CN117965391B - 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，涉及一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci‑1及其用途，尤其涉及一株具有降低胆固醇、抑制脂肪合成、改善腹泻症状的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci‑1菌株及其用途。该菌株无毒力因子、无耐药基因，具有良好的安全性，且同时具有调节脂质代谢和改善腹泻症状多重功效，对高胆固醇血症、肥胖和/或腹泻具有潜在益处。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1及其用途，尤其涉及一株具有降低胆固醇、抑制脂肪合成、改善腹泻症状的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1菌株及其用途。
背景技术
肥胖是世界性的健康问题，根据世界肥胖联盟研究显示，预测到2035年，全球将有超过40亿人属于肥胖或超重，占全球人口的51%。2020~2035年间，儿童肥胖率将翻倍上升，全球男孩的肥胖率将从10%上升到20%，女孩的肥胖率将从8%上升到18%。国际通常用体重指数（Body Mass Index，BMI）为标准判断肥胖程度，18 .5≤BMI≤24 .9时属正常范围，BMI≥25为超重，BMI≥30为肥胖。
肥胖症是指由环境、饮食以及遗传等多种因素相互作用引起的体内脂肪堆积过多、脂肪分布异常和体重增加等的一种慢性代谢类疾病，其发病趋势与2型糖尿病类似，主要表现为脂肪细胞数量增多、体脂分布失调以及局部脂肪沉积。肥胖使机体代谢稳态破坏，进而引起代谢疾病，肥胖是2型糖尿病的重要发病危险因素。此外，肥胖患者常伴有自卑、焦虑及抑郁等社会心理因素，高血压、糖尿病、冠心病和血管粥样硬化等疾病的发生发展也与肥胖症及其并发症密切相关，通常表现为：①糖代谢、脂代谢功能障碍；②代谢性内毒素血症（与高血液脂多糖水平相关的低级炎症状态）；③肠道屏障功能受损。
肥胖症根据其病因和临床表现可分为单纯性肥胖、继发性肥胖和药源性肥胖。其中，单纯性肥胖在临床上较为常见，其无明显病因且体重增加相对缓慢；继发性肥胖由疾病、内分泌紊乱或代谢紊乱所引起；药源性肥胖则由于使用药物所引起。当前主要治疗方法为：①生活及行为方式治疗：改善身体活动，合理安排饮食和改变环境因素等方式，该方法简单易实施，但对患者的依从性要求较高，且起效慢、治疗效果不稳定。②药物治疗：当BMI超过30kg/m2且伴随肥胖并发症时需要使用药物进行辅助治疗，目前中国获得国家药品监督管理局批准的肥胖症治疗药物是奥利司他，然而长期用药会产生不良反应及耐药性。③外科治疗：适用于重度肥胖（BMI 在30～35kg/m2之间）且伴有严重并发症患者，能更有效减轻并长久维持减重后的体重，但该方法成本高，且具有较大风险和副作用，对于病人心理健康也存在负面影响。④靶点治疗、基因定向治疗等：存在一定风险和不确定性，尚未有充足的临床实验，安全性有待进一步验证。
因此，目前仍有必要进一步开发可用于预防和/或治疗肥胖症的新物质。而人类的另一个基因组即肠道菌群基因组——编码基因是人类自身基因组编码基因的150倍，这种丰富性决定了其可能在肥胖发生中扮演一定角色。研究表明肥胖病人肠道菌群结构失调，肠道细菌多样性下降，存在拟杆菌门与厚壁菌门的比例失调，这些研究的发现为开发益生菌干预肥胖提供了重要试验依据和技术手段。研究发现，益生菌和益生元可以通过减少肠道细菌脂多糖，改变菌群组成，降低脂肪存储等方式发挥抵抗肥胖的作用。因此，用靶向肠道微生物群的产品进行治疗表现为用于治疗肥胖症和相关病症的有前景的治疗工具。
嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）是疣微菌门疣微菌属中一种严格厌氧的革兰氏阴性菌，可以在人类肠道中定殖，在健康肠道中的丰度占3%~5％。它在肠道中的定殖与宿主的健康息息相关，具有改善肥胖、减轻糖尿病患者的炎症反应以及胰岛素抵抗和葡萄糖耐受等不良症状、调节机体的免疫应答、维持体内代谢平衡等营养和保健作用。
嗜黏蛋白阿克曼氏菌的特别之处在于该菌依赖肠粘液层的黏蛋白生存，与大多数益生菌不同，它几乎不依赖于食物中的营养，即使消化道中没有营养物质，它也会以肠粘膜层中的黏蛋白为食，高度适应黏蛋白降解的生存方式。基因组分析显示嗜黏蛋白阿克曼氏菌具有多种适合利用黏蛋白寡糖中的特殊糖类的酶，如唾液酸酶、岩藻糖苷酶、硫酸酯酶，表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌对宿主的潜在功能意义。
现已有研究验证了抗肥胖症功效的嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株的抗肥胖作用机理：嗜黏蛋白阿克曼氏菌可通过诱导调节性T细胞，显著提高肥胖小鼠的糖耐量，减轻脂肪炎症反应。研究发现，口服嗜黏蛋白阿克曼氏菌胞外囊泡干预可能通过改变高脂饮食小鼠的肠道通透性和屏障完整性来改善代谢功能。还发现嗜黏蛋白阿克曼氏菌定殖完全逆转饮食诱导的空腹高血糖症，并且治疗后胰岛素抵抗指标同样地降低。在高脂肪饮食下，嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理增加了脂肪细胞分化和脂质氧化的标志物的mRNA表达，而不影响脂肪生成。因此，嗜黏蛋白阿克曼氏菌可以作为一种代谢标志物，表明肥胖风险的降低，它可以直接用于改善葡萄糖和脂质代谢来治疗肥胖。
专利申请CN104918626 A公开了嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株MucT （ATTC BAA-835）用于治疗代谢病症的用途，其研究发现，施用嗜黏蛋白阿克曼氏菌能影响肥胖症及其相关病症的三种潜在功能障碍，即代谢功能障碍、与较高的血液脂多糖（LPS）水平相关的低级炎症状态和受损的肠道屏障功能障碍。专利申请CN 108289918 A的研究发现，嗜黏蛋白艾克曼氏菌标准菌株MucT（ATTC BAA-835）经巴氏灭菌比非经巴氏灭菌能更有效增加屏障功能和治疗与肥胖症和相关病症有关的代谢功能障碍。专利申请CN117050914A则证明特定的嗜黏蛋白阿克曼氏菌株能改善GLP-1分泌量和提高基础代谢率。专利CN116200312A则公开一种同时具有抗氧化、肿瘤抑制和减脂潜力的阿克曼氏新种属菌株。专利CN114250179A则表明联用格氏乳杆菌和嗜黏蛋白阿克曼氏菌的减重效果优于单用任一种菌。专利CN113330109A提供一种可能通过B2UM07蛋白增加GLP-1分泌进而抑制体重增加的特定嗜黏蛋白阿克曼氏菌株。CN110964650B公开了一种主要在体重控制和糖代谢方面具有预防和治疗前景的阿克曼氏菌株。
嗜黏蛋白阿克曼氏菌还被报道有其他多种用途，比如抗肿瘤，改善牙周炎，调节免疫等。但因为菌株的功效具有特异性，已被测试菌株的功效不能作为支持同种属的未经测试的菌株的功效证据（《世界胃肠组织临床指南》）。同时也说明，未被发现的新菌株可能存在比已知菌株更大的潜力，因此，发掘出功能更多、功效更佳的新菌株是功能益生菌开发的重要课题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种安全性良好、同时具有多种功效，具体而言，是同时具有降低胆固醇、抑制脂肪合成和改善腹泻症状功能的嗜黏蛋白阿克曼氏菌株，这在现有研究中从未有过报道。
作为本发明的第一方面，首先提供了一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，所述菌株如保藏编号为CCTCC NO：M 2024046的Amuci-1菌株所示。所述菌株可以为活菌或灭活形式。
作为本发明的第二方面，本发明提供了前述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株的纯培养物、活菌或灭活菌体。
作为本发明的第三方面，本发明提供了前述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株的培养方法，所述方法包括将所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的嗜黏蛋白阿克曼氏菌。
作为本发明的第四方面，本发明提供了一种食品、保健品或药物组合物，其含有前述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株或前述培养方法得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株。
在一些具体实施方式中，所述药物组合物中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株作为唯一活性成分。
在一些具体实施方式中，所述药物组合物还含有二甲双胍、司美格鲁肽、奥利司他、洛哌丁胺、洛伐他汀、辛伐他汀、阿伐他汀、瑞舒伐他汀、依折麦布、苯扎贝特、非诺贝特和吉非贝齐等中一种或多种。
在一些具体实施方式中，所述组合物的单个制剂中含有106~1012 CFU的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株。
作为本发明的第五方面，本发明提供了前述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株或前述培养方法得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株在制备降低胆固醇、抑制脂肪合成和/或改善腹泻症状的制剂中的用途。
在一些具体实施方式中，所述制剂施用于高胆固醇血症、肥胖和/或腹泻受试者。
在一些具体实施方式中，所述受试者包括人和其他哺乳动物。
在一些具体实施方式中，所述腹泻为化疗相关性腹泻。
在一些具体实施方式中，所述化疗相关性腹泻是由活性成分选自如下一种或多种的药物引起的腹泻：5-氟尿嘧啶、替加氟、5'-2'-脱氧尿苷、卡培他滨、替吉奥、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀、伊立替康。
本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌无毒力因子和耐药基因，安全性良好，且同时具有降低胆固醇、抑制脂肪形成和抗腹泻多重功效，是有潜力的益生菌株。现有技术从未报道同时具有这些功效的嗜黏蛋白阿克曼氏菌株。
Amuci-1菌株保藏信息如下：
菌株名称：嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）Amuci-1
保藏日期：2024年1月9日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，CCTCC），地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052
保藏编号：CCTCC NO：M 2024046。
附图说明
图 1 是本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1菌落形态正面照片。
图 2 是嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1的胆固醇降解能力试验结果。
图 3 是油红O（oil red-O）染色检测菌株Amuci-1对3T3-L1细胞成脂的影响：A是各组油红O染色图片；B是以模型组为基准的各组细胞的脂质堆积的相对量。
图 4 是qPCR检测3T3-L1细胞成脂诱导过程中各组别脂肪酸氧化相关基因表达水平。A是acox1基因表达水平；B是cpt1b基因表达水平。
图 5 是灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1对斑马鱼脂肪合成抑制效果图。A肠道和尾部血管脂肪染色强度柱状结果图；B染色结果图。
图6 是灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1对肥胖小鼠体重及采食量改善效果图：A实验终点体重结果；B实验终点体重变化率；C实验终点体重增长量；D平均日采食量结果。
图7 是灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1对肥胖小鼠体脂改善效果图：A脂肪质量结果；B脂体比结果；C瘦肉质量结果；D瘦肉/体重比结果；E脾指数改善效果图。
图8是嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1活菌对5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠的治疗效果图：A 第1-9天各组腹泻评分曲线；B D8腹泻评分图；C D9腹泻评分图；D各组腹泻总分图。
图9是嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1对血细胞改善效果图：A 白细胞数量；B单核细胞数量。
图10是嗜黏蛋白阿克曼活菌Amuci-1 21天亚急性毒性试验体重图：A 雄性小鼠体重；B雌性小鼠体重。
具体实施方式
本发明所请求保护的特定保藏编号的嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株，其涵义包括但不限于：
（1）存放于所述保藏中心的特定保藏号的菌株；
（2）与（1）所述菌株具有相同基因组的菌株；
（3）基于前述（1）或（2）的没有突变的传代菌株；
（4）基于前述（1）、（2）或（3）的在传代中积累微小突变的，但毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株；
（5）基于前述（1）-（4）任一所述菌株的活菌、灭活形式、裂解物或发酵产物等。
如本领域所知，菌株经传代应用不可避免会引入微小突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响菌株毒性、免疫原性与生物活性的突变（比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响毒性、免疫原性与生物活性的微小突变的残基），可以合理预期，当这些微小变化没有明显影响后代毒株的毒性、免疫原性与生物活性的情况下，仍然能实现本发明的目的，且其源于本发明贡献的菌株，因此仍在本发明的实质技术贡献范围内。这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为毒性、免疫原性与生物活性没有变化的突变菌株。
毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化，包括担不限于，在检测灵敏度、检测限等检测技术的局限性和可接受或不可避免误差的范围内视为毒性、免疫原性与生物活性是相同的。用细胞、动物等测定Amuci-1株后代的毒性、免疫原性与生物活性，由于细胞品系、动物品种、年龄、性别、健康状况、培养条件等体现的差别以及可预期或不可避免的系统误差属于没有实质性变化。
本发明所述的组合物含有活性成分嗜黏蛋白阿克曼氏菌，以及其他成分，比如不具有生理功效的辅料成分，并可选地含有其他功效性成分。
功效性成分包括但不限于其他功效菌株、活性化合物成分、活性生物成分、活性中药成分、益生元成分、后生元成分等。
本发明的组合物可以用于食品、保健品或药品等。并根据应用领域选用适宜的辅料和添加剂。
对于药物，辅料成分包括药物载体和赋型剂。药物载体是指不对受试者引起显著刺激且不消除所施用的益生菌的生物活性及特性的药学载体。药学上可接受的载体可增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可包括溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物稳定剂、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，正如本领域技术人员已知的（参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版MackPrinting Company,1990,第1289-1329页）。除非常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗性或药物组合物中。载体可经选择以使受试者的不利副作用降至最低和/或使活性成分的失活降至最低。
赋型剂是指添加至药物组合物中以使药物具有一定形状或一定浓度的物质。例如无菌水、生理盐水、聚亚烷基二醇（诸如聚乙二醇）、植物油或氢化萘、碳酸氢钙、磷酸钙、多种糖、各种类型淀粉、纤维素衍生物、明胶等。
本发明所述的组合物可以制备成任一种便于使用的形式，例如临床或食品中常见的粉剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、胶囊或液体剂。
本发明所述的组合物以能发挥功效的含量（治疗有效量）和频率给予使用对象，推荐单次使用剂量中含有102~1015CFU、103~1014CFU、104~1013CFU、105~1012CFU、106~1012CFU、107~1011CFU、108~1010CFU、或108~1010CFU的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）。
本发明中的特定温度参数，如无特殊说明，应理解为恒温处理，并允许在一定温度区间内存在变动。如在±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均应属于本发明保护的范围。
以下实施例中所用到的培养基配制方法如下，未特殊说明的可以通过商业购买获得，或者按本领域常用方法制得：
无氧BHI&黏蛋白液体培养基的配制：称取BHI肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8297-1）38.5 g，黏蛋白（西格玛奥德里奇贸易有限公司，M2378-100G）2 g，溶解于1 L的蒸馏水中，N2置换除氧并分装，121℃高温湿热灭菌15 min，阴凉、干燥处存放。若配制固体培养基，则还需加入琼脂粉15 g。
含胆固醇的无氧BHI&黏蛋白液体培养基的配制：称取胆固醇（西格玛奥德里奇贸易有限公司，C8667）0.5 g，加入至25 mL吐温80（上海麦克林生化科技股份有限公司，T6336）中，用90℃水浴加热至胆固醇溶解（约40~60 min），再按2.5%（v/v）的比例将此混合物加至分装好的无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，121℃高温湿热灭菌15 min，阴凉、干燥处存放。
菌粉制备培养基配制：称取无水葡萄糖10 g，N-乙酰氨基葡萄糖2g，胰蛋白胨20g，酪蛋白胨10g，酵母提取物5 g，大豆蛋白胨5 g，苏氨酸2g，丝氨酸1g，磷酸二氢钾2 g，磷酸氢二钾2 g，碳酸氢钠0.5g，硫酸锰0.1 g，氯化钙0.05 g，吐温80 0.5 mL，一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，N2置换除氧，分装，121 ℃灭菌20 min。阴凉、干燥处存放。
无氧生理盐水配制：称取8.5g氯化钠溶于1 L纯水中，搅拌煮沸，煮沸后使用亨盖特装置通入N2，吹气20 min，待冷却至室温后分装培养基到已通N2进行除氧的厌氧瓶中121min高温灭菌15 min。
实施例1 菌株的分离与鉴定
（1）采集健康志愿者的新鲜粪便样本，加入适量无氧PBS重悬，震荡，并过滤。在N2保护下，将样本进行梯度稀释后厌氧培养5-9天。培养好的菌株经MALDI-TOF质谱检测去重后再进行16S rDNA基因扩增并测序（北京擎科生物科技有限公司成都分公司）鉴定。对测序结果进行BLAST对比，最终分离出3株嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila），分别命名为Amuci-1、 Amuci-7和Amuci-8。
（2）取嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1划线至无氧BHI&黏蛋白固体培养基培养后，其菌落形态呈较小的白色不透明状圆形菌落，中间凸起、表面光滑湿润，正面照片见图1，该菌株已于2024年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，武汉大学保藏中心），该菌株保藏号为：CCTCC NO：M 2024046。
实施例2 全基因组分析
将Amuci-1接种至5 mL无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，培养至对数生长后期，提取菌株全基因组DNA进行全基因组测序。对下机数据进行质控后用常规方法组装及注释，将所得蛋白序列与VFDB（Virulence Factor Databases）及CARD（The ComprehensiveAntibiotic Resistance Database）数据库进行比对开展毒力因子及耐药基因分析。结果显示，该菌不具有毒力因子，无可移动耐药基因，基因组层面安全。
利用平均核苷酸相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）和基于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的Variant分析进行菌株的新颖性分析。通过在Genbank中进行搜索，找到了307个已公开的Akkermansia muciniphila相关全基因组，通过fastANI（v1 .33）、snippy （v4.6.0）比较发现，与Amuci-1全基因组最相近的菌株ANI为99.81%，相关ANI和Variant信息如下表1：
表1 全基因组ANI和Variant 分析
| 基因组组装名称 | ANI（%） | Variant 总数 |
| ASM288529v1 | 99.81 | 2559 |
| ASM1837585v1 | 99.77 | 3534 |
| ASM288535v1 | 99.76 | 2563 |
| ASM1050923v1 | 99.71 | 3884 |
| ASM973157v1 | 99.71 | 3884 |
| ASM1884793v1 | 99.66 | 4363 |
| ASM288537v1 | 99.53 | 4901 |
| ASM288539v1 | 99.08 | 13673 |
| ASM288567v1 | 99.06 | 13658 |
实施例3 胆固醇降解实验
将保藏的Amuci-1接种至5 mL无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，以嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株（CICC24917，中国工业微生物菌种保藏管理中心，同ATCC BAA-835）作为参比菌株。所有菌株均在37℃厌氧培养至对数生长后期，得到活化菌株。各取活化菌株接种至1mL含胆固醇的无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，每组设置3个平行，于37℃厌氧培养72 h后进行胆固醇含量检测。
取1 mL培养菌液5000 rpm离心10 min，取上清得到检测样本。采用总胆固醇（TC）含量检测试剂盒（试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，BC1985），按照试剂盒的说明书操作绘制标准曲线并检测总胆固醇含量。胆固醇降解率计算方式为：胆固醇降解率%=（空白培养基中胆固醇的含量-实验组中胆固醇的含量）/空白培养基中胆固醇的含量×100%。结果以Mean±SD表示，采用T-test进行比较分析。**代表 p<0.01。
结果见图2，菌株Amuci-1的胆固醇降解能力达78.63%，极显著高于标准菌株CICC24917，表明Amuci-1具有较强的胆固醇降解能力。
实施例4 油红O（oil red-O）染色检测菌株Amuci-1对3T3-L1细胞成脂的影响
油红O染色法是一种通过油红O试剂染色分化的3T3-L1细胞来测量在细胞内所生成的脂肪含量的方法。
菌株培养：将Amuci-1、标准菌株CICC24917接种至15 mL菌粉制备培养基中，37℃电热恒温培养箱厌氧培养48 h。将活化菌株转接至360mL菌粉制备培养基中，厌氧培养48h。收集菌液，7000 rpm/min，离心15 min，使用无菌PBS洗菌一次。巴氏灭活处理后置于4℃待用。
细胞接种：将生长状态良好，密度适宜的3T3-L1细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，CL-0006）使用胰酶（北京兰杰柯科技有限公司，BL501A）进行消化，离心收集后，用含10%FBS和1% PS（赛默飞世尔科技有限公司，15140-122）的DMEM完全培养基（赛默飞世尔科技有限公司，C11995500BT）稀释至3×105个/mL接种于6孔板，每孔体积2 mL。接种当天记为Day0。
成脂诱导剂配制：
诱导剂I：称地塞米松（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，D1756）25 mg，用12.74 mL DMSO重悬混匀，使其浓度为5 mM；称罗格列酮（卡曼化学公司，71740）100 mg，用139.89 mL DMSO重悬混匀，使其浓度为2 mM；称IBMX（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，I5879）250 mg，用2.25 mL DMSO重悬混匀，使其浓度为0.5 M；称胰岛素（美国MCE生物科技有限公司，HY-P0035）25 mg，用2.5 mL DMSO重悬混匀，使其浓度为10 mg/mL。将上述药品稀释1000倍加入至100 mL DMEM完全培养基中，使其终浓度分别为5μM、2μM、0.5mM和10μg/mL。
诱导剂II：吸取2 mM罗格列酮100 μl，10 mg/mL胰岛素100 μl，加入至100 mLDMEM完全培养基中，使其终浓度分别为2μM和10μg/mL。
细胞成脂诱导与给药：设置模型组、标准菌株CICC24917组和Amuci-1组。不同组别处理方式如下：Day 3时模型组加入提前配制的诱导剂I，CICC24917组和Amuci-1组分别加入用诱导剂I重悬的灭活菌液，使其浓度为5×108 个/mL。置于5%二氧化碳培养箱中，37℃静置培养。Day 5、7、9、11和13时模型组加入提前配制的诱导剂II，CICC24917组和Amuci-1组分别加入用诱导剂II重悬的灭活菌液，使其浓度为5×108 个/mL置于5%二氧化碳培养箱中，37℃静置培养。
3T3-L1细胞染色处理：Day 15时弃去细胞上清液，加入4%多聚甲醛（北京兰杰柯科技有限公司，BL539A）固定30min，使用无菌PBS（武汉博士德生物工程有限公司，PYG0021）洗涤2次，加入60%异丙醇（生工生物工程（上海）股份有限公司，A507048-0500）溶液静置3min，加入油红O染液（北京索莱宝科技有限公司，G1260）进行染色，染色结束后加入60%异丙醇溶液显微镜下观察细胞间隙，细胞间隙清晰，加入无菌PBS洗涤2次，显微镜下拍照观察，结束后，添加异丙醇来溶解用油红O溶液染色的脂滴，利用酶标仪测量500 nm处的吸光度。
实验结果：如图3所示，通过显微镜观察，与模型组相比，Amuci-1组显著降低细胞内脂滴及脂肪堆积（p<0.001）；与标准菌株 CICC24917相比，Amuci-1降低细胞内脂肪堆积的效果显著优于标准菌株（P<0.01）。结果以Mean±SD表示，采用One-way ANOVA进行多重比较分析。***，表示与模型组比较，p<0.001；##，表示与嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC24917比较，p<0.01。
实施例5 qPCR检测3T3-L1细胞成脂诱导过程中acox1和cpt1b基因的相对表达水平
Acox1和Cpt1b作为脂肪酸β氧化过程的关键蛋白，在氧化降解脂肪酸的过程中至关重要。因而检测acox1和cpt1b基因的相对表达水平可以一定程度上反应脂肪酸降解水平。
菌株培养：将Amuci-1接种至15 mL菌粉制备培养基中，37℃电热恒温培养箱厌氧培养48 h。以标准菌株CICC24917作为参比菌株。将活化菌株转接至360 mL菌粉制备培养基中，厌氧培养48 h。收集菌液，7000 rpm/min，离心15 min，使用无菌PBS洗菌一次。巴氏灭活处理后，置于4℃待用。
细胞接种：将生长状态良好，密度适宜的3T3-L1细胞使用胰酶进行消化，用含10%FBS和1% PS的DMEM完全培养基稀释至3×105个/mL并接种于6孔板中，每孔体积2 mL。接种当天记为Day 0。
成脂诱导剂配制：同实施例4。
细胞成脂诱导与给药：分组、成脂诱导与给药方式与实施例4类似。Day 13时弃去细胞上清液，进行RNA提取、逆转录与qPCR实验。
qPCR：Day 13时弃去细胞上清液，按照RNAsimple总RNA提取试剂盒（TIANGEN，DP419）说明书进行RNA提取。RNA提取完成后，按照Thermo的cDNA逆转录试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司，K1622）说明书进行逆转录。逆转录完成后，使用SYBR法（伯乐生命医学产品（上海）有限公司，1725124）进行qPCR实验。检测得到的CT值，采用2^-ΔΔCt 算法计算。基因表达量=2^-[ΔCT（目的基因CT-对应内参基因CT）-ΔCT（对照组目的基因CT-对照内参基因CT）]。将诱导脂肪分化后，模型组各基因的表达量设定为100%，其余各组均以模型组为基准计算相对表达水平。
试验结果：如图4A和B所示，相对于模型组，Amuci-1显著增加acox1和cpt1b的mRNA相对表达水平，且效果显著优于嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株CICC24917。结果以Mean±SD表示，采用One-way ANOVA进行多重比较分析。**，与模型组比较，p<0.01；##，与菌标准菌株CICC24917比较，p<0.01。
实施例6 嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养与制备
冻干保护剂配制：
A液：蔗糖5g，海藻糖5g，甘露醇5g，脱脂乳粉8g，纯化水62 g；115℃灭菌20 min。
B液：维生素C钠3 g，纯化水12 g。过滤除菌备用。
使用时按质量比A:B=17：3混合。
菌粉制备：将保藏的嗜黏蛋白阿克曼氏菌 Amuci-1、Amuci-7和Amuci-8接种至菌粉制备培养基，得到一级种子液。随后，再转接一次得到二级种子液。将二级种子液泵入发酵罐中，设置发酵参数（37℃、pH 6.0、100 rpm、0.06 MPa），发酵培养。发酵到达终点后，离心收集菌体。按菌泥和冻干保护剂重量比1:1~1:2添加冻干保护剂，混匀乳化菌泥。乳化后的菌悬液冻干，粉碎后即得菌粉。
实施例7 灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1抑制斑马鱼脂肪合成
灭活菌液制备：按实施例6制备的CICC24917、Amuci-1、Amuci-7和Amuci-8菌粉（2×109CFU），以2 mL 生理盐水充分溶解，制成浓度为1×109CFU/mL的菌悬液。随后80℃水浴30~60 min进行巴氏杀菌，获得灭活菌悬液。
试验分组与给药：选取5 dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼210尾（购自杭州环特生物科技股份有限公司），随机分为7组，分别为正常对照组、模型对照组、奥利司他组、灭活CICC24917组、灭活Amuci-1组、灭活Amuci-7组和灭活Amuci-8组，每组30尾。正常对照组及模型对照组给予PBS溶液，阳性对照奥利司他组给予浓度为15.0 μg/ml的奥利司他（购自山东新时代药业有限公司）。上述制备的灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌悬液2mL，加入18 mL PBS至斑马鱼溶液终体积为20 mL，即灭活CICC24917组、灭活Amuci-1组、灭活Amuci-7组和灭活Amuci-8组给予浓度均为1×108 CFU/mL。28 ℃孵育1 h后，除正常对照组外，其余各组均饲喂高脂食物（蛋黄粉，38%甘油酯、19%卵磷脂、30%蛋白质，少量胆固醇、糖类、矿物质等），随后，28 ℃继续孵育24 h。试验结束后进行油红O脂肪染色（油红O是一种强脂溶剂和染脂剂，可与甘油三酯等中性脂肪滴结合呈橘红色，可定量反映斑马鱼肠道和血管中的脂肪含量），每组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，分析肠道和尾部血管脂肪染色强度。结果以Mean±SEM表示，采用One-way ANOVA进行多重比较分析。与模型组相比，* p<0.05；*** p<0.001。
试验结果：结果如图5所示，奥利司他、灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌标准菌株CICC24917和灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1均能显著减少斑马鱼体内脂肪含量（P<0.05），且灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1改善斑马鱼肥胖的效果优于灭活标准菌株CICC24917，灭活Amuci-7和Amuci-8未能有效降低斑马鱼脂肪含量（P>0.05）。
实施例8 灭活嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1控制HFD小鼠肥胖
受试物配制：
冻干保护剂：称量实施例6中制备的冻干保护剂0.2g，用生理盐水（购自四川科伦药业股份有限公司）4 mL充分溶解，用于正常对照组和模型对照组给药。
奥利司他溶液：1粒奥利司他胶囊（购自植恩生物技术股份有限公司），以30 ml的生理盐水充分溶解，制成浓度为4 mg/mL溶液。
灭活CICC24917、灭活Amuci-1菌悬液：实施例6中制备的CICC24917和Amuci-1菌粉分别取1×1010CFU，以2 mL 生理盐水充分溶解，制成浓度为5×109CFU/mL的菌悬液。随后80℃水浴30~60 min进行巴氏杀菌，以获得灭活菌液。
试验设计：4~5周龄，17~19 g SPF级雄性C57BL/6J小鼠40只，购自四川维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房。小鼠适应性饲养7天后，根据体重随机分为5组，分别为正常对照组、模型对照组、奥利司他组、灭活CICC24917组和灭活Amuci-1组，每组8只，分3笼，每笼2~3只。正常对照组饲喂普通维持饲料，其余各组均饲喂高脂饮食（HFD）（60kcal％的脂肪；D12492，购自Research Diets Inc），连续8周。试验期间，正常对照组、模型对照组均按0.2 mL/只灌胃冻干保护剂，阳性对照奥利司他组按10 mL/kg给药体积灌胃上述配制的奥利司他溶液，灭活CICC24917组和灭活Amuci-1组分别灌胃0.2 mL上述配制的灭活CICC24917菌悬液和灭活Amuci-1菌悬液，各组均每日给药1次，连续给药8周。结果以Mean±SEM表示，采用One-way ANOVA进行多重比较分析。与模型组相比，* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001。
体重及摄食量变化：试验期间，每周对小鼠进行称重，并计算体重变化率和体重增量；体重变化率=（检测体重-初始体重）/初始体重×100%；体重增量=检测体重-初始体重。每周对各笼小鼠摄食量进行记录，并计算整个试验期间总平均日采食量。平均日才采食量=（饲喂量-剩余量）/试验天数。
结果如图6所示，图6为试验结束时给药8周后的结果，奥利司他组和灭活Amuci-1组的体重显著低于模型对照组（图6A，P<0.05），奥利司他、灭活CICC24917和灭活Amuci-1可显著控制体重增长（图6B、C，P<0.05），灭活muci-1控制肥胖小鼠体重增长的效果优于灭活CICC24917。试验期间，相较于模型对照组，各给药组的平均日采食量无显著差异（图6D，P>0.05）。
体脂含量检测：在试验期结束后，使用体成分分析仪（购自苏州纽迈分析仪器股份有限公司）对小鼠脂肪、瘦肉量进行检测，并计算脂体比和瘦肉体重比（脂肪重量/体重，瘦肉重量/体重）。
结果如图7所示，奥利司他和灭活Amuci-1能显著降低脂肪量和脂体比（图7A、B，P<0.05），效果优于灭活CICC24917；奥利司他能显著提升瘦肉/体重比（图7D，P<0.05）。
脾指数变化：试验结束后，解剖各组小鼠，称量脾重量，计算脾指数。脾指数=脾重量/体重×100%。
结果如图7E所示，与正常对照组相比，模型对照组脾指数显著升高（P<0.05），相较于模型对照组，灭活Amuci-1组的脾指数显著降低（P<0.05），效果优于灭活CICC24917和奥利司他。
实施例9 Amuci-1对5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠的治疗效果
试验动物：15只SPF级雄性Balb/c小鼠，体重18~22 g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房。
试验设计：采用5-FU（5-氟尿嘧啶，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶液诱导小鼠化疗相关性腹泻模型，根据小鼠初始体重随机分为3组，分别为正常对照组、模型对照组、Amuci-1组，每组5只。
总体试验周期为9 d，记为D1-D9。D3进行5-FU单次造模处理，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其他组均进行5-FU单次腹腔注射造模处理，造模剂量按体重给药（250 mg/kg）。
所有组给药方式为灌胃，正常对照组、模型对照组灌胃冻干保护剂，连续灌胃5天（D1-D5）；Amuci-1组连续灌胃5天（D1-D5）1×109CFU 活菌Amuci-1。在D5给药结束后，连续观察4天。具体试验分组和给药方案见下表2。
表2 试验分组和给药方案
| 组别 | 数量 | 造模剂 | 造模剂量 | 受试物 | 给药体积 | 给药剂量 | 给药天数 |
| 正常对照组 | 5 | 生理盐水 | / | 冻干保护剂 | 0.2 mL/只 | / | 5 d |
| 模型对照组 | 5 | 5-FU | 250 mg/kg | 冻干保护剂 | 0.2 mL/只 | / | 5 d |
| Amuci-1 | 5 | 5-FU | 250 mg/kg | Amuci-1 | 0.2 mL/只 | 1×109CFU/只 | 5 d |
注：5-FU:5-氟尿嘧啶；CFU:菌落形成单位；d: 天
腹泻观察与评分：将小鼠置于垫有洁净滤纸的小鼠笼内，每笼1只。粪便硬，正常便视为0分；轻度、轻微湿便或软便视为1分；中度，湿便、粪便不成形且肛周不洁视为2分；重度，稀便且严重肛周不洁视为3分。试验周期内，每天对小鼠粪便进行观察、评分。腹泻总分为每天腹泻评分的总和。
血常规检测：各组动物经腹腔静脉采集全血样本，进行血常规检测（全自动血液细胞分析仪，Mindray）。结果以Mean±SEM表示，采用One-way ANOVA进行多重比较分析。与模型组相比， ** p<0.01。
试验结果：如图8所示，与模型对照组相比，Amuci-1对5-FU导致的腹泻具有明显改善作用（图8A），与模型对照组相比D8和D9腹泻评分显著降低（P<0.01）（图8B和图8C），腹泻总分显著降低（P<0.01）（图8D）。
血常规结果如图9所示：与模型对照组相比Amuci-1对5-FU导致的白细胞数量减少，特别是单核细胞数量减少具有明显改善作用（图9A和图9B）。
结果表明Amuci-1对5-FU诱导的小鼠CID模型腹泻和白细胞数量减少具有明显的改善作用。
实施例10 嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1菌株21天亚急性毒性试验
菌株样品制备：
将Amuci-1菌株按体积比5%添加量从甘油管中转接至3 mL无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，37℃厌氧恒温培养48 h进行菌株活化。将活化菌株按照体积比1.6%添加至360 mL无氧BHI&黏蛋白液体培养基中，37℃厌氧恒温培养约60 h后，转移至500 mL离心筒中，8000rpm/min离心10 min，弃上清。用35 mL无氧生理盐水重悬菌体3次后，取重悬后的菌液点样至血球计数板中进行显微计数并记录数据，确保菌液浓度不低于1.25×109CFU/mL。分装上述调浊计数后的菌液至10 mL厌氧管中，每份菌液分装5 mL/支，共6支。
灭活菌液制备：每份菌液各选择3支进行70℃水浴30 min，进行菌株灭活。
试验设计：
参考国家市场监督管理总局颁发的《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则（2020年版）》中“保健食品原料用细菌致病性检验方法”评价灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1菌株的致病性。4~5周龄，体重在18~22 g范围内的ICR小鼠30只，雌雄各半，雄性14~16 g，雌性15~17 g，购自四川维通利华实验动物技术有限公司。适应期饲养3天后，随机分为3组，即对照组、Amuci-1组（活菌）和灭活Amuci-1组，每组10只，雌雄各半。试验周期为21天，分组当天为D0，分组后各组小鼠均过夜禁食（16h），给药当天为D1，D1~D3连续3天按照20 mL/kg的给药体积灌胃受试物，对照组灌胃生理盐水，Amuci-1组灌胃浓度为2.84×1010 CFU/mL，灭活Amuci-1组灌胃浓度为1.40×1010CFU/mL（指导原则中要求受试物浓度不低于1.25×109CFU/mL），第一次灌胃给药后3~4 h喂食，从第一天给药开始，连续观察21天。
临床观察：观察并记录小鼠皮肤和毛、眼睛和粘膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。观察是否出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象。
结果显示，在对各组雌性和雄性小鼠连续21天的观察中发现，每只小鼠均皮肤整洁、被毛顺滑有光泽、眼睛粘膜正常、呼吸平稳正常、肢体活动正常、行为方式正常。未出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等毒性反应。
体重检测：试验前称量并记录所有小鼠的体重，试验结束后称量并记录所有小鼠的体重。结果以Mean±SEM表示，采用T检验分析。
结果如图10所示，试验期间，对照组、Amuci-1组、灭活Amuci-1组的雄性或雌性小鼠的体重均稳定增长。21天时，与对照组相比，Amuci-1组、灭活Amuci-1组雄性或雌性小鼠的体重无显著差异。
结果判定标准：若受试物组动物在试验期间未出现中毒症状或死亡，且体重等指标与对照组相比差异无统计学意义，即可判定该菌株无致病性；若受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡，或试验期间体重等指标与对照组相比有显著性差异，即可判定该菌株具有致病性。
结论：Amuci-1组、灭活Amuci-1组和对照组的每只雄性或雌性小鼠在试验期间一切生命体征均正常、体重增长稳定、未出现任何毒性反应及死亡情况。21天时，雄性和雌性体重在两组间无统计学差异。综上所述，活菌和灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌Amuci-1菌株均无致病性。
Claims (12)
1.一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，其特征在于，所述菌株为保藏编号为CCTCC NO：M 2024046 的Amuci-1 菌株。
2.权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株的纯培养物、活菌或灭活菌体。
3.权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株的培养方法，其特征在于，包括将所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的嗜黏蛋白阿克曼氏菌。
4.一种食品组合物、保健品组合物或药物组合物，其特征在于，含有权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，或权利要求2 所述的纯培养物、活菌或灭活菌体，或权利要求3 所述的培养方法得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株。
5.根据权利要求4 所述的食品组合物、保健品组合物或药物组合物，其特征在于，嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株作为唯一活性成分。
6.一种药物组合物，含有权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，或权利要求2 所述的纯培养物、活菌或灭活菌体，或权利要求3 所述的培养方法得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株其特征在于，还含有司美格鲁肽、奥利司他。
7.权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）Amuci-1 菌株，或权利要求2 所述的纯培养物、活菌，或权利要求3 所述的培养方法得到的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株，在制备降低胆固醇和/或改善化疗相关性腹泻症状的药品中的用途。
8.权利要求1 所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）Amuci-1 菌株的灭活菌体在制备改善肥胖的药品中的用途。
9.根据权利要求7 所述的用途，其特征在于，所述药品的单个制剂中含有106~1012 CFU的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）菌株。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药品施用于高胆固醇血症受试者、肥胖受试者、化疗相关性腹泻受试者。
11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药品施用于肥胖受试者。
12.根据权利要求10 所述的用途，其特征在于，所述化疗相关性腹泻是由活性成分选自如下一种或多种的药物引起的腹泻：5-氟尿嘧啶、替加氟、5'-2'-脱氧尿苷、卡培他滨、替吉奥、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀、伊立替康。
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