CN111164201B - 用于改善代谢症候群的副干酪乳杆菌gks6、其用途、医药组合物及可食用组合物 - Google Patents

用于改善代谢症候群的副干酪乳杆菌gks6、其用途、医药组合物及可食用组合物

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Abstract

本发明揭露一种改善代谢症候群的新颖副干酪乳杆菌GKS6,其寄存编号为CGMCC No.14566。本发明还揭露一种GKS6菌株的培养基、培养方法、用途、医药组合物及可食用组合物。GKS6菌株可耐酸、耐胆盐,可有效地降低体重、降低脏器肥大、降低肝脏脂质含量、降血脂、降低肝肿大、降低肝功能指数、减少内脏脂肪组织及/或皮下脂肪组织含量、排除体脂肪,可用于预防及/或治疗代谢症候群相关疾病、减少由高油脂饮食引起的肥胖、增加体内脂肪的排出而减少由高油脂饮食引起的肥胖。

Description

用于改善代谢症候群的副干酪乳杆菌GKS6、其用途、医药组合 物及可食用组合物
技术领域
本发明关于一种乳酸菌,尤其关于一种用于改善代谢症候群的新颖副干酪乳杆菌GKS6、其培养基、培养方法、用途、医药组合物及可食用组合物。
背景技术
随着生活型态、饮食习惯的转变,各国人民的肥胖率增加,肥胖在现代化国家已成为严重的健康问题。世界卫生组织(WHO)更将肥胖列为21世纪最重要的公共卫生及预防医学课题。WHO将肥胖定义为身体质量指数(Body mass index,BMI,体重/身高2(kg/m2))大于30为肥胖,介于25~29.9为过重。
肥胖成因主要是长期热量的摄取大于热量的消耗,导致脂肪堆积于身体,因而形成肥胖。肥胖的形成分为原发性及自发性,其中原发性肥胖为饮食及运动等环境因素所造成;自发性肥胖则为遗传或疾病所引起。细胞生物学所定义的肥胖,是指由于脂肪组织中前脂肪细胞分化成脂肪细胞的数目及大小增加所致。脂肪组织可以分泌多种物质,包括激素、生长因子、酵素、细胞因子、补体及基质蛋白等,其主要作用为调节代谢、生殖、免疫、血压与血管新生等。因此,肥胖会诱发全身多种疾病。
高油高脂的饮食习惯将造成肥胖,连带导致肝脏细胞囤积过量的脂肪颗粒。当脂肪囤积超过肝重量的5%即为脂肪肝,进而产生肝肿大等症状。造成肝肿大的原因包括病毒性肝炎、肝硬化、中毒性及药物性肝炎、瘀血、代谢异常所导致的脂肪肝、肿瘤或白血病等。
肝脏功能检测通常藉由抽血检测丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase(ALT),又称为丙酮酸转氨酶(GPT))、天门冬胺酸转氨酶(aspartate aminotransferase(AST),又称为麸胺酸草乙酸转氨酶(GOT)),AST及ALT为肝细胞制造最多的两种酵素。当肝脏发炎时,肝细胞会坏死,AST及ALT就会进入血液中,造成肝指数GOT及GPT升高,因此医疗上常以此作为肝脏发炎或受损程度的评估。肝指数过高的原因包括病毒引起的肝炎、药物性肝炎、猛爆性肝炎、肝化脓、肝癌、血压降低、急性心肌梗塞、甲状腺机能亢进,肥胖所引起的脂肪肝也是原因之一。
血液中的脂肪主要分为两类,即胆固醇及三酸甘油脂,而根据其与蛋白质的比例又再细分为乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白质(VLDL)、低密度脂蛋白质(LDL)及高密度脂蛋白质(HDL)。若血液中好的胆固醇过少或是坏的胆固醇过高,即称为高血脂。原发性高血脂为家族遗传,次发性高血脂则是内分泌疾病(如糖尿病、甲状腺机能低下或肝肾疾病)、生活习惯、药物等原因所造成。高血脂使胆固醇累积在血管,形成粥状动脉硬化,导致血液流动不佳,引发心肌梗塞、中风、周边动脉堵塞等症状。
酮体包含丙酮、乙酰乙酸及β-羟丁酸三种化合物。当身体饥饿、禁食或某些病理状态(如糖尿病)下,脂肪代谢增加,大量的脂肪酸被肝细胞吸收及氧化,而此同时为了维持血糖浓度的稳定,体内的糖异生也会被激活,进而生成酮体。
食物中所含的嘌呤经摄食及分解后即生成尿酸。尿酸经由肾脏或肠道排出体外。当体内生成尿酸过多或肾脏功能发生障碍,导致尿酸无法顺利排出体外,血液中的尿酸含量过高,称为高尿酸血症。进而血液中的尿酸积存于关节或组织将引起肿胀变形,即痛风。遗传、不当的高嘌呤饮食习惯、药物、酒精等将可能导致原发性高尿酸血症,而脂肪分解所产生的酮体则会抑制尿酸排出,因此肥胖者可能出现尿酸过高症状,进而导致相关疾病。
由于前述关于肥胖、体脂肪、肝指数、高血脂、酮体、尿酸等代谢症候群已严重影响人们生活,因此开发能够改善代谢症候群的技术、药物、食品等已刻不容缓。
本案申请人鉴于已知技术中的不足,经过悉心试验与研究,并一本锲而不舍的精神,终构思出本案,能够克服先前技术的不足,以下为本案的简要说明。
发明内容
为了解决现代社会的代谢症候群问题,本发明由健康女婴粪便中筛选、分离出新颖的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GKS6,该GKS6菌株及其菌粉、医药组合物、可食用组合物的形式可耐酸、耐胆盐,可有效地降低体重、降低脏器(心脏、肝脏、肾脏)肥大、排除体脂肪、降血脂、降低肝肿大、降低肝功能指数(ALT及/或AST)、减少内脏脂肪组织及/或皮下脂肪组织含量、降低肝脏脂质(三酸甘油脂及/或胆固醇)含量,可用于预防及/或治疗代谢症候群相关疾病、减少由高油脂饮食引起的肥胖、增加体内脂肪的排出而减少由高油脂饮食引起的肥胖。
因此,本发明揭露一种新颖的副干酪乳杆菌GKS6,其于2017年8月25日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),寄存编号为CGMCC No.14566,且于2017年8月26日通过存活试验。
该GKS6菌株包括核苷酸序列为SEQ ID NO:3的全基因组、位于该全基因组上的核苷酸序列为SEQ ID NO:1的pheS基因以及核苷酸序列为SEQ ID NO:2的recN基因、以及核甘酸序列为SEQ ID NO:4的质粒。
该GKS6菌株具有葡萄糖及乳糖以约3:1比例组成的多糖类,GKS6菌株可耐受低至pH2.0的胃的酸性,至少可耐受消化道中占食物比例0.3%的胆盐。
本发明还揭露一种可食用组合物,包括前述新颖的GKS6菌株。该GKS6菌株以菌粉的方式呈现。该可食用组合物还包括保护剂,该保护剂包括但不限于海藻糖、奶粉、聚糊精、味精、焦磷酸盐、维生素、精氨酸及其组合的成分。前述成分及比例可由所属技术领域中具有通常知识者依其熟用技艺加以修改及调整。
本发明还揭露一种新颖GKS6菌株的培养基,该培养基包括:葡萄糖及乳糖以3:1比例组成的碳源、包含酵母萃取物的氮源。在一具体实施例中,氮源还包括牛肉萃取物。
本发明还揭露一种培养新颖GKS6菌株的方法,包括:将GKS6菌株无菌接种于培养基中并培养于37℃,其中该培养基包含碳源及碳源,碳源由葡萄糖及乳糖为3:1的比例组成,且氮源包含酵母萃取物。
本发明还揭露一种将新颖GKS6菌株制备用于治疗或预防代谢症候群引起的肥胖的医药组合物的用途。该GKS菌株可促进体内脂肪排出,有效减缓高油脂食物引起的肥胖,进而开发为用于治疗或预防肥胖的医药组合物或可食用组合物。
附图说明
本发明的上述目的及优点在参阅以下详细说明及附图之后对那些本领域技术人员将变得更立即地显而易见。
图1显示本发明副干酪乳杆菌GKS6与其它乳酸菌品系的pheS基因的演化树示意图。
图2显示本发明副干酪乳杆菌GKS6与其它乳酸菌品系的recN基因的演化树示意图。
图3显示本发明副干酪乳杆菌GKS6与其它市售副干酪乳杆菌的耐酸性示意图。
图4显示本发明副干酪乳杆菌GKS6与其它市售副干酪乳杆菌的耐胆盐能力示意图。
图5显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的初始体重、最终体重以及体重变化量示意图。
图6显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏重量示意图。
图7显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的不同部位(肾周围、附睾、肠系膜、腹膜外以及腹股沟)脂肪组织的重量相对于大鼠体重的脂肪量示意图。
图8显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的不同类型脂肪组织(总体脂、内脏脂肪组织以及皮下脂肪组织)相对于大鼠体重的脂肪量示意图。
图9显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的肝脏总脂质、三酸甘油脂以及胆固醇的含量示意图。
图10显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的血清AST以及ALT的含量示意图。
图11显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的血清三酸甘油脂、胆固醇以及高密度脂蛋白的含量示意图。
图12显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的血清酮体的含量示意图。
图13显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的血清尿酸的含量示意图。
图14显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的干燥粪便中脂质的含量示意图。
图15显示C57BL/6JNarl小鼠管喂14天后口服葡萄糖耐受性试验的血糖值变化示意图。
图16显示C57BL/6JNarl小鼠管喂14天后口服葡萄糖耐受性试验的120分钟血糖曲线下面积(AUC120min)的变化示意图。
图17显示C57BL/6JNarl小鼠管喂14天后口服葡萄糖耐受性试验的血糖上升值变化示意图。
图18显示C57BL/6JNarl小鼠管喂14天后口服葡萄糖耐受性试验的120分钟血糖上升曲线下面积(iAUC120min)的变化示意图。
具体实施方式
本案所提出的发明将可由以下的实施例说明而得到充分了解,使得本领域技术人员可以据以完成,然而本案的实施并非可由下列实施例而被限制其实施型态,本领域技术人员仍可依据除既揭露的实施例的精神推演出其它实施例,该等实施例皆当属于本发明的范围。
实施例1、新颖副干酪乳杆菌的筛选及鉴定
本发明新颖的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GKS6(简称GKS6)是由新生儿粪便检体中筛选得到。为了得到能够改善代谢症候群疾病的新颖菌株,设定以下筛选条件:
1.母体年纪低于35岁,此为最适怀胎哺育幼儿的年龄。
2.母体在怀孕过程无因罹病而用药治疗,母体具有良好免疫力及健康。
3.母体具有无过敏症状的良好体质。
4.母体产检一切正常,无使用安胎药物,且其胎儿在孕期中健康长大。
5.母体自然产出新生儿。
6.新生儿经筛选后无带有特定过敏源且其病理检查正常。
7.新生儿获选条件为出生一周内,以利筛选原始生长于肠道的菌株。
经过以上筛选条件,由15个出生一周内新生儿的粪便检体,经由该发明技术领域熟知的微生物实验技术初步分离出约300株乳酸菌。进一步以耐酸性试验以及周边血液单核细胞(PBMC)筛选平台的干扰素-γ(IFN-γ)诱导能力作为筛选指标,由约300株乳酸菌中筛选得到本发明新颖的副干酪乳杆菌GKS6,其具有最佳的90%以上的高耐酸特性及IFN-γ诱导能力(91pg/mL),该IFN-γ诱导能力较已知的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus GG,简称LGG菌)的36.5pg/mL IFN-γ诱导能力高出约2.5倍。
GKS6是由一新生儿女婴的粪便中分离、筛选而得,可于37℃下的MRS(De Man,Rogosa and Sharpe)选择性(洋菜)培养基中生长良好。以无菌技术将GKS6菌株划线在MRS培养基中活化,再以无菌技术勾取单一的GKS6菌落接种至MRS培养基中扩增,隔日收取新鲜GKS6菌体。以十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl-ammonium bromide,CTAB)法抽取菌株基因组DNA(genomic DNA,gDNA),再以0.6%琼脂胶体电泳确认gDNA品质。经适度浓缩后以第三世代定序技术平台PacBio RSII(Pacific Biosciences of California,Inc.,CA,USA)进行GKS6菌株的全基因组分析,其中GKS6菌株的全基因组长度为3,076,381bp(SEQ ID NO:3),并包含81,241bp的质粒(SEQ ID NO:4)。将GKS6全基因组序列的编码送入全基因组资料库进行比对,获得GKS6菌株的pheS基因序列(SEQ ID NO:1)及recN基因序列(SEQ ID NO:2)。再将pheS基因序列送入美国国家生物技术资讯中心(NCBI)资料库进行比对,结果显示GKS6菌株与副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)最为接近,从而确认GKS6菌株为副干酪乳杆菌,但其前述基因序列与资料库中其它副干酪乳杆菌有所差异,因此本发明副干酪乳杆菌GKS6为新颖的微生物菌株。
为进一步确认GKS6菌株的独特性,将GKS6菌株与随机挑选且购买自财团法人食品工业发展研究所生物资源保存与研究中心的5株副干酪乳杆菌BCRC 16094、BCRC 17005、BCRC 17475、BCRC 17482以及BCRC 80881进行比对。
首先,抽取GKS6菌株以及其它5株市售的副干酪乳杆菌的gDNA,再以引子对pheS-F(5'-TTAACCCTCC TGGCTGAATT G-3',SEQ ID NO:5)及pheS-R(5'-ATGGATCTTC AAACCAARCTTGA-3',SEQ ID NO:6)与recN-F(5'-TTAACTCATG CGTCCATGTT T-3',SEQ ID NO:7)及recN-R(5'-ATGTTACAAG AGTTAGCGAT TCATG-3',SEQ ID NO:8),于以94℃3分钟,再于94℃30秒、52℃30秒、72℃1分30秒(35个循环)及72℃5分钟的条件进行聚合酶链反应。将反应完成的产物定序出GKS6菌株及这5株市售的副干酪乳杆菌的pheS及recN基因序列。
此外,由NCBI资料库下载已知的干酪乳杆菌12A(Lactobacillus casei 12A)全基因组(基因库编号:CP006690)、副干酪乳杆菌JCM 8130(L.paracasei subsp.JCM 8130)全基因组(基因库编号:AP012541)、副干酪乳杆菌KL1(L.paracasei KL1)全基因组(基因库编号:CP013921)、副干酪乳杆菌ATCC 334(L.paracasei ATCC 334)全基因组(基因库编号:CP000423)以及干酪乳杆菌ATCC 393(L.casei ATCC 393)全基因组(基因库编号:AP012544)中的pheS与recN基因序列,以分子演化遗传分析软件“BootstrapTest of Phylogeny”的近邻接合(Neighbor-Joining)模式绘制演化树。
请参阅图1及图2,其分别本发明副干酪乳杆菌GKS6与其它乳酸菌品系的pheS基因以及pheS基因的演化树示意图。无论是在pheS基因(图1)或是recN基因(图2)的演化树,GKS6菌株均独立于其它乳酸菌品系,显现GKS6菌株为新颖的副干酪乳杆菌菌株。经鉴定后,本发明的副干酪乳杆菌GKS6于2017年8月25日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,北京市朝阳区北辰西路1号院3号),其寄存编号为CGMCC No.14566,且于2017年8月26日通过存活试验。
实施例2、GKS6菌株的发酵培养
本发明新颖的GKS6菌株为一种益生菌菌株,具有高活性表现的特殊黏多糖。经多糖结构分析,GKS6菌株中的多糖类为葡萄糖及半乳糖以约3:1的比例组合而成。因此,在GKS6菌株的发酵培养中,以3%葡萄糖搭配1%乳糖进行发酵测试。另将4%葡萄糖及4%乳糖的组合以及葡萄糖与乳糖(3:1)添加比例进行测试比较,并无明显差异,因此以葡萄糖及乳糖以3:1比例作为发酵的碳源。
培养本发明新颖的GKS6菌株的氮源则选用非基改酵母萃取物、大豆分离水解蛋白质、牛肉萃取物或其组合进行试验。经正交试验交叉筛选比较测试,最佳条件为酵母抽出物及牛肉萃取物的比例为1%:1%,GKS6菌数可达4.3×109cfu/mL。当采用2%酵母抽出物为氮源时,GKS6菌数可达3.7×109cfu/mL;而采用大豆蛋白分离水解蛋白质为氮源时,GKS6菌数仅为6.4×108cfu/mL。因此,大豆类的蛋白质并不适合应用于GKS6菌株的培养。在考虑GKS6菌株产品需符合纯素食者的要求时,则以酵母萃取物作为氮源,进行GKS6菌株的高密度发酵。
当将GKS6菌株无菌接种于含有复合糖类碳源(3%葡萄糖及1%乳糖)及2%酵母萃取物的培养基并于37℃进行高密度发酵时,GKS6活菌数达到1.3×1010cfu/mL,达到400%的提升。因此,本发明后续实验中,除非特别说明,否则新颖的GKS6菌株是以此培养条件进行培养。
进一步而言,在GKS菌株在冷冻干燥过程中可加入保护剂,其包括但不限于海藻糖、奶粉、聚糊精、味精、焦磷酸盐、维生素、精氨酸及其组合。因此GKS6菌株可以菌粉方式成为可食用组合物。
进一步而言,亦可将GKS6菌株与药学可接受的载体或赋形剂组合,而制备为医药组合物。有效GKS6菌株数量的该医药组合物较佳地适于以口服方式给予所需的个体,而用于治疗、预防或改善其代谢症候群。
实施例3、乳酸菌耐酸试验
本发明新颖的GKS6菌株与市售副干酪乳杆菌BCRC 16094、17005、17475、17482及80881比较耐酸能力。此试验是将菌株活化后,以盐酸调整MRS培养液(MRS broth)的酸碱值至pH 3.2、2.4或2.0,于37℃培养3小时后,计数菌数。
请参阅图3,其显示本发明副干酪乳杆菌GKS6与其它市售副干酪乳杆菌的耐酸性示意图。在图3中,在原始酸碱值(约pH 6.5)的MRS培养液中培养下,GKS6菌株与BCRC16094、17005、17475、17482及80881菌株的单位菌数皆可到1010左右,而在调整MRS培养液的酸碱值至pH 2.4及2.0后,发现BCRC 16094、17005、17475、17482及80881菌株的单位菌数都显著地低于GKS6菌株的单位菌数(P<0.05)。因此,本发明的GKS6菌株的耐酸能力较其它已知副干酪乳杆菌更好,对于通过胃酸的能力更佳。
实施例4、乳酸菌耐胆盐试验
本发明新颖的GKS6菌株与市售副干酪乳杆菌BCRC 16094、17005、17475、17482及80881比较耐胆盐能力。此试验是将菌株活化后,于37℃下将菌株接种至含0.3%胆盐的MRS培养液中,浸泡0.5小时后计数菌数。
请参阅图4,其显示本发明副干酪乳杆菌GKS6与其它市售副干酪乳杆菌的耐胆盐能力示意图。在图4中,在原始MRS培养液的培养下,GKS6菌株与BCRC 16094、17005、17475、17482及80881的单位菌数皆接近9×109,而在添加0.3%胆盐至MRS后,可发现BCRC 16094、BCRC 17005、BCRC 17475、BCRC 17482及BCRC 80881菌数都显著低于GKS6菌数(P<0.05),可得知GKS6菌株耐胆盐能力较其它副干酪乳杆菌更好,对于通过体内消化道胆盐的能力更佳。
实施例5、喂食副干酪乳杆菌GKS6的大鼠的生理试验
本实施例的实验动物为18只6周龄且体重介于201-225克的雄性Wistar大鼠。大鼠饲养于不锈钢鼠笼,而动物房温度控制在22±2℃,湿度控制在60-80%,光照及黑暗各12小时(07:00-19:00为光照期;19:00-07:00为黑暗期)。试验期间,大鼠自由地摄取饲料及蒸馏水。
依据上述“实施例2、GKS6菌株的发酵培养”段落的高密度发酵技术,将培养基中的培养液离心以获得GKS6菌体,并将GKS6菌体冷冻干燥成为GKS6菌粉。在冷冻干燥过程中,可加入保护剂(包括但不限于海藻糖、奶粉、聚糊精、味精、焦磷酸盐、维生素、精氨酸及其组合)于GKS6菌体中。后续试验所使用的GKS6菌株即为GKS6菌粉。
首先,喂予Wistar大鼠正常的成鼠饲料及饮用蒸馏水,适应环境1周后,将其随机分为三组。试验样品以口服方式喂食,分组如下:
1.正常饮食组(normal diet,ND)(n=6只)
2.高脂饮食组(high-fat diet,HFD)(n=6只)
3.高脂饮食组给予GKS6(HFD+GKS6)(n=6只)
高脂饮食组的饲料配方是以AIN93G为基础,辅以调整油脂比例,高脂饮食组包含68%饲料固形物、7%大豆油及25%猪油。而在HFD+GKS6组中,除了与高脂饮食组相同的饲料配方外,以口服方式喂食102.8mg/kg大鼠/日的GKS6菌株达6周。
试验开始先记录大鼠的初始体重,之后每2天精称体重并观察其变化。给予试验样品的时间为6周,处死前3天收集大鼠粪便,并于试验结束前12小时禁食。以二氧化碳处死大鼠,并记录大鼠最终体重及体重变化量。此外,从大鼠的静脉采集血液,作为后续的血清生化分析。同时,取出脏器组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏)以及脂肪组织(肾周围脂肪组织(perirenal adipose tissue)、附睾脂肪组织(epididymal adipose tissue)、肠系膜脂肪组织(mesenteric adipose tissue)、腹膜外脂肪组织(retroperitoneal adiposetissue)及腹股沟脂肪组织(inguinal adipose tissue),以生理食盐水清洗并擦拭,精称并记录各个脏器及脂肪组织的重量。各种脂肪组织重量的总和为总脂肪重量,总脂肪重量除以最终体重则为体脂肪率。以铝箔纸包覆称量后的脏器及脂肪组织,并以液态氮冷冻,储存于-80℃,以供实验分析使用。
以SPSS电脑统计软件分析前述的实验数据。以PROC ANOVA以及Duncan’smultiple range test进行变异数分析,p<0.05为具有显著性差异。
(1)体重变化:
请参阅图5,其显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的初始体重、最终体重以及体重变化量示意图。体重变化量以下述式(1)计算:
体重变化量(g)=最终体重(g)-初始体重(g) 式(1)
在图5中,各组间的初始体重并无显著差异(p>0.05)。高脂饮食组的最终体重显著地高于正常饮食组(p<0.05)。而以高脂饮食诱导肥胖的大鼠并给予GKS6菌株的组别则可显著地降低最终体重(p<0.05)及体重变化量(p<0.05),表明本发明新颖的GKS6菌株可有效降低由高脂饮食引起的体重增加。
(2)脏器重量:
请参阅图6,其显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏重量示意图。在图6中,大鼠的脾脏及肺脏重量在各组间没有显著变化;高脂饮食组的心脏、肝脏及肾脏的重量高于正常饮食组,而喂食GKS6菌株的组别的心脏、肝脏及肾脏重量相较于高脂饮食组则明显下降(p>0.05)。因此,服用本发明新颖的GKS6菌株能有效降低心脏、肝脏及肾脏的重量,减缓因高脂饮食所引起的脏器肥大。
(3)脂肪重量变化:
请参阅图7,其显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的不同部位(肾周围、附睾、肠系膜、腹膜外以及腹股沟)脂肪组织的重量相对于大鼠体重的脂肪量示意图。在图7中,高脂饮食诱导的肥胖大鼠的脂肪组织重量显著地高于正常饮食组(p<0.05);而高脂饮食合并给予GKS6的组别相较于单纯给予高脂饮食组,各种脂肪重量都显著地下降,表明在高脂饮食下本发明新颖的GKS6菌株能有效地降低动物全身各脂肪的堆积(p<0.05)。
学理上,脂肪组织被区分为内脏脂肪及皮下脂肪,其中肾周围脂肪、附睾脂肪及肠系膜脂肪属于内脏脂肪,腹股沟脂肪及腹膜外脂肪属于皮下脂肪,而各种脂肪组织的重量总和则为总脂肪量。内脏脂肪及皮下脂肪量分别以式(2)及式(3)计算,总脂肪量以式(4)计算。
内脏脂肪量(mg/g大鼠)=[肾周围脂肪量(mg)+附睾脂肪量(mg)+肠系膜脂肪量(mg)]÷最终体重(g) 式(2)
皮下脂肪量(mg/g大鼠)=[腹股沟脂肪(mg)+腹膜外脂肪量(mg)]÷最终体重(g)式(3)
总脂肪量(mg/g大鼠)=[肾周围脂肪量(mg)+附睾脂肪量(mg)+肠系膜脂肪量(mg)+腹股沟脂肪(mg)+腹膜外脂肪量(mg)]÷最终体重(g) 式(4)
请参阅图8,其显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的不同类型脂肪组织(总体脂、内脏脂肪组织以及皮下脂肪组织)相对于大鼠体重的脂肪量示意图。在图8中,高脂饮食诱导的大鼠的内脏脂肪组织重量显著地高于正常饮食组(p<0.05);高脂饮食合并给予GKS6的组别相较于单纯给予高脂饮食组,在内脏脂肪和皮下脂肪组织的重量皆显著地低于高脂饮食组(p<0.05);表明不论在内脏脂肪或皮下脂肪,本发明新颖的GKS6菌株能有效地减少因高脂饮食造成的脂肪堆积。
(4)肝脏脂质含量:
在此试验中,将称重后的大鼠肝脏组织加入萃取溶剂(氯仿:甲醇=2:1(v/v))并以均质机磨碎,过滤至有盖试管,以萃取液定量至10mL,加入2mL的0.05%(w/v)CaCl2,于4℃以3,500×g离心3分钟。去除上层液后再以氯仿:甲醇:水=3:48:47(v/v/v)定量至12mL,于4℃以3,500×g离心3分钟。去除上层液后加入甲醇至10mL,再以萃取溶剂(氯仿:甲醇=2:1(v/v))定量至25mL,收集于样品瓶中并储存于-20℃。以市售试剂组分析总胆固醇及三酸甘油酯。
请参阅图9,其显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的肝脏总脂质、三酸甘油脂以及胆固醇的含量示意图。在图9中,单纯给予高脂饮食的组别在肝脏总脂质、三酸甘油酯和胆固醇的含量均显著地高于正常饮食控制组(p<0.05),而高脂饮食合并给予GKS6的组别的肝脏总脂质、三酸甘油脂和胆固醇的含量相对于单纯给予高脂饮食组别,在统计学上都有意义的明显降低(p<0.05),此表明本发明新颖的GKS6菌株能有效地减少因高脂饮食所导致的肝脏的脂质堆积。
(5)肝指数测定:
将大鼠处死后的血液收集于血清分离管(BDPlymouth,UK),以4,000rpm离心10分钟,将血清置于微量离心管中并储存于-80℃。以市售分析套组(DiaSysDiagonostic Systems GmbH,Holzheim,Germany)测定AST、ALT。
请参阅图10,其显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的血清AST以及ALT的含量示意图。在图10中,高脂饮食组大鼠血清的ALT及AST显著地高于正常饮食组(p<0.05),表明其肝脏发炎程度较高;然而,高脂饮食诱导的大鼠合并给予GKS6的组别,相较于高脂饮食组,可显著地降低血清ALT及AST浓度(p<0.05),表明服用本发明新颖的GKS6菌株可有效地降低血清ALT和AST浓度,以改善肝功能。
(6)血清脂质含量:
此试验是以市售分析套组(DiaSys Diagonostic Systems GmbH,Holzheim,Germany)测定大鼠血清的三酸甘油脂、总胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇的含量,实验结果如图11所示。结果显示,高脂饮食组大鼠血清的三酸甘油脂及胆固醇显著地高于正常饮食组(p<0.05)。相对于高脂饮食组,高脂饮食诱导的大鼠合并给予GKS6的组别的三酸甘油脂及胆固醇含量显著地降低。此外,高脂饮食组大鼠血清的高密度脂蛋白胆固醇显著地低于正常饮食组(p<0.05)。相对于高脂饮食组,高脂饮食诱导的大鼠合并给予GKS6的组别的高密度脂蛋白胆固醇含量显著地提升,表明服用本发明新颖的GKS6菌株能有效提高血清中高密度脂蛋白胆固醇的浓度。
(7)酮体:
本试验是以市售分析套组(Denka Seiken Co.Ltd)测定大鼠血清的酮体,实验结果如图12所示。结果显示,高脂饮食组大鼠血清的酮体含量显著地高于正常饮食组(p<0.05);经高脂饮食诱导的大鼠合并给予GKS6的组别则显著地降低因高脂饮食引起的血清酮体浓度上升情形(p<0.05),表明服用本发明新颖的GKS6菌株能有效降低血清中酮体浓度。
(8)尿酸:
本试验是以市售分析套组(DiaSys Diagonostic Systems GmbH,Holzheim,Germany)测定大鼠血清的尿酸,实验结果如图13所示。结果显示,高脂饮食组大鼠血清的尿酸含量显著地高于正常饮食组;高脂饮食合并给予GKS6的组别与高脂饮食组相比则显著地降低血清中尿酸浓度(p<0.05)至正常饮食组的水准,表明施予本发明新颖的GKS6菌株能有效降低血清中尿酸浓度。
(9)脂肪排出效果:
在本试验中,收集大鼠处死前3天的粪便,称重后磨碎。将萃取溶剂(氯仿:甲醇=2:1(v/v))加至磨碎的粪便,振荡混合后以滤纸过滤。加入0.05% CaCl2至滤液并混匀,于4℃以3,500×g离心5分钟。去除上清液,再以萃取溶剂定量至25mL,储存于-20℃。当欲测定粪便脂质浓度时,以减压浓缩方式干燥10μL的粪便脂质萃取液,加入市售试剂组的1,000μL反应剂并混匀,置于37℃水浴5分钟,再以分光光度计、于500nm波长下测量吸光值,与标准液吸光值对照换算而获得粪便脂质浓度。
请参阅图14,其显示正常饮食的控制组(ND)、高脂饮食组(HFD)以及高脂饮食组给予副干酪乳杆菌GKS6组(HFD+GKS6)大鼠的干燥粪便中脂质的含量示意图。在图14中,高脂饮食组大鼠粪便的总脂质显著地高于正常饮食组(p<0.05);但高脂饮食合并给予GKS6的组别相较于高脂饮食组,粪便脂质的排出量显著地提高(p<0.05),表明高脂饮食所导致的大鼠给予GKS6能有效地透过排便方式排出脂质。
实施例6、副干酪乳杆菌GKS6改善葡萄糖敏感性的能力
本实施例的目的在于试验GKS6菌株改善葡萄糖敏感性的能力。实验动物为20只雄性C57BL/6JNarl小鼠。经过一周的观察期,小鼠被随机分组,每笼饲养5只。饲养小鼠的垫料为经灭菌的木屑垫料(ASPEN shavings,Northeastern Products Corp.,Warrensburg,NY12885,U.S.A.),每周更换2次。小鼠按一般的实验动物饲养管理方法饲养,动物房的温度控制在23±2℃,相对湿度控制在50±10%,光照及黑暗各12小时。试验期间,小鼠自由的摄取饲料及蒸馏水。
将小鼠随机分为2组,分别为对照组(n=10)及GKS6实验组(n=10)。实验组灌食剂量为500mg/kg小鼠重量的GKS6菌株,灌食体积为0.1mL/10g体重/日,共灌食14日。对照组则给予正常饲料及蒸馏水,不给予GKS6菌株。
(1)口服葡萄糖耐受性试验(oral glucose tolerance test,OGTT)
首先,让C57BL/6JNarl小鼠禁食16小时,从尾端采集血液样本,以Glucosure II血糖机(ApexBio Inc)搭配血糖测试片(葡萄糖氧化酵素法)检测小鼠的空腹(0分钟)血糖值。再管喂葡萄糖溶液(2g/kg小鼠体重),之后在30、60及120分钟各自检测血糖值。
(2)摄食量、饮水量以及脏器重量:
喂食期间,每周量测体重一次、饲料摄取量及饮水量各二次。于OGTT之后处死小鼠,取出肝脏、肾藏及脾脏,并称重。
(3)统计分析:
实验结果以“Mean±SD”表示,以Student’s t-test进行GKS6实验组与对照组之间的比较。
(4)结果:
请参阅表1,于管喂14天后,GKS6实验组的体重及总体增重(克数及百分比)均显著低于对照组(p<0.01)。在此管喂期间,GKS6实验组的饮水量及饲料摄取量则与对照组之间并无统计上显著的差异性(表2)。与前述体重及总体增重的变化趋势相同的是,GKS6实验组的肾脏重量也是显著地较对照组低,但可能因小鼠体重也较轻,其相对重量比则与对照组没有统计上显著差异(表3)。
表1、试验期间各组C57BL/6JNarl小鼠的体重及总体增重变化
**表示与对照组之间p<0.01
表2、试验期间各组C57BL/6JNarl小鼠之平均每日摄食量及饮水量
表3、试验期间各组C57BL/6JNarl小鼠脏器重量及相对重量
在口服葡萄糖耐受性试验方面,GKS6实验组的30分钟血糖值显著地低于对照组(表4、图15)。GKS6实验组的120分钟血糖曲线下面积(area under curve,AUC120min)亦略低于对照组(p<0.05)(表4、图16)。而GKS6实验组的30分钟血糖上升值(i30分钟)以及120分钟血糖上升曲线下面积(iAUC120mn)都明显地低于对照组(表5、图17、图18),且GKS6实验组的120分钟血糖上升值(i120分钟)也显著地较对照组为低(表5、图17)。
表4、管喂14天后,各组C57BL/6JNarl小鼠于口服葡萄糖耐受性试验的血糖值及血糖曲线下面积
*表示与水对照组之间p<0.05。
表5、管喂14天后,各组C57BL/6JNarl小鼠于口服葡萄糖耐受性试验的血糖上升值及血糖上升曲线下面积
*及**分别表示与对照组之间p<0.05、p<0.01
综上所述,显示在500mg/kg小鼠重量的GKS6菌株的剂量下,GKS6菌株具有改善葡萄糖敏感性的潜力。
因此,本案从健康女婴粪便中分离出一株副干酪乳杆菌亚种GKS6,该菌株GKS6具备耐酸、耐胆盐能力,能在食用后通过消化道到达肠道,借此协助食物的消化分解,使脂质排出量增加,并有效降低体脂与血脂。
然而,由于如前所提及的由肥胖导致的症状及疾病可以得知,肥胖全面性地改变生理环境,引起的是身体在多种不同面向上的病变。因此,具有单一功效的菌株无法满足由肥胖引起的多种症状的缓解需求,在预防及/或治疗的医药领域中仍有发展具复合性功效的菌株的必要,以更有效地同时针对肥胖相关的病症达到改善的效果。
因此,上述亦说明了肠道菌相与消化吸收的关系,且并非所有益生菌都能在服用后顺利抵达肠道,它必须要具备耐胃酸,耐胆盐,且具优良的肠道吸附能力能活着抵达肠道,否则进入肠道后变成死菌,那么原本标榜的功效就无法完全发挥了。
本发明实属难能的创新发明,深具产业价值,援依法提出申请。此外,本发明可以由本领域技术人员做任何修改,但不脱离如所附权利要求书所要保护的范围。

Claims (1)

1.一种将副干酪乳杆菌GKS6(Lactobacillus paracasei GKS6)制备用于治疗或预防代谢症候群引起的肥胖的医药组合物的用途,其中所述副干酪乳杆菌GKS6的寄存编号为CGMCC No.14566,且所述副干酪乳杆菌GKS6耐受胃的酸性低至pH 2.0。
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