KR102296223B1 - 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 프로바이오틱스의 대량배양 방법 및 이의 용도 - Google Patents
혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 프로바이오틱스의 대량배양 방법 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 프로바이오틱스의 대량배양 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 1~10 톤 용량의 발효 탱크에서 대량 배양하는 방법 및 상기 균주의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 프로바이오틱스의 대량배양 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 1~10 톤 용량의 발효 탱크에서 대량 배양하는 방법 및 상기 균주의 용도에 관한 것이다.
당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않아 세포가 혈액속의 포도당을 흡수하지 못해 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 말미암아 끈적해진 혈액으로 인해 말단괴사 등과 같은 증상 중증을 말한다.
상기와 같이 당뇨병은 혈액속의 포도당을 흡수하지 못하기 때문에 당이 소변으로 배출되고 이로 인하여 당뇨(糖尿) 라는 병명으로 불리고 있고, 또한 당뇨병은 제1형과 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병은 이전에 '소아 당뇨병'이라고 불렸었으며, 인슐린을 전혀 생산하지 못하는 것이 원인이 되어 발생하는 질환이다.
한편, 프로바이오틱스(Probiotics)란 인간이나 동물 등 숙주(host)의 건강에 유익한 역할을 해주는 미생물과 이 미생물이 생산하는 이차대사산물(Secondary metabolites)을 총칭하는 용어이며, 균주의 특이성으로 인해 같은 속(Genus)과 종(Species)이라 하더라도 기능은 모두 다르게 나타나는 특성이 있다.
상기 프로바이오틱스는 정장작용 등 일차적인 기능을 하는 이외에 면역기능 향상, 대사증후군 완화, 장기능 개선을 통한 장건강에 도움을 주는 등 중요한 역할을 하고 있고, 이러한 프로바이오틱스의 역할과 더불어 혈당강하 효과와 항당뇨 효과를 기대하기 위해서는 수많은 종류 중에 균주 특이성이 부합하여야만 가능한 실정이다.
프로바이오틱스에 관한 종래기술로는 스트렙토코커스 서모필루스 ST3(KCTC 11870BP), 락토바실루스 람노수스 LR3(KCTC 11868BP) 및 락토바실루스 파라카제이 LPC4(KCTC 11866BP) 유산균 균주를 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물(특허문헌 1), 락토바실러스 가세리 BNR17 균주를 포함하는 당뇨병예방 및 치료용 조성물(특허문헌 2), 인슐린 저항성 개선 효능을 가지는 락토바실러스 애시도필러스 HY7037 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품(특허문헌 3) 등이 개시되어 있다.
그러나, 상기 종래기술들에는 프로바이오틱스로서 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주, 상기 균주의 대량배양 방법 및 상기 균주의 용도에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않은 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 1~10 톤 용량의 발효 탱크에서 대량 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 프로바이오틱스로서 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 1~10 톤 용량의 발효 탱크에 배지를 투입하고, pH를 조절한 후, 멸균 및 냉각하는 단계, (b) 상기 냉각한 발효 탱크에 종배양한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP)를 접종하는 단계, 및 (c) 상기 접종한 균주를 상기 발효 탱크에서 본배양하는 단계를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주의 대량배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 혈당 개선용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 신규 프로바이오틱스 유산균 및 이의 용도를 제공할 수 있는데, 상기 유산균은 현재 건강기능식품 중혈당강하, ?l장내 총 항산화능 등의 항당뇨 효과가 우수하다고 알려진 구아바잎 추출물보다 훨씬 우수한 활성을 갖는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 의하면 1~10 톤 규모의 대용량 발효 탱크에서 상기 유산균을 대량 배양할 수 있는 방법을 제공할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 유산균의 분리방법을 나타낸 것이다.
도 2는 96-웰 플레이트를 이용한 내산성 균주 스크리닝 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 생균수 측정방법을 나타낸 것이다.
도 4는 96-웰 플레이트를 이용한 내담증성 균주 스크리닝 방법을 나타낸 것이다.
도 5는 내담즙성 우수균주 선발을 위한 생균수 측정방법을 나타낸 것이다.
도 6은 양성대조구의 α-glucosidase 억제활성, 하기 표 5는 양성대조구를 이용한 검정선을 나타낸 것이다.
도 7은 선발 균주의 α-glucosidase 억제활성을 나타낸 것이다.
도 8은 분리균주의 식품 유해균 B. cereus에 대한 생육 저해환 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 분리 균주의 장부착능 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 유산균 선별 과정을 나타낸 것이다.
도 11은 상기 유산균 선별 과정을 나타낸 것이고, 도 12는 MBELL0138 균주의 계통수를 나타낸 것이다.
도 12는 MBELL0138 균주의 계통수를 나타낸 것이다.
도 13은 Lab scale 최적 배양조건 설정실험 흐름도를 나타낸 것이다.
도 14는 MBELL0138균주 온도에 따른 배양시간별 생균수 측정 결과(120 rpm)를 나타낸 것이다.
도 15는 MBELL0138 균주의 rpm에 따른 배양시간별 생균수 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 MBELL0138 균주를 30℃/ 120rpm의 조건으로 12, 14 및 16 시간 배양한 배양액을 위상차 현미경으로 관찰한 모습을 나타낸 것이다.
도 17은 균주별 최적 배지 검토조건 흐름도를 나타낸 것이다.
도 18a 및 도 18b는 MBELL0138 균주의 후보배지 조성에 따른 시간별 배양액의 생균수를 나타낸 것이다.
도 19는 MBELL0138 균주의 후보배지 추가 조정에 따른 시간별 배양액의 생균수를 나타낸 것이다.
도 20은 MBELL0138균주 Lab scale 최적 배지조성 및 조건을 나타낸 것이다.
도 21은 MBELL0138균주 최적 배지조성에 따른 시간별 생균수 및 OD를 나타낸 것이다.
도 22는 15L 배양탱크를 이용한 Scale up 조건 설정 실험 흐름도를 나타낸 것이다.
도 23은 20L 배양 탱크를 이용한 pH 조절에 따른 각 균주의 시간별 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 24는 200L 배양탱크를 이용한 스케일업 조건 확인실험 흐름도를 나타낸 것이다.
도 25는 200L 배양 탱크를 이용한 각 균주별 최적 스케일업 조건 배양의 시간별 생균수를 나타낸 것이다.
도 26은 최종 결정된 MBELL0138 균주의 최적배지 및 최적 배양조건를 나타낸 것이다.
도 27은 대량 발효탱크 및 생균수를 측정하는 실시예를 나타낸 것이다.
도 28은 접종농도 변경에 따른 균주별 생장곡선, 변경전 공정 및 변경후 공정을 나타낸 것이다.
도 29는 α-glucosidase 활성 우수 균주의 Lineweaver-Burk plot 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 선발 유산균의 disaccharidase 효소 저해활성을 나타낸 것이다.
도 31은 2t 배양탱크 및 원심분리기를 이용한 균체분리 공정의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 32는 분리균체 동결건조 조건 수립의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 33은 유산균 FD 분말의 생산공정을 나타낸 것이다.
도 34는 혈중 트리글리세라이드(triglyceride)의 농도를 나타낸 것이다.
도 35는 공복 16시간 후 혈액 내 글루코오스 함량을 나타낸 것이다.
도 36은 혈장 내 총항산화능(TRAP)을 나타낸 것이다.
도 2는 96-웰 플레이트를 이용한 내산성 균주 스크리닝 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 생균수 측정방법을 나타낸 것이다.
도 4는 96-웰 플레이트를 이용한 내담증성 균주 스크리닝 방법을 나타낸 것이다.
도 5는 내담즙성 우수균주 선발을 위한 생균수 측정방법을 나타낸 것이다.
도 6은 양성대조구의 α-glucosidase 억제활성, 하기 표 5는 양성대조구를 이용한 검정선을 나타낸 것이다.
도 7은 선발 균주의 α-glucosidase 억제활성을 나타낸 것이다.
도 8은 분리균주의 식품 유해균 B. cereus에 대한 생육 저해환 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 분리 균주의 장부착능 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 유산균 선별 과정을 나타낸 것이다.
도 11은 상기 유산균 선별 과정을 나타낸 것이고, 도 12는 MBELL0138 균주의 계통수를 나타낸 것이다.
도 12는 MBELL0138 균주의 계통수를 나타낸 것이다.
도 13은 Lab scale 최적 배양조건 설정실험 흐름도를 나타낸 것이다.
도 14는 MBELL0138균주 온도에 따른 배양시간별 생균수 측정 결과(120 rpm)를 나타낸 것이다.
도 15는 MBELL0138 균주의 rpm에 따른 배양시간별 생균수 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 MBELL0138 균주를 30℃/ 120rpm의 조건으로 12, 14 및 16 시간 배양한 배양액을 위상차 현미경으로 관찰한 모습을 나타낸 것이다.
도 17은 균주별 최적 배지 검토조건 흐름도를 나타낸 것이다.
도 18a 및 도 18b는 MBELL0138 균주의 후보배지 조성에 따른 시간별 배양액의 생균수를 나타낸 것이다.
도 19는 MBELL0138 균주의 후보배지 추가 조정에 따른 시간별 배양액의 생균수를 나타낸 것이다.
도 20은 MBELL0138균주 Lab scale 최적 배지조성 및 조건을 나타낸 것이다.
도 21은 MBELL0138균주 최적 배지조성에 따른 시간별 생균수 및 OD를 나타낸 것이다.
도 22는 15L 배양탱크를 이용한 Scale up 조건 설정 실험 흐름도를 나타낸 것이다.
도 23은 20L 배양 탱크를 이용한 pH 조절에 따른 각 균주의 시간별 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 24는 200L 배양탱크를 이용한 스케일업 조건 확인실험 흐름도를 나타낸 것이다.
도 25는 200L 배양 탱크를 이용한 각 균주별 최적 스케일업 조건 배양의 시간별 생균수를 나타낸 것이다.
도 26은 최종 결정된 MBELL0138 균주의 최적배지 및 최적 배양조건를 나타낸 것이다.
도 27은 대량 발효탱크 및 생균수를 측정하는 실시예를 나타낸 것이다.
도 28은 접종농도 변경에 따른 균주별 생장곡선, 변경전 공정 및 변경후 공정을 나타낸 것이다.
도 29는 α-glucosidase 활성 우수 균주의 Lineweaver-Burk plot 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 선발 유산균의 disaccharidase 효소 저해활성을 나타낸 것이다.
도 31은 2t 배양탱크 및 원심분리기를 이용한 균체분리 공정의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 32는 분리균체 동결건조 조건 수립의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 33은 유산균 FD 분말의 생산공정을 나타낸 것이다.
도 34는 혈중 트리글리세라이드(triglyceride)의 농도를 나타낸 것이다.
도 35는 공복 16시간 후 혈액 내 글루코오스 함량을 나타낸 것이다.
도 36은 혈장 내 총항산화능(TRAP)을 나타낸 것이다.
본 발명에서, 용어 "혈당 강하 활성"은 혈액 내 포도당 농도를 나타내는 수치인 혈당을 낮추는 효과를 의미하지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 통용되는 의미를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항산화 활성"은 산화를 억제하는 작용일 수 있다. 활성 산소에 의한 생체지질의 산화에서는 생체막 인지질(불포화지방산포함) 이외에 단백질(여러 효소를 포함)이나 유전의 정보를 담당하는 DNA의 손상 등이 나타나며, 나아가 간 장해나 순환기계 질환 혹은 암 등의 질병 그리고 노화가 유도될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "배양물"은 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 미생물이 포함되는 개념이다.
본 발명에서, 용어 "파쇄물"은 세포를 계면활성제(detergent) 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "추출물"은 균주로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미하며, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출액을 분획한 것도 포함한다.
본 발명에서, 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "건강기능식품"은 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 혈당 강하 또는 당뇨병의 예방 또는 개선에 관한 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미하며, 동시에 항산화 효과를 나타낼 수 있는 식품을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 (a) 1~10 톤 용량의 발효 탱크에 배지를 투입하고, pH를 조절한 후, 멸균 및 냉각하는 단계, (b) 상기 냉각한 발효 탱크에 종배양한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP)를 접종하는 단계, 및 (c) 상기 접종한 균주를 상기 발효 탱크에서 본배양하는 단계를 포함하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주의 대량배양 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에 사용되는 상기 락토바실러스 사케이 MBELL0138 균주는 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 특성을 지니고 있다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에 사용되는 상기 락토바실러스 사케이 MBELL0138 균주의 혈중 트리글리세라이드 농도 강하 활성은, 현재 건강기능식품 중에서 혈중 트리글리세라이드 농도 강하 효과가 좋다고 알려진 구아바 추출물에 비하여 30% 이상, 바람직하게는 30~35% 증가할 수 있다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에 사용되는 상기 락토바실러스 사케이 MBELL0138 균주의 혈장내 총항산화능(TRAP) 활성은, 현재 건강기능식품 중에서 혈중 트리글리세라이드 농도 강하 효과가 좋다고 알려진 구아바 추출물에 비하여 10~20% 증가할 수 있다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에 사용되는 상기 락토바실러스 사케이 MBELL0138 균주는 α-글루코시데이즈(α-glucosidase) 저해활성을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에서, 상기 배지는 배지의 전체 중량에 대하여, 소이 펩톤 1~3 중량%, 소고기 추출물(beef exrtact) 0.5~1.5 중량%, 효모 추출물 1~2 중량%, 덱스트로오스 1~3 중량%, 폴리솔베이트 80 0.2~0.4 중량%, 소디움아세테이트 0.4~0.6 중량%, 마그네슘설페이트 0.01~0.03 중량%, 망가니즈설페이트 0.005~0.015 중량% 및 디퍼태슘포스페이트 0.3~0.5 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에서, 상기 배지는 바람직하게는 소이 펩톤 2 중량%, 소고기 추출물 1 중량%, 효모 추출물 1.5 중량%, 덱스트로오스 2 중량%, 폴리솔베이트 80 0.3 중량%, 소디움아세테이트 0.5 중량%, 마그네슘설페이트 0.02 중량%, 망가니즈설페이트 0.01 중량% 및 디퍼태슘포스페이트 0.4 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에서, 상기 배지는 발효 탱크 용량의 5~10 용량%, 바람직하게는 7~8 용량%가 되도록 상기 발효 탱크에 투입할 수 있고, 상기 pH 조절은 pH 5.1~5.3, 바람직하게는 pH 5.2로 조절할 수 있다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에서, 상기 멸균 및 냉각은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 방법으로 수행하는 것으로 족하므로, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에서, 상기 종배양은 상기 본배양 발효 탱크 용량의 1/100 정도 용량의 퍼멘터(fermenter)에서, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 방법으로 수행하는 것으로 족하므로, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에서, 상기 균주의 접종량은 1.0×108 ~ 1.0×1010 cfu/ml, 바람직하게는 1.0×109 cfu/ml인 상기 균주 0.5~2%(v/v), 바람직하게는 1%(v/v)일 수 있다.
본 발명의 상기 대량배양 방법에서, 상기 본배양은 28~32℃, 바람직하게는 30℃의 온도 및 50~150 rpm, 바람직하게는 100 rpm의 교반속도로 14~18시간, 바람직하게는 15~17시간 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 혈당 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 혈당 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주(KCTC 14037BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 항산화용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 혈당 강하용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물, 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물, 항산화용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 상기 균주, 균주 배양액 또는 무세포 상등액을 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등의 부성분 또는 첨가제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아키시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품 또는 건강기능식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 식품 조성물에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스낵류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물의 제조방법은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 방법으로 제조하는 것으로 족하므로, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유산균의 분리
1. 분리원 수집
배추김치, 산마늘, 민들레, 당귀, 산더덕, 콩잎 등 다양한 원료를 사용한 김치 17 점, 머위대, 방풍, 뽕잎 등을 사용한 장아찌 9 점을 수집하였다. 전통주 9 점과 누룩 등 총 49점의 전통발효 식품을 수집하였으며, 순차적으로 구입하며 젖산균을 분리하였다.
2. 전통식품으로부터 유산균의 분리
생리식염수 9 ml에 시료 1 g을 첨가하여 균질화한 후, 1/10 씩 5번 희석하여 0.015%의 브로모크레졸퍼플(Bromocresol purple)을 함유한 MRS 배지에 도말하였다. 도말한 배지는 37℃로 유지되는 정체배양기에서 72 시간 동안 배양한 후, 단일 집락을 분리하였다.
상기 브로모크레졸퍼플은 낮은 pH에서 황색으로 변하는 특징을 가지므로, 유산균의 성장과정에서 젖산이 생성되면 집락 주변이 황색으로 변하여 유산균을 분리할 수 있다. 도 1은 유산균의 분리방법을 나타낸 것이다.
<실시예 2> 유산균의 내산성, 내담즙성 평가를 통한 균주 선발
유산균이 프로바이오틱스로서의 역할을 수행하기 위해서는 강산성의 위를 통과하여 장내로 이동하여야 한다. 음식물이 유입될 때 위에서는 pH가 약 2.0~3.0으로 나타나며, 음식물이 위를 통과하는데 소요되는 시간은 약 2~4시간으로 알려져 있다.
지금까지 유산균의 위액에 대한 내산성 실험은 위액에 의한 미생물 사멸작용의 주요 원인이 염산에 의한 낮은 pH인 것으로 밝혀졌으며, 미생물의 생존은 그들의 낮은 pH에 대한 저항성에 따른 것으로 알려져 있다.
담즙산에 대한 내성은 위에서의 산성 조건에 대한 저항성과 더불어 프로바이오틱스 미생물이 갖추어야 할 기본적인 특성 중 하나이다. 담즙은 소장의 상부에서 분비되어 섭취된 지질 식품의 소화, 흡수를 촉진하고, 미생물에 대해 세제와 유사한 작용을 함으로써 지방과 지방산으로 구성 되어 있는 미생물의 세포막에 영향을 주어 미생물 살균 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
1. 내산성 우수 균주 스크리닝
(1) 재료 및 방법
① 1차 스크리닝 방법
내산성이 우수한 균주를 스크리닝 하기 위하여 MRS 배지에 균주를 접종하여 24시간 동안 37℃에서 교반하며 배양하였다. 배양액 50㎕를 회수하여 96well-plate에 분주하고, 완충액을 사용하여 제작한 MRS 배지(pH 2.5) 150 ㎕를 첨가하였다.
96-웰 플레이트는 30℃에서 200 rpm으로 교반하며, 4시간 동안 배양하여 미생물의 생육 여부를 측정하였다. 도 2는 96-웰 플레이트를 이용한 내산성 균주 스크리닝 방법을 나타낸 것이다.
(2) 1차 스크리닝 결과
간균으로 판단된 245점의 유산균에 대하여 내산성 우수 균주 스크리닝을 수행하였다. 245점의 유산균 중 산성 배지에서 300% 이상의 증가율을 보이는 균주를 아래 표와 같이 1차적으로 스크리닝하였다.
하기 표 1은 산성(pH 2.5) 배지에서 선발 균주의 생육을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
(3) 생균수 측정을 통한 인공위액에서의 내산성 검정
분리 균주의 인공 위산에 대한 내성은 단순 산성 pH에 대한 내성실험과 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액 내성실험을 실시하여 확인하였다.
1 N HCl로 pH를 2.5로 조정한 MRS 액체 배지에 펩신을 1,000 unit/ml로 첨가하여 인공위액을 제조하였다. 배양한 균주에 인공위액 1%(v/v)를 첨가한 후 30℃에서 2시간 동안 배양하였다.
배양액을 회수하여 원심분리 후 상등액을 제거하고, 생리식염수를 사용하여 적정농도로 희석하여 MRS 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양 한 후, 단일집락 개수를 측정하였다. 도 3은 생균수 측정방법을 나타낸 것이다.
1차 스크리닝을 통해 선발한 19점의 유산균을 사용하여, 조금 더 확실하게 생균수 측정을 통한 내산성을 확인한 결과를 하기 표 2에 나타내었는데, 선발된 19점의 균주 모두 95% 이상의 생존율을 나타내었음을 알 수 있다.
2. 내담즙성 우수 균주 스크리닝
(1) 재료 및 방법
내담즙성의 확인을 위하여 내산성이 확인된 유산균 19점을 MRS 배지에 접종하여 24시간 동안 30℃에서 교반하며 배양하였다. 배양액 50 ㎕를 회수하여 96-웰 플레이트에 분주하고, 1% oxgall을 힘유한 MRS 배지 150 ㎕를 첨가하였다.
상기 96-웰 플레이트는 30℃에서 200 rpm으로 교반하며, 4시간 동안 배양하여 미생물의 생육여부를 측정하였다. 도 4는 96-웰 플레이트를 이용한 내담증성 균주 스크리닝 방법을 나타낸 것이다.
(2) 1차 스크리닝 결과
118점의 균주가 oxgall 스트레스 후에 성장하였으며, 하기 표 3과 같이 정리하였다.
(3) 생균수 측정을 통한 내담즙성 검정
분리 균주의 인공 담즙에 대한 내성은 MRS 액체배지에 0.45 ㎛로 여과한 Oxgall 용액을 1% 첨가하여 제조하였다. % Oxgall MRS 액체 배지에 균주를 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 2시간 동안 정치 배양하였다.
배양액을 회수하여 원심분리하여 상등액을 제거하고, 생리식염수를 사용하여 적정농도로 희석하여 MRS 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양 한 후, 단일집락 개수를 측정하였다. 도 5는 내담즙성 우수균주 선발을 위한 생균수 측정방법을 나타낸 것이다.
인공 위액에서 내산성이 확인된 19점의 유산균을 이용하여 인공 담즙을 이용한 내담즙성 시험을 수행한 결과 19점의 균주 모두 90%이상의 생존율을 나타내어, 기존에 보고된 균주들 보다는 우수한 내담즙성을 나타내었다을 확인하였다.
하기 표 4는 생균수 측정 방법을 통한 내담즙성 우수 균주 조사 결과를 나타낸 것이다.
3. α-glucosidase 저해능을 통한 균주 선별
(1) 재료 및 방법
α-glucosidase 저해 활성을 나타내는 유산균을 분리하기 위하여 현미경으로 형태를 관찰한 1,057점의 균주 중 간균으로 판단된 245점의 균주를 사용하였다.
MRS 액체 배지에 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 유산균 배양액 1 ml을 회수하여 균체 파쇄한 후 α-glucosidase 저해능을 측정하였다. 균체 파쇄는 sonication을 사용하였으며, Sonication(VCX 130, SONICS)은 130 watt 20kHz에서 10초간 9회 펄스(pulse) 후 10초 휴식, Amp1 40 %의 조건으로 수행하였다.
파쇄된 유산균 배양액은 원심분리(13,000 rpm, 1분) 한 후, 상등액을 조효소액으로 사용하였다. α-glucosidase의 저해 활성은 기질인 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside로부터 α-glucosidase에 의해 분해되어 유리된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 흡광도로 측정하였다.
0.1M 인산완충용액(pH 6.8)에 0.2 U/ml로 희석한 α-glucosidase 효소액 50 ㎕와 균주 배양액 50 ㎕를 96-웰 플레이트에 넣고 37℃에서 5분 동안 반응하였다.
0.1M 인산완충용액(pH 6.8)을 이용하여 5 mM로 희석한 기질 p-NPG 용액 50 ㎕를 첨가한 후 37℃에서 25분간 반응하였다. 반응 후 0.1M 소디움카르보네이트(sodium carbonate)를 100 ㎕ 넣어 반응을 정지 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
α-glucosidase 저해능(%)은 (대조구의 흡광도 - 균주 배양액 첨가 후 흡광도)/대조구의 흡광도 × 100 으로 계산하였다. 실험의 대조군으로는 α-glucosidase 저해제로 알려진 아카보스(acarbose)를 사용하여 10mg/ml부터 적정 농도로 희석하여 사용하였다.
(2) 실험 결과
도 6은 양성대조구의 α-glucosidase 억제활성, 하기 표 5는 양성대조구를 이용한 검정선을 나타낸 것이다.
전통발효 식품으로부터 분리한 유산균을 사용하여 α-glucosidase 억제활성을 조사한 결과를 도 7에 나타내었는데, 7점의 유산균에서 α-glucosidase 억제활성이 나타났다.
7점의 α-glucosidase 억제활성을 나타낸 균주 중, 간균 형태는 MBELL119, MBELL138로 나타났다. 하기 표 6에서 보는 바와 같이, 오대산 된장 쌈장에서 분리한 MBELL119 균주는 1.95±0.49 %의 억제활성을 나타냈으며, 당귀김치에서 분리한 MBELL138균주는 3.91±0.25%로 나타났는 바, α-glucosidase 억제활성을 나타내는 간균 MBELL119, MBELL138 균주를 선발하였다.
<실시예 3> 식품 유해균에 대한 항균활성 평가
1. 재료 및 방법
Bacillus cereus KCTC3624 균주는 식품 유해균으로 알려져 있으며, 식중독, 곡류 부패 및 변질을 일으키고 성인에게 폐렴 등 질병을 초래하는 것으로 보고되어 있으며 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터 분양받아 사용하였다.
분리 균주의 유해균에 대한 증식 억제 활성은 종이 디스크법을 사용하여 검정하였다. 유해균은 5 ml의 TSB 액체배지에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 정치배양 후, 원심분리하여 균체를 회수하였으며 TSB 액체 배지에 초기 세포흡광도(OD600)가 0.1 되도록 접종한 후, 최종 세포흡광도가 1.0 수준이 될 때까지 배양하였다.
배양한 유해 균주는 TSA 고체배지에 100 ㎕씩 도말하고, 지름 9 mm의 멸균된 종이 디스크를 점적하였다.
분리한 유산균은 5 ml의 MRS 액체배지에 24 시간 동안 정치배양 하였으며, 배양액 20 ㎕를 점적된 종이 디스크에 분주하여 30℃에서 24시간 동안 배양하며 생육저해환의 크기를 측정하였다.
항균활성 평가 시험에 사용한 양성대조구 물질은 암피실린(10 μg/ml)을 사용하였으며, 대조구 균주는 문헌을 통해 유산균의 항균활성평가에서 식품 유해균 중 지시균주의 한 종류인 L . monocytogenes KCTC3569 균주를 사용하였다.
2. 실험 결과
분리균주의 식품 유해균에 대한 생육 저해환 결과를 하기 표 7 및 도 8에 나타내었다. 도 8에서, PC는 암피실린(Ampicillin), A는 L. monocytogenes KCTC3569, 1은 MBELL0116, 2는 MBELL0118, 3은 MBELL0119, 4는 MBELL0122, 5는 MBELL0123, 6은 MBELL0126, 7은 MBELL0138, 8은 MBELL0141, 9는 MBELL0396, 10은 MBELL0430의 결과이다.
내산성 및 내담즙성 평가를 통해 선별된 상위 30점의 균주에 대해 식품 유해균에 대한 항균활성평가를 진행하였다. 30점의 균주 중에서 B. cereus 에 대해 생육 저해환을 형성하는 균주는 8점으로 나타났다.
이 때, 대조균주로 사용된 L. monocytogenes 균주에서는 생육 억제 활성이 육안으로는 확인되지 않았으며, 양성 대조구로 사용된 Ampicillin(10 μg/ml)에서는 항균활성이 확인되었다.
항균활성을 나타내는 8점의 균주는 10mm 이상의 생육 저해환을 나타내었으며, 이는 양성 대조구 L. monocytogenes 균주의 생육 저해환 9mm 대비 10% 이상 우수한 것으로 나타났다.
<실시예 4> 장 정착능 평가(Caco-2 cell에 대한 부착능 측정)
유산균이 프로바이오틱스로의 특징을 가지려면 위와 십이지장을 통과하여 최종 목적 부위인 장에 도달하여 장내 상피세포에 정상적으로 부착되어야 그 기능을 할 수 있다. 문헌에 따르면 L. rhamnosus GG는 다른 유산균에 비해 장내 부착능이 뛰어난 것으로 알려져 있어 양성대조군으로 사용하였다.
인체 장내 상피세포 계열인 Caco-2, HT-29, Int-407 등의 세포를 이용하여 장 세포 기능 및 병원성 장구균 연구에 사용한다. 유산균이 점막세포와 결합하는데 유산균의 리간드가 특정 수용체와 반응해야 하므로, 인체 장내의 Caco-2세포가 유산균의 장내 정착을 연구하는게 가장 적합한 모델로 보고되었다.
Caco-2 세포는 소장 융모 세포의 다양한 특성을 나타내며, 여러 가지 병원성 세균 둥의 정착과 침입 기작에 대한 연구에 사용되었다. 실험에 사용한 Caco-2 세포는 한국세포주은행으로부터 분양받았다.
단일층(Monolayer)을 형성한 Caco-2 세포의 세포수를 1.0×105 cells/ml로 조정하여 37℃, 5% CO2 조건으로 2시간 배양후, 흡광도가 1.0(OD600)인 유산균 현탁액을 희석하여 100 ㎕ 첨가하여, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.
2시간 후 부착되지 않은 세포 및 유산균을 Phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)로 세척하여 제거하였다. 생균수 측정을 위해 부착된 유산균을 희석하여 MRS 고체 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다.
생균수를 통해 균주 투여 농도 대비 부착농도를 측정하였으며, 이를 통해 장부착능이 우수한 균주를 선발하였다. 실험에 사용한 8점의 균주 모두 대조구(L. rhamnosus)의 부착능 41.2%보다 우수한 장부착능을 나타내었으며, 대조구(L. rhamonosus) 대비 20% 이상의 장부착능 우수균주 2점(MBELL0126, MBELL0141)을 선발하였다.
하기 표 8은 선별 균주의 장부착능 생균수 측정 결과를 나타낸 것이고, 도 9는 분리 균주의 장부착능 실험 결과를 나타낸 것이다.
<실시예 5> 유산균 선발 및 동정
1. 유산균 선발
분리한 1,057점의 유산균에 대하여 현미경을 통한 형태학적 분석을 통하여 245점의 간균형태의 유산균을 재분류하였으며, 내산성, 내담즙성 평가를 진행하였다.
245점의 간균 형태의 유산균중 내산성, 내담즙성 평가를 통하여 우수 균주 30점을 선발하였으며, 내산성, 내담즙성이 우수한 균주에서 항균활성 평가를 통하여 식품 유해균인 B. cereus에 대해 생육저해환을 형성하여 대조구(Listeria monocytogenes) 대비 10%이상의 항균활성을 나타내는 균주 8점을 선별하였다.
식품 유해균에 대해 생육저해환을 형성하는 유산균 8점 중 장부착능 실험을 통해 대조구(L. rhamnosus) 대비 20%이상의 장부착능을 보이는 균주 MBELL0126, MBELL0141 균주 2점을 선별하였으며, 나머지 6점에 대해서도 대조구인 L. rhamonosus 보다 높은 부착능을 확인하였다.
선별 균주의 α-glucosidase 억제활성 결과 MBELL0119, MBELL0138 두 균주에서 저해능이 확인되었다. 과제의 목표인 혈당강하 프로바이오틱스 제품개발을 위해 최종적으로 내산성, 내담즙성을 가지며, 식품 유해균에 대해 생육 저해환을 형성하고 장부착능이 우수한 균주 MBELL0119, MBELL0138 두 균주를 최종 균주로 선발하였다.
도 10은 유산균 선별 과정을 나타낸 것이다.
2. 선발 유산균 동정
(1). 균주의 동정 방법
27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG: 서열번호 1), 1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT: 서열번호 2) 프라이머를 이용하여 PCR을 하여 서열번호 3의 16s 리보솜 RNA 염기서열을 확인하고, 확인된 염기서열을 NCBI의 BLAST를 이용하여 상동성을 분석하여 동정하였다.
(2) 균주 동정 결과
염기서열 분석을 통하여 약 0.9 kb의 MBELL0138 균주의 query sequences를 확보하였으며, 해당 염기서열을 이용하여 NCBI BLAST 데이터베이스에서 분석한 결과, L. sakei와 95%의 상동성을 나타내었다.
도 11은 상기 유산균 선별 과정을 나타낸 것이고, 도 12는 MBELL0138 균주의 계통수를 나타낸 것이다.
상기와 같이 동정한 MBELL0138 균주를 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBELL0138 균주로 명명하고, 2019년 11월 19일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC 14037BP로 기탁하였다.
<실시예 6> 혈당강하 미생물 선정 및 배양
1. 미생물배지 후보물질 선정
미생물을 배양하기 위한 미강, 대두박 등 경제성이 좋으며 미생물 배양시 적은 시간안에 높은 배양수치를 나타낼 수 있는 배지를 후보를 선정하고자 하였으나, 미강, 대두박 등 불용성 소재의 경우 회수시 원심분리 등을 통한 순수 생균의 회수가 어렵고, 고형물로 인하여 대용량의 동결건조기가 필요하며, 회수된 동결건조 분말의 순도가 떨어지는 단점이 있어 수용성 식첨용 소재를 검토한다.
특히, 단백질 지질 및 당과 같은 필수요소의 경우 상대적으로 단가가 낮고 안정적으로 수급이 가능한원료를 기준으로 검토하였다. 특히 단백질의 경우 당사가 사용하는 Peptone은 단가가 매우 높기 때문에, 여러 후보군 중 대체 가능한 가수분해 대두단백질(Soy peptone을)을 사용하는 것으로 결정한다.
하기 표 9는 식첨용 소재로 사용가능한 수용성 배양원료를 나타낸 것이다.
2. Lab scale 배양조건 검토
2018년 9월 5일 부 발표된 식품의약품안전처 고시(건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시 제 2018-67호)에서 프로바이오틱스 원재료 중 Enterococcus 속 균주는 항생제 내성 유전자 및 독성 유전자가 없는 경우에 한하여 사용이 가능하다고 공시하였으며, 이에 따라 Enterococcus 속 균주는 규제 강화로 사용이 어려워졌다.
법령 변경 및 주관기관의 설비를 고려할 때, 유산간균의 사용이 유리하다고 판단되었다. 따라서 주관-협동 기관의 상호 협의를 통하여 선발 균주를 유산간균으로 한정하기로 하였다.
배지 조건을 검토하기 전에, 제공받은 균주에 맞는 최적 온도, rpm 및 배양시간과 같은 생육조건을 먼저 검토하였다. 균주는 강원대학교 측에서 제공한 7개 균주중 유산 간균으로 확인된 2개 균주를 사용하였으며, 접종 농도는 1.0%(1.0×10^8cfu/ml)로 고정하였다.
배지는 MRS 브로쓰 배지를 사용하였으며, 도 13과 같이 온도, rpm에 변화를 주어 매 2시간마다 생균수를 측정하고, 측정된 생균수에 따라 성장곡선을 그려 16시간 이내에서 대수기가 끝나는 조건을 선정하여 최적 배양 조건을 설정하였다.
생균수의 측정은 2018식품공전 ▷ 제 7. 일반시험법 ▷ 4. 미생물시험법 ▷ 4.9 유산균수 ▷ 4.9.2 유산간·구균 및 비피더스균 시험법에 따라 단계별 희석법, Pouring plate법을 이용하고 BCP PCA 배지를 사용하여 측정하였다.
하기 표 10은 MBELL0138 균주의 온도에 따른 배양시간별 생균수 측정 결과(120 rpm)를 나타낸 것이다.
도 13 및 상기 표 10에서와 같이, MBELL0119, MBELL0138 균주 모두 30℃에서 가장 높은 생균수를 나타내었으며, 성장곡선에서의 대수기의 종료점 또한 14시간 이내로 나타났다. 따라서, 두 균주 모두 최적 온도 조건은 30℃로 결정하였다.
도 14는 MBELL0138균주 온도에 따른 배양시간별 생균수 측정 결과(120 rpm)를 나타낸 것이고, 하기 표 11은 MBELL0138균주 rpm에 따른 배양시간별 생균수 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 14를 보면, MBELL0119 균주의 경우 30℃/120rpm 조건에서 가장 높은 생균수를 나타내었으며, MBELL0138 균주의 경우 표 11을 볼 때 30℃/100rpm에서 가장 높은 생균수를 나타내었다.
도 14에서 보는 바와 같이, BELL0138 균주는 14시간에서 대수기가 종료된 것으로 생각된다. 도 15는 MBELL0138 균주의 rpm에 따른 배양시간별 생균수 측정 결과를 나타낸 것으로서, 대수기 종료점(14hr) 및 전후(12hr, 16hr)의 위상차 현미경 관찰결과, 균의 형태학적 측면에서 차이가 없는 것으로 판단되었다.
따라서, 이후의 배지 검토실험은 MBELL0138균주 30℃/ 120rpm 조건 12, 14, 16hr 배양액 위상차현미경 관찰 모습을 나타내는 도 16과 같은 조건으로 각 균주별 배지조건을 검토하는 것으로 결정하였다.
도 17은 균주별 최적 배지 검토조건 흐름도를 나타낸 것이다.
3. Lab scale 배지조건 검토
식첨용 소재를 사용한 Lab scale 배지의 조성은 유산균 배양에 많이 사용되는 MRS 브로쓰 배지를 참고하였으며, 하기 표 12의 1번 후보배지와 같이 나타내었다. 나머지 후보배지 2~9번은 각 소재의 개별 첨가량을 조절하여 균주별 원료에 따른 생균수의 변화를 측정하였다.
하기 표 3은 MBELL0138균주의 후보배지 조성에 따른 시간별 배양액의 생균수를 나타낸 것이다.
상기 표 13과 도 18a 및 도 18b에서 보는 바와 같이, MBELL0138 균주의 경우 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9번 배지 조성에서 생균수가 증가하였다. 상기의 결과를 바탕으로 하여 MBELL0138균주 후보배지 추가조정 결과인 하기 표 14와 같이 첨가량 증가에 따라 긍정적인 효과가 있었던 식첨용 소재는 추가로 3, 4배 늘려 실험하였다.
하기 표 15 및 도 19는 MBELL0138 균주의 후보배지 추가조정에 따른 시간별 배양액의 생균수를 나타낸 것이다.
상기 표 15 및 도 18a, 도 18b의 결과를 반영하여 도 20과 같이 최적 배지조성을 선정하였으며, 그에 따른 생균수 및 OD를 측정한 결과를 하기 표 16 및 도 21에 나타내었다.
상기와 같이, MBELL0138 균주의 기준규격을 10^9 cfu/ml 이상으로 설정한 것은 배양액에서 최소 1.0×10^9 cfu/ml 이상의 생균수를 보여야만 산업적으로 이용 가능한 정도의 유산균을 얻을 수 있기 때문이다.
또한, 유산간균의 경우 막여과 필터 등을 이용한 배지교체가 없는 이상 10^9 cfu/ml 이상 증식하기 힘들다. 현재 본 출원인이 주로 배양하는 유산균종 대부분은 약 1.5×10^9 cfu/ml 수준으로 배양되며, 해당 균주를 원심분리, 동결건조시 균주에 따른 회수율의 차이는 다소 있으나 산업적으로 가능한 범위이다.
만약 배양액이 10^9 cfu/ml 이하의 생균수를 보일 경우, 원심분리 회수율 및 동결건조 후 분말화 과정에서 생균의 사멸율을 억제하여 산업적으로 이용하는 것은 한계가 있다. 따라서, 본 실험에서는 선정 균주를 가장 빠르게 10^9 cfu/ml을 달성하며, 유효숫자가 높은 배양조건 및 배지조건을 선정하였다.
4. 스케일업(Scale up) 조건 설정
검토가 완료된 Lab scale 배지 및 배양조건을 바탕으로 도 22와 같이 20L 및 200L 배양탱크를 이용하여 pH 조절에 따른 스케일업 배양 조건을 설정하였다. 스케일업 최적 배양조건은 가장 빠른 시간 안에 10^9 cfu/ml을 달성하며, 높은 생균수를 나타내는 것으로 결정하였다.
초기 배지의 pH의 조절은 식첨용 HCL을 3N 농도로 하여 사용하였으며, 배양을 진행함에 따라 낮아지는 pH는 식첨용 NaOH를 3N 수용액을 투입하여 조절하였다.
또한, Seed 미생물 접종의 경우 실험 및 대용량 생산시의 편의성을 위하여 실험실 규모(Lab scale) 실험조건에서 사용된 1.0×10^8 cfu/ml 1% 접종에서 1.0×10^9 cfu/ml 0.1%로 변경하였으며, Lab scale 실험으로 확립된 조건을 이용하여 사전에 배양하여 사용하였다. 유효숫자의 경우 Seed 배양액의 시료를 채취하여 OD에 따른 값으로 확인하여 접종하였다(OD 3.5~4.0).
하기 표 17은 20L 배양 탱크 이용 pH 조절에 따른 시간별 배양액의 생균수를 나타낸 것이다.
상기 표 17 및 도 23의 결과와 같이, MBELL0119의 경우 pH5.6에서, MBELL0138의 경우 pH 5.2에서 14hr 배양시 가장 높은 생균수를 나타내었다. 해당 결과에 따라, pH를 고정하고 도 24와 같이 200L 스케일업 실험을 추가 진행하였다.
하기 표 18은 200L 배양 탱크 각 균주별 최적 Scale up 조건 배양의 시간별 생균수를 나타낸 것이다.
상기 표 18 및 도 25의 결과와 같이, MBELL0138 균주의 스케일업 실험에서 생균수가 감소하는 경향은 있었으나, 전체적인 성장곡선 및 패턴은 Lab scale 및 15L 배양시와 유사한 것으로 확인되었다.
이상의 결과를 종합적으로 검토할 때, MBELL0138의 최종 배양조건은 도 26의 조건으로 설정하였다.
<실시예 7> 대량 발효조건 설정
상기 실시예 6에서 결정된 스케일업 조건을 기반으로, MBELL 0119, MBELL 0138 2개 균주에 대하여 2t 탱크를 이용한 1t 대량 발효를 실시하였다. 도 27은 대량발효탱크 및 생균수 측정 실시예를 나타낸 것이다.
최초 조건대로 배양한 결과, 성장곡선에서 정지기가 보이지 않았으며 대수기가 지속되는 것을 확인하였다. 이에 따라, 배지, pH 및 rpm 등의 문제가 아닌 접종량에 문제가 있는 것으로 판단하여 접종량을 증량하였으며, MBELL 0119, MBELL 0138 모두 1.0×10^9 cfu/ml의 Seed를 1.0% 접종할 때 최적의 성장곡선을 나타내었다.
도 28은 접종 농도의 변경에 따른 균주별 생장곡선, 변경전 공정 및 변경후 공정을 나타낸 것이다.
또한, 접종되는 종배양(Seed) 배지의 양이 증가함에 따라, 기존 플라스크 배양에 따른 접종이 아닌 20L 퍼멘터를 이용하여 10L 배양한 종배양 배양액을 접종 하는 것으로 공정을 변경하였으며, 배양 시간 또한 기존 14 시간에서 10~12 시간 배양하는 것으로 설정하였다.
<실시예 8> 혈당강하 효능평가(in vitro)
1. α-Glucosidase(AGI) 저해 활성 우수 균주의 카이네틱 분석
MBELL 0119, 0138, 1720, 1842 균주의 α-glucosidase (AGI) 저해활성 카이네틱(Kinetic) 분석을 진행하였다.
α-Glucosidase 카이네틱 분석은 기질 농도별, 시료 농도별 분석을 수행함으로써, 효소-기질 복합체에 대한 최대반응 속도와(Vmax), 기질친화도(Km), 저해방법(경쟁적 저해, 비경쟁적 저해 등)을 파악할 수 있다.
4종의 유산균은 MRS 배지에 초기세포 흡광도를 OD600=1.0 으로 접종하여 48시간 배양하였다. 세포를 파쇄한 배양액을 2배씩 희석하였고(4-1~16-1), 기질(p-nitrophenyl a-D-glucopyranoside)은 2.5mM, 5mM, 10mM, 20mM 농도로 처리하여 분석하였다.
시료농도, 기질농도별 효소 저해활성을 Lineweaver-Burk plot을 작성하여 α-glucosidase에 대한 Km, Vmax 값을 분석한 결과를 하기 표 19에 나타내었다. 한편, 도 29는 α-Glucosidase 활성 우수 균주의 Lineweaver-Burk plot 결과를 나타낸 것이다.
분석 결과, 음성대조구로 측정한 MRS 배지의 기질친화도(Km)값은 1.3으로 가장 높은 값을 보였지만, 유산균 투여군에서는 낮은 값을 나타내어 유산균의 효소-기질 복합체 형성을 방해하는 것으로 판단되었다. 특히, MBELL 0138 균주는 Km값이 0.031로 가장 낮은 값을 나타내었다.
효소저해 양상은 모두 혼합 저해형(mixed inhibition type)으로 나타났다. 유산균의 효소 저해효과는 기질과 생성물에 복합적인 작용을 통해 효소활성을 저해한다고 판단되었다.
α-Glucosidase효소 저해활성은 MBELL 0138, 0119, 1720, 1842 순으로 우수하게 나타나, 가장 우수하였던 2종, MBELL 0119, 0138 균주를 선발하여 disaccharidase 효소 저해활성을 분석하였다.
2. Disaccharidase 효소 저해활성
랫드 instestinal acetone powder를 30초간 얼음위에서 초음파 처리한 후, 30분간 원심분리하여 조효소로 사용하였다. 슈크로오스를 기질로 사용하여 Disaccharidase 효소 저해활성 비교하였다.
Disaccharidase 효소 저해 활성을 비교한 결과, MBELL 0119와 0138 처리군이 대조군 배지에 비해 효소활성이 감소하여. 두 균주에 의해 효소활성이 저해됨을 확인할 수 있었다. 도 30은 선발 유산균의 disaccharidase 효소 저해활성을 나타낸 것이다.
MBELL 0119와 0138은 두 시료간의 유의적인 차이는 나타나지 않았지만, α-glucosidase 효소 저해 활성이 우수하였던 MBELL 0138 균주를 이용하여 혈당강하 기능성 평가를 진행하였다.
<실시예 9> 대량발효 유산균 균체 분리 및 분리균체의 동결건조 공정 확립
1. 대량발효 유산균 균체 분리공정 확립(MBELL 0138)
1t 대량 발효조건으로 배양된 미생물의 분리조건을 검토하였다. 원심분리를 통하여 분리조건을 설정하며, 튜블라, 디스크타입 모두를 검토하였다. 튜블라 타입의 경우 분리는 더 잘되나 분리시간이 오래 걸려 미생물이 특성을 잃거나 사멸하는 경우가 있으며, 디스크 타입의 경우 분리속도는 빠르나 분리수율이 낮은 특성이 있다.
대양 배양된 미생물의 균체길이, 유입량, 냉각온도, G값에 따라 개별 균주의 회수율이 다르므로, 상기의 조건을 검토하여 최적 분리조건을 설정하였다. 도 31은 2t 배양탱크 및 원심분리기를 이용한 균체 분리공정 설정 흐름도를 나타낸 것이다.
실험은 1t 배양액 전량을 사용할 경우 검토에 시간과 비용이 많이 소요되므로, 배양이 종료된 배양액은 다른 1t 탱크에 옮겨 각각 500L씩 나누었으며, 원심분리가 진행되는 동안 배양액은 20℃로 냉각하여 사용하였다.
하기 표 20은 튜블라 타입(15,000rpm) 원심분리 조건 검토결과, 표 21은 디스크 타입(8,000rpm) 원심분리 조건 검토결과를 나타낸 것이다.
원심분리 공정 조건을 위한 실험결과, 균체의 농도는 튜블라 타입이 더 높았으나, 최종 배양액대비 수율 및 분리시간에 있어 디스크 타입으로 원심분리하는 것이 생산에 더 유리하다고 판단되어 디스크 타입으로 원심분리 하는 것으로 결정하였다.
2. 분리균체 동결건조 조건 수립
원심분리 공정이 설정된 유산균은 동결건조 조건을 검토하였다. 분리된 미생물의 경우 대부분 동결건조 하게 되는데, 최종 동결건조는 300kg 용량의 동결건조기를 사용하며, 동결 건조시에는 트랩(trap)의 온도, 감압시간, 동결건조 시간 및 보호제의 조건에 따라 유산균의 생균수에 영향을 주게 된다.
최악의 경우 분리된 유산균의 생균수가 동결 건조 후 오히려 낮아지는 현상이 발생하므로, 300kg 동결건조기를 이용하여 동결건조 조건 및 보호제의 배합비율을 설정하였다. 도 32는 분리균체 동결건조 조건 수립 과정을 나타낸 것이다.
보호제의 비율을 설정하기 전에 선정 균주의 최적 동결건조 조건을 검토할 필요가 있어, 30L 동결건조기를 이용하여 균주가 가장 스트레스를 덜 받으면서 경제적인 동결건조 조건을 검토한 결과를 하기 표 22에 나타내었다.
30L 동결건조기를 통해 확인한 조건으로 하기 표 23과 같이 동결건조 보호제 조건을 설정하였다. 이 때, 상기 동결건조 보호제는 일반적으로 동결시 생성되는 물 결정에 의한 세포의 파괴를 막기 위하여 사용하였다.
실험적인 방법으로는 탈지분유, 글리세린등을 첨가하는 방법이 있으나, 식품으로써의 용도를 생각할 때, 알레르기 위험성이 있는 탈지분유나 추후 제품 제조시 문제의 소지가 있는 글리세린을 첨가하기는 어렵다.
대부분의 경우 점도에 따른 차이 및 균체 특성에 따라 다르나, 전분 및 덱스트린을 주로 이용한다. 전분 및 덱스트린은 분자의 구조가 길고 수분을 잘 흡착하지 않기 때문에, 동결건조 보호제로써 적합하다.
본 출원인의 경우 감자전분과 덱스트린, 알긴산 수용액을 사용하여 동결건조 보호제를 설정하는 것에 노하우가 있어 해당 원료의 비율조합을 통하여 동결건조 보호제를 설정하였다.
도 33은 유산균 FD 분말의 생산공정을 나타낸 것이다.
<실시예 10> 혈당강하 기능성 평가(in vivo)
실험구는 α-glucosidase 효소 저해 활성이 우수하였던, MBELL 0138의 건조분말을 강원대로부터 전달받아 사용하였으며, 당뇨쥐는 db/db 마우스 (BSK.Cg-Dock7<m> +/+ Lepr<db>, n=24), Jackson Laboratory(USA)로부터 수컷 5주령을 받아 사용하였다.
또한, 양성 대조구로는 기존 항당뇨 건강기능식품을 이용하는 것을 심사위원들이 요청한바 있어, 양성대조구 기능성 식품으로 구아바잎 추출가루로 선정하였다. 상기 구아바잎 추출가루는 ㈜힐링에서 판매하는 건강기능식품용 구아바잎추출물분말을 구입하여 사용하였고, 투여 용량은 하기 표 24에서 보는 바와 같이, 200mg/kg b.w으로 하였다.
하기 표 24는 실험구 및 양성 대조구 등을 정리하여 나타낸 것이다.
1. 혈중 트리글리세라이드(triglyceride) 농도
db/db 마우스에서 당뇨 질환은 복부지방 대사와 밀접한 관련이 있는데, 당뇨 질환에서 인슐린 분비의 연속적인 이상증은 지방조직에서 혈장까지 지방유래 물질이나 중성지질 축적을 유발하게 된다고 알려져 있다.
도 34에서 보는 바와 같이, 트리글리세라이드 농도는 정상대조군 39.17±4.50 mg/dL, 당뇨유발군 154.33±26.12 mg/dL로 당뇨 유발군에서 triglyceride 농도가 3.9배 이상 증가하였다.
한편, 유산균 투여군의 경우, 트리글리세라이드 농도(101.42±9.79 mg/dL)는 당뇨 유발군보다 유의적으로 감소하였고, 양성대조군으로 사용한 구아바 추출물 투여군(147.23±38.82 mg/dL)에 비해 10% 이상 감소하였다.
2. 공복 혈당
혈당은 당뇨 진단에 있어 가장 중요한 지표로 활용되고 있다. 공복혈장의 포도당농도가 126 mg/dL 이상의 경우, 미국당뇨협회에서는 당뇨병의 미세혈관 합병증인 망막증의 발생을 예측할 수 있는 혈당농도의 근거로 보고 있다.
도 35에서 보는 바와 같이, 당뇨 유발군의 공복혈당은 225.00±42.11 mg/dL로 정상대조군(59.60±5.03 mg/dL)보다 4배 이상 증가하였다. 유산균 투여군의 경우, 162.60±21.94 mg/dL으로 당뇨 유발군에 비해 유의적으로 감소하였지만, 양성대조구로 사용한 구아바 추출물 투여군에(117.40±40.23) 비해 높은 함량을 나타내었다.
3. 혈장 내 총 항산화능(TRAP)
혈장 TRAP은 제2형 당뇨병의 방어체계 지표로, 분석은 Total antioxidant assay kit(sigma)를 이용하였다.
분석 결과, 도 36에서 보는 바와 같이, 유산균 투여군(1.46±0.03 mM Trolox)이 당뇨유발군(1.24±0.03 mM Trolox) 대비 증가하는 것으로 나타났고, 당뇨를 유발하지 않은 정상대조구(1.44±0.04 mM Trolox)와 유의적으로 비슷한 농도를 나타내었다. 그러나, 양성대조구로 사용한 구아바 추출물 투여군(1.20±0.17 mM Trolox)에 비해 높은 혈장 내 총 항산화능(TRAP)을 나타내었다.
혈당관련 기능성을 확인하기 위한 바이오 마커에는 혈당 관련 지표와 인슐린 관련 지표가 있다. 혈당관련 지표인 공복 혈장 혈당에서는 유산균 투여로 인한 감소 효과를 확인할 수 있었다.
인슐린 감소 효과는 유산균 투여군에서 나타나지 않았지만, 혈중 트리글리세라이드의 농도가 감소하여, 인슐린에 의한 간접적인 효과를 기대할 수 있었다.
상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있다을 이해할 수 있을 것이다.
<110> Wellbeing LS & University of Kangwon
<120> Method for mass culturing probiotics having hypoglycemic activity
and antioxidant activity and use of the same
<130> 11556
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of 27F
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of 1492R
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S rRNA gene of Lactobacillus sakei MBELL0138
<400> 3
aataccgcat aaaacctaac accgcatggt gtagggttga aagatggttt cggctatcac 60
tttaggatgg acccgcggtg cattagttag ttggtgaggt aaaggctcac caagaccgtg 120
atgcatagcc gacctgagag ggtaatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 180
ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc 240
gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg ttggagaaga atgtatctga 300
tagtaactga tcaggtagtg acggtatcca accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 360
cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg 420
caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa 480
actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 540
agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg 600
ctcgaaagca tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg 660
agtgctaggt gttggagggt ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat taagcactcc 720
gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 780
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct 840
ttgaccactc tagagataga gctttccctt cggggacaaa gtgacaggtg gtgcatggtt 900
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta 960
ctagttgcca gcatttagtt gggcactcta gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1020
gtggggacga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1080
gatggtacaa cgagttgcga gaccgcgagg ttta 1114
Claims (11)
- (a) 1~10 톤 용량의 발효 탱크에 배지를 투입하고, pH를 조절한 후, 멸균 및 냉각하는 단계;
(b) 상기 냉각한 발효 탱크에 종배양한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주를 접종하는 단계; 및
(c) 상기 접종한 균주를 상기 발효 탱크에서 본배양하는 단계를 포함하고, 상기 배지는 배지의 전체 중량에 대하여, 소이 펩톤 1~3 중량%, 소고기 추출물 0.5~1.5 중량%, 효모 추출물 1~2 중량%, 덱스트로오스 1~3 중량%, 폴리솔베이트 80 0.2~0.4 중량%, 소디움아세테이트 0.4~0.6 중량%, 마그네슘설페이트 0.01~0.03 중량%, 망가니즈설페이트 0.005~0.015 중량% 및 디퍼태슘포스페이트 0.3~0.5 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주(KCTC 14037BP)의 대량배양 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 pH 조절은 pH 5.1~5.3으로 조절하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주의 대량배양 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 균주의 접종량은 1.0×108 ~ 1.0×1010 cfu/ml인 상기 균주 0.5~2%(v/v)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주의 대량배양 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 본배양은 28~32℃의 온도 및 50~150 rpm의 교반속도로 10~12시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주의 대량배양 방법.
- 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주를 포함하는 혈당 개선용 식품 조성물.
- 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주를 포함하는 혈당 개선용 건강기능식품 조성물.
- 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주를 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주를 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주를 포함하는 항산화용 식품 조성물.
- 혈당강하 활성 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MBEL1397 균주를 포함하는 항산화용 건강기능식품 조성물.
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-
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