JP3272023B2 - 白血球減少治療剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エンテロコッカス（En
terococcus）属に属する微生物の菌体又はその処理物を
含有する白血球減少予防治療剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの腸管内には１００種類、１００兆
個といわれる腸内菌が生息している。腸内菌の存在は一
つのエコシステム（生態系）として把握することができ
る。すなわち、腸内菌叢（フローラ）の構成微生物の種
類と量は、微生物相互間及び宿主生体との間の相互依
存、拮抗などの相互作用等の複雑な関係を維持しながら
存在している。この腸内菌叢は、あたかも一つの臓器で
あるとみることができ、その宿主生体における役割の重
要性がますます広く認識されつつある。その役割の範囲
は、発生分化、免疫活性、栄養（消化吸収）、癌、心臓
病、脳疾患をはじめとする成人病や消化器疾患などの各
種疾患、ひいては老化、寿命にいたるまで、直接的又は
間接的に関連しているものと思われる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】既に癌の化学療法剤
（制癌剤）のいくつかが治療に供されているが、癌細胞
の破壊もさることながら、化学療法剤投与による副作用
とりわけ白血球（好中球）減少が著しく、免疫不全や菌
交代等により更に重篤な事態を招く例が多い。従って、
化学療法剤の最大の問題点である白血球減少は、骨髄移
植時や再生不良貧血等の疾患においても重大であり、か
かる白血球減少を予防、治療し、しかも副作用のない薬
剤が求められている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、研究の結
果、ヒトの腸管由来（ヒトの腸内常在性）の腸球菌であ
るエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する微生物
に白血球減少を予防ないし治療する作用を見い出した。
更に、本菌はヒトの腸管内の常在菌の一種であるところ
から、経口摂取による毒性は実質上全く認められないこ
とより、本発明をするに至ったものである。

【０００５】本発明に用いられるエンテロコッカス属に
属する微生物としては、エンテロコッカス・フェカリス
（Enterococcus faecalis)やエンテロコッカス・フェシ
ウム（Enterococcus faecium）があげられるが、特に有
用な菌株は、本発明者により健常者の糞便から分離され
た新菌株のエンテロコッカス・フェカリス（Enterococc
us faecalis)ＮＦ−１０１１である。該菌株は工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５６４号と
して寄託されている。

【０００６】以下にエンテロコッカス・フェカリスＮＦ
−１０１１の分離手段及び同菌株の菌学的及び生理学的
性質を示す。

【０００７】（１）分離手段 健常者の糞便の加熱滅菌水による１０倍希釈物を、適切
な選択培地（ＫＭＮ寒天平板及びＳＦ寒天平板）に塗抹
し、好気条件下３７℃で、４８〜７２時間培養し、菌集
落を出現させた。この菌集落を別の同種平板培地に画線
塗抹し、同様に培養して菌集落を再び出現させた。同じ
操作を数回繰り返し、単一の菌種だけからなる単一集落
を分離した。この新分離菌株について、菌学的（形態
的、生化学的及び血清学的）性状を調べ、エンテロコッ
カス・フェカリス（Enterococcus faecalis)に属すると
分類同定した。

【０００８】 （２）菌学的及び生理学的性質 ───────────────────────── 性状 判定 ───────────────────────── グラム染色性 ＋ 菌形態 球形 カタラーゼ − 溶血性 α 血清群 Ｄ 増殖性 １０℃ ＋ ４５℃ ＋ ５０℃ ＋ 熱耐性 ６０℃ ３０分 ＋ 胆汁エスクリン添加培地での生育 ＋ pH９．６培地での生育 ＋ ６．５％食塩添加培地での生育 ＋ メチレンブルー還元性 ＋ ゼラチン液化 − ０．０１％ＴＴＣ添加培地での生育 ＋ テルライト添加培地での生育 ＋ 酸生成の有無 グリセロール ＋ Ｌ−アラビノース − Ｄ−リボース ＋ Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−マンノース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ シュクロース ＋ Ｌ−ソルボース − Ｄ−ソルビトール ＋ Ｌ−ラムノース − ラクトース ＋ アミグダリン ＋ エスクリン ＋ セロビオース ＋ メリビオース − イヌリン − メレジトース ＋ ───────────────────────── ＋；陽性、−；陰性 ＴＴＣ；２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロ
リド

【０００９】（培地）本発明に用いられる微生物培養用
の代表的培地としては、以下に示す組成のロゴサ液体培
地を用いることができる。 トリプチケース １０ g 酵母エキス ５ g トリプトース ３ g リン酸一カリウム ３ g リン酸二カリウム ３ g クエン酸三アンモニウム ２ g ツイーン８０（界面活性剤） １ g グルコース ２０ g システイン塩酸塩 ０．２ g 塩類溶液（１） ５ ml 蒸留水 １，０００ ml （pHを水酸化ナトリウム溶液で７．０に調整、１２１℃１５分間加熱滅菌） （１）塩類溶液；ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １１．５ g ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．６８g ＭｎＳＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ２．４ g 蒸留水 １００ ml

【００１０】（培養法）エンテロコッカス属に属する微
生物をロゴサ液体培地１０mlに接種し、３７℃にて１０
〜１６時間好気的に静置培養（前培養）し、約１０⁹ 個
／mlの培養液（シード）を得る。これを１０リットルの
滅菌ロゴサ液体培地に加え、同様に静置培養する。

【００１１】（集菌、洗浄及び乾燥法）上述のようにし
て得られた培養液を８，０００〜１２，０００rpm にて
遠心分離操作を行い、生菌体（沈殿物）を得る。生菌体
を生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ水溶液）で２回洗浄
（同様に遠心分離操作）した後、蒸留水に懸濁して菌液
（約１０¹¹個／ml）１００mlを得る。

【００１２】得られた生菌体懸濁液を１１０℃で１０分
間加熱して死菌体懸濁液を得る。次に、熱風乾燥法ある
いは凍結乾燥法など適宜な方法で乾燥処理し、乾燥死菌
体を得る。

【００１３】本発明剤は、上記のようにして得られた死
菌体或いはこれらの磨砕物、水抽出物を用いることがで
きる。これらを製剤するにはでんぷん、乳糖、大豆タン
パク等の担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定
剤、矯味矯具剤等の添加剤を用いて周知の方法で錠剤や
顆粒剤に製剤される。

【００１４】使用量は、症状、年令等により異なるが、
有効成分として１日０．００２〜０．１g/kg体重を通常
成人に対して１日１回又は数回に分けて投与することが
できる。

【００１５】

【発明の効果】本発明のエンテロコッカス属菌は腸内乳
酸球菌であるので毒性がなく、副作用もなく、制癌剤、
免疫抑制剤等の化学療法剤投与による白血球減少に対し
て、予防又は治療効果がある。

【００１６】

【実施例】

実施例１．（菌体の調製）Enterococcus faecalis ＮＦ−１０１１をロゴサ液体培
地１０リットルに接種（菌数；１０⁶ 個／ml）し、３７
℃にて１６時間静置培養し、生菌数約１０⁹ 個／mlの培
養液を得た。得られた培養液を１２，０００rpm で遠心
分離して集菌し、これを生理食塩水（０．８５％ＮａＣ
ｌ水溶液）で２回洗浄して、１００ml蒸留水に懸濁し、
菌液を得た。この菌液を１１０℃で１０分間加熱後、凍
結乾燥により死菌体菌末を得た。

【００１７】実施例２．ＩＣＲ系マウス（雄性、６週
令、体重２３±２ｇ）を、マウス用固形飼料（ＣＥ−
２、日本クレア製）及び滅菌水道水を与え、室温（２５
±２℃）、湿度６０±１０％で１週間予備飼育した。こ
のマウスを２群（１群５匹）に分け、一方の群には実施
例１で得た菌体標品を０．２５％配合した飼料を経口投
与し、７日目から５％エタノール含有飲料水を自由摂取
させた。他方の群には、菌体標品を含まない飼料を経口
投与し、７日目から同様に５％エタノール含有飲料水を
自由摂取させた。両群ともに、エタノール含有飲料水投
与から２８日間飼育した。

【００１８】エタノール含有飲料水投与７日目と２８日
目に眼窩静脈から採血し、白血球数を血球計測盤で測定
した。表１に白血球数を示した。上記の菌体標品投与群
において、アルコール経口摂取に基づく白血球減少に対
する改善、治療効果が観察された。

【００１９】 表１ ───────────────────────── エタノール投与日数 ────────────────── ７ ２８ ───────────────────────── 対照群 ５１００±５９１ ４０３０±７６０ 菌体投与群 ４９３３±２６２ ５８３０±８３ ───────────────────────── 数値は平均値±ＳＤ（μｌ当たり）

【００２０】実施例３．健常犬（雑種、１〜３歳、雄性
又は雌性、体重約１０kg）にＡＧＦ社製ドッグフード
（乾燥及び缶詰）及び飲料水を与え、通常の飼育環境に
て飼育した。

【００２１】各犬に１０mg／kgのシクロホスファミド
（エンドキサン、シオノギ製薬）を連続３日間、静脈内
投与し、実験的に白血球減少症を起こさせた。１群１５
匹ずつの２群に分け、シクロホスファミド投与と同時
に、一方の群には実施例１で得た菌体標品を生理食塩水
（０．８５％ＮａＣｌ水溶液）に溶解又は懸濁し、１０
０mg／kg体重の割合で摂取するように飼料に混ぜて、１
日１回、１４日間連続経口投与した。他方の群には、菌
体標品を含まない飼料を同様に投与した。両群動物の全
匹について、実験中の一般的健康状態の観察、血液性状
及び骨髄の検査を行った。

【００２２】（１）白血球数に及ぼす効果 菌体標品を含まない飼料を投与した対照群では、シクロ
ホスファミド投与後８日目に白血球数が最低となりその
後上昇した。一方、上記の菌体標品投与群では、白血球
数が最低値であったのは７日目であり、対照群よりも早
い回復、改善への転換が見られ、更に白血球数も対照群
より多い傾向があった（図１）。

【００２３】（２）骨髄像 常法による骨髄穿刺を行って採取した骨髄成分を塗抹、
観察して骨髄像を求めた。シクロホスファミド投与か
ら、５、１１及び１４日目の顆粒球系細胞総数（Ｍ）の
赤芽球系細胞総数（Ｅ）に対する比（Ｍ／Ｅ比）を表２
に示した。特に５日目の対照群のＭ／Ｅ比が著しい低値
を示しているのに対して、菌体標品投与群においてＭ／
Ｅ比の増大が観察され、菌体標品の投与によって化学療
法剤使用に伴う骨髄機能抑制の改善、好中球（白血球）
産生の促進が認められた。

【００２４】 表２ ───────────────────────── 日数 ────────────────── ５ １１ １４ ───────────────────────── 対照群 ０．６７ １．２８ ０．９５ 菌体投与群 ２．３４ ２．４４ １．７３ ─────────────────────────

【００２５】（３）副作用及び死亡例 シクロホスファミド投与後の各犬の一般的健康状態（発
熱、活動性、食欲、嘔吐、咳、脱水症状、紫斑、血尿、
膀胱炎等の有無）を観察した。菌体標品投与群では、全
実験期間を通して、シクロホスファミド処置による副作
用（一般的健康状態）が軽度であった。また、対照群で
は死亡例が見られたのに対し、菌体標品投与群では死亡
例はなかった（表３）。

【００２６】

【００２７】実施例４．（製剤例） （１）実施例１で得た死菌体菌末１５０mgを精製でんぷ
ん末１５０mg及び乳糖７００mgと混合して錠剤又は顆粒
剤にする。

【００２８】（２）実施例１で得た死菌体菌末３００mg
を大豆タンパク３００mg及び乳糖４００mgと混合して錠
剤又は顆粒剤にする。

【００２９】上記、実施例２及び３に示したように、本
発明の死菌体菌末は白血球減少に対して顕著な予防、治
療効果を有し、しかも副作用の少ないあるいは全くない
ことが確認された。

【図面の簡単な説明】

【図１】白血球数回復効果を示したグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山口 英世 神奈川県川崎市多摩区栗谷２丁目15番５ 号 (56)参考文献 特開 昭62−103023（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／425（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 35/74 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 有効成分としてエンテロコッカス属に属
   する微生物の加熱処理死菌体又はその処理物を含有する
   白血球減少予防剤。