JP7153274B2 - 慢性腎臓病進行抑制剤 - Google Patents
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Description
項2.線維化抑制剤である、項1に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
項3.前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスである、項1又は2に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
項4.前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスNF-1011株(FERM BP-10902)である、項1~3のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
項5.前記菌体が死菌体である、項1~4のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
項6.前記乳酸菌の菌体成分が、乳酸菌の溶菌酵素及び加熱処理物である、項1~5のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
項7.経口製剤形態である、項1~6のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
項8.食品組成物である、項1~6のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
項9.食品添加物である、項1~6のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
項10.医薬である、項1~6のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
1. 尿検査、画像・病理診断や身体所見などにおいて、腎障害の存在を示唆する所見が明らかであり、特に0.15 g/gCr以上のタンパク尿がある。
2.糸球体濾過量(GFR)が60 mL/min/1.73 m2未満に低下している。
1.FK-23
エンテロコッカス・フェカリスNF-1011株を液体培地(グルコース2%、酵母エキス2%、ペプトン2%、リン酸水素二カリウム4%)中で37℃、18時間培養した。マイクロフィルトレーション膜で集菌及び洗浄し、生菌体を回収した。これを110℃で10分間熱処理し、処理後、スプレードライで乾燥させた。得られた死菌体乾燥物を、菌体試料(FK-23)として、以下の実験で用いた。
エンテロッコカス・フェカリスNF-1011株をロゴサ液体培地10 mlに播種し、37℃にて15時間好気的に静置培養(前培養)し、菌体濃度が約109個/mlの菌体液(シード)を得た。これをロゴサ液体培地10Lに播種(菌体濃度:106個/ml)し、37℃で16時間好気的に静置培養し、生菌数約109個/mlの菌体液を得た。得られた菌体液を遠心分離(12,000×g、20分間)して集菌し、これを生理食塩水(0.85%塩化ナトリウム水溶液)で2回洗浄して、蒸留水100 mlに懸濁し、菌体懸濁液を得た。当該菌体懸濁液にリゾチームを終濃度0.1 mg/ml量となるよう添加し、37℃で4時間処理後、110℃で10分間加熱処理して、菌体処理物を得た。得られた菌体処理物を、菌体試料(LFK)として、以下の実験で用いた。
AZAN染色は定法に従い、線維性結合組織のうち膠原線維(コラーゲン)を青色に染色した。
腎組織をホモジナイズしタンパク定量を行った後、SDSバッファーを添加して95℃・5分間処理した。
SDS Buffer: 0.35M Tris-HCl pH6.8, 10% SDS, 30%グリセロール, 0.06%ブロモフェノールブルー
SDS-PAGEを行った後、PVDFメンブレンに転写した。以下の抗体を用いて抗原抗体反応後、発光基質を添加しFUSION SOLO S (Vilber-Lourmat)を用いてバンドを検出した。検出したバンドはImageJ version 1.63 (National Institutes of Health)を用いて定量した。
・用いた抗体と希釈倍率
HSP47: Enzo Life Sciences, ADI-SPA-470-F, 1:2000
α-SMA: Dako, M0851, 1:2000
PAI-1: BD Biosciences, 612024, 1:2000
β-actin: Sigma-Aldrich, A5441, 1:5000
免疫組織染色は以下の手順に従って行った。
(1)脱パラフィン処理
100% Hemo-De 5分×3
100% EtOH 3分×2
70% EtOH 3分×1
50% EtOH 3分×1
dH2O 3分×2
(2)オートクレーブによる抗原賦活化処理
耐熱プラスチック製蓋付きドーゼに10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)と切片を入れて軽く蓋をし、121℃5分オートクレーブを行った後、dH2Oで切片をすすぎ、PBSで5分×2ウォッシュした。
(3)内因性ペルオキシダーゼ除去
切片にDako REAL Peroxidase-Blocking Solution (Dako, S2023, 4℃)を滴下し、室温で10分間反応させた後、PBSで5分×2ウォッシュした。
(4)ブロッキング
切片にProtein Block Serum-Free Ready-To-Use (Dako, X090, 4℃)を滴下し、室温で20分間反応させた。
(5)1次抗体反応
切片にCan Get Signal immunostain solution A (TOYOBO, NKB-501)で上記の抗α-SMA抗体を希釈した希釈液(200倍)を滴下し、室温1時間又は4℃オーバナイトで反応させた後、PBSで5分×2ウォッシュした。
(6)標識2次抗体反応
1次抗体を認識する標識2次抗体希釈液を滴下し、室温で90分反応させPBSでウォッシュした。
(7)発色
切片に1 mL bufferに発色基質を1滴(20μL)加えて調製した基質溶液を滴下し室温で反応させた後、dH2Oで切片をすすいだ。
(8)対比染色
金属製ラックにスライドをさし、マイヤーヘマトキシリン(武藤化学株式会社)に浸し室温で1~5分反応させた後、流水ですすいだ。
(9)脱水、封入
50% EtOH 3分×1
70% EtOH 3分×1
100% EtOH 3分×2
100% Hemo-De 5分×3
血漿中BUN及びクレアチニンの測定は、株式会社エスアールエルにより、それぞれウレアーゼ法、酵素法に基づき行われた。
ラット右腎摘出及び左腎の虚血再灌流(one kidney-ischemia reperfusion, 1K-IR)による尿細管線維化モデル(腎線維症)におけるFK-23及びLFKの腎機能障害抑制効果を確認した。
Claims (8)
- エンテロコッカス・フェカリス に属する乳酸菌の菌体並びに該乳酸菌の溶菌酵素及び加熱処理物からなる群から選択される少なくとも1種を含有する、慢性腎臓病進行抑制剤。
- 線維化抑制剤である、請求項1に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
- 前記エンテロコッカス・フェカリスに属する乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスNF-1011株(FERM BP-10902)である、請求項1又は2に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
- 前記菌体が死菌体である、請求項1~3のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
- 経口製剤形態である、請求項1~4のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
- 食品組成物である、請求項1~4のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
- 食品添加物である、請求項1~4のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
- 医薬である、請求項1~4のいずれか一項に記載の慢性腎臓病進行抑制剤。
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実験医学 (2018) vol.36, no.5(増刊), p.189-194 |
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