JP2017001961A

JP2017001961A - 生体抗酸化能賦活剤

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Publication number: JP2017001961A
Application number: JP2015114016A
Authority: JP
Inventors: 寛市川; Hiroshi Ichikawa; 幸子南山; Sachiko Minamiyama; 貴志嶋田; Takashi Shimada
Original assignee: NICHINICHI SEIYAKU KK; Doshisha Co Ltd; Kyoto Prefectural Public Univ Corp
Current assignee: NICHINICHI SEIYAKU KK; Doshisha Co Ltd; Kyoto Prefectural Public Univ Corp
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2017-01-05

Abstract

【課題】生体抗酸化能賦活剤を提供すること。【解決手段】エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体を含有する、生体抗酸化能賦活剤。【選択図】なし

Description

本発明は、生体抗酸化能賦活剤に関する。

生体内では、酸素代謝、白血球による異物の分解等の内的要因、及び紫外線、放射線、喫煙等の外的要因によって、種々の活性酸素やフリーラジカルが生じる。生じた活性酸素やフリーラジカルは、脂質、タンパク質、核酸等の生体物質を酸化変性させ、それによりその機能を消失又は低下させ、これがシミ、シワ、白髪、白内障、糖尿病、潰瘍、動脈硬化、高血圧、冷え性、しびれ等の種々の生体現象の原因となるといわれている。このため、生体における活性酸素やフリーラジカルの消去活性（生体抗酸化能）を賦活することにより、活性酸素やフリーラジカルによる上記生体現象の改善又は予防を図ることが可能である。

ただ、抗酸化剤等、それ自身が抗酸化作用を有する物質を単に摂取しても、生体抗酸化能が賦活される訳ではない。例えば、ビタミンＣは、過剰に摂取してもすぐに排出されてしまうので、これを摂取しても効率的な生体抗酸化能の賦活には繋がり難いと考えられる。また、抗酸化作用を有する物質がタンパク質である場合、一般にタンパク質は消化管や血管内で分解され易いので、これを摂取しても効率的な生体抗酸化能の賦活には繋がり難いと考えられる。

一方、エンテロコッカス属に属する乳酸菌は、生体に対して多様な効果を有することが知られている。例えば、エンテロコッカス・フェカリスＮＦ−１０１１株の加熱処理物は、免疫賦活作用、抗がん剤の副作用軽減作用、Ｃ型肝炎改善作用、アレルギー抑制効果等を有することが報告されている（非特許文献１〜４）。

また、特許文献１では、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株、チャーガ、オキシカイン等を摂取させた場合の、血清の抗酸化能に対する影響が調べられているが、該株が単独で血清の抗酸化能を向上させることは示されていない。

特許文献２及び３、並びに非特許文献５では、エンテロコッカス・フェカリスＥＦ−２００１株等自身の抗酸化作用について記載されてはいるが、これらの乳酸菌が生体の抗酸化能を賦活させることについては何らの教示もされていない。それ自身が抗酸化作用を有する物質を単に摂取しても生体抗酸化能が賦活される訳ではないことは、前述のとおりである。

非特許文献６では、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株を摂取させると、肝臓内のＭｎ−ＳＯＤ活性が刺激される可能性が示唆されている。しかしながら、このＭｎ−ＳＯＤはミトコンドリア内に局在するタイプのＳＯＤであることから、この活性が多少上昇したところで、生体全体、特に血液等の体液の抗酸化能が賦活される訳ではない。これを裏付ける事実として、非特許文献６には、真核細胞の細胞質（特に赤血球等）に広く存在するタイプのＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ活性は、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株を摂取させても変化しなかったことが記載されている。

このように、エンテロコッカス属に属する乳酸菌が単独で生体の抗酸化能を向上させることについては、これまで知られていなかった。

特開２００８−０００１２１号公報特開２００３−２６１４５３号公報特許第２６９０１３０号

乳酸菌エンテロコッカス・フェカリスFK-23の補完代替医療的効果. ニューフードインダストリー. 2006; 09; 48(9):12-18. Enterococcus faecalis FK-23 標品の経口投与による5-Fluorouracilの副作用の防御効果. 日本赤十字社和歌山医療センター医学雑誌. 2004; 22:85-91. Enterococcus faecalis FK-23株加熱殺菌粉末の摂取によるC型肝炎症例の血清トランスアミナーゼ値の改善. 日本赤十字社和歌山医療センター医学雑誌. 2004; 22:19-24. Effects of lysed Enterococcus faecalis FK-23 on experimental allergic rhinitis in a murine model. Journal of Biomedical Research. 2012; 26(3): 226-234. 乳酸菌由来抗酸化物質の同定と高抗酸化活性株の選抜. 公益財団法人野田産業科学研究所 2009年度「奨励研究助成」対象研究成果概要エンテロコッカス・フェカリスEC12株殺菌菌体投与によるマウス肝臓の抗酸化作用. 腸内細菌学雑誌24巻2号104頁（2010）一般演題16

本発明は、生体抗酸化能賦活剤を提供することを課題とする。

本発明者等は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体が生体抗酸化能賦活作用を有することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。

即ち、本発明は、下記の態様を包含する。

項１．エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体を含有する、生体抗酸化能賦活剤．
項２．前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスである、項１に記載の剤．
項３．前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスＮＦ−１０１１株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９０２）である、項１又は２に記載の剤．
項４．前記菌体が死菌体である、項１〜３のいずれかに記載の剤．
項５．唾液及び血液からなる群より選択される少なくとも１種の抗酸化能の賦活剤である、項１〜４のいずれかに記載の剤．
項６．経口製剤形態である、項１〜５のいずれかに記載の剤．

本発明によれば、生体における活性酸素やフリーラジカルの消去活性（生体抗酸化能）を賦活することができる。これにより、生体内で生じる活性酸素やフリーラジカルが原因である生体現象を改善又は予防することができる。

実施例２の2-2-1の、血清サンプルのヒドロキシルラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、ＤＭＳＯ濃度換算値を示す。実施例２の2-2-1の、唾液サンプルのヒドロキシルラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、ＤＭＳＯ濃度換算値を示す。実施例２の2-2-2の、血清サンプルのスーパーオキシドラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、ＳＯＤ濃度換算値を示す。実施例２の2-2-2の、唾液サンプルのスーパーオキシドラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、ＳＯＤ濃度換算値を示す。実施例２の2-2-3の、血清サンプルのアルキルオキシラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、Ｔｒｏｌｏｘ濃度換算値を示す。実施例２の2-2-3の、唾液サンプルのアルキルオキシラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、Ｔｒｏｌｏｘ濃度換算値を示す。実施例２の2-2-4の、血清サンプルのアルキルペルオキシラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、αリポ酸濃度換算値を示す。実施例２の2-2-4の、唾液サンプルのアルキルペルオキシラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、αリポ酸濃度換算値を示す。実施例２の2-2-5の、血清サンプルのメチルラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、ＢＳＡ濃度換算値を示す。実施例２の2-2-5の、唾液サンプルのメチルラジカル消去活性の測定結果を示す。縦軸は、ＢＳＡ濃度換算値を示す。実施例２の2-2-6の、血清サンプルの一重項酸素消去活性の測定結果を示す。縦軸は、Ｔｒｏｌｏｘ濃度換算値を示す。実施例２の2-2-6の、唾液サンプルの一重項酸素消去活性の測定結果を示す。縦軸は、Ｔｒｏｌｏｘ濃度換算値を示す。

本発明は、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体を含有する、生体抗酸化能賦活剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある）に関する。以下、これについて説明する。

エンテロコッカス属に属する乳酸菌は、特に限定されず、例えばエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フラベセンス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム等が挙げられ、より好ましくはエンテロコッカス・フェカリスが挙げられる。また、エンテロコッカス・フェカリスの中でも、好ましくはエンテロコッカス・フェカリスＮＦ−１０１１株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９０２）が挙げられる。

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体は、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の構成物全体である限り特に限定されず、生菌体であっても、死菌体であってもよい。

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の生菌体は、ＡＴＣＣ、ＩＦＯ、ＪＣＭ等の分譲機関から取り寄せることができるし、生物体から単離することもできる。また、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の生菌体は、公知の方法に従って培養することにより、増殖させることもできる。生菌体を採用する場合、例えば培養液そのものを用いてもよいし、該培養液から遠心分離等で生菌体を沈殿させて得られた沈殿物を用いてもよいし、該沈殿物を生理食塩水などの等張液に懸濁して得られた懸濁液を用いてもよい。

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の死菌体は、特に限定されないが、例えば生菌体の細胞壁破壊処理物であることができる。この細胞壁破壊は、生菌体の細胞壁の全体であってもよいし、一部分であってもよい。細胞壁破壊処理としては、例えば熱処理、物理的力による処理、溶菌酵素による処理等、或いはこれらを組み合わせた処理が挙げられ、好ましくは熱処理が挙げられる。

熱処理の温度は、１００℃以上であれば特に限定されないが、好ましくはオートクレーブ処理ができる温度（例えば１１０〜１２５℃）であることができる。熱処理時間は、細胞壁の破壊ができる限り特に限定されず、熱処理の温度に応じて適宜設定することができる。熱処理時間は、例えば１分間以上、好ましくは５〜２０分間、より好ましくは５〜１５分間程度であることができる。

物理的力による処理の方法は、細胞壁の破壊ができる限り特に限定されない。例えば、超音波処理、フレンチプレス等が挙げられる。

溶菌酵素による処理に用いる酵素は、細胞壁の破壊ができる限り特に限定されない。例えば、アクチナーゼ、ザイモリエース、キタラーゼ、リゾチーム、ムタノシリン、アクロモペプチターゼ等が挙げられる。溶菌酵素による処理条件は、酵素の種類、溶菌対象（生菌体）量等に応じて適宜設定することができる。例えば、アクチナーゼを用いる場合は、アクチナーゼを終濃度０．０１〜１ｍｇ／ｍＬになるように生菌体懸濁液に添加し、３０〜４０℃で１〜１０時間処理すればよい。

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明の剤の用途は、本発明の効果を奏すれば特に限定されない。本発明の剤は、例えば医薬品、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメント等）、食品添加剤等に利用できる。

本発明の剤の製剤形態は、特に限定されず、本発明の剤の用途に応じて、各用途において通常使用される製剤形態をとることができる。製剤形態としては、用途が医薬品、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメント等）等である場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられ、好ましくは経口製剤形態が挙げられる。また、用途が食品添加剤等である場合は、製剤形態として、例えば液剤、顆粒剤、散剤等が挙げられる。

本発明の剤における、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体の菌体数は、本発明の剤の用途に応じて、その効果を発揮できる菌体数である限り特に限定されない。菌体数は、例えば、用途が医薬品、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメント等）等である場合は、一度に摂食させる分量（例えば０．０１〜１００ｇ、好ましくは０．０１〜１０ｇ、より好ましくは０．１〜５ｇ、さらに好ましくは１〜３ｇ）に対し、例えば１億個〜１０兆個、好ましくは１００億個〜１０兆個、より好ましくは５００億個〜１０兆個、さらに好ましくは１０００億個〜５兆個、よりさらに好ましくは３０００億個〜３兆個であることができる。また、用途が食品添加剤等である場合は、菌体数は、例えば３０００億個〜１０兆個、好ましくは１兆個〜１０兆個であることができる。

本発明の剤は、有効成分の他に、用途あるいは製剤形態に応じて、他の成分を適宜配合してもよい。配合できる成分としては、特に制限されないが、例えば、アミノ酸類、アルコール類、多価アルコール類、糖類、ガム質、多糖類などの高分子化合物、界面活性剤、防腐・抗菌・殺菌剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、抗酸化剤、酵素成分、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、清涼化剤の他、ミネラル類、細胞賦活剤、滋養強壮剤、賦形剤、増粘剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、分散剤、吸着剤、崩壊補助剤、湿潤剤または湿潤調節剤、防湿剤、着色料、着香剤または香料、芳香剤、還元剤、可溶化剤、溶解補助剤、発泡剤、粘稠剤または粘稠化剤、溶剤、基剤、乳化剤、可塑剤、緩衝剤、光沢化剤などを挙げることができる。

本発明の剤を、医薬品、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメント等）等として摂取させる場合、その摂取量は、症状、被摂取者の年齢、体重、製剤形態等に応じて適宜設定することができる。摂取量は、例えば、成人１日あたり、菌体数で例えば３億個〜３０兆個、好ましくは３００億個〜３０兆個、より好ましくは１５００億個〜３０兆個、さらに好ましくは３０００億個〜１５兆個、よりさらに好ましくは９０００億個〜９兆個であることができる。また、摂取は、１日１回でもよいが、複数回（例えば２〜４回）に分けて行うことが好ましい。

本発明の剤を、食品添加剤等として使用する場合、その添加量は、食品の種類等に応じて適宜設定することができる。添加量は、例えば、成人が１日に摂取する量の食品中の菌体数が例えば３億個〜３０兆個、好ましくは３００億個〜３０兆個、より好ましくは１５００億個〜３０兆個、さらに好ましくは３０００億個〜１５兆個、よりさらに好ましくは９０００億個〜９兆個となるような添加量であることができる。本発明の剤を食品に配合する方法は、食品の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、食品中に本発明の剤を混合してもよく、食品を、本発明の剤を含有する水溶液中に浸漬してもよく、または食品に本発明の剤を噴霧してもよい。噴霧する場合は、エタノールなどの揮発性溶媒に本発明の剤を混合して噴霧することができる。さらに本発明の剤は、例えば、食品を加熱して加工する場合、加熱の前後いずれの食品素材に対しても処理が行われてもよい。

本発明の剤は、生体の（例えば唾液、血液、リンパ液、組織液、涙、鼻水、尿、羊水等の体液の、好ましくは唾液、血液等の）抗酸化能を賦活することができる。これにより、生体が有する活性酸素やフリーラジカル消去活性が向上し、これらが原因である（或いはこれらによりその症状が悪化する）生体現象（又は疾患）を改善（若しくは治療）又は予防することができる。

活性酸素やフリーラジカルとしては、例えば、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、スーパーオキシドラジカル（Ｏ_２ ⁻・）、アルキルオキシラジカル（ＲＯ・）、アルキルペルオキシラジカル（ＲＯＯ・）、メチルラジカル（・ＣＨ_３）、一重項酸素（^１Ｏ_２）等が挙げられる。

活性酸素やフリーラジカルが原因である生体現象としては、例えばシミ、シワ、白髪、白内障、糖尿病、潰瘍、口内炎、歯周病、動脈硬化症、高血圧症、冷え性、しびれ、心筋梗塞、脳出血、脳梗塞、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、胃潰瘍、腸管潰瘍、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クーロン病等）、アトピー性皮膚炎、火傷、凍傷、肌荒れ、膠原病、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、ベーチェット病、川崎病、関節リウマチ、レイノー病、花粉症、鼻炎、加齢黄斑変性症、脂肪肝（特に、非アルコール性脂肪肝炎：NASH）、慢性肝炎（ウイルス性肝炎等）、慢性閉塞性肺疾患、癌等が挙げられる。

以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

実施例１：菌体試料の調製
エンテロコッカス・フェカリスＮＦ−１０１１株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９０２）を液体培地（グルコース２％、酵母エキス２％、ペプトン２％、リン酸水素二カリウム４％）中で３７℃、１８時間培養した。マイクロフィルトレーション膜で集菌及び洗浄し、生菌体を回収した。これを１１０℃で１０分間熱処理し、処理後、スプレードライで乾燥させた。得られた死菌体乾燥物を、菌体試料として、以下の実施例で用いた。

実施例２：菌体試料が生体抗酸化能に与える影響の解析
被験者に菌体試料を摂取させた後、体液を採取し、その活性酸素及びフリーラジカルの消去活性を測定した。具体的には次のように行った。

＜2-1．菌体試料の摂取、及び体液の採取＞
被験者７名（年齢：１８〜２２歳、性別：男性５名、女性２名）をＡ群（４名）、Ｂ群（３名）に分けた。Ａ群の被験者には、実施例１で調製された菌体試料（死菌体乾燥物を９０００億個含む。総重量は１．５ｇ）を、１日あたり３回、７日間毎日、経口摂取させた。Ｂ群の被験者については、菌体試料に代えて対照試料（乳糖、１回当たり１．５ｇ）を用いる以外は、Ａ群と同様に経口摂取させた。

菌体試料の最後の摂取から３〜６時間経過後、血液及び唾液を採取した。血液については、定法に従って採血し、得られた血液を常温で３０分間静置した後、遠心分離（３０００×ｇ、５分間、４℃）し、上清（血清）を回収し、−８０℃で保存した（血清サンプル）。唾液については、唾液回収用スポンジ（サリベット（登録商標））を被験者の口に１分間含ませた後、該スポンジを専用チューブにセットし、遠心分離（１０００×ｇ、２分、４℃）し、上清（唾液）を回収し、−２０℃で保存した（唾液サンプル）。

血液及び唾液の採取終了から２週間のウォッシュアウト後、Ａ群の被験者には対象試料を、Ｂ群の被験者には実施例１で調製された菌体試料を、上記と同様に経口摂取させ、血清及び唾液を回収した。

＜2-2．体液の活性酸素及びフリーラジカル消去活性の測定＞
上記項2-1で回収した血清サンプル及び唾液サンプルについて、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、スーパーオキシドラジカル（Ｏ_２ ⁻・）、アルキルオキシラジカル（ＲＯ・）、アルキルペルオキシラジカル（ＲＯＯ・）、メチルラジカル（・ＣＨ_３）、及び一重項酸素（^１Ｏ_２）の消去活性を測定した。唾液サンプルについては、−２０℃からの解凍後に、遠心分離を行い、得られた上清を用いた。また、血清サンプルについては、蒸留水で１０倍又は１００倍に希釈したもの（１０倍希釈血清サンプル、１００倍希釈血清サンプル）を用い、唾液サンプルについては、原液又は蒸留水で１０倍に希釈したもの（原液唾液サンプル、１０倍希釈唾液サンプル）を用いた。

測定は、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）装置（ＲＥシリーズ、ＪＥＯＬ社製）を用いて行った。測定対象それぞれについてのＥＳＲ測定条件は、表１のとおりである。

測定データは、ＷＩＮ−ＲＡＤ（ラジカルリサーチ社製、バージョン１．３０）に取り込んで解析した。得られた解析結果について、統計解析ソフト（日本ＩＢＭ社製、ＳＰＳＳｖｅｒ２２）を用いて、Ｔｕｒｋｅｙ（Ｔ）検定を行った。

＜2-2-1．ヒドロキシルラジカル消去活性の測定＞
１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプル（２０μＬ）、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（１００μＬ）、１００ｍＭ５−（２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１,３−ｐｒｏｐｏｘｙｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅＮ−ｏｘｉｄｅ（ＣＹＰＭＰＯ、ラジカルリサーチ社製）（２０μＬ）、１０ｍＭＤＴＰＡ（２０μＬ）、蒸留水（２０μＬ）、及び１００ｍＭ過酸化水素（和光純薬工業社製）（２０μＬ）を反応容器に添加し、そこへ光照射装置（ＳＵＰＥＲＣＵＲＥ−２０３、三永電気製作所社製）（全反射ミラー、熱線カットフィルター）で紫外線を５秒間照射した。これにより反応容器内でヒドロキシルラジカル産生され、さらにこのヒドロキシラジカルはＣＹＰＭＰＯ（スピントラップ剤）に捕捉されスピンアダクトとなる。このスピンアダクトのＥＳＲスペクトルの５つ目のシグナル強度を測定した。一方で、１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルに代えて、種々の濃度のヒドロキシルラジカル消去剤（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業社製）を添加して、上記と同様にシグナル強度の測定を行い、検量線を作成した。この検量線、及び１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルを添加した場合のシグナル強度に基づいて、血清サンプル及び唾液サンプルのヒドロキシルラジカル消去活性を、ＤＭＳＯ濃度（血清サンプルについては、モル濃度（ｍＭ）、唾液サンプルについては、唾液サンプルのタンパク質量に対するモル数（ｍｍｏｌ／ｇｐｒｏｔｅｉｎ））に換算した。換算値が高い程、血清サンプル及び唾液サンプルのヒドロキシルラジカル消去活性がより高いことを示す。血清サンプル結果を図１に、唾液サンプルの結果を図２に示す。

＜2-2-2．スーパーオキシドラジカル消去活性の測定＞
１０倍希釈血清サンプル又は１０倍希釈唾液サンプル（２０μＬ）、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（１００μＬ）、１００ｍＭＣＹＰＭＰＯ（２０μＬ）、１００ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ（２０μＬ）（和光純薬工業社製）、蒸留水（２０μＬ）、及び２５０ｍＭリボフラビン（和光純薬工業社製）（２０μＬ）を反応容器に添加し、そこへ光照射装置（全反射ミラー、フィルターＨＡ−３０、Ｇ５３３併用）で可視光を３０秒間照射した。これにより反応容器内でスーパーオキシドラジカル産生され、さらにこのスーパーオキシドラジカルはＣＹＰＭＰＯ（スピントラップ剤）に捕捉されスピンアダクトとなる。このスピンアダクトのＥＳＲスペクトルの５つ目のシグナル強度を測定した。一方で、１０倍希釈血清サンプル又は１０倍希釈唾液サンプルに代えて、種々の濃度のスーパーオキシドラジカル消去剤（スーパーオキシドディムスターゼ：ＳＯＤ）（和光純薬工業社製）を添加して、上記と同様にシグナル強度の測定を行い、検量線を作成した。この検量線、及び１０倍希釈血清サンプル又は１０倍希釈唾液サンプルを添加した場合のシグナル強度に基づいて、血清サンプル及び唾液サンプルのスーパーオキシドラジカル消去活性を、ＳＯＤ濃度（血清サンプルについては、ユニット濃度（Ｕ／ｍｌ）、唾液サンプルについては、唾液サンプルのタンパク質量に対するユニット数（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ））に換算した。換算値が高い程、血清サンプル及び唾液サンプルのスーパーオキシドラジカル消去活性がより高いことを示す。血清サンプル結果を図３に、唾液サンプルの結果を図４に示す。

＜2-2-3．アルキルオキシラジカル消去活性の測定＞
１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプル（２０μＬ）、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（１００μＬ）、１００ｍＭＣＹＰＭＰＯ（２０μＬ）、蒸留水（４０μＬ）、及び１０ｍＭ２，２‘−ａｚｏｂｉｓ−２−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｒｏｐａｎｉｍｉｄａｍｉｄｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＡＰＨ、フナコシ社製）（２０μＬ）を反応容器に添加し、そこへ光照射装置（全反射ミラー、熱線カットフィルター）で紫外線を５秒間照射した。これにより反応容器内でアルキルオキシラジカル産生され、さらにこのアルキルオキシラジカルはＣＹＰＭＰＯ（スピントラップ剤）に捕捉されスピンアダクトとなる。このスピンアダクトのＥＳＲスペクトルの５つ目のシグナル強度を測定した。一方で、１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルに代えて、種々の濃度のアルキルオキシラジカル消去剤（Ｔｒｏｌｏｘ）（和光純薬工業社製）を添加して、上記と同様にシグナル強度の測定を行い、検量線を作成した。この検量線、及び１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルを添加した場合のシグナル強度に基づいて、血清サンプル及び唾液サンプルのアルキルオキシラジカル消去活性を、Ｔｒｏｌｏｘ濃度（血清サンプルについては、モル濃度（ｍＭ）、唾液サンプルについては、唾液サンプルのタンパク質量に対するモル数（ｍｍｏｌ／ｇｐｒｏｔｅｉｎ））に換算した。換算値が高い程、血清サンプル及び唾液サンプルのアルキルオキシラジカル消去活性がより高いことを示す。血清サンプル結果を図５に、唾液サンプルの結果を図６に示す。

＜2-2-4．アルキルペルオキシラジカル消去活性の測定＞
１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプル（２０μＬ）、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（１００μＬ）、１００ｍＭＣＹＰＭＰＯ（２０μＬ）、蒸留水（４０μＬ）、及び１００ｍＭｔｅｒｔ−ＢｕｔｙｌＨｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（ｔ−Ｂｕｔｙｌ−ＯＯＨ、和光純薬工業社製）（２０μＬ）を反応容器に添加し、そこへ光照射装置（全反射ミラー、熱線カットフィルター）で紫外線を５秒間照射した。これにより反応容器内でアルキルペルオキシラジカル産生され、さらにこのアルキルペルオキシラジカルはＣＹＰＭＰＯ（スピントラップ剤）に捕捉されスピンアダクトとなる。このスピンアダクトのＥＳＲスペクトルの５つ目のシグナル強度を測定した。一方で、１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルに代えて、種々の濃度のアルキルペルオキシラジカル消去剤（αリポ酸）（和光純薬工業社製）を添加して、上記と同様にシグナル強度の測定を行い、検量線を作成した。この検量線、及び１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルを添加した場合のシグナル強度に基づいて、血清サンプル及び唾液サンプルのアルキルペルオキシラジカル消去活性を、αリポ酸濃度（血清サンプルについては、モル濃度（ｍＭ）、唾液サンプルについては、唾液サンプルのタンパク質量に対するモル数（ｍｍｏｌ／ｇｐｒｏｔｅｉｎ））に換算した。換算値が高い程、血清サンプル及び唾液サンプルのアルキルペルオキシラジカル消去活性がより高いことを示す。血清サンプル結果を図７に、唾液サンプルの結果を図８に示す。

＜2-2-5．メチルラジカル消去活性の測定＞
１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプル（２０μＬ）、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（１００μＬ）、１００ｍＭＣＹＰＭＰＯ（２０μＬ）、５００ｍＭＤＭＳＯ（２０μＬ）、蒸留水（２０μＬ）、及び１Ｍ過酸化水素（２０μＬ）を反応容器に添加し、そこへ光照射装置（全反射ミラー、熱線カットフィルター）で紫外線を５秒間照射した。これにより反応容器内でメチルラジカル産生され、さらにこのメチルラジカルはＣＹＰＭＰＯ（スピントラップ剤）に捕捉されスピンアダクトとなる。このスピンアダクトのＥＳＲスペクトルの５つ目のシグナル強度を測定した。一方で、１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルに代えて、種々の濃度のメチルラジカル消去剤（Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）（ＮｉｃｈｔｄｉｒｅｌｔｅｍＳｏｎｎｅｎｌｉｃｈｔａｓｓｅｔｚｅｎ社製）を添加して、上記と同様にシグナル強度の測定を行い、検量線を作成した。この検量線、及び１０倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルを添加した場合のシグナル強度に基づいて、血清サンプル及び唾液サンプルのメチルラジカル消去活性を、ＢＳＡ濃度（血清サンプルについては、モル濃度（ｍＭ）、唾液サンプルについては、唾液サンプルのタンパク質量に対するモル数（ｍｍｏｌ／ｇｐｒｏｔｅｉｎ））に換算した。換算値が高い程、血清サンプル及び唾液サンプルのメチルラジカル消去活性がより高いことを示す。血清サンプル結果を図９に、唾液サンプルの結果を図１０に示す。

＜2-2-6．一重項酸素消去活性の測定＞
１００倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプル（２０μＬ）、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（１００μＬ）、１００ｍＭ４−ＯＨ−ＴＥＭＰＯ（２０μＬ）、１０ｍＭＤＴＰＡ（２０μＬ）、蒸留水（２０μＬ）、及び２ｍＭローズベンガル（２０μＬ）を反応容器に添加し、そこへ光照射装置（全反射ミラー、フィルターＨＡ−３０、Ｇ５３３併用）で可視光を６０秒間照射した。これにより反応容器内で一重項酸素産生され、さらにこの一重項酸素は４−ＯＨ−ＴＥＭＰＯ（スピントラップ剤）に捕捉されスピンアダクトとなる。このスピンアダクトのＥＳＲスペクトルの２つ目のシグナル強度を測定した。一方で、１００倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルに代えて、種々の濃度の一重項酸素消去剤（Ｔｒｏｌｏｘ）を添加して、上記と同様にシグナル強度の測定を行い、検量線を作成した。この検量線、及び１００倍希釈血清サンプル又は原液唾液サンプルを添加した場合のシグナル強度に基づいて、血清サンプル及び唾液サンプルの一重項酸素消去活性を、Ｔｒｏｌｏｘ濃度（血清サンプルについては、モル濃度（ｍＭ）、唾液サンプルについては、唾液サンプルのタンパク質量に対するモル数（ｍｍｏｌ／ｇｐｒｏｔｅｉｎ））に換算した。換算値が高い程、血清サンプル及び唾液サンプルの一重項酸素消去活性がより高いことを示す。血清サンプル結果を図１１に、唾液サンプルの結果を図１２に示す。

＜2-3．結果＞
図１〜１２に示されるように、菌体試料摂取群の体液は、対照試料摂取群の体液に比べて、活性酸素及びフリーラジカルの消去活性が高かった。このことより、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体は、生体抗酸化能賦活作用を有することが示唆された。

Claims

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体を含有する、生体抗酸化能賦活剤。
前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスである、請求項１に記載の剤。
前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスＮＦ−１０１１株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０９０２）である、請求項１又は２に記載の剤。
前記菌体が死菌体である、請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
唾液及び血液からなる群より選択される少なくとも１種の抗酸化能の賦活剤である、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
経口製剤形態である、請求項１〜５のいずれかに記載の剤。