KR100686558B1 - 체지방 저하 기능성 락토바실러스 플랜타륨와 이를 함유한 식품 - Google Patents

체지방 저하 기능성 락토바실러스 플랜타륨와 이를 함유한 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체지방 감소 기능을 가진 유산균에 관한 것으로, 락토바실러스 플랜타륨 PL62 (Lactobacillus plantarum Strain PL62, KACC 91104)을 제공한다. 본 발명의 균주는 체지방 저하 기능성 식품으로 직접 사용하거나, 체지방 저하 기능성 식품의 첨가제로 사용될 수 있으며, 체지방 저하 기능성 발효식품의 발효 종균으로 사용할 수 있으며, 본 균주가 생산하는 체지방 억제 물질을 분리하여 사용할 수 있다. 또한 본 균주를 이용하여 발효식품을 제조할 경우 최대의 체지방 저하 효과를 낼 수 있는 조건을 제공한다.
체지방 저하, 지방세포, 비만, 유산균, 락토바실러스 플랜타륨, CLA, 요구르트

Description

체지방 저하 기능성 락토바실러스 플랜타륨와 이를 함유한 식품{Lactobacillus plantarum with body-fat reducing activity and the foods containing them}
도 1. L. plantarum Strain PL62의 CLA 생산을 확인한 가스크로마토그램
도 2. L. plantarum Strain PL62의 현미경 사진
도 3. L. plantarum Strain PL62의 16S rRNA 염기서열
도 4. L. plantarum Strain PL62의 Caco-2 세포 부착 실험
도 5. L. plantarum Strain PL62의 인체 장 정착성 실험
도 6. L. plantarum Strain PL62의 인체 경구 투여 후 분리된 집락의 PCR
도 7. L. plantarum Strain PL62의 투여 쥐의 체중 변화
도 8. L. plantarum Strain PL62를 9주차 투여 후 각군 쥐의 체중 비교
도 9. L. plantarum Strain PL62를 9주차 투여 후 각군 쥐의 장기 무게 비교
본 발명은 체지방 저하 기능을 가진 유산균을 제공한다.
또한 본 발명은 본 유산균의 생균, 사균, 파쇄된 세포벽 분획, 배양액, 배양 액 건조물, 체지방 감소 효과를 가진 CLA를 포함하는 배양액 추출물들과 이들을 포함하는 체지방 저하 기능성 식품과 식품 첨가제를 제공한다.
또한 본 발명은 체지방 저하 효과를 가진 유산균을 종균 또는 첨가제로 사용한 체지방 저하 기능성 식음료를 제공한다.
또한 본 발명은 본 유산균을 함유한 체지방 저하 효과의 복용제를 제공한다.
현대 사회에서 비만은 암보다 완치율이 낮은 질병으로 이로 인한 각종 성인병은 물론 이로 인한 사망률이 증가하고 있다. 미국에서는 "비만과의 전쟁"을 선포할 정도의 심각한 문제를 야기하고 있다. 비만 예방 및 치료의 효과가 있다고 주장되고 있는 물질로는 여러가지가 있으나 현재까지는 피부르산과 conjugated linelic acid (CLA)만이 과학적인 근거로 그 효능이 입증되고 있다 (Lenz TL, Hamilton WR.Supplemental products used for weight loss. 2004. J Am Pharm Assoc (Wash DC) 44:59-67). CLA의 체지방 감소 기전으로는 지방세포의 자살기전 유도로 지방세포수의 감소, 지방세포의 크기 감소, 에너지와 음식 섭취 감소, 지방 생산 감소, 에너지 소비 증가, 지방 분해 증가, 지방 산화 증가 등이 제안되고 있다 (Chardigny JM, Hasselwander O, Genty M, Kraemer K, Ptock A, Sebedio JL. 2003. Effect of conjugated FA on feed intake, body composition, and liver FA in mice Lipids. 38(9):895-902).
CLA (c9t11-octadecadienoic acid, t10c12-octadecadienoic acid)는 linoleic acid (LA, C18:2 cis9cis12)의 isomerization 과정을 통해 형성된다. CLA는 이중 결합의 위치에 따라 항산화효과, 콜레스테롤 저하효과, 성장 촉진 효과, 항암 효과를 가지는 것으로 알려져 있으며 최근에는 인체 혈장 지질과 체지방 감소 효과 등을 가지고 있는 것이 알려져 있다. 이것들은 동물의 고기와 유산균 발효유 등에 포함되어 있는 것으로 보고되어 있다. CLA의 이성질체중에서 특히 c9,t11-CLA의 체지방 감소 효과는 동물실험과 임상실험으로 이미 입증되어 있다. 가장 이상적으로는 c9t11과 t10c12가 동량 생산되는 것이 가장 좋다.
CLA를 생성하는 미생물 중 처음 발견된 것은 소와 같은 반추 동물에서 분리된 혐기성 미생물인 Butyrivibrio fibriosolvents로 LA의 biohydrogenation시 2단계를 거쳐 trans-11-octadecenoic acid를 생산한다. Linoleic acid isomerase의 작용으로 cis-9, trans-11-octadecadienoic acid를 생산하고 이어 생성된 conjugated acid의 hydrogenation으로 trans-11-octadecenoic acid를 생산한다.
최근 2004년의 노르웨이의 연구결과에 의하면 (Gaullier JM, Halse J, Hoye K, Kristiansen K, Fagertun H, Vik H, Gudmundsen 0. 2004. Conjugated linoleic acid supplementation for 1 y reduces body fat mass in healthy overweight humans. Am J Clin Nutr. 79(6):1118-1125) CLA를 1년간 180명의 과체중인 사람에게 1년간 투여한 결과 부작용이 없이 4~10%의 체중감소를 일으켰다.
본 특허에서는 체지방 감소 효과를 가지고 있는 t10c12를 과량 생산하는 한국형 유산균을 선별하고 동정하고, 이 균주의 장 정착성 등의 프로바이오틱으로써의 성질을 확인하고, 이 균주가 CLA를 최대로 생산 할 수 있는 조건, 이 균주로 동물실험을 수행하여 체중감소를 확인하여 체지방 감소 효과를 가지고 있는 유산균을 개발하였다.
따라서, 본 발명은 CLA를 생산하는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 균주는 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 PL62 (L. plantarum Strain PL62)로 이 유산균은 KACC 91104 로 기탁되어 있다. 또한, 상기 균주를 PCT 국제출원함에 따라 한국미생물보존센터에 2005년 5월 12일자로 KCCM-10655P로 재기탁되었다.
또한 본 발명은 체지방을 감소할 수 있는 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 체지방 감소를 유도함으로써 각종 성인병을 예방 혹은 치료하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 체지방 감소효과를 가진 CLA 생산을 극대화하는 조건을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 체지방 감소효과를 가지며 동시에 장 부착성, 내산 내담즙성이 우수한 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 프로바이오틱으로써 항생제 내성 전이가 없고, 인체에 안전한 유산균을 제공하는 것을 목적으로 한다.
유산균은 각종 조성물로 제제화 할 수 있으며, 바람직하게는 이 조성물은 캡슐, 정제 및 분말 등의 조성물 형태와 각종 식품 첨가에 용이한 형태도 바람직하다. 이러한 제제는 공지된 방법에 의해 제조상 허용되는 담체, 부형제, 용매 또는 보조제를 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 방법 및 성분은 잘 알려져 있으며, 표준 텍스트 및 매뉴얼, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 (Remington. 1995. The Science and Practice of Pharmacy. Mack Publising Co. Easton, PA 18042, USA)에 상세히 기재되어 있다.
또한 당 업계에 일반적으로 잘 알려진 방법에 의해 정장성 유산균 식품으로 제조할 수도 있다.
또한 당 업계에 일반적으로 잘 알려진 방법에 의해 발효 유제품을 포함한 발효식품의 종균 또는 첨가제로 사용하여 체지방 감소효과를 가진 식음료 제조에 사용할 수 있다.
또한 본 특허에서 제시한 조건을 사용하여 체지방 효과를 최대로 가지는 발효식품을 생산할 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 체지방 감소 기능성 식품을 제공한다.
또한 본 발명은 체지방 감소를 위한 락토바실러스 플랜타륨 PL62 (Lactobacillus plantarum Strain PL62, KACC-91105)을 제공한다.
또한 본 발명은 체지방 감소 효과를 이용하여 성인병 예방과 치료를 위하여 락토바실러스 플랜타륨 PL62 (Lactobacillus plantarum Strain PL62)가 1×106 CFU/g ∼ 1×1011 CFU/g 포함된 체지방 감소 기능 식품을 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 플랜타륨 PL62 (Lactobacillus plantarum Strain PL62)를 포함한 식음료 첨가제를 제공한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 플랜타륨 PL62 (Lactobacillus plantarum Strain PL62)를 이용한 발효식품에서 최대의 체지방 효과를 얻을 수 있는 조건을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
[실험예 1]
Conjugated Linoleic Acid(이하 CLA라 칭함) 생산 기능을 갖는 유산균의 검색
CLA를 생산하는 균주를 선발하기 위해 CLA의 기질인 LA가 함유된 배지에서 성장하는 유산균을 선별하고 이중에서 CLA 생산에 관여하는 효소인 isomerase 효소의 발현을 확인하였다.
＜재료 및 방법＞
리노레익산 (LA)이 첨가된 배지에서 성장하는 유산균을 1차적으로 선발하고 이들 유산균 중 CLA를 생산하는 유산균을 선별한다. 이를 위해 isomerase assay(Ogawa J, Matsumura K, Kishino S, Omura Y, and Shimizu S. 2001. Conjugated linoleic acid accumulation via 10-Hydroxy-12-octadecaenoic acid during microaerobic transformation of linoleic acid by Lactobacillus acidophilus. Appl. Envir. Microbiol. 67:1246-1252; T.Y. Lin, C.W. Lin, Y.J. Wang. 2002. Linoleic acid isomerase activity in enzyme extracts from Lactobacillus acidophilus and Propionibacterium freudenreichii ssp.Shermanii. J Food Sci. 67(4):1502-1505)를 이용하여 대량의 유산균으로부터 CLA 생산 균주를 쉽게 선별해 낸다. 먼저 0.1% LA가 포함된 MRS 배지에서 성장하는 유산균을 1차로 선별해 낸다. 다음 이들 유산균을 MRS broth에서 두번 계대 배양한 후 10 ml의 0.1% 의 LA가 포함된 MRS broth에 2일 동안 배양한다. 배양액 중 5 ml을 8,000 rpm, 10 min동안 원심 분리하여 cell을 모으고 이를 0.1 M potassium phosphate 완충용액으로 (pH 7.0)으로 두번 세척한다. 다시 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.0) 1.0 ml을 첨가한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 3분씩 냉장상태에서 파쇄하고 원심분리하여 crude enzyme solution을 얻는다. 기질용액 (0.1 ml LA, 2.7 ml 0.1 M potassium phosphate buffer, 0.2 ml 1,3-propanediol)에 준비된 crude enzyme solution을 첨가하고 233nm에서 흡광도를 측정한다.
＜결과 및 고찰＞
총 200 여종 이상의 유산균 중 isomerase assay를 이용하여 CLA를 생산하는 유산균을 선별하였다.
[실험예 2] 가스크로마토그래피를 이용한 CLA 생산 확인
Isomerase 효소를 발현하는 유산균이 실제로 CLA를 얼마나 생산하는가를 확인하기 위해서 가스크로마토그래피를 이용하여 CLA의 생산된 양을 측정하였다.
＜재료 및 방법＞
LA가 함유된 MRS 액체 배지에서 후보 유산균을 접종한 후 37℃에서 24-48시간 배양하였다. 4일간 배양한 배양 배지를 Heptadecanoic acid 와 chloroform: methanol로 추출하였다. sodium sulfate를 처리하여 시료의 수분을 제거하고 evaporation 시킨다. 준비된 시료에 1 N sodium hydroxide (in methanol)을 첨가한 후 100℃에서 15분 동안 saponification시킨다. 다음 4% HCl (in methanol)을 첨가하여 메칠화시킨다. 메칠화된 샘플에 hexane:water (1:1, v/v)을 첨가하여 혼합한 뒤 원심분리한다. 유기용매 층을 질소가스로 모두 날려 보내고 다시 이를 1 ml hexane에 녹여 준비한다.
본 발명에서 산화물의 제거 전과 후에 각각의 시료에 함유된 CLA 함량은 불꽃이온화검출기 (FID dector)가 장착된 가스 크로마트그래피(Hewlett Packard 5890 Series Ⅱ GC)를 사용하였고, 컬럼(DB FFAP capillary column)의 길이 30 m, 내경 0.25 μm, 필름 두께 0.25 μm의 모세관 컬럼을 사용하였다. 컬럼을 GC에 장착한 후 GC의 오븐온도는 210℃, 검출기의 온도는 270℃로 하였고, 주입부(injector)의 온도는 250℃ 로 하였고 운반용 기체는 헬륨 (1 ml/min)을 사용하였고 분해비 (split ratio)는 50:1로 하였다. 시료 주입량은 2 μl이고 각 피크의 면적은 기기에 연결된 적분계(3395, Hewlett Packard)를 이용하여 구하였다. CLA의 동정은 표준물질의 머무름 시간과 비교하여 확인하였으며 CLA의 함량을 계산하기 위해 내부표준물질로 Heptadecanoic acid를 이용하였다 (Lin, T.Y. 2000. Conjugated linoleic acid concentration as affected by lactic cultures and additives, Food Chemistry 69. 27-31).
＜결과 및 고찰＞
도 1의 가스크로마토 그램의 결과에 나타나 있듯이 분리된 유산균은 CLA의 c9t11과 t10c12 형태를 모두 생산하고 있었다. 체지방 효과를 가지고 있는 t10c12의 생산능력을 ppm으로 환산했을 때 43.22 ppm으로 이는 기존에 CLA를 생산하는 것을 보고된 L. reuteri 의 30 ppm(Lee SO, Kim CS, Cho SK, Choi HJ, Ji GE, Oh DK. 2003. Bioconversion of linoleic acid into conjugated linoleic acid during fermentation and by washed cells of Lactobacillus reuteri. Biotechnol Lett. 25(12):935-938), Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii 의 26.5 ppm과 비교하여 월등히 우수한 생산능력을 갖추고 있었다 (Jiang J, Bjorck L, Fonden R. 1998. Production of conjugated linoleic acid by dairy starter cultures. J Appl Microbiol. 85(1):95-102).
[실험예 3] 유산균의 동정 : 그람 염색, API kit를 이용한 동정, 16s rRNA 염기서열 분석, multiplex PCR
CLA 생산 유산균을 동정하기 위해 그람 염색시 그람 양성 막대균, 카타라아제 음성을 확인하였고, API kit를 이용하여 각종 생화학, 생리적 검사를 하였고 16S rRNA 염기서열을 분석하여 동정하였다. 또한 근연종간의 분류를 위해 group-specific primer를 이용한 multiplex PCR로 균을 동정하였다.
그람 염색
슬라이드에 세균을 도말하고 열고정시킨 후 crystal violet 용액을 가하여 약 1분간 반응시켰다. Iodine 용액을 처리하여 과량의 염료를 세척하고 다시 iodine을 가하여 1분간 처리하였다. 95% 에탄올로 30초간 탈색시컸다. 물로 2-3초 세척을 한 후 흡지로 물기를 제거하였다. 대응염색을 위하여 Safranin O 용액을 약 10-30초 처리하였다. 염료가 더 이상 녹아나오지 않을 때까지 조심스럽게 물로 세척하고, 흡지로 말린 후 유침오일을 한 방울 떨어뜨린 후 현미경 하에서 관찰하였다 (X 1000).
＜결과 및 고찰＞
도 2에 나타나 있듯이 CLA를 생산하는 유산균은 그람 양성 막대균으로 나타났다.
API kit을 이용한 생화학 생리적 특성 검사
균주가 순수 분리되었는지 확인하고 MRS 배지에서 30℃ 또는 37℃에서 24시간동안 배양하였다. MRS 배지에서 콜로니를 분리하기 전에 MRS broth에서 2회 이상 계대 배양한 후 사용하였다. Suspension medium 앰플을 개봉하고 면봉을 이용해서 매우 탁도가 높은 용액을 (heavy suspension)을 준비하였다. Suspension medium 5 ml에 준비된 균액을 몇 방울 떨구어 탁도를 McFarland 2로 맞추었다. 위와 같이 준비된 균이 함유된 API 50 CHL 배지를 스트립의 튜브에 분주하고 30℃또는 37℃에서 48시간 동안 호기적으로 배양하였다. API kit는 산이 생성되면 배지에 포함되어 있는 bromocresol purpul 지시약에 의해 배지의 색이 노란색으로 변한다. Esculin test (Tube No. 25)은 보라색에서 검은색으로 변하면 양성이다.
＜결과 및 고찰＞
표 1에 있듯이 API 50CH kit를 사용한 결과 L. plantarum (99.3%)로 판정되었다.
표 1. 유산균의 API CH50을 이용한 동정 결과
Figure 112004514305871-pat00001
16S rRNA 염기서열 분석을 이용한 동정
Genomic DNA를 분리하여 16S ribosomal DNA 부분을 증폭하여 증폭된 DNA단편을 전기영동으로 확인하였다. DNA 단편을 Qiagen PCR purification kit (Giagen,Hilden,Germany)으로 정제하여 d-Rhodamine dye-labeling dd-NTP를 포함하는 반응액과 혼합하여 sequencing PCR을 한 후 얻어진 DNA를 Ethanol/Sodium acetate 침전법을 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA를 TSR(Template Suppression Reagent)에 녹여 ABI prism 310 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems, U.S.A)로 분석하고 분석된 염기서열은 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 동정하였다.
＜결과 및 고찰＞
CLA 생산 유산균의 염기서열을 분석한 결과 (도 3) Lactobacillus plantarum 823/823 (100%)로 확인되었다.
[실험예 4] L. plantarum Strain PL62의 장 정착성
프로바이오틱으로써는 내산 내담즙성이 강하며 장세포 정착성이 우수하여야 하며 이를 인체 신체실험을 통해 장에 정착성을 확인하여야 한다.
내산성실험
선발 균주의 생존성에 대한 pH의 영향을 알아보기 위해 MRS (DeMan-Rogosa-Sharpe) 배지를 10 N HCl을 이용하여 pH를 7.0, 4.8, 4.5로 조정한 후 사용하였다. MRS 배지에 활성화된 균액(O.D=2.0)을 2% 수준으로 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후 흡광도를 600 nm에서 측정한 흡광도를 통하여 pH가 선발균주의 성장에 미치는 영향을 알아 보았다. PH 7.0의 0.D는 1/10으로 희석하여 잰 후 기록한다 (Conway PL, Gorback SL, Goldin BR. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy Sci. 70:1-12).
＜결과 및 고찰＞
저산성에서의 생존성을 실험한 결과 표 2와 같이 24시간 처리에도 생존성을 보여 내산성이 강함을 알 수 있었다.
표 2. L. plantarum Strain PL62의 내산성 실험 결과
Figure 112004514305871-pat00002
내담즙성실험
선발 균주의 성장에 미치는 담즙의 영향을 알아보기 위해 MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe) 배지에 ox-gall (OXOID)를 0.125%, 0.25% 농도로 첨가한 후 멸균하여 활성화된 균액(O.D=2.0)을 2%수준으로 접종하고 37℃에서 24시간 경과 후 흡광도를 600 nm에서 측정하였다. Bile 0%에서의 O.D는 1/10으로 희석하여 잰 후 기록하였다 (Ibrahim SA, Bezkorovainy A. 1993. Survival of bifidobacteria in the presence of bile salt. J. Sci. Food Agric. 62: 351-354).
＜결과 및 고찰＞
정상인의 소장의 담즙 농도는 0.06%로 이에 비해 농도가 훨씬 높은 0.250%의 담즙에서도 생존성을 보여 내담즙성이 매우 강한 것으로 나타났다.
표 3.
Figure 112004514305871-pat00003
장부착성 실험
인체 장에 부착하는 능력이 있는 지 알아보기 위해 인체 장표피세포 유래의 세포주인 Caco-2 세포에 부착시켜 보았다. 이를 위해 Caco-2세포주를 2.7 g/L의 소듐 바이카보네이트, 20%(v/v) fetal bovine serum (FBS) 및 안티바이오틱스 안티마이코틱스를 포함한 DMEM배지 (pH 7.0)에서 배양하였다. 30 mm 배양접시에 3×105세 포를 2 ml의 배양 배지에 접종하여 단일층으로 배양하였다. 배지는 2일에 한번 교환해 주었다. 6일간 배양 후 2 ml의 인산완충용액 (PBS)으로 세포 단일층을 2회 세척하였다. 1×107세포의 유산균을 배양배지 2 ml에 현탁시켜 배양접시에 첨가하고 37℃, 5% CO2-95% 공기 조건에서 배양하였다. 60~90분간 배양 후 세포를 멸균 PBS로 2회 세척하고, 메탄올로 10분간 고정시켰다. 그람 염색후 광학현미경 하에서 관찰하였다. 정량적 측정을 위해 100배 현미경상에서 20개의 필드를 관찰하였으며, 부착된 균수를 세어 Caco-2 세포 100개당 부착된 균수로 표기하였다 (Bibiloni R, Perez PF, DeAntoni GL. 1999. Anaerobe 5, 483-485; Edited by R.Fuller (1997) Probiotics 2, 10-22).
＜결과 및 고찰＞
도 5에 나타났듯이 L. plantarum Strain PL62은 Caco-2 세포에 부착 능력이 매우 뛰어났다. 이를 20개의 필드에서 각 필드당 부착된 세균 수를 계수하여 필드 당 부착된 세균수의 평균을 계산하면 필드당 8.49±0.98 유산균이 부착된 것이다.
이는 배양 접시 당 1000개 이상의 유산균이 세포에 부착한 것으로 기존의 알려진 유산균보다 장 정착성이 우수한 것으로 나타났다.
인체 장 장정착성 실험
실제 사람이 유산균을 복용하였을 때 장에 정착하는 지 여부를 확인하기 위하여 매일 하루 한번 L. plantarum Strain PL62을 1010 CFU를 8일간 경구투여하고 다음날 채변하여 MRS (with 1% bromo phenol blue, 30 ug/ml vancomycin)를 사용하 여 배양하였다. 48시간 배양 후 관찰된 유사 colony를 모두 그람 염색으로 관찰하고 subculture하여 순수분리 된 colony를 이용하여 Species-specific PCR을 수행하였다.
＜결과 및 고찰＞
도 5에 보이듯이 유산균을 섭취하고 1일 후부터 유산균이 검출되었으며 복용을 금지하고 5일까지 검출되었다. 검출된 유산균 집락은 species-specific PCR로 L. plantarum 로 확인되었다 (도 6). 이것은 L. plantarum Strain PL62이 장에 정착되는 것을 보여주는 증거이며, 특히 도 6에 보이듯이 L. plantarum Strain PL62을 복용한 뒤부터 장내 세균총이 단순해 지는 것으로 미루어 정장작용도 있음을 알 수 있었다.
[실험 예 5] 유산균의 안전성 실험
인체 복용을 위해서 유산균의 안전성을 실험하여야 한다. 이를 위해 암모니아, 인돌, 용혈독소 등 유해 물질 생산 여부와 유해 효소 존재 여부를 확인하였다.
용혈 현상 검사
Sheep blood Agar 배지에 L. plantarum PL62를 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였을 때 α-hemolysis만 있었으며 β-hemolysis는 관찰되지 않았다.
젤라틴 액화 반응 검사
MRS gelatin 배지(0.3 g beef extract, 0.5 g peptone, 12 g gelatin, 100 ml MRS broth)로 사면배지를 만들어 L. plantarum PL62를 접종하여 35℃에서 6주간 배양한다. 접종하지 아니한 대조구와 함께 4℃에서 4시간 정도 냉각시켜 젤라틴 액 화 여부를 확인하였을 때 액화를 보여주지 않아 젤라틴 분해효소가 없는 것이 확인되었다.
암모니아 생성 확인
Urea agar 배지(20 g urea, 5 g NaCl, 2 g KH2PO4, 1 g peptone, 1 g glucose, 12 mg phenol red, 100 ml 증류수)를 여과멸균 한 후 한천 15 g을 증류수 900 ㎖에 녹여 습윤멸균을 한 후 섞어 총 부피를 1 ℓ로 맞춘다 (pH 6.9 ). 여기에 L. plantarum PL62를 접종하고 37℃에서 12시간 정도 배양하여 배지 색의 변화를 확인하였다. L. plantarum PL62는 배지색이 노란색을 띈 음성으로 암모니아를 생성하지 않는 것으로 판명되었다.
인돌 생성 확인
0.1% Tryptone을 함유된 MRS agar에 L. plantarum PL62를 접종하고 18시간 정도 배양한다. 여기에 Kovac's reagent (10 g p-dimethylaminobenzaldehyde, 150 ml buthanol, 50 ml hydrocholic acid)를 5방울 정도 가해 색의 변화를 관찰하였을 때 색의 변화가 없어 인돌이 생성되지 않음을 확인할 수 있었다.
페닐알라닌 탈아민 조사
MRS 배지에 D,L-phenylalanine 0.2 % 첨가하여 L. plantarum PL62 을 접종하고 24시간 정도 배양하였다. 여기에 5-10방울의 10% ferric chloride를 떨어뜨려 사면 배지 위로 흘러내리게 하여 1-5분 안에 색의 변화를 관찰한다. 양성인 경우 생성된 phenylpyruvic acid에 10% ferric chloride와 반응이 되어 녹색으로 변한다. L. plantarum PL62는 음성으로 나타났다.
β-glucuronidase 확인 검사
p-nitrophenyl-β-D-glucuronide을 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 에 0.2% 되도록 용해시켰다. L. plantarum PL62를 Ab600= 4으로 phosphate buffer에 잘 부유시켜 현탁액을 만들어 200 ㎕ 현탁액에 기질이 있는 buffer 200 ㎕를 첨가하여 37℃에서 16시간 처리한다. 배양액의 색이 노랑으로 변하면 양성으로 판독하였을 때 음성이었으며 원심 분리하여 상등액을 405 nm에서 측정하였을 때 0.078로 나타났다.
Nitroreductase activity 확인 검사
MRS 액체배지에서 하룻밤 배양된 L. plantarum PL62를 3,000X g에서 10분간 원심분리하여 균체를 모아 5분간 sonication(초음파 분해) 시켰다. 상등액에 4-nitrobenzoic acid (final conc. 30 ㎍/㎖)와 trichloroacetic acid (final conc. 0.21%)을 첨가하여 37℃에서 한 시간 처리하고, sodium nitrite (final conc. 0.007%)을 첨가하고 실온에서 20분간 처리하였다. Ammonium sulfamate (final conc. 0.04%) 첨가하고 실온에서 3분간 처리한다. NEDD (N-(1-naphtyl)ethylenediamine dihydrochiolide) (final conc. 0.35%) 를 첨가하고 4℃에서 발색시켜 540 nm spectrophotometer로 하였을 때 음성으로 나타났다.
이때 양성반응은 1 ㎍/㎖ 4-aminobenzoic acid을 첨가하여 비교하였다.
항생제 내성
프로바이오틱은 항생제에 내성이 강할수록 장내 생존성이 높아지므로 항생제 내성이 강할수록 좋다. 하지만 이들 내성이 전달 될 경우 내성 문제를 야기할 수 있어 다른 균으로의 내성 전이를 확인하였다.
표 4. L. plantarum PL62의 항생제 내성
Figure 112004514305871-pat00004
항생제 내성의 전이 확인
항생제내성의 전이를 확인하기 위해 filter binding assay를 수행하였다 (givers, D., G. Huys, and J. Swings.2003. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from lactobacillus islates to other Gram-positive bacteria. FEMS Microb. Letters 225:125-130). L. plantarum PL62을 mid-exponential phase (대략 4-5시간)까지 배양시켜 이의 1 ml와 1 ml의 E. faecalis CCARM 5110를 혼합하여 멸균된 cellulose acetate filter에 여과시키고 PPS (peptone physiological saline solution)로 세척하였다. 여과지를 non-selective agar medium 위에 올려 37℃에서 16시간 배양시킨다. 여과지에 성장한 균체를 2 ㎖ 의 PPS로 세척해서 떨어뜨리고 이를 다시 희석하여 각각의 항생제가 함유된 Enterococcosal 선택배지에 접종하여 37℃에서 24-48시간 배양시켜 내성 E. faecalis를 확인하였으나 내성 E. faecalis는 발견되지 않아 내성이 전이되지 않음을 확인하였다.
[실험예 6] CLA 생산을 위한 최적 조건
CLA를 최대로 생산하기 위한 LA의 농도와 기질의 종류를 알아내었다.
CLA를 최대로 생산하기 위한 LA의 농도
고농도의 LA는 균 자체의 성장을 억제하기 때문에 고농도로 배지에 첨가할 수 없다 (Jenkins JK, Courtney PD. 2003. Lactobacillus growth and membrane composition in the presence of linoleic or conjugated linoleic acid. Can J Microbiol. 2003 49(1):51-57.). 또한 배지에 소요되는 LA를 절약하기 위해 최대 CLA 생산을 얻을 수 있는 LA의 농도를 확인하였다.
＜재료 및 방법＞
Skim milk 배지와 MRS 에 배지에 각각의 농도가 되도록 수용성 LA ester를 첨가하고 하룻밤 배양하여 배지 내에 생산된 CLA 양을 확인하였다. 이를 위해 배양액내의 지질을 추출하여 메칠화시킨 뒤 GC를 이용하여 측정하였다. 이를 위해 20 ml 배양액에 heptadecanoic acid 1000 ppm와 chloroform:methanol (2:1) 200 ml을 첨가하고 glass bead를 첨가하여 5분간 강하게 흔들어 5분간 균질화 시킨다. 이를 6,000 rpm에서 15분 동안 (4℃) 원심 분리하여 두 층을 분리한다. 유기 용매층의 수분제거를 위해 sodium sulfate로 처리하고 evaporation하여 유기용매를 날려 보 내고 질소가스로 건조시킨다. 건조시킨 시료에 1 N sodium hydroxide(methanol)을 3 ml 첨가한 후 100℃에서 15분 동안 saponification(비누화)시킨다. 이때 테프론 처리된 screw-capped test tube를 사용하고 parafilm으로 뚜껑을 잘 감싸준다. 여기에 4% HCl (methanol)을 6 ml 첨가한 후 20분 동안 메칠화 시킨다. 메칠화된 시료에 2 ml hexane:water(1:1, v/v)을 섞어 약 10분 정도 강하게 혼합한 후 8,000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리한다. 유기용매층을 취한 후 질소가스로 이용하여 모두 건조시켜 1 ml hexane에 용해시킨다.
＜결과 및 고찰＞
표준물질인 heptodecanoic acid의 peak area를 100으로 했을 때의 peak area를 계산하면 적어도 100 ppm 이상의 LA가 배지에 첨가되었을 때 CLA 생산이 충분히 발생하였다 (표 5). 또한 1000 ppm과 500 ppm 첨가된 경우 CLA 생산량에 큰 차이가 없었다. 즉 CLA를 생산하기 위해서는 LA를 100∼1000 ppm을 첨가하는 것이 바람직하며 비용과 효율면에서는 500 ppm이 가장 적합하였다.
표 5. 배지에 첨가된 LA 농도에 따른 CLA 생산 정도
Figure 112004514305871-pat00005
CLA 최대 생산을 위한 유화제 첨가 조건
유화제를 첨가하여 배지내 LA가 배양액과 잘 혼합되게 하면 CLA 생산이 증가 하는지 알아보았다. 이를 위해 Skim milk 배지와 MRS 배지에 LA 농도가 0.1%가 되도록 첨가하였다. 이때 첨가되는 LA를 LA, LA salt 형태, LA와 Tween-80 (0.2%)의 세가지 형태로 첨가하고 하룻밤 배양하여 L. plantarum PL62의 CLA 생산 능력을 확인하였다. CLA의 양은 위에서 언급한 방법을 사용하여 배양액내의 지질을 추출하여 메칠화시킨 뒤 GC를 이용하여 측정하였다.
＜결과 및 고찰＞
배지에 첨가된 LA의 용해도를 높이기 위해 Tween 80을 첨가한 경우가 salt 형태의 LA를 첨가한 경우에 비해 3배 이상의 t10c12의 CLA를 생산하였다(표 6). 이는 배지에 LA 첨가 시 유화제를 첨가하여 LA 용해도를 높이는 것이 중요한 것을 밝혀내었다.
표 6. Tween80첨가가 CLA 생산에 미치는 영향
Figure 112004514305871-pat00006
CLA 생산 유도를 위한 선배양 시 유화제 첨가 조건
L. plantarum Strain PL62을 직접 복용하거나 종균형태, 혹은 첨가제로 사용하여 복용 즉시 최대로 CLA를 생산하게 하기위한 경우, 배양 배지에 LA를 넣어 배양한 경우와 앞의 CLA 생산 조건과 같은 Tween80 첨가로 LA의 용해도를 증가시킨 조건이 효율적인 지 비교 확인 하였다. 이를 위해 종균의 선 배양시 LA salt 첨가 배지, LA와 Tween80 0.01%, LA와 Tween80 0.1%, LA와 Tween80 0.2%, LA와 Tween80 0.5%를 첨가하였다. 이렇게 선 배양된 L. plantarum Strain PL62을 CLA 생산 배지 (0.1% LA 함유된 skim milk)에서 배양하여 생산된 CLA 양을 측정하였다.
＜결과 및 고찰＞
상업 목적의 대량 배양에 사용되는 skim milk 배지 (훼이 배지)에서 CLA를 최대로 생산하기 위해서는 L. plantarum Strain PL62을 먼저 0.1% LA와 이를 배지에 잘 혼합되도록 Tween-80 이 0.1%~0.5% 함유된 skim milk에서 배양하여 CLA 생산능력을 유도한 경우가 CLA 생산능력이 가장 좋았다 (표 7). 0.2% Tween80가 첨가된 경우 0.5% 첨가된 경우보다 CLA 생산능력이 높은 것은 0.5% Tween80에 의한 유산균 성장 억제 때문으로 생각되었다.
표 7. L. plantarum Strain PL62의 배지 내 LA의 용해를 위한 Tween80 농도에 따른 CLA 생산 능력
Figure 112004514305871-pat00007
CLA 최대 생산을 위한 당 첨가 조건
CLA 생산을 최대로 하기 위한 당의 종류를 찾아내었다. 이를 위해 0.1% LA가 첨가된 skim milk 배지에 과당, 설탕, 유당을 각각 6%가 되도록 배지에 첨가하여 CLA 생산 정도를 측정하였다.
＜결과 및 고찰＞
과당을 첨가했을 경우 가장 CLA 생산이 높았으며 다음으로 설탕과 유당이었으며, glucose와 lactose 첨가의 경우 CLA 생산이 오히려 감소하였다 (표 8).
표 8. 여러가지 당에 의한 CLA 생산량의 변화
Figure 112004514305871-pat00008
[실험예 7] CLA 생산 L. plantarum Strian PL62를 투여한 쥐의 체중 및 장기의 무게 변화
CLA 생산 L. plantarum Strian PL62를 투여한 쥐의 체중 변화
고지방 식이를 투여하면서 0.1% LA와 0.2% Tween-80이 첨가된 배지에서 배양된 L. plantarum Strian PL62을 skim milk를 부형제로 사용하여 동결건조 시킨 것을 마리당 109 CFU/1일 과 107 CFU/1일 투여하여 체중의 변화를 관찰하였다.
＜재료 및 방법＞
C57BL/6N (Charles river laboratory animal facility, USA)를 4마리씩을 한 군을 형성하여 실험하였다. 제 1군은 보통 식이(Purina rodent chow #5057 (3.28 cal/g))를 투여한 군, 제 2 군은 고지방 식이 (Research diet 45% high fat diet D12451 (5.252 cal/g))를 투여한 군 (Research diet 45% high fat diet D12451 (5.252 cal/g)), 제 3군은 고지방 식이와 부형제인 skim milk를 투여한 대조군, 제 4군은 고지방 식이와 L. plantarum Strain PL62을 고농도로 투여한 군 (109 CFU/day), 제 5군은 고지방 식이와 L. plantarum Strain PL62을 저농도로 투여한 군 (107 CFU/day)으로 나누어 실험하였다. 3 주령인 쥐에 고지방식이와 물을 마음껏 먹게 하고 매일 몸무게의 변화, 급여된 식이의 양을 측정하였다. 9주차에 해부하여 내장 지방과 각 주요장기의 무게를 측정하였다.
＜결과 및 고찰＞
L. plantarum Strain PL62을 고농도로 투여한 군 (109 CFU/day)은 4주차에서 통계적으로 유의적이지는 못하나 control에 비해 3 g 이상 체중 증가가 적었으며 8주차에는 통계적으로 유의성을 보이게 체중 증가가 적었다 (표 9, 도 8, 도 9). 표 9의 자료와 같이 4주차 일반 식이 투여군의 평균 체중은 22.3 g, 고지방 식이군의 평균 체중은 25.5 g, 부형제인 skim milk 투여군의 경우 25.7 g 이었으나 L. plantarum Strain PL62의 고농도 투여군의 경우 22.5 g, 저농도 투여군의 경우 23.8 g 이었다. 이는 고농도 투여군이 고지방 식이군에 비하여 3.2 g 체중 증가가 적었으며 이는 12.4% 만큼 체중 증가가 적은 것에 해당된다. 저농도 투여군의 경우도 고지방 식이군에 비해 1.9 g 체중 증가가 적은 것으로 이는 7.3% 만큼 체중 증 가가 적은 것에 해당된다. 8주차에서는 부형제인 skim milk 투여군의 평균 체중이 34 g인 것에 비해 고농도 투여군은 30.5 g으로 3.5 g 의 감소 (10.2%)를, 저농도 투여군의 평균 체중은 30.2g으로 3.8 g (11.1%)의 체중 감소를 보였다.
표 9. L. plantarum Strain PL62을 투여한 쥐의 체중 변화
Figure 112004514305871-pat00009
CLA 생산 L. plantarum Strian PL62를 투여한 쥐의 장기 무게 변화
8 주 투여 후 쥐를 해부하여 내장 지방과 각 장기의 변화를 관찰한 결과를 표 10에 표기하였다. 신장, 비장, 뇌, 간 등 주요 장기의 무게는 콘트롤과 차이가 없었다. 이에 반해 신장주변, 서혜부, 부고환등 내장 지방이 축적되는 장기의 무게 는 유산균 투여균에서 확실하게 감소되었다. 즉, 신장 주변의 경우 0.83 g 에서 0.63 g과 0.62 g으로 0.2 g (25%) 감소되었고, 서혜부 역시 1.4 g 에서 1.17g 가 1.16 g 으로 0.23 g (16.43%) 감소를 보였다. 부고환의 경우 1.77 g에서 1.63과 1.47 g 으로 0.14g(7.9%)과 0.3g(16.9%)이 감소되어 L. plantarum Strain PL62의 체중감소가 내장 지방의 감소에 의한 것을 알 수 있었다.
표 10. L. plantarum Strain PL62을 투여한 쥐의 장기의 무게 변화
Figure 112004514305871-pat00010
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 (L. plantarum Strain) PL62는 체지방 감소 효과를 가지고 있어 비만에 의한 질환을 예방 혹은 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 L. plantarum Strain PL62 건조물과 L. plantarum Strain PL62 균주 배양여액, 배양여액 건조물은 각종 식음료의 첨가제로 사용되어 체지방 예방 및 치료하는 용도로 사용할 수 있어 모든 비만 관련 관련 질환 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다. 또한 본 L. plantarum Strain PL62을 이용한 발효식품은 체지방 감소 효과에 의한 비만 예방 및 치료의 목적으로 사용할 수 있다.
또한 본 발명에서는 발견한 CLA 최대 생산을 위해 LA가 함유된 배지에서 선 배양을 해야 하며, L. plantarum Strain PL62을 이용한 발효식품이 최대의 체지방 효과를 갖기 위해서는 LA는 100∼1000 ppm, Tween80는 1∼0.01%, 탄수화물 기질은 과당과 설탕이 적합하다.

Claims (14)

  1. LA(linoleic acid)를 기질로 사용하여 CLA(conjugated linoleic acid)의 이성질체인 c9t11(cis-9,trans-11-octadecadienoic acid(18:2))과 t10c12(trans-10,cis-12-18:2)를 생산하는 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 PL62(Lactobacillus plantarum Strain PL62) KCCM-10655P.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 PL62(Lactobacillus plantarum Strain PL62) KCCM-10655P의 생균 또는 건조균을 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 CLA 생산용 조성물.
  5. 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 PL62(Lactobacillus plantarum Strain PL62) KCCM-10655P를 유산균 배양 배지에서 선배양함을 특징으로 하는 CLA 생산방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유산균 배지는 0.01~1.0 중량% LA를 포함함을 특징으로 하는 CLA 생산방법.
  7. 제6항에서, 상기 유산균 배지는 0.01~0.5 중량% Tween 80을 포함함을 특징으로 하는 CLA 생산방법.
  8. 제6항에서, 상기 유산균 배지는 6 중량% 과당 또는 설탕을 포함함을 특징으로 하는 CLA 생산방법.
  9. 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 PL62(Lactobacillus plantarum Strain PL62) KCCM-10655P의 생균 또는 건조균을 첨가제로 포함함을 특징으로 하는 체지방 저하 기능성 식품.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식품은 요구르트, 치즈, 김치, 고추장 또는 된장을 포함하는 발효식품이거나 건강보조식품임을 특징으로 하는 체지방 저하 기능성 식품.
  11. 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 PL62(Lactobacillus plantarum Strain PL62) KCCM-10655P 균주를 종균으로 사용하여 제조됨을 특징으로 하는 유제품.
  12. 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 PL62(Lactobacillus plantarum Strain PL62) KCCM-10655P 균주를 발효종균으로 사용하여 제조됨을 특징으로 하는 곡물발효제품.
  13. 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 PL62(Lactobacillus plantarum Strain PL62) KCCM-10655P 균주의 생균, 건조균 또는 상기 균주의 배양여액 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 복용제.
  14. 제13항에 있어서, 복용제의 적량은 평균체중이 60kg인 사람이 락토바실러스 플랜타륨 스트레인 PL62(Lactobacillus plantarum Strain PL62) KCCM-10655P 균주를 1일 1~2회 섭취하고, 1회에 1×106~1×1011 CFU를 섭취하는 것임을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 복용제.
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