滅菌した。これを冷却した後、バチルス・ズブチリスＡＫ株を接種し、温度３０±２℃の恒温室でｐＨ４．５～６．５で６０日間発酵させ、次いで温度１５±２℃の恒温室でｐＨ４．０～６．０の条件下で１８０日間熟成させて培養液を透明化させた。これをフィルターによってろ過し、１２５リットルの液状の保健栄養食品の原液（以下、培養濾液と称する。）を得た。
　得られたインスリン抵抗性改善剤の液状有効成分の原液１００ｇ中の一般分析結果を以下の表１中に示す。なお、表中の記号φは、検出限界以下の微量を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、得られた液状成分または同成分のエンザミン（登録商標）が含まれる食品の経口安全性については、特許第３９０２０１５号公報の段落００３１にも記載されているように、ウィスター系ラットを用いた経口ＬＤ５０値が雄雌共に４２．０ｍｌ／ｋｇ以上と高いものであり、この発明に用いる有効成分は高い安全性を有していることが明らかである。
　次に、上記の液状成分の原液の２０倍濃縮液（エンザミン研究所社製：ＥＮＭ－ＨＬ、以下の実施例１、２、比較例、これらの試験の説明および図表中の説明において、これをエンザミンと称する。）を有効成分とする実施例１、２、比較例（コントロール）の各インスリン抵抗性改善剤を調製し、それらを以下の試験によって評価した。
　なお、以下の試験結果は、平均値±標準誤差で示し、％の記載は質量％であり、有意差検定は、一元配置分散分析法（one-way ANOVA）を用い、特に示さない限りp<0.05を有意差ありとした。また、統計解析は全て StatView version 5.0 software (米国SAS Institute社製)を用いて行なった。
［実施例１、２、比較例］
＜脂質代謝異常のインスリン抵抗性改善剤、糖代謝異常のインスリン抵抗性改善剤＞
　上記のようにして得られた有効成分のエンザミンを０．１質量％濃度で含有する飲料水（実施例１）、エンザミンの１．０質量％濃度の飲料水（実施例２）、エンザミンを全く含まない水（比較例）を調製し、マウスへの経口摂取による実施例１、２の脂質代謝異常または糖代謝異常のインスリン抵抗性改善剤としての適性を評価した。
［マウスの経口摂取］
　日本チャールス・リバー社より購入した５週齢の雄性db/dbマウス(肥満モデルマウス)とヘテロのdb/+mマウス(痩せのモデルマウス)のうち、ｄb/dbマウスに標準固形食とエンザミンを０．１％（平均０．５mg/kg体重/日/マウス）および１．０％（平均５．０mg/kg体重/日/マウス）で混ぜた飲水（実施例１、２）を６週齢より８週間与えた。比較例（コントロール）として、エンザミンを全く含まない水を与えた。
　なお、餌および飲水は自由摂取とし、やせのコントロールとしてdb/+mマウスを用い、これに標準固形食と飲水を同じ期間、自由に摂取させた。これらのマウスは、１２時間の明暗サイクルで飼育し、すべての動物実験は、学校法人近畿大学医学部動物実験指針に従って行なった。
　上記した実施例、比較例の発明の効果を評価するに当たり、その前提として、エンザミン投与によりdb/dbマウスの体重および体脂肪量に影響がないことを確認するため、供試マウスに対する実施例１、２の経口摂取と全く同じ条件で経口摂取したマウスについて、体重、体脂肪率、皮下脂肪率の増減を調べ、その結果を図１に示した。なお、図中に記した％は質量％である。また、体脂肪率、内臓脂肪量、皮下脂肪量の測定については、以下の体組成解析試験を行なった。
［体組成解析試験］
　体脂肪組成の解析をコンピュータ断層撮影法(ＣＴ解析)で行なった。すなわち、マウスをイソフルランで麻酔した後、実験動物ＣＴ解析装置（日立アロカメディカル社製：ラシータ　LCT-200)を用いて体脂肪組成を測定した。その際、実験動物の第１腰椎から第５腰椎の間を１ｍｍの間隔でスキャンし、連続したスライス断層画像を作成した後、ラシータソフトウェア（version 3.40）を用いて定量化した。内臓脂肪と皮下脂肪は、腹筋の位置により区別し、総脂肪量、内臓脂肪重量および皮下脂肪重量は、全スライス画像を積算することで算出した。
　図１に示された結果からも明らかなように、０．１％濃度および１％濃度のエンザミン投与による体重への影響は認められず、ＣＴ画像から計算した体脂肪率、内臓脂肪量および皮下脂肪量、肝脂肪量においてもエンザミン投与による変化は認められなかった。
　次に、脂質代謝異常または糖代謝異常のインスリン抵抗性改善剤による所期した直接的なインスリン抵抗性による効果を調べるため、実施例１、２、比較例に対し、以下の代謝マーカーによる解析試験を行ない、その結果を図２、３に示した。なお、図中、％は質量％である。
［代謝マーカーによる解析試験（１）］
　db/dbマウスを用いた実施例１、２、比較例、およびdb/+mマウスを用いたコントロールについて、血清トリグリセロール、血清総コレステロール、血漿グルコース、血漿インスリンの濃度は、それぞれトリグリセライドEテスト(和光純薬工業社製)、コレステロールEテスト(和光純薬工業社製)、グルテストエース(三和化学研究所製)、超高感度マウスインスリン測定キット(森永生科学研究所製)を用いて測定した。
［脂質代謝異常によるインスリン抵抗性の改善］
　図２(ａ)に示した結果からも明らかなように、db/dbマウスにおける血清トリグリセリドの測定結果から、db/dbマウスの空腹時の血清トリグリセリド濃度(158.1±12.4mg/ml)は、db/+mマウス（コントロール群：図中ｍで示す。）の血清トリグリセリド濃度(59.9±6.7mg/dl)に比べて、有意（p<0.01）な高値を示した。
　また図２(ａ)から、０．１％濃度のエンザミン投与により、db/dbマウスにおける血清トリグリセリド濃度は137.0±8.0mg/dlであり、コントロール群の158.1±12.4mg/dlに比べて有意差はないが減少傾向を示し、さらに１％濃度のエンザミン投与群（122.0 ± 8.4 mg/dl）では、エンザミン非投与のdb/dbマウス群に比べて有意（p<0.05、図中に＊印を付す。）な減少が認められた。
　同様に図２(ｂ)からも明らかなように、db/dbマウスの空腹時の血清総コレステロール濃度(217.9±8.7mg/dl)と比べて、０．１％濃度のエンザミン投与群(181.4±8.3mg/dl)には減少傾向が認められ、１％濃度エンザミン投与群には有意（p<0.05）な減少が認められた。
　これらの結果から、有効成分のエンザミンは、血清トリグリセリドおよび総コレステロール濃度を投与濃度依存的に減少させており、有効成分の摂取によってdb/dbマウスにおける脂質代謝が改善されることが明らかになった。
＜糖代謝異常によるインスリン抵抗性の改善剤＞
　次に、db/dbマウスの糖代謝異常に対するエンザミンの効果を検討した。
　図２(ｃ)に示す結果からも明らかなように、db/dbマウスの空腹時血漿グルコース濃度（758.7±24.7mg/dl）は、db/+mマウス（コントロール群54.6±1.5mg/dl：図中ｍで示す）に比べて、著明な増加を示した（p<0.01）。
　また、０．１％濃度のエンザミン投与群のdb/dbマウスの血漿グルコース濃度は減少傾向を示し、１．０％濃度のエンザミン投与群（643.0±34.0mg/dl）は有意（p<0.05）な減少を示した。
　図２(ｄ)に示す結果からも明らかなように、血漿インスリン濃度は、db/+mマウス（図中ｍで示す。0.12±0.04ng/ml）に比較し、db/dbコントロール群で2.05±0.22ng/mlであり、著明な高値を示したが（p<0.01）、０．１％エンザミン投与群（2.72±0.27ng/ml）、１．０％エンザミン投与群（2.72±0.30ng/ml）であり、エンザミン投与による血漿インスリン値に対する影響が認められなかった。
　さらに、エンザミンの糖代謝に対する効果を詳細に検討するため、グルコース負荷テスト（intraperitoneal glucose tolerance test （IPGTT））およびインスリン負荷テスト（intraperitoneal insulin tolerance test （IPITT））を行ない、それらの結果を図３（ａ）（ｂ）に示した。
　先ず、グルコース負荷テストを行うために、マウスを１６時間絶食させ、その後、腹腔にグルコースを１．５mg/kg体重の濃度で投与した。この結果を図３（ａ）に示した。
　また、インスリン負荷テストを行うためには、マウスを６時間絶食させた後、腹腔にレギュラーヒトインスリンを１U/kg体重の濃度で腹腔に投与した。この結果を図３（ｂ）に示した。血液サンプルは、投与前と投与後に採取し、血中グルコース濃度はグルテストエース(三和化学研究所製)を用いて測定し、投与前（０分）と投与後（３０～９０分）の結果を図３（ｂ）に示した。
　なお、図３の折れ線グラフ中の記号については、○：db/+mマウス、●：エンザミン非投与db/dbマウス（コントロール）、△：0.1％エンザミン投与db/dbマウス、□：１．０％エンザミン投与db/dbマウスの各群の結果を示している。
　図３(a)の結果からも明らかなように、腹腔内へのグルコース投与後の血漿グルコース濃度は、db/dbマウスにおいてdb/+mマウスに比較して著明に上昇しており、著明な耐糖能異常を示した。１．０％濃度のエンザミン投与により、db/dbマウスにおけるグルコース注入３０分後、６０分後および９０分後の血漿グルコース濃度の上昇が有意に抑制された。なお、０．１％濃度のエンザミン投与では有意差はなかったが、血漿グルコース濃度の上昇の抑制傾向が認められた。これらのことから、エンザミン投与により、db/dbマウスにおける耐糖能異常が改善されていることがわかる。
　また、図３(b)の結果からも明らかなように、ｄb/dbマウスでは、耐糖能異常と共に、インスリン感受性が著明な障害が認められた。すなわち、db/+mマウスに比較して、db/dbマウスではインスリン投与後の血漿グルコース濃度の低下が著しく抑制されていた。０．１％濃度のエンザミン投与では効果は認められなかったが、１．０％濃度のエンザミンの投与（□印）では、インスリン投与後のdb/dbマウスにおける血漿グルコース濃度の低下が30分、60分、90分および120分後がコントロール群（●印）に比べて有意に亢進していた。これらのことから、エンザミンの投与がdb/dbマウスにおけるインスリン抵抗性を改善させることがわかる。
＜脂肪組織における炎症性アディポサイトカインの産生亢進または抗炎症性アディポサイトカインの産生低下によるインスリン抵抗性改善剤＞
　実施例１、２のアディポサイトカイン発現・分泌に対するエンザミンの効果を調べ、これらの効果を奏するインスリン抵抗性改善剤としての適性を評価した。
　すなわち、前記同様のマウスへの経口摂取試験を行ない、db/dbマウスを用いた実施例１、２、比較例、およびdb/+mマウスを用いたコントロールについて、以下の試験を行ない、その結果を図４に示した。
［代謝マーカーの解析試験（２）］
　エンザミン投与（８週間）によるインスリン抵抗性改善効果の機序を検討するために、実施例１、２、比較例のdb/dbマウスの脂肪組織における炎症性アディポサイトカインと抗炎症性アディポサイトカインの発現および分泌に対するエンザミンの効果を検討した。　血清アディポネクチンおよび血清ＴＮＦα濃度は、それぞれアディポネクチンELISAキット(大塚製薬社製)およびQuantikine TNF-alpha ELISA kit (米国Ｒ＆Ｄシステムズ社製)を用いて測定した。
　図４の（ａ）～（ｆ）は、順にTNF-α, MCP-1, IL-6 , PAI-1 のmRNA発現量、各群のマウスにおける血清TNF-α濃度、血清アディポネクチン濃度を示し、各図中のｍ印はｄb/+mマウス（やせのコントロール（n=6））の脂肪組織、－印はエンザミン非投与（n=10）db/dbマウスの脂肪組織、０．１はエンザミン投与０．１％（n=9）の実施例１のdb/dbマウスの脂肪組織であり、１．０は、エンザミン投与１．０％（n=8）の実施例２のdb/dbマウスの脂肪組織である。これらの結果は平均値±標準誤差で表し、エンザミン非投与 db/dbマウスに対してp<0.05で有意差のあるものは＊印で示し、p<0.01で有意差のあるものは**印で示した。）なお、図中、％は質量％を示している。
　図４（ａ）の結果からも明らかなように、ｄb/dbマウスの脂肪組織におけるTNFαの発現はdb/+mマウスのそれに比較して、５倍に増加しており、db/dbマウスの脂肪組織において炎症が誘発されていることを確認した。
　特筆すべきことは、投与したエンザミンの濃度依存的にdb/dbマウスの脂肪組織におけるTNF-αのmRNAの発現量の抑制が認められたことである。特に、１．０％濃度のエンザミン投与では、コントロール群に比較して、TNF-αのmRNAの発現を４０％抑制した。
　また、図４（ｂ）、（ｃ）の結果からも明らかなように、１．０％濃度のエンザミン投与によって、単球走化因子（Monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1)）とインターロイキン６（IL-6）の発現が、コントロール群に比較してそれぞれ５０％、６０％抑制された。
　また、図４（ｄ）の結果からも明らかなように、プラスミノゲンアクチベータインヒビター１（Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)）の発現は、０．１％および１．０％濃度のエンザミン投与の両方で有意な抑制が認められた。
　これらの結果から、エンザミンの投与はdb/dbマウスの脂肪組織における炎症を抑制するものと認められる。
　さらに、全身の炎症状態に対するエンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤の効果を検討するために、db/dbマウスにおける血中TNF-α濃度を測定した。図４（ｅ）の結果からも明らかなように、コントロール群（－印）の45.2±6.5pg/mlに比べて１．０％濃度のエンザミン投与をした実施例２では、血中TNF-α濃度が27.2±6.4pg/mlになるという有意な抑制が認められた（p<0.05)。従って、エンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤は、脂肪組織の炎症抑制効果と同様に、全身の炎症も抑制することがわかる。
　図４（ｆ）の結果からも明らかなように、抗炎症性アディポサイトカインである血中アディポネクチン濃度は、エンザミンの投与濃度依存的に増加し、特に1.0％濃度のエンザミンの投与においては、11.4±0.8μg/mとなっており、db/dbコントロール群の8.1±0.7μｇ／ｍｌに対してl1.4倍の増加が認められた。これらのことから、エンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤が、肥満マウスにおけるアディポサイトカインの産生破綻を改善していることがわかる。
＜脂肪組織におけるマクロファージの浸潤によるインスリン抵抗性の改善剤＞
　次に、エンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤の脂肪組織へのマクロファージ浸潤に対するインスリン抵抗性の効果を検討するために、肥満マウスの脂肪組織におけるF4/80（成熟マクロファージのマーカー）に対する組織免疫学的解析を行なった。
［組織免疫学的解析］
　マウスの精巣上体白色脂肪組織を４℃の条件下で１２～１６時間、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、４μｍ厚のパラフィン切片を作製し、ラットモノクローナル抗F4/80抗体(米国AbD Serotec社製)と反応させた。そして、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した二次抗体と反応させた。チラミドシグナル増幅システム(米国パーキンエルマー社製)を用いて、陽性シグナルを可視化した。また、切片を4′,6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI)で後染色し、蛍光顕微鏡（キャノン社製：E800）とＣＣＤカメラ(キーエンス社製)を用いて観察した。それぞれのマウス個体より作製したパラフィン切片中の１０視野を観察し、F4/80発現陽性細胞の核の数とすべての細胞の核の数を、画像解析ソフト（NIHイメージ）を用いてカウントし、全細胞数対するF4/80陽性細胞の割合を算出した。
　図５の免疫染色像が示すように、まず、db/+mマウス（図５(a)）に比較して、db/dbマウス（図５(b)）では、脂肪組織におけるF4/80陽性細胞の数が著明に増加しており、これはマクロファージの脂肪組織への浸潤が著明に増加していることを示している。
　そして、図５(c)、(d)からも明らかなように、エンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤の０．１％、１．０％投与により、濃度依存的にF4/80陽性細胞の数の減少が観察された。
　また図６(a)に示すように、F4/80陽性細胞の数をカウントし、全体の細胞に対する割合を算出したところ、0.1％のエンザミンの投与（47.4±5.1%）では、db/dbコントロール群(54.5±2.4%)に比べて有意差(p<0.05)は認められなかったが、脂肪組織へのマクロファージ浸潤を抑制する傾向が認められ、さらに１．０％のエンザミン投与（42.8±2.3%）では、マクロファージ浸潤の有意な抑制が認められた。
　さらに、マクロファージの活性化および脂肪組織の炎症を確認するため、以下のように「細胞培養」を行ない、「定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応」による遺伝子発現定量解析を行なった。
［細胞培養］
　マウスマクロファージ培養細胞のRAW264.7細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎児血清（FBS）および１００mg/mLのペニシリンストレプトマイシンを含むダルベッコ変法培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養維持した。RAW264.7細胞を１×１０６cells/ウェルで６ウェルプレートに播主し、２４時間培養後、０．０１％および０．１％のエンザミンをそれぞれ添加し、さらに１μg/mlの濃度でリポポリサッカライド（LPS）を添加し、１２時間反応させた。リン酸生理食塩緩衝液（PBS）で２回洗浄後、細胞からＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量RT-PCR反応）による遺伝子発現解析を行なった。
［定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応］
　マウスの精巣上体白色脂肪組織（１００mg）およびRAW264.7細胞よりＲＮＡをRNeasy Mini kit （キアゲン社製）を用いて抽出した。そして、ｃＤＮＡ（環状ＤＮＡ）をSuper Script III逆転写キット(ライフテクノロジーズ社製)を用いて合成した。発光試薬としてSYBR GREEN PCR Master Mixを用い、StepOne PlusリアルタイムPCR装置（ライフテクノロジーズ社製）にて、遺伝子発現定量解析を行なった。遺伝子発現解析により定量化されたmRNA量は、内部標準として18sリボソーマルRNAにより標準化し、単位は任意単位で表した。
　図６(b)に示すように、上記のマーカー遺伝子の発現定量解析の結果は、1.0％濃度のエンザミン投与群では、コントロール群に比較して、脂肪組織におけるEmr1（F4/80）mRNAの発現が４０％抑制されていた。
　さらに図６(c)(d)に示すように、マクロファージの活性化マーカーおよび炎症状態のマーカーであるCD68およびToll like receptor 4（TLR4）の発現もそれぞれ４０％抑制されていた。
　これらの結果から、エンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤がdb/dbマウスの脂肪組織への炎症性マクロファージの浸潤を抑制していることがわかる。
＜脂肪組織における酸化ストレスによるインスリン抵抗性の改善剤＞
　脂肪組織における酸化ストレスに対するエンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤の効果を評価するため、db/dbマウスの精巣上体白色脂肪組織におけるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼのサブユニット（Nox2, p22phox 及び p47phox）の遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量を検討した。
　細胞培養試験および定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応についは、上記した「脂肪組織におけるマクロファージの浸潤によるインスリン抵抗性の改善」についての実験操作と同じ手順で行ない、Nox2、p22phox およびp47phox mRNAの発現量を調べた。
　図７(a)(b)(c)に示す結果からも明らかなように、Nox2、p22phox およびp47phox の各mRNAの発現量は、db/dbマウスにおいてdb/+mマウスに比較して、顕著に増加しており、db/dbマウスの脂肪組織における酸化ストレスが亢進していることがわかる。
　０．１％濃度のエンザミン投与では、エンザミン非投与に対する有意差(P<0.05)は認められなかったが、これらNADPHオキシダーゼサブユニットの発現量を抑制する傾向が認められた。さらに1.0%濃度のエンザミン投与では、Nox2, p22phox およびp47phoxの遺伝子発現上昇をそれぞれ４０％、３０％および４０％ほど有意に抑制した。
　これらの結果から、エンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤が、db/dbマウスの脂肪組織における酸化ストレスを抑制することがわかる。
＜脂肪組織におけるLPS誘導性の炎症反応によるインスリン抵抗性の改善剤＞
　次に、マクロファージにおける炎症反応に対するエンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤のLPS誘導性の炎症反応の効果を検討するために、マウスマクロファージ培養細胞のRAW264.7細胞を用いて、LPS刺激時のTNF-αの発現上昇に対するエンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤添加効果を検討した。
　細胞培養試験および定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応についは、上記した「脂肪組織におけるマクロファージの浸潤によるインスリン抵抗性の改善」についての実験操作と同じ手順で行ない、TNF-αのmRNAの発現量を調べた。
　すなわち、RAW264.7細胞におけるLPS（1μg/ml）の存在下、非存在下における０．０１％および０．１％エンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤の１２時間の添加効果を調べ、その結果は、図８に平均値±標準誤差で示し、図中の**はp<0.01(各群n=3)での有意差があることを示している。
　図８の結果からも明らかなように、LPS非存在下（－印）においては、０．１％のエンザミンの添加により、RAW264.7細胞におけるTNF-αの発現量をわずかに増加した。
　しかし、LPSにより著明に発現が誘導されたTNF-αmRNAを０．０１％および０．１％濃度のエンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤の添加群では有意に抑制された。これらのことから、エンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤がマクロファージにおける炎症反応を抑制することがわかる。
[肝臓および筋肉における糖代謝および脂質代謝への影響]
　エンザミンを有効成分とするインスリン抵抗性改善剤の筋肉における糖代謝および脂質代謝への効果と、肝臓に対する影響を調べるため、前記同様にしてｄb/dbマウスに標準固形食とエンザミンを０．１％（平均０．５mg/kg体重/日/マウス）および１．０％（平均５．０mg/kg体重/日/マウス）混ぜた飲用水（実施例１、２）を６週齢より８週間餌と共に自由に摂取させ、また比較例（コントロール）としてｄb/dbマウスにはエンザミンを含まない水を与えた。また、他の比較例(痩せのコントロール)としてdb/+mマウスには、前記同じ期間中に標準固形食と水を自由に摂取させた。
　上記飼育試験された各マウスの肝臓におけるGLUT2遺伝子とG6Pase遺伝子(mRNA)の発現、また筋肉におけるGLUT4遺伝子(mRNA)の発現について、更にまた肝臓および筋肉におけるカルニチン・パルミトイル・トランスフェラーゼ１遺伝子(mRNA)の発現について、遺伝的手法(ELISA法)によって以下の(a)～(e)の各酵素を調べた。
　すなわち、（ａ）GLUT2（肝臓においてグルコースを細胞内に取り込むトランスポーター）、(ｂ）G6Pase （糖新生に関わる酵素）、（ｃ）CPT1a（脂質酸化に関連するミトコンドリアの酵素：肝臓型）、（ｄ）GLUT4（筋においてグルコースを細胞内に取り込むトランスポーター）、（ｅ）CPT1b（脂質酸化に関連するミトコンドリアの酵素：筋肉型）について各mRNAの発現量を調べ、その結果を図９中に示した。なお、同図には、平均値±標準誤差を付記し、図中の**はp<0.01(各群n=3)で有意差のあることを示した。
　図９の(a),(b）に示す結果からも明らかなように、エンザミン投与は、db/dbマウスの肝臓におけるGLUT2 およびG6PaseのｍRNA発現に影響しなかった。この結果から、エンザミンが、肝臓の糖代謝に影響を与えないことが示唆された。
　図９(d)からも明らかなように、筋肉におけるGLUT4のｍRNA発現は、db/dbマウスにおいてdb/+mマウスに比べて著しく減少した。これは肥満マウスの筋肉におけるグルコースの取り込み関連因子（GLUT4）の発現が、やせマウスの同因子の発現に比べて著しく弱かったことを示し、一方、１％濃度のエンザミン投与は、肥満マウスの筋肉におけるグルコース取り込みを著しく促進した。
　次に、db/dbマウスの肝臓と筋肉内におけるカルニチン・パルミトイル・トランスフェラーゼ１（CPT1:脂質酸化に関連するミトコンドリアの酵素）の遺伝子発現について、以下のように評価した。
　図９(c),(e)の結果からも明らかなように、CPT1a(肝臓型)とCPT1b (筋肉型)のｍRNA発現は、db/+mマウスに比べてdb/dbマウスにおいて少なかった。また、図９(c)のように、肥満マウスの肝臓におけるCPT1bのｍRNA発現は、エンザミンの投与濃度に影響されなかった。一方、図９(e)のように、肥満マウスの筋肉におけるCPT1bのｍRNA発現は、１％濃度のエンザミンの投与において最も顕著であった。
　このように肥満マウスの肝臓と筋肉内における脂肪燃焼に関わる酵素（CPT１a，b）の発現は、やせマウスの場合に比べて有意に少なかった。これに対し、１％濃度のエンザミンの投与は、筋肉内における脂肪燃焼酵素を増加させ、肝臓内の脂肪燃焼酵素には影響しないことがわかる。
　これらの試験結果からみて、エンザミンの投与が、肝臓に影響を与えることなく、db/dbマウスの筋肉内におけるグルコース吸収と脂質酸化を改善すると認められた。
　インスリン抵抗性改善剤は、内臓肥満によるインスリン抵抗性によってもたらされる疾患の予防または治療に利用できるものであり、例えば脂質代謝異常、糖代謝異常、アディポサイトカインの産生バランス異常、脂肪組織に対する酸化ストレスの亢進などを予防し改善するためのインスリン抵抗性改善剤となるものである。より具体的には、肥満細胞組織に対する脂質代謝異常の抑制剤または糖代謝異常の抑制剤、アディポサイトカイン産生バランス調整剤、肥満脂肪組織の炎症・酸化ストレス抑制剤、肥満細胞組織のマクロファージ阻害（浸潤抑制）剤などである。
　また、この発明のインスリン抵抗性改善剤を様々な飲食品に含有させれば、インスリン抵抗性疾患予防用の健康補助食品になり、例えば脂質代謝異常予防用の健康補助食品または糖代謝異常予防用の健康補助食品、アディポサイトカイン産生失調予防用の健康補助食品、肥満脂肪組織の炎症・酸化ストレス予防用の健康補助食品、肥満細胞組織のマクロファージ阻害（浸潤抑制）予防用の健康補助食品などである。

Claims (6)

  1. 　澱粉をアミラーゼで加水分解した糖化物を培地用基材とし、これに酵母エキスを添加して発酵用培地を調製し、この培地にバチルス・ズブチリスＡＫ（受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ－１８２９１）を接種し、発酵および熟成させた後、生成した液状成分を有効成分として含有するインスリン抵抗性改善剤。
  2. 　インスリン抵抗性が、脂質代謝異常または糖代謝異常によるインスリン抵抗性である請求項１に記載のインスリン抵抗性改善剤。
  3. 　インスリン抵抗性が、脂肪組織における炎症性アディポサイトカインの産生亢進または抗炎症性アディポサイトカインの産生低下によるインスリン抵抗性である請求項１に記載のインスリン抵抗性改善剤。
  4. 　インスリン抵抗性が、脂肪組織における炎症またはマクロファージの浸潤によるインスリン抵抗性である請求項１に記載のインスリン抵抗性改善剤。
  5. 　インスリン抵抗性が、脂肪組織に対する酸化ストレスの亢進によるインスリン抵抗性である請求項１に記載のインスリン抵抗性改善剤。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載のインスリン抵抗性改善剤を含有するインスリン抵抗性による疾患予防用の健康補助食品。
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