KR100443080B1

KR100443080B1 - 콜레스테롤 저하능을 갖는 스트렙토코커스 페시움 균주

Info

Publication number: KR100443080B1
Application number: KR10-2002-0040450A
Authority: KR
Inventors: 김기원; 김태용; 강병화; 권혁상; 유정수; 양은희
Original assignee: 일동제약주식회사
Priority date: 2002-07-11
Filing date: 2002-07-11
Publication date: 2004-08-04
Also published as: KR20040007855A

Abstract

본 발명은 혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 스트렙토코커스 페시움 (Streptococcus faecium) 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소장에서 콜레스테롤의 흡수를 저해하여 혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 스트렙토코커스 페시움 균주 및 상기 균주를 함유하는 콜레스테롤 저하제 또는 식품에 관한 것이다. 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는 혈중 콜레스테롤을 감소시키는 작용이 우수할 뿐만 아니라 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하여 발효유, 건강보조식품 및 의약품 등의 다양한 유산균제품에 사용될 수 있다.

Description

콜레스테롤 저하능을 갖는 스트렙토코커스 페시움 균주{Streptococcus faecium having activity of reducing cholesterol}

본 발명은 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하고 혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 스트렙토코커스 페시움(Streptococcus faecium) 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소장에서 콜레스테롤의 흡수를 저해하여 혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 스트렙토코커스 페시움 균주 및 상기 균주를 함유하는 콜레스테롤 저하제 또는 식품에 관한 것이다.

유산균이 생균활성제(probiotics)로서 유용한 효과를 나타내기 위해서는 장에 도달하여 증식할 수 있어야 한다. 이를 위해서는 내산성 및 내담즙산성 뿐만 아니라 장내 정착성이 우수해야 한다. 기존의 유산균주 개발은 이러한 내산성, 내담즙산성 및 부착능에 관한 연구가 주류를 이루었다. 그러나 최근에 유산균 연구가 활발해지면서 유산균의 항암효과, 면역활성효과, 특정 유해균(대장균, 헬리코박터 파이로리 등)에 대한 저해효과, 혈압강하효과 및 혈중 콜레스테롤 저하능 등 유산균의 특수 기능에 관한 관심이 높아지고 있다.

유산균에 의한 콜레스테롤 흡수의 저하 기작은 보통 세 가지로 설명되어 질 수 있다. 첫번째는 유산균이 장내에 정착 증식하면서 콜레스테롤을 흡착하여 배설시키는 것이고 두번째는 유산균이 담즙산을 흡착하여 배설시키는 것이다. 이런 경우 콜레스테롤은 담즙산의 전구체이므로 부족한 담즙산을 보충하기 위해 콜레스테롤을 이용하게 되어 결과적으로 장내 콜레스테롤 농도를 감소시킬 수 있다. 그리고 세번째 기작은 유산균이 포합담즙산을 탈포합시키는 작용이다. 간에서 생성된 프리 담즙산(free bile acid)은 소장에서 타우린 또는 글라이신과 결합하여 포합담즙산(conjugated bile acid)이 된다. 포합담즙산은 지질 용해도가 높아 소장에서 콜레스테롤 등의 지질 흡수를 용이하게 한다. 그러므로 포합담즙산이 많은 경우 혈중으로 흡수되는 콜레스테롤양이 많아져 혈중 콜레스테롤 농도가 높아진다. 그러나 탈포합된 담즙산(deconjugated bile acid)은 지질용해도가 낮아 콜레스테롤등 지질의 혈중 이행을 저하시키는 작용을 한다. 따라서 포합담즙산을 탈포합시키는 담즙산 분해효소(bile salt hydrolase)를 갖는 균주는 지질 용해도를 낮추어 소장에서 콜레스테롤의 흡수를 저하시킬 수 있다.

미국특허 5,516,684(1996년)에 따르면 유산균의 탈포합 활성이 높으면 지질의 용해도를 감소시켜 콜레스테롤 뿐만 아니라 비타민 등의 다른 지질 영양성분도 흡수를 저하시켜 영양의 불균형을 초래하고 설사를 유발할 수 있다고 하였다. 또한 탈포합된 담즙산은 소장에서는 거의 흡수되지 않고 대장으로 이동되어 발암물질인 2차 담즙산으로 전환될 수 있다고 지적하였다. 따라서 콜레스테롤 저하 유산균은 담즙산을 탈포합시키는 활성은 없으면서 콜레스테롤 흡착능이 우수한 균주가 바람직하다고 하였다. 그러나 다카하시(J. Dairy. Sci.1994, 77:3275∼3286)는 일반 유산균에서는 7-알파-디하이드록실라제(7-alpha-dehydroxylase)의 활성이 없으므로 2차 담즙산 생성에 직접 관여하지 않는다고 보고하였다. 콜레스테롤 저하 유산균주에 의한 콜레스테롤과 담즙산의 대사와 관련되는 부작용이나 발암성분의 상관성은 아직 명확히 밝혀져 있지 않아 동물 또는 인체시험을 통해 더많은 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다. 따라서, 부작용 없으면서도 한국인 체질에 맞는 콜레스테롤 저하 기능을 갖는 균주를 개발하여 이를 이용한 의약품 또는 식품을 개발하는 것이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 한국인 모유 영양아의 분변에서 분리된 균주로 높은 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성을 가질 뿐만 아니라 장내에서 콜레스테롤을 흡착하고 배설시켜 혈중 콜레스테롤을 감소시킬 수 있는 기능이 우수한 균주를 선별하고, 상기 균주를 콜레스테롤 저하효능과 정장효능을 특징으로 하는 발효유, 건강보조식품 그리고 의약품에 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하고 소장에서 콜레스테롤 흡착능이 우수하여 혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 스트렙토코커스 속균주 및 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하제 또는 식품을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 ID9201 균주 투여에 의한 10주간 혈중 콜레스테롤 농도변화를 나타낸 그래프이고,

A : ID9201 균주 투여 군, C : 551번 균주 투여 군,

E : 대조군(control), G : 맹검군(Blank)

도 2는 표 5와 같이 실험한 각 시험군에서의 분변 유산균수를 나타낸 그래프이고,

A, B, F : ID9201 균주 투여 군, C, D : 551번 균주 투여 군,

E : 대조군(control), G, H : 맹검군(Blank)

도 3은 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 ID9201 균주의 전자현미경 사진(5,000 배)이며,

도 4는 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 ID9201 균주의 핑거프린팅과 종특이 중합연쇄반응 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.

M : DNA 사이즈 마커, 19433 : 스트렙토코커스 페칼리스 ATCC 19433,

19434 : 스트렙토코커스 페시움 ATCC 19434,

ID9201 : 스트렙토코커스 페시움 ID9201,

S. 페칼리스 : 스트렙토코커스 페칼리스 종특이 프라이머를 사용하여 PCR 수행,

S. 페시움 : 스트렙토코커스 페시움 종특이 프라이머를 사용하여 PCR 수행

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하고, 혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 스트렙토코커스 속 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하용 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하고, 혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 균주는 스트렙토코커스 속 균주를 제공하는 것이고, 상기 균주는 스트렙토코커스 페시움인 것이 바람직하다.

본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는 단쇄, 쌍쇄 또는 연쇄구균의 모양을 가지며(도 3참조), 그램 양성, 카탈라제 음성 균주이고, pH 9.6, NaCl 6.5%, 45℃ 및 SF 아가에서 생육한다(표 1).

구 분	판 정	구 분	판 정
그램 염색	+	글루코스로부터 가스	+
세포 형태	구균(cocci)	성장(pH 9.6)	+
운동성(Motility)	-	성장(6.5% NaCl)	+
엔도스포어(Endospore)	-	성장(45℃)	+
조건 혐기성 (Facultative anaerobe)	+	성장(15℃)	+
카탈라제(Catalase)	-	성장(SF 아가)	+

또한, 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주의 생리 생화학적 특성은 하기표 2와 같다. 또한, 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는서열번호 15로 기재되는 1,520 bp의 염기서열을 포함하는 16S rRNA 유전자를 갖고 있다.

시험 항목	판 정
피루베이트로부터 아세톤	+
히푸레이트(Hippurate) 가수분해	+
β-글루코시다제(β-glucosidase)
Pyrrolidonyl arylamidase	+
α-갈락토시다제	-
β-글루코로니다제	-
β-갈락토시다제	+
알카라인 포스파타제	-
류신 아릴아미드화(Leucine arylamidation)	+
아르기닌 디하이드로라이시스(Arginine dihydrolysis)	+
리보스	+
L-아라비노스	+
만니톨	+
소비톨	±
락토스	+
트레할로스	+
인슐린	-
라피노스	-
전분	±
글리코젠	-
베타-용혈반응	-

본 발명의 바람직한 실시예에서 분리한 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하고 소장에서 콜레스테롤 흡착능이 우수한 균주를 '스트렙토코커스 페시움 ID9201'로 명명하고, 이를 2001년 9월 6일 자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCCM-10313).

본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주를 콜레스테롤 함유 배지에서 배양하면, 콜레스테롤이 균체에 흡착되어 배양여액 중 남아있는 콜레스테롤의 양이 급격히 줄어든다(표 3참조). 또한, 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주를 콜레스테롤과 함께 랫트에 투여하면 본 발명의 균주를 투여하지 않거나 또는 다른 균주를 투여한 군에 비하여 혈중 콜레스테롤 양이 급격히 감소한다(표 4및표 6참조). 상기와 같은 혈중 콜레스테롤 저하는 사료 섭취량 또는 체중 차이의 의한 영향이 아니라 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주에 의한 것임을 알 수 있다(표 7참조). 또한, 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는 우수한 장내 정착성을 나타내며, 상기와 같은 우수한 장내 정착성이 혈중 콜레스테롤을 감소시킨다. 또한, 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는 내산성 균주로 알려진 락토바실러스 GG보다 우수한 내산성 및 내담즙산성을 나타낸다(표 8참조). 따라서 본 발명의 균주는 위산의 산과 소장의 담즙산에 대한 높은 내성을 나타내기 때문에 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는 경구투여하였을 때 장내에서 높은 생존율을 나타내어 효과적으로 작용한다.

또한, 본 발명은 상기 스트렙토코커스 페시움 균주를 유효성분으로 함유하는콜레스테롤 저하제를 제공한다.

Stamler등(Arch. Pathol. Lab. Med .,1988, 112:1032-1040)은 혈중 콜레스테롤이 감소하면 심장질환을 예방 또는 치료할 수 있다 하였고, Sindelka등(Physiol. Res., 2002, 51:85-91)은 혈중 콜레스테롤이 비만, 당뇨병 및 고혈압에도 관련이 있다고 하였다. 따라서 본 발명의 콜레스테롤 저하제는 콜레스테롤을 저하시킴으로써 콜레스테롤과 관련된 질병의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있고, 특히 비만, 당뇨병, 고혈압 및 심장질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는 임상투여시에 경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는 실제 임상투여시에 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 스트렙토코커스 페시움 균주에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는 독성이 없는 안정한 균주이며, 유효용량은 1 x 10⁸∼ 40 x 10⁸균수/kg 이고, 바람직하기로는 10 x 10⁸∼ 20 x 10⁸균수/kg 이며, 하루 1~3 회 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 스트렙토코커스 페시움 균주를 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하용 식품을 제공한다. 본 발명의 콜레스테롤 저하용 식품은 콜레스테롤 관련 질병의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있고, 특히 비만, 당뇨병, 고혈압 및 심장질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주를 식품으로 사용할 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 균주를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 발효유, 요구르트, 치즈, 우유 음료 또는 분유로 제조하는 것이 바람직하고, 발효유, 요구르트, 음료수, 분유, 식품첨가물, 또는 건강보조식품인 것이 더욱 바람직하다.

유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주를 식품 또는 음료의 제조시에 상기 특정식품 소재 1 g(또는 ㎖) 당 본 발명의 균을 1 x 10⁷내지 10 x 10⁸개(균수) 첨가하고, 바람직하게는 1 x 10⁸내지 5 x 10⁸개의양으로 첨가한다. 본 발명의 균주의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 유산균의 분리

본 발명자들은 콜레스테롤 저하능을 갖고 내산성과 내담즙산성을 갖는 균주를 분리하기 위하여, 한국인 유아의 분변 및 소, 돼지, 개 등의 소화기관에서 균주를 분리하였다. 구체적으로, 유아분변은 이유식을 하지 않는 유아의 신선한 분변을 사용하였다. 채변 즉시 혐기용액(Mitsuoka수)에 넣고 일정량 희석하여 분석배지에 도말하였다. 포유동물로는 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐, 염소 그리고 토끼 등을 사용하였다. 도살 직후 각 동물의 소화기관(위장, 소장, 대장)을 채취하고 각 장기 내부의 표피를 긁어내고 내용물을 혐기용액으로 희석하여 분석배지에 도말하였다. 그리고 어류, 염장류, 유제품, 그리고 유산균 제제 등은 내용물을 균질기로 균질화시키고 혐기용액으로 희석하여 분석배지에 도말하였다. 유산균 분리용 분석배지는 0.5% 담즙산을 포함하는 MRS 아가(pH 3.0)를 사용하여 내산성과 내담즙산성을 갖는 균주를 분리하였다. 분석배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양하여 가급적 집락의 모양과 크기가 다른 집락을 분리하여 총 2,047 균주를 분리하였다.

<실시예 2> 콜레스테롤 저하균주의 1차 선별

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 균주 중 시험관 내에서 콜레스테롤 저하 효능을 갖는 균주를 선별하기 위하여 분리균주를 0.3% 옥스갈(oxgall)과 콜레스테롤원으로 10% BCS(bovine calf serum)가 함유된 MRS 배지(최종 콜레스테롤 농도 100 ㎍/㎖)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 종료된 배양액은 원심분리하여 배양여액을 취한 후 배양여액 중 남아있는 콜레스테롤 농도를 측정하였다. 콜레스테롤 농도는 O-프탈알데하이드 방법(O-phthalaldehyde method; Lipid Res14:364-3 66. 1973)을 적절하게 변형하여 측정하였다. 배양여액 400 ㎕가 들어있는 에펜돌프 튜브에 5% KOH 200 ㎕와 95% 에탄올 300 ㎕를 첨가하고 혼합하여 60℃에서 10분간 반응시켰다. 반응액은 실온에서 냉각한 후 핵산 500 ㎕를 넣고 격렬히 혼합시킨 후 실온에서 10분간 방치하였다. 층분리가 일어나면 핵산층을 새로운 에펜돌프 튜브에 옮기고 증발기(evaporator)를 이용하여 핵산용매를 증발시켰다. 완전히 증발시킨 후 O-프탈알데하이드 용액(0.5 ㎎ O-프탈알데하이드/아세트산 1 ㎖) 300 ㎕를 넣고 실온에서 10분간 반응시켰다. 여기에 진한 황산 200 ㎕를 첨가하고 격렬히 혼합한 후 10분간 방치하였다. 붉은 색의 발색 정도를 550 nm에서 측정하여 흡광도(O.D)가 대조군에 비하여 30% 이상 낮은 균주를 1차로 선별하였다. 콜레스테롤 저하율은 다음과 같다.

콜레스테롤 저하율(%) = ( 1 - 시험군 O.D / 대조군 O.D ) X 100

(시험군: 분리균을 배양한 배양여액의 콜레스테롤 O.D; 대조군: 균을 배양하지 않은 배양여액의 콜레스테롤 O.D)

그 결과, 콜레스테롤 저하능을 갖는 1차 선별균주로 200 균주를 분리하였다

<실시예 3> 콜레스테롤 저하균주의 2차 선별

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 1차 선별한 200 균주 중 냉장 또는 냉동 보관시 활성이 낮아지거나 생육이 안되는 균주 또는 계대배양시 불안정한 생육을 보이거나 활성이 낮아지는 균주를 배제하기 위하여 3차에 걸쳐 계대배양하면서 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 콜레스테롤 저하율을 측정하였다.

그 결과, 1차 선별 균주 중 계대배양시 배양상태가 양호하고 재현성 있게 30% 이상 콜레스테롤 저하율을 보이는 균주 100주를 2차로 선별하였다.

<실시예 4> 콜레스테롤 흡착 균주의 선별

본 발명자들은 상기 실시예 3에서 선별된 100 균주 중 콜레스테롤 흡착율이 높은 균주를 선별하기 위하여 균체에서 콜레스테롤 농도를 측정하였다. 균체에 흡착된 콜레스테롤 농도 측정은 그릴의 방법(Grill,Current Microbiology 33:187-193. 1996)을 약간 변형하여 실시하였다. 상기 실시예 2와 동일하게 배양한 배양액에서 배양액 4 ㎖에 해당하는 균체를 수거한 후 인산염 완충용액(0.1M, pH7.0)으로 3회 세척하여 균체에 묻어 있는 콜레스테롤을 제거하였다. 세척된 균체에 증류수 400 ㎕를 넣고 균질화시켰다. 상기 균질화된 용액은 실시예 2에 기술된 O-프탈알데하이드 방법을 이용하여 콜레스테롤 농도를 측정하였다.

그 결과, 배양여액에서 콜레스테롤을 30% 이상 재현성있게 저하시키고 균체에서 추출된 콜레스테롤 흡광도가 0.3 이상인 균주를 선별하였다(표 3).

균주 No.	분리원	균모양	콜레스테롤 감소율 (%)	균체 흡착량(O.D)
균주 No.	분리원	균모양	1차	균체 흡착량(O.D)	2차	3차	4차
49	고양이 소장	중간균	35	30	32	37	0.441
50	고양이 소장	단간균	35	50	31	43	0.306
351	닭 장	단간균, 긴간균	40	40	20	33	0.470
355		반듯한 간균	45	30	30	30	0.284
367		구균	40	30	24	24	0.353
492	오이지	단 중간균	40	40	23	20	0.434
493		단 중간균	40	30	20	40	0.470
496		단 중간균	40	30	22	26	0.423
519	유아분변	연쇄 구균	30	30	46	40	0.356
551	유아분변	단간균	35	50	40	25	0.401
316	대조군		<20	<20	<20	<20	0.10

* 대조군으로 사용한 균은 배양여액에서 콜레스테롤 저하효과가 없었던 균주임.

<실시예 5> 선별균주의 혈중 콜레스테롤 저하능 평가시험

본 발명자들은 상기 실시예 4에서 선별된 10 균주 중 분리원 및 형태가 다른 6균주에 대해서 동물시험을 진행하여 생체내 환경에서 콜레스테롤 농도 저하율이 높은 균주를 선별하고자 하였다. 구체적으로, 시험동물은 5주령 SD 랫트 암컷을 사용하였으며 군당 3 마리씩 사육하였다. 대조군의 사료는 콜레스테롤이 0.5% 함유된 사료를 사용하였으며 음용수는 시험균이 들어 있지 않은 2.0% 탈지 분유를 사용하였다. 시험군의 사료는 콜레스테롤이 0.5% 함유된 사료를 사용하였으며 음용수는 랫트 당 하루에 6억개의 균이 함유된 2.0% 탈지분유를 사용하였다. 그리고 맹검군은 콜레스테롤이 없는 일반 사료와 균체가 들어있지 않은 일반 수돗물을 사용하였다. 콜레스테롤 사료는 콜레스테롤(5-cholesten-3β-ol, Fluka) 0.5 g을 물 15 ㎖에 현탁하고 20분간 초음파로 균질화 시킨 후 일반사료 100 g에 혼합하여 사료 전체에 골고루 묻힌 다음 50℃에서 약 4시간 건조시켜 사용하였다. 이 사료를 군당 1일 60 g씩 급식하였다. 그리고 균체 투여는 그람당 60억인 균 원료 0.3 g(18억)을 멸균된 2% 탈지분유에 현탁시킨 후 음료병에 넣고 음용수로 투여하였다. 투여량은 군당 1일 50 ㎖씩 투여하였다. 혈중 콜레스테롤 농도를 측정하기 위하여 매주 랫트의 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 2시간 동안 실온에 방치시킨 후 원심분리(6000 rpm/20 min)하여 혈청을 분리하였다. 혈청 20 ㎕에 콜레스테자임(에이겐 화학) 300 ㎕를 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨 후 ELISA 리더로 500 nm에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 이용하여 콜레스테롤 농도를 측정하였다.

그 결과, 6균주 중 519번 균주를 투여한 랫트의 6주 후 혈중 콜레스테롤 농도는 초기농도 대비 10% 증가하여 30% 증가한 대조군에 비하여 유의성 있게 낮은 증가율을 보였다. 이러한 결과를 보인 519번 균주를 콜레스테롤 저하균주로 최종 선별하고 "ID9201"라 명명하였다. 그 외 균주들은 대조군과 유사하거나 높은 증가율을 보여 혈중 콜레스테롤 저하효과가 없었다. 각 균주의 6주 후 혈중 콜레스테롤 농도 및 증가율은 하기표 4와 같다.

구 분	혈중 콜레스테롤 농도 (㎍/㎖)
구 분	초기농도	6주 후 농도	^b증가율(%)
49	493 ±16	750 ±82	52 ±24
355	517 ±11	682 ±10	32 ±1
367	513 ±25	658 ±13	28 ±7
493	508 ±26	668 ±19	31 ±3
519	551 ±32	^a602 ±32	^a10 ±5
551	568 ±20	708 ±19	25 ±1
대조군	539 ±27	700 ±19	30 ±3
맹검군	488 ±8	^a559 ±16	15 ±5

^ap<0.05 (대조군과의 유의성)

^b증가율=(6주 농도-초기농도) X 100/초기농도

<실시예 6> ID9201 균주의 생체내 효능 평가 시험

본 발명자들은 상기 실시예 5와 같이 동물시험에서 혈중 콜레스테롤 저하효능을 갖는 균주로 최종 선별된 ID9201 균주에 대한 생체내 효능시험을 평가하였다. 생체내 효능시험은 ID9201 균주의 투여 균수에 의한 콜레스테롤 농도 변화와 랫트에서의 장내 정착성 및 음용수로 사용되는 탈지분유의 영향도 알아보았다.

<6-1> 생체내 효능 평가 방법

시험군은 콜레스테롤 사료와 시험균을 투여한 군으로 A, B 군은 ID9201 균주의 투여 농도에 의한 영향을 본 것이며 C, D군은 551번 균주의 투여 농도에 의한 영향을 본 것이다. 그리고 대조군 중 E군은 콜레스테롤 사료를 투여하고 시험균 대신 유당을 투여한 대조군이며 F군은 일반사료에 ID9201균주를 투여한 군으로 시험균만 투여했을 때 혈중 콜레스테롤 농도에 미치는 영향을 본 것이며 G군은 시험균 현탁액으로 사용되고 있는 탈지분유에 의한 영향을 본 것이다. ID9201 균주 생체내 효능 평가를 위한 시험 디자인은표 5와 같다.

구 분	균주	그룹	개체수	사 료	투여균수(억/day/군)
시험군	ID9201	A	6	0.5% 콜레스테롤 첨가된 사료	20
	ID9201	B	6		60
	551	C	6		20
대조군	대조군	E	6		락토스
	ID9201	F	6	일반사료	20
	맹검군	G	3	일반사료	_

<6-2> 혈중 콜레스테롤 농도 측정 및 결과

콜레스테롤 사료 조제 방법과 시험균 투여 방법 및 콜레스테롤 농도 측정은 실시예 5와 동일한 방법으로 수행하였다. 또한, 매주 체중변화 및 사료와 음료 섭취량을 기록하였다. 각 시험군 별 6주 후 혈중 콜레스테롤 농도 증가는 하기표 6와 같고 10주간 혈중 콜레스테롤 농도 추이는도 1에 나타내었다.

구 분	혈중 콜레스테롤 농도 (㎍/㎖)
구 분	초기농도	6주후 농도	b증가율(%)
A	533 ±16	^a826 ±29	^a55 ±6
B	518 ±26	^a852 ±20	^a64 ±11
C	479 ±14	906 ±26	89 ±8
D	501 ±24	882 ±45	76 ±17
E	515 ±19	980 ±32	90 ±6
F	541 ±39	^a716 ±36	^a32 ±5
G	517 ±19	^a709 ±64	^a37 ±5

^ap<0.05 (control과의 유의성)

^b증가율=(6주농도-초기농도) X 100/초기농도

그 결과, 6주후 대조군(E)의 콜레스테롤 농도가 980 ㎍/㎖으로 가장 높았고 ID9201 투여군(A, B)은 815∼850 ㎍/㎖, 551번 균주투여군(C, D)은 880∼900 ㎍/㎖, 그리고 콜레스테롤 사료를 투여하지 않은 군(F, G)은 700 ㎍/㎖의 농도를 보였다. ID9201 투여군은 대조군(E)에 비해서 17% 저하된 콜레스테롤 수치 감소효과를 보였다. 또한 초기 농도 대비 증가율에 있어서도 대조군은 6주경에 최고 90%까지 상승하였으나 ID9201 투여군은 50∼60%상승하여 약 40%의 콜레스테롤 감소효과를 보여 대조군 보다 유의성 있게 낮은 콜레스테롤 증가를 보였다. 그리고 ID9201균 20억 투여군(A)이 60억 투여군(B)과 유사하거나 약간 우수한 결과를 보여 투여 균수(20억 또는 60억/day/군)에 의한 콜레스테롤 저하율의 차이는 없는 것으로 보였다. 이는 일정 균수 이상에서는 동일한 효과를 나타낼 수 있는 것을 의미한다. 551번 균주 투여군(C, D)은 대조군과 유사하게 80∼90%정도의 증가를 보여 콜레스테롤 농도 저하효과가 없었다. 그리고 일반사료에 ID9201균을 투여한 대조군(F)과 균 현탁액으로 사용한 2% 탈지분유만 투여한 대조군(G)은 30∼40%의 증가율을 보여 이들간에는 유의성이 없었으나 대조군보다는 유의성 있게 낮은 콜레스테롤 농도를 보였다.

<6-3> 체중 증가량과 사료 섭취량

시험에 사용된 랫트는 사료와 음료섭취 조건이 다르나표 7과 같이 체중 증가량과 사료 섭취량은 각 시험군간에 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 혈중 콜레스테롤 저하가 사료 섭취량 또는 체중차이에 의한 영향이 아니라 균주에 의한 영향이 크다는 것을 의미한다고 볼 수 있다.

구 분	체 중 (g)	사료섭취량(g)	^a소화율(%)
구 분	초 기	사료섭취량(g)	^a소화율(%)	6주 후	증가량(g)
A	148 ±2	368 ±2	220 ±3	826	27
B	144 ±6	374 ±10	230 ±11	825	28
C	142 ±3	381 ±8	240 ±7	835	29
D	152 ±4	353 ±8	202 ±9	814	25
E	148 ±4	376 ±11	228 ±9	814	28
F	144 ±4	359 ±8	215 ±8	818	26
G	152 ±3	382 ±9	231 ±10	859	27
H	150 ±0	360 ±1	210 ±11	856	25

^a소화효율=체중증가량 X 100/사료 섭취량

<6-4> 균주 정착성 분석

시험균을 투여한 랫트에서 투여균의 장내 정착성을 보기 위하여 분변 균수를 측정하였다. 각 군에서 2시간 동안 분변을 수거하여 건조시킨 후 1.0% 펩톤수로 희석하고 MRS 아가에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 집락을 계측하였다.

그 결과, ID9201을 투여한 군(A, B, F)은 분변 균수가 15억/g 이상이었고 551번 균주를 투여한 군(C, D)은 5∼6억/g으로 상대적으로 적은 균수를 나타내었으며 균을 투여하지 않은 대조군(E)과 맹검군(G,H)은 2억/g 미만이었다(도 2). 이는 ID9201 균주의 장내 정착성이 551번 균주보다 우수하다고 볼 수 있다. 또한 이런 장 정착성의 차이가 혈중 콜레스테롤 농도 증가율을 감소시키는 것을 나타낸다.

<실시예 7> 내산성 및 내담즙산성 비교시험

일반적으로 균주가 혈중 콜레스테롤을 농도를 감소시키는 효능을 나타내려면 높은 생존율이 요구되며 이를 위해서 위산의 산과 소장의 담즙산에 대한 내성이 높아야 한다. ID9201균주의 내산성과 내담즙산을 평가하기 위해 내산성과 내담즙 시험을 실시하였다. 내산성 시험은 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.0)을 10% HCl 용액으로 pH 2.3, 3.0 및 7.0으로 보정한 용액에 MRS 배지에서 24시간 배양된 균 배양액을 넣고 30분, 60분 및 120분 방치한 후 혐기용액(Mitsuoka수)으로 적절하게 희석하고 MRS 아가에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정하여 평가하였다. 내담즙산 시험은 0.1M 인산염 완충용액(7.0)에 옥스갈(sigma)을 각각 0.1, 0.3, 0.5 및 1.0% 농도로 첨가한 용액에 MRS 배지에서 24시간 배양된 균배양액을 넣고 30분, 60분 및 120분 방치한 후 혐기용액으로 연속희석하고 MRS 아가에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정하여 평가하였다.

그 결과, ID9201 균주는 pH 2.3 용액에서 120분 방치 후 85% 생존율을 보여 내산성 균주로 알려진 락토바실러스(Lactobacillus) GG 65%보다 우수한 내산성을 보였다(표 8). 또한 내 담즙산도 88% 생존율로 락토바실러스 GG 66%보다 우수하였다.

균주	생존율 (%)
	pH	옥스갈(%)
	7.0	3.0	2.3	0.5	1
ID9201	100	90	85	108	88
GG	100	70	65	95	66

<실시예 8> ID9201 균주의 동정

상기 실시예로써 혈중 콜레스테롤 저하균주로 최종 선별된 ID9201균주에 대해서 베르기 방법(Bergey's manual)과 API에 따른 동정시험을 실시하였다. 일반생리시험 중 카탈라제(Catalase) 테스트는 배양액 200 ㎕를 원심분리하여 균체를 얻고 균체에 3% 과산화수소 용액 200 ㎕를 반응시켜 기포가 생성되는지를 관찰하였다. 대조군으로는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)균주를 사용하였다. 생육시험은 ID9201 균주를 MRS 액상배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 혐기조건으로 전배양한 후 전배양액을 각 생육조건의 MRS 본배양 배지에 10%(v/v) 농도로 재접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 각 배양조건에서 생육여부는 탁도로 판별하였다. 베르기 방법에 따른 ID9201의 균주 특성은표 1과 같다.

ID9201은 단쇄, 쌍쇄 또는 연쇄구균의 모양을 가지며 그램 양성, 카탈라제 음성 균주이므로 스트렙토코커스 속에 속하는 것으로 볼 수 있다(도 3). 또한, pH 9.6, NaCl 6.5%, 45℃ 및 SF 아가에서 생육하는 것으로 보아 스트렙토코커스 중에서도 엔테로코커스 속에 속하는 것으로 보인다. 더욱 상세한 균주 동정을 위해서 API Strep20 킷트(API biomerieux, France)를 사용하였다. API Strep20 판독결과표 2에 따라 ID9201 균주는 스트렙토코커스 페시움 균주로 동정되었다(상동성 98.4%).

<실시예 9> ID9201 균주의 DNA 핑거프린팅(fingerprinting) 및 종특이 중합연쇄반응 분석

본 발명자들은 상기 실시예 8에서 ID 9201이 스트렙토코커스 페시움 균종으로 판명되었으나, 이를 유전자 수준에서 확인하고 동정하기 위해 ID9201의 유전자 특성을 알아보았다.

<9-1> 중합연쇄반응 샘플의 준비

ID9201 균주를 BHI(Brain Heart Infusion) 고체 배지에 접종하고 37℃에서 2일간 배양하여 활성화시킨 후 지름 2 ㎜ 정도의 단일 콜로니를 취하여 탁도가 680 ㎚ 파장에서 0.8∼1.0 정도가 되게 멸균수에 현탁시켜 -20℃에서 저장하였다. 이와 같이 준비한 현탁액을 중합연쇄반응 샘플로 사용하였다.

<9-2> DNA 핑거프린팅(fingerprinting)

중합연쇄반응 샘플은서열번호 1로 기재되는 P32-A 프라이머와서열번호 2로 기재되는 P32-T 프라이머를 1:1 비율로 섞은 혼합 프라이머와 결합시켜 중합연쇄반응법으로 증폭시켰다(Cusicket al.,Appl. Environ. Microbiol.2000,66: 2227∼2231). 상기의 중합연쇄반응 혼합물로부터 얻은 핑거프린팅 유전자 분획물은 1.0% TAE(40mM Tris-acetate, 1mM EDTA) 완충액을 사용하여 1.5% 아가로스겔 상에서 전기영동 방법으로 결과를 확인하였다.

그 결과, 0.1∼1.6kb 사이에 5∼10개 정도의 유전자 분획물을 가지며 약 1.3, 0.4, 0.3, 0.2 kb에서 주요 분획물이 나타났다(도 4). 이런 핑거프린팅은 스트렙토코커스 페칼리스 기준균주인 ATCC19433 보다는 페시움 기준균주인 ATCC19434에 유사하지만 0.4∼1.0kb 사이의 주요 분획물 일부가 결손된 양상을 보여 유사 균주로 판단되었다.

<9-3> 종특이 중합연쇄반응

종특이 중합연쇄반응은 중합연쇄반응 샘플을표 9의 스트렙토코커스 페칼리스 종특이 프라이머와 스트렙토코커스 페시움 종특이 프라이머와 각각 결합시켜 중합연쇄반응법으로 증폭시켰다. 상기의 중합연쇄반응 혼합물로부터 얻은 핑거프린팅 유전자 분획물은 1.0% TAE(40mM Tris-acetate, 1mM EDTA) 완충액을 사용하여 0.75% 아가로스 겔 상에서의 전기영동 방법으로 결과를 확인하였다.

이름	균종	염기서열	부착온도(℃)	결과물(bp)
ID3-F	스트렙토코커스 페칼리스	서열번호 3	62	260
ID3-R		서열번호 4
ID4-F	스트렙토코커스 페시움	서열번호 5	62	263
ID4-R		서열번호 6

그 결과, ID9201은 ID3-F/R 프라이머를 이용한 페칼리스 종특이 중합연쇄반응 결과 스트렙토코커스 페칼리스 기준균주인 ATCC19433과 동일한 표적 밴드(260 bp)를 생산하지 않은 반면, ID9201은 ID4-F/R 프라이머를 이용한 페시움 종특이 중합연쇄반응 결과 스트렙토코커스 페시움 기준균주인 ATCC19434와 동일한 표적 밴드(263 bp)를 생산하였다(도 4). 따라서 ID9201균주는 스트렙토코커스 페시움균으로 판단되었다.

<실시예 10> ID9201 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석

<10-1> 중합연쇄반응 샘플의 준비

ID9201 균주를 BHI(Brain Heart Infusion) 고체 배지에 접종하여 37℃에서 2일간 배양하여 활성화시킨 후 지름 2 ㎜ 정도의 단일 콜로니를 취하여 탁도가 680 ㎚ 파장에서 0.8∼1.0 정도가 되게 멸균수에 현탁시켜 -20℃에서 저장하였다. 이와 같이 준비한 현탁액을 중합연쇄반응 샘플로 사용하였다.

<10-2> 염기 배열 분석을 위한 DNA의 준비

16S rRNA 유전자의 중합연쇄반응 샘플은표 10의서열번호 7로 기재되는 ID8-F와서열번호 8로 기재되는 ID8-R 프라이머를 1:1 비율로 섞은 혼합 프라이머와 결합시켜 중합연쇄반응법으로 증폭시켰다. 상기의 중합연쇄반응 혼합물로부터 얻은 16S rRNA 유전자 분획물을 1% TAE(40mM Tris-acetate, 1mM EDTA) 완충액을 사용하여 0.75% 아가로스 겔 상에서의 전기영동 방법으로 분리하였다. 에티디움-브로마이드 염색 및 UV 조사 후 원하는 DNA 단편이 있는 겔을 일정한 크기로 절단하여 유전자크린 키트(Geneclean kit, Bio101)를 사용하여 DNA를 정제하고BamHI과XhoI 제한효소로 이중 절단하여 pcDNA3.1/ Hygro(+)(5.6kb) 플라스미드 벡터에 연결하였다. 16S rRNA 유전자를 함유하는 플라스미드(pcDNA3.1/Hygro(+)-ID9201 16S rDNA, 7.1kb)로 대장균 숙주세포를 형질전환시킨 후 형질전환된 세포만을 선별하여 대량 배양함으로써 원하는 플라스미드를 대량 확보하였다. 확보된 플라스미드는 다시 유전자 크린 키트로 정제하였으며 16S rRNA 유전자 단편은표 10의서열번호 9로 기재되는 T7-F와서열번호 10으로 기재되는 BGH-R,서열번호 11로 기재되는 ID8S1-F와서열번호 12로 기재되는 ID8S1-R, 그리고서열번호 13으로 기재되는ID8S2-F와서열번호 14로 기재되는 ID8S2-R 등 세쌍의 프라이머를 사용하여 염기 배열을 분석하였다.

이름	목표	위치	염기서열
ID8-F	16S rRNA	1∼ 19	서열번호 7
ID8-R	16S rRNA	1501∼1520	서열번호 8
T7-F	pcDNA3.1	·	서열번호 9
BGH-R	pcDNA3.1	·	서열번호 10
ID8S1-F	16S rRNA	479∼ 496	서열번호 11
ID8S1-R	16S rRNA	943∼ 961	서열번호 12
ID8S2-F	16S rRNA	943∼ 961	서열번호 13
ID8S2-R	pcDNA3.1	·	서열번호 14

<10-3> 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석

ID9201 샘플에서 유래된 16S rRNA 유전자는서열번호 7로 기재되는 ID8-F와서열번호 8로 기재되는 ID8-R 프라이머를 이용하여 증폭하고,서열번호 10으로 기재되는 BGH-R,서열번호 11로 기재되는 ID8S1-F와서열번호 12로 기재되는 ID8S1-R 및서열번호 13으로 기재되는 ID8S2-F와서열번호 14로 기재되는 ID8S2-R 등 세쌍의 프라이머로 시퀀싱(염기 서열반응)을 수행하였다. 염기서열 반응은 싸이클 시퀀싱 키트(cycle sequencing kit; Perkin Elmer)와 염료 종결제(dye terminator; Perkin Elmer)를 사용하여 실시하였고 16S rRNA 유전자 염기 서열은 ABI 프리즘 310 자동 DNA 서열 분석기(automatical DNA sequencer)를 사용하였다. ID9201 16S rRNA 유전자는서열번호 15로 기재되고, 1,520bp의 염기서열을 갖는다. 16S rRNA 유전자와 이미 알려진 세균의 16S rRNA 유전자 염기 서열과의 유사성은 블라스트유사성 조사 프로그램(Blast similarity search program : National Institute of Biotechnology Information)으로 계산하였다. 이 염기서열은 스트렙토코커스 페시움 NCFB947T의 16S rRNA 염기서열과 비교했을 때(Blast2) 전체 1,459 bp 중 오직 3군데만 차이가 있었다(99.8% 상동성). 이 염기서열은 GenBank에 AY057055의 번호로 등록되어 있다. ID9201의 분자생물학적 동정을 위하여 GenBank에 등록된 9개의 속(Genus)과 24개의 스트렙토코커스 종(Species), 그리고 10개의 스트렙토코커스 페시움 주(Strain)의 16S rRNA 유전자 서열들과 함께 각각 다중 서열 정렬을 진행한 후 계통수(phylogenic tree)에서의 위치를 판별하였다. 다중 서열 정렬 프로그램(multiple sequence alignment program)은 ClustalX를 사용하였다. 계통수 상에서 ID9201 16S rRNA 유전자는 스트렙토코커스 페시움에 가장 가까운 위치에 배치되었다.

상기 실시예 8, 9 및 10과 같이 ID9201균주를 생리 생화학적 특성 및 분자생물학적 특성으로 동정한 결과, 이 균주는 스트렙토코커스 페시움균으로 동정되었다. 본 발명자들은 상기 균주를 '스트렙토코커스 페시움 ID9201'로 명명하고, 이를 2001년 9월 6일 자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 : KCCM-10313).

<제제예 1> 건강보조식품 제조

본 발명자들은 스트렙토코커스 페시움 ID9201 균주를 주 성분으로 함유하는건강보조식품을 하기와 같이 제조하였다.

스트렙토코커스 페시움 ID9201 균주 500㎎(10 x 10⁸cfu/g)

치옥토산아미드 2 ㎎

니코틴산아미드 3 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

유당 490 ㎎

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 그리고 캡슐제형으로 제조하였다.

<제제예 2> 의약품의 제조

본 발명자들은 스트렙토코커스 페시움 ID9201 균주를 주 성분으로 함유하는 의약품을 하기와 같이 제조하였다.

스트렙토코커스 페시움 ID9201 500 ㎎ (10 x 10⁸cfu/g)

락토바실루스 아시도필루스 100 ㎎ (10 x 10⁸cfu/g)

비피도박테리움 롱검 100 ㎎ (10 x 10⁸cfu/g)

유당 100 ㎎

백당 100 ㎎

만니톨 80 ㎎

포도당가공품(prim) 18 ㎎

구연산 1.5 ㎎

PVP K--30 0.3 ㎎

황색4호 0.2 ㎎

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 세립제형으로 제조하였다.

<실험예 1> 마우스에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 Balb/c 마우스를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 대조 균주로는 락토바실러스 GG(Lactobacillus. GG)균을 사용하였다. 군당 10 마리씩의 동물에 본 발명의 균주를 배양 후 균체를 수거하여 각각 2% 탈지분유 용액에 현탁하였다(2000억/㎖). 균체현탁액 100 ㎕를 마우스(25g)에 8일(2회/일) 연속 경구투여 하였다. 시험균 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기를 관찰하였다. 시험결과, 시험균을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었다. 혈액 검사시 시험균은 검출되지 않았으며 , 혈액생화학 검사등에서도 독성변화는 관찰되지 않았고 체중변화도 없었다. 이상의 결과 ID9201은 모든 마우스에서 160 x 10¹⁰cfu/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 160 x 10¹⁰cfu/kg 이상인 안전한 균으로 판단되었다.

<실험예 2> 마우스에 대한 복강투여 급성 독성실험

6주령의 Balb/c 마우스를 사용하여 복강 투여 급성독성실험을 실시하였다. 대조 균주로는 MIC 표준균주인 S. 페시움(S. faecium)MD 8b균을 사용하였다. 군당 4 마리씩의 동물에 본 발명의 균주를 BHI 액상배지에서 배양 후 균체를 수거하여 각각 BHI 액상배지에 현탁하였다. 상기 현탁액을 BHI 액상배지로 희석하여 2000억/㎖, 1000억/㎖, 500억/㎖ 그리고 250억/㎖로 조절된 균체현탁액 100㎕를 마우스(25g)에 단회 복강투여하였다. 시험균 투여 후 7일간 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하였다. 시험결과, LD₅₀균 농도는 ID 9201의 경우 750억/㎖으로 S. 페시움 MD 8b균의 250억/㎖ 보다 3배 이상 높은 것으로 나타났다. ID9201의 복강 투여 최소치사량(LD₅₀)은 30 x 10¹⁰cfu/kg 이상인 안전한 균으로 판단되었다.

마우스에 대한 복강 투여 급성시험

	ID9201투여농도( x 10⁸/마우스)	S.페시움 MD8b투여농도( x 10⁸/마우스)
	25	50	100	200	25	50	100	200
죽은 마우스의 수	0/4	0/4	1/4	4/4	2/4	4/4	4/4	4/4
폐사율(%)	0	0	25	100	50	100	100	100

<실험예 3> ID9201의 병원성 유전자 진단 시험

S. 페시움의 병원성 인자로는gelE(gelatinase activity), agg(aggregation protein), esp(immune evasion protein), 그리고ccf(conjugation) 유전자 등이 알려져 있다(Applied and Environmental Microbiology, 2001, 1628-1635). 각각의 유전자에 대해 통상의 방법으로 제작된 프라이머로 ID9201균주의 병원성 인자를 진단하였다.

시험결과, ID9201은gelE유전자를 비롯한 다른 병원성 인자를 가지고 있지 않는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때 ID9201은 알려진 병원성인자를 갖고 있지 않는 안전한 균으로 판단되어 진다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 스트렙토코커스 페시움 균주는 장내 정착성, 내산성 및 내담즙산성이 우수하고 소장에서 콜레스테롤 흡착능이 우수하기 때문에 음식물 섭취에 의한 혈중 콜레스테롤 증가를 감소시킬 수 있었고, 경구투여시 독성이 나타나지 않고 분자생물학적 시험에서도 병원성 인자 등이 확인되지 않아 안전하게 콜레스테롤 저하효능과 정장효능을 특징으로 하는 발효유, 건강보조식품 및 의약품 등에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> IL DONG PHARM CO., LTD. <120> Streptococcus faecium having activity of reducing cholesterol <130> 2p-02-19 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P32-A <400> 1 cagcagccgc ggtaatac 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P32-T <400> 2 cagcagccgc ggtaattc 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID3-F <400> 3 gctttccctt cggggacaaa gt 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID3-R <400> 4 tttgcatgac ctcgcggtct agcg 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID4-F <400> 5 atagagcttc cccttcgggg gcaa 24 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID4-R <400> 6 agctttaaga gattagctta gcctgcgg 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8-F <400> 7 gggggatcca gagtttgatc ctggctca 28 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8-R <400> 8 gggctcgagt accttgttac gacttcacc 29 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-F <400> 9 taatacgact cactataggg 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGH-R <400> 10 tagaaggcac agtcgagg 18 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8S1-F <400> 11 ctgttcatcc cttgacg 17 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8S1-R <400> 12 atgctccacc gcttgtgc 18 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8S2-F <400> 13 gcacaagcgg tggagca 17 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ID8S2-R <400> 14 cacctactca gacaatgcg 19 <210> 15 <211> 1520 <212> DNA <213> Streptococcus faecium ID9201 <400> 15 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60 gcttcttttt ccaccggagc ttgctccacc ggaaaaagag gagtggcgaa cgggtgagta 120 acacgtgggt aacctgccca tcagaagggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt 180 ataacaatca aaaccgcatg gttttgattt gaaaggcgct ttcgggtgtc gctgatggat 240 ggacccgcgg tgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcca cgatgcatag 300 ccgacctgag agggtgatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga 360 ggcagcagta tggaatcttc ggcaatggac gaaagtctga ccgagcaacg cccgcgtgag 420 tgaagaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttagaga agaacaagga tgagagtaac 480 tgttcatccc ttgacggtat ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 540 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg 600 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactggga 660 gacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata 720 tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa 780 gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 840 agtgttggag ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 900 gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 960 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctttgacca 1020 ctctagagat agagcttccc cttcgggggc aaagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1080 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttgttagttg 1140 ccatcattca gttgggcact ctagcaagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1200 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggaagta 1260 caacgagttg cgaagtcgcg aggctaagct aatctcttaa agcttctctc agttcggatt 1320 gcaggctgca actcgcctgc atgaagccgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg 1380 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1440 cccgaagtcg gtgaggtaac ctttttggag ccagccgcct aaggtgggat agatgattgg 1500 ggtgaagtcg taacaaggta 1520

Claims

혈중 콜레스테롤 저하능을 갖는 스트렙토코커스 페시움 ID9201 균주(수탁번호 : KCCM-10313).
제 1항의 균주를 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하제.
제 1항의 균주를 유효성분으로 함유하는 콜레스테롤 저하용 식품.
제 3항에 있어서, 상기 식품은 발효유, 요구르트, 음료수, 우유 음료, 식품첨가물 및 건강보조식품으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식품.