WO2014021205A1 - 新規乳酸菌 - Google Patents

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improving
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愛郎 立垣
泰三 川辺
田中　穂積
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株式会社カネカ
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Definitions

  • the present invention relates to a novel lactic acid bacterium belonging to Enterococcus faecium species, a composition containing the lactic acid bacterium, a fatigue improving agent, a blood flow improving agent, a stool odor improving agent, or a growth comprising the composition as an active ingredient.
  • the present invention relates to any of the accelerators and the use of the composition in foods.
  • lactic acid bacteria have attracted attention as a component (so-called functional component) that exerts physiological activity beneficial to humans and animals. So far, it has been known that oral administration to humans and animals exerts various physiological activities depending on strains such as intestinal regulating action, antiallergic action, cholesterol reduction action, blood pressure lowering action and the like (Non-patent Document 1). ). Recently, lactic acid bacteria (Lactobacillus johnsonii La1 (LC1 lactic acid bacteria) perform autonomic control via the histamine nervous system in the brain and the hypothalamic suprachiasmatic nucleus in which the circadian clock is present, affecting blood pressure and body temperature. (Non-patent Document 2), research on lactic acid strains having novel physiological activity is underway.
  • LC1 johnsonii La1 lactic acid bacteria
  • lactic acid bacteria Although various lactic acid bacteria are known to have beneficial physiological activities for humans and animals as described above, there are currently no lactic acid bacteria that have effective effects on lactic acid bacteria that improve fatigue and blood flow disorders. . Moreover, the effect at the time of giving livestock etc. the lactic acid bacteria which improve fatigue and a blood flow disorder, especially the fecal odor improvement and the growth promotion effect are not examined.
  • An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium having at least one effect selected from a fatigue improvement effect, a blood flow improvement effect, a fecal odor improvement effect, and a growth promotion effect, and having high safety. It is another object of the present invention to provide a preparation containing as an active ingredient a lactic acid bacterium having at least one effect selected from a fatigue improvement effect, a blood flow improvement effect, a fecal odor improvement effect, and a growth promotion effect.
  • the present inventors have surprisingly had specific bacteriological properties and live viable bacteria when lyophilized in the absence of a dispersion medium. Lactic acid bacteria belonging to Enterococcus faecium having a survival rate of 40% or more and a survival rate of viable bacteria in a viable preparation when stored at 40 ° C. for 4 months is an excellent fatigue improvement effect.
  • the present inventors have found that it has at least one effect selected from a blood flow improving effect, a fecal odor improving effect, and a growth promoting effect, and has completed the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the survival rate of viable bacteria when lyophilized in the absence of a dispersion medium is 40% or more, and when stored at 40 ° C. for 4 months
  • Lactic acid bacteria belonging to Enterococcus faecium having a survival rate of 80% or more in the viable cell preparation Morphological properties 1) Gram staining: positive 2) Spore-forming ability: none 3) Motility: none Physiological properties 1) Catalase: negative 2) Sodium pyruvate degradation: positive 3) Esculin degradation: positive 4) Pyrrolidonyl -Decomposition of 2-naphthylamide: positive 5) Decomposition of 2-naphthyl- ⁇ -D-galactopyranoside: positive 6) Decomposition of L-leucine-2-naphthylamide: positive 7) Decomposition of L-alginic acid: positive 8) Degradability of various carbohydrates D-ribose: + D-mannitol: + Lac
  • Enterococcus faecium R30 strain NITE BP-01362
  • Enterococcus faecium R28 strain NITE BP-01361
  • a mutant obtained by DNA mutation treatment according to [1] or [2] Lactic acid bacteria belonging to Enterococcus faecium
  • [4] A composition containing the lactic acid bacterium according to any one of [1] to [3], or a processed product or an extraction residue of the lactic acid bacterium.
  • composition according to [4] further comprising a protective agent.
  • composition according to [5], wherein the wrinkle protecting agent is at least one selected from the group consisting of sucrose, trehalose, sodium glutamate, histidine and malic acid.
  • a fatigue improving agent comprising the composition according to any one of [4] to [7] as an active ingredient.
  • a blood flow improving agent comprising the composition according to any one of [4] to [7] as an active ingredient.
  • a fecal odor improving agent comprising the composition according to any one of [4] to [7] as an active ingredient.
  • a growth promoter comprising the composition according to any one of [4] to [7] as an active ingredient.
  • a pharmaceutical comprising the composition according to any one of [4] to [7].
  • a method for improving fatigue or blood flow disorder comprising administering the composition according to any one of [4] to [7] to a subject in need thereof.
  • [17] A method for improving stool odor, comprising administering the composition according to any one of [4] to [7] to a subject in need thereof.
  • a growth promoting method comprising administering the composition according to any one of [4] to [7] to a subject in need thereof.
  • the lactic acid bacteria of the present invention Since lactic acid bacteria belonging to Enterococcus faecium having specific bacteriological properties of the present invention have been found to improve fatigue and blood flow disorders, the lactic acid bacteria of the present invention, or processed products or extraction residues of the lactic acid bacteria are used.
  • the composition to be contained can be used for foods and pharmaceuticals having high safety and an effect of improving fatigue and blood flow disorder. Furthermore, since the lactic acid bacterium has been confirmed to have a fecal odor improving effect and a growth promoting effect, the lactic acid bacterium of the present invention, or a composition containing a processed product or an extraction residue of the lactic acid bacterium is used in the field of livestock and the like. As an alternative to these drugs, it can be used in feeds and feed additives that are highly safe and have a fecal odor improving effect and a growth promoting effect.
  • Lactic acid bacterium of the present invention has a survival rate of 40% or more when lyophilized in the absence of a dispersion medium, and is a viable preparation when stored at 40 ° C. for 4 months
  • the survival rate of viable bacteria in the medium was 80% or more, preferably 40% or more when freeze-dried in the absence of a dispersion medium, and stored at 40 ° C. for 4 months.
  • the survival rate of viable bacteria in the viable cell preparation is 90% or more, more preferably, the survival rate of viable bacteria when freeze-dried in the absence of a dispersion medium is 40% or more, and 40 ° C.
  • the lactic acid bacteria belonging to Enterococcus faecium having a survival rate of 95% or more in the viable preparation when stored for 4 months.
  • the survival rate of viable bacteria when lyophilized in the absence of a dispersion medium is less than 40%, or the survival rate of viable bacteria in a viable preparation when stored at 40 ° C. for 4 months is less than 80% Is not preferable because lactic acid bacteria having at least one effect selected from a fatigue improvement effect, a blood flow improvement effect, a fecal odor improvement effect, and a growth promotion effect cannot be obtained.
  • freeze-drying in the absence of a dispersion medium means that cells in a culture solution cultured by a conventional method are collected using a centrifugal separator or the like, and a dispersion medium is added to the collected cells. Without adding, the cells are dispersed in water and lyophilized.
  • the “dispersion medium” is a substance that can uniformly disperse collected cells, and examples thereof include physiological saline, phosphate physiological saline, and a solution containing a protective agent.
  • the ⁇ protective agent '' is a substance that can reduce damage to cells by freezing or drying, such as trehalose, bovine serum albumin, skim milk powder, sodium glutamate, L-ascorbic acid, histidine, malic acid, whey, Examples include glucose, aspartic acid, methionine, starch, dextrin, sucrose, lactose, sodium chloride, and phosphate.
  • the lactic acid bacteria of the present invention can be obtained by the screening method shown below.
  • the screening strain is cultured at 37 ° C. for 24 hours using a medium in which lactic acid bacteria can grow, and the culture solution and cells are separated by centrifugation, and the culture solution is removed and the cells are collected. An appropriate amount of water is added to the collected cells without adding a dispersion medium to obtain a dispersed cell concentrate.
  • the total viable cell count in the bacterial cell concentrate is determined by a conventional method such as a colony count method. Subsequently, the cell concentrate is freeze-dried, and the total viable cell count in the obtained freeze-dried cell is obtained by a conventional method such as a colony count method.
  • Lactic acid bacteria having a survival rate of 40% or more are selected.
  • Secondary screening (measurement of survival rate of viable bacteria in viable preparations when stored at 40 ° C. for 4 months)
  • lactic acid bacteria with a survival rate of 40% or more when freeze-dried in the absence of a dispersion medium are cultured at 37 ° C. for 24 hours, and the culture solution and cells are separated by centrifugation. And remove the culture solution to obtain wet cells.
  • a dispersion medium is added to the wet cells and then freeze-dried to obtain freeze-dried cells.
  • An excipient is added to the obtained freeze-dried microbial cells so that the viable count becomes 1.0 ⁇ 10 10 cfu / g to prepare a viable cell preparation.
  • the prepared viable cell preparation is stored in an incubator at 40 ° C.
  • viable cell count of viable cell preparations viable cell count in the (1.0 ⁇ 10 10 cfu / g ) and the viable cell preparations per 1g stored 4 months at 40 ° C. before storage, it was stored for 4 months at 40 ° C.
  • the survival rate of viable bacteria in the viable cell preparation is calculated, and lactic acid bacteria having the survival rate of 80% or more are selected.
  • R30 strain Enterococcus faecium R30 strain (hereinafter also referred to as R30 strain) and R28 strain (hereinafter also referred to as R28 strain), which are examples of the lactic acid bacteria of the present invention obtained by the above screening, were dated May 16, 2012. Deposited as NITE P-1362 and NITE P-1361 to the Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) (National Institute of Technology and Evaluation, NPMD) (2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba, Japan 292-0818) As of April 24, 2013, they were transferred to the International Deposit under the provisions of the Butabest Convention under the accession numbers NITE BP-01362 and NITE BP-01361, respectively.
  • NPMD Patent Microorganism Depositary Center
  • the Enterococcus faecium R30 and R28 strains have the following mycological properties. Morphological properties 1) Gram staining: positive 2) Spore-forming ability: none 3) Motility: none Physiological properties 1) Catalase: negative 2) Sodium pyruvate degradation: positive 3) Esculin degradation: positive 4) Pyrrolidonyl -Decomposition of 2-naphthylamide: positive 5) Decomposition of 2-naphthyl- ⁇ -D-galactopyranoside: positive 6) Decomposition of L-leucine-2-naphthylamide: positive 7) Decomposition of L-alginic acid: positive 8) Degradability of various carbohydrates D-ribose: + D-mannitol: + Lactose: + D-sorbitol:- D-trehalose:- D-Raffinose:-
  • the lactic acid bacteria belonging to Enterococcus faecium of the present invention are further characterized by having the following chemical taxonomic properties.
  • Chemical taxonomic property It has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a base sequence showing 90% or more sequence identity with SEQ ID NO: 1.
  • the lactic acid bacterium belonging to Enterococcus faecium of the present invention only needs to have 90% or more sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of 16SMrDNA of DSM20477, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, Preferably 99% or more, most preferably 99.5% or more, 99.8% or more, and 100% are selected from an excellent fatigue improving effect, blood flow improving effect, fecal odor improving effect, and growth promoting effect. This is preferable in that a lactic acid bacterium having at least one effect can be obtained. If the sequence identity is less than 90%, a lactic acid bacterium having at least one effect selected from an excellent fatigue improving effect, blood flow improving effect, fecal odor improving effect, and growth promoting effect cannot be obtained.
  • the composition of the present invention is used instead of the R30 strain or R28 strain.
  • “Mutant” refers to a lactic acid bacterium that has been subjected to DNA mutation treatment
  • DNA mutation treatment refers to a treatment that artificially induces mutation by known means such as radiation or a mutagen, DNA mutations include those due to spontaneous mutations.
  • Any medium can be used for culturing the lactic acid bacteria of the present invention as long as they can grow, and the culture method can be cultivated by test tube culture, flask culture, fermentation in a fermenter, or the like.
  • a normal lactic acid bacterium culture may be performed under general conditions using an MRS medium generally used for lactic acid bacterium culture.
  • composition of the present invention contains the lactic acid bacterium of the present invention or a variant thereof.
  • the lactic acid bacterium or a variant thereof contained in the composition of the present invention may be the microbial cell itself, or may be a processed product or an extraction residue of the lactic acid bacterium or the variant thereof.
  • the cells contained in the composition of the present invention may be live or dead (sterilized).
  • a living bacterium is a lactic acid bacterium that is still alive
  • a dead bacterium (dead sterilization) is a microbial cell that has been sterilized by heating, pressurization, drug treatment, or the like.
  • the “processed product” as used in the present invention is at least selected from a liquefied product obtained by grinding, crushing, and extraction of lactic acid bacteria, concentration, pasting, drying (spray drying, freeze drying, vacuum drying, drum drying, etc.), and dilution.
  • extraction residue include a sediment obtained by treating a cell with boiling water or hot water, and extracting the extract from the cell by centrifugation. Although a thing is mentioned, it is not limited to these.
  • composition containing viable lactic acid bacteria of the present invention is collected, for example, by collecting cells in a culture solution cultured by a conventional method, adding a solution in which a protective agent is dissolved in the collected cells, and then drying. Thereafter, it can be obtained by mixing with an appropriate excipient.
  • These protective agents can be used alone or in combination.
  • the cells in the culture medium cultured by a conventional method are collected by centrifugation, and a solution in which a protective agent such as trehalose, sodium glutamate, histidine, malic acid, sucrose is dissolved is added to the collected cells. can do.
  • the blending ratio of each protective agent is not limited, but the lower limit of the total amount of the protective agent is 1% by weight or more, preferably 10% by weight or more, more preferably 100% by weight or more with respect to the dry cell weight.
  • the final concentration of the protective agent is less than 1% by weight with respect to the dry cell weight, it is not preferable because damage caused to the cells by freezing or drying cannot be sufficiently reduced.
  • the composition containing the killed lactic acid bacterium of the present invention collects the microbial cells in a culture solution cultured by a conventional method, sterilizes the collected microbial cells, and after drying, suitable shaping It can be obtained by mixing with an agent.
  • the sterilization is to kill bacteria by heating, pressurization, drug treatment, etc., for example, dry heat sterilization, steam sterilization, high pressure steam sterilization, chemical sterilization, ultrasonic sterilization, electromagnetic wave sterilization, ultraviolet sterilization, etc. Can be mentioned. Further, the sterilization treatment may be performed after drying the collected cells.
  • the composition of the present invention can be used as a fatigue improving agent because it has an excellent fatigue improving effect.
  • the fatigue-improving agent of the present invention has effects such as prevention or improvement of fatigue due to excessive stress, uneven eating habits, irregular lifestyle such as lack of sleep, improvement of exercise ability, and improvement of endurance.
  • composition of the present invention has an excellent blood flow improving effect, it can be used as a blood flow improving agent.
  • the blood flow improving agent of the present invention has an effect of preventing or improving pathological conditions such as coldness due to excessive stress, uneven eating habits, irregular lifestyle such as lack of sleep, stiff shoulders, rough skin, and back pain.
  • the composition of the present invention has an excellent stool odor improving effect, it can be used as a stool odor improving agent.
  • the stool odor improving agent of the present invention has the effect of improving the stool odor of infants, elderly people, and humans whose physical strength has been weakened.
  • it has the effect of improving the stool odor of livestock whose intestinal environment has deteriorated due to stress caused by the administration of drugs such as multi-head breeding and vaccines.
  • composition of the present invention has an excellent growth promoting effect, it can be used as a growth promoter.
  • the growth-promoting agent of the present invention has an action of promoting the growth of infants and the like and suppressing weight loss of the elderly and sick. Moreover, it has the effect
  • the fatigue improvement effect is achieved by, for example, using a treadmill device, and running the rat at a speed of 10 m / min, and gradually increasing the speed by 5 m / min every 3 minutes, as in the examples described later. It can be evaluated by measuring the time until the rat becomes unable to run (maximum running time). If the maximum running time of the rat after administration of the test substance is extended as compared with the maximum running time of the rat before administration of the test substance, the test substance is evaluated as having a fatigue improving effect.
  • the blood flow improving effect is obtained by, for example, having the left hand immersed in cold water at 15 ° C. for 10 seconds, as in the examples described later, and the skin temperature at the time immediately before the cold water load and 10 minutes after the cold water load. Can be evaluated by measuring using thermography. Compare the difference in skin temperature immediately after the subject's cold water load and 10 minutes after the cold water load. If the difference in the skin temperature of the subject increases due to the intake of the test material, the test substance has an effect of improving blood flow. Evaluate to have.
  • the fecal odor improving effect can be evaluated by measuring the fecal odor of chicken chicks, for example, as in the examples described later. From the stool odor before administration of the test substance and the stool odor after administration of the test substance, the reduction rate of stool odor is obtained, and if the reduction rate of stool odor is large, the test substance has an effect of improving stool odor. evaluate.
  • the stool odor may be evaluated by sensory evaluation or by measuring the concentration of acetic acid gas in feces.
  • the growth promoting effect can be evaluated by measuring the body weight of a mouse, for example, as in Examples described later. If the body weight of the mouse administered with the test substance is larger than that of the mouse not administered with the test substance, the test substance is evaluated as having a growth promoting effect.
  • composition of the present invention can be used as food, functional food or supplement, feed (including pet food), veterinary drug, or drug.
  • the form of the food containing the composition of the present invention is not particularly limited.
  • edible oil and fat compositions including the general form of food, such as beverages.
  • the fermented material which fermented general food using the lactic acid bacteria of this invention and the variant by which DNA mutation treatment was carried out
  • the content of the lactic acid bacteria or the processed product of lactic acid bacteria or the extraction residue when the composition of the present invention is used as a food is not particularly limited.
  • the lower limit of the content in the food is 0.00001% by weight or more, preferably 0. 0.001% by weight or more, more preferably 0.1% by weight or more
  • the upper limit of the content in food is 100% by weight or less, preferably 50% by weight or less, more preferably 30% by weight or less. Can be included.
  • the composition of the present invention can also be a functional food such as a health food such as a food for specified health use, a nutritional functional food, a health food, a dietary supplement, etc. in a supplement form such as a capsule or a tablet, It is used to prevent or improve fatigue, exercise ability, endurance, and / or coldness, stiff shoulders, rough skin, back pain, and / or alleviate or alleviate stool odor, and / or promote growth. You can also indicate that there is.
  • a functional food such as a health food such as a food for specified health use, a nutritional functional food, a health food, a dietary supplement, etc. in a supplement form such as a capsule or a tablet, It is used to prevent or improve fatigue, exercise ability, endurance, and / or coldness, stiff shoulders, rough skin, back pain, and / or alleviate or alleviate stool odor, and / or promote growth. You can also indicate that there is.
  • the lower limit per adult day is 0.01 mg / kg body weight or more, preferably 1 mg / kg body weight or more,
  • the upper limit per day for an adult is administered in one to several doses so that 1000 mg / kg body weight or less, preferably 300 mg / kg body weight or less can be ingested.
  • the dosage form is not particularly limited.
  • other pharmaceutically acceptable formulations such as excipients, disintegrants, lubricants, binders, antioxidants, colorants, anti-aggregation agents, absorption enhancers, solubilizers Further, it can be prepared by appropriately adding a stabilizer and the like.
  • composition of the present invention when used as feed (including pet food) or veterinary medicine, the above lactic acid bacterium or a processed product of lactic acid bacterium or an extraction residue is used as a main raw material, but it is used for ordinary mixed feed.
  • the raw materials may be appropriately blended.
  • raw materials include cereals or processed cereals (corn, milo, barley, wheat, rye, buckwheat, millet, wheat flour, wheat germ flour, etc.), potatoes (bran, rice bran, corn gluten feed, etc.), plant Oil lees (soybean oil lees, sesame oil lees, cottonseed oil lees, peanut lees, sunflower lees, safflower lees, etc.), animal ingredients (fat dry milk, fish meal, meat and bone meal, etc.), minerals (calcium carbonate, calcium phosphate, salt, anhydrous silica, etc.) Acids), vitamins (vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , vitamin B12, calcium pantothenate, nicotinamide, folic acid, etc.), amino acids (glycine, methionine, etc.) , Yeasts such as beer yeast, fine powder of inorganic substances (
  • the feed of the present invention is used for feeds such as excipients, extenders, binders, thickeners, emulsifiers, colorants, fragrances, food additives, seasonings and the like that are commonly used in blended feeds.
  • feeds such as excipients, extenders, binders, thickeners, emulsifiers, colorants, fragrances, food additives, seasonings and the like that are commonly used in blended feeds.
  • Additives and other components may be added as desired.
  • the form of the feed of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include powders, granules, pastes, pellets, capsules (hard capsules, soft capsules), tablets and the like.
  • the animals to be fed with the feed of the present invention are not particularly limited. For example, livestock such as cattle, horses, pigs, and sheep, chickens (including both broilers and egg-laying chickens), turkeys, and duck And the like, laboratory animals such as mice, rats and guinea pigs, and pets such as dogs and cats.
  • the composition of the present invention is a lactic acid bacterium, a processed product of lactic acid bacterium or an extraction residue, and the lower limit of daily intake is 0.001 mg / kg body weight or more, preferably 0, regardless of the type of animal. 0.01 mg / kg body weight or more, more preferably 0.1 mg / kg body weight or more, and the upper limit of the daily intake is 1000 mg / kg body weight or less, preferably 500 mg / kg body weight or less once to several times Give in divided times.
  • the dosage form is not particularly limited.
  • other pharmaceutically acceptable formulations such as excipients, disintegrants, lubricants, binders, antioxidants, colorants, anti-aggregation agents, absorption enhancers, solubilizers Further, it can be prepared by appropriately adding a stabilizer and the like.
  • the dose of the composition of the present invention when used as a pharmaceutical may be in accordance with the dose of the functional food or supplement.
  • lactic acid bacteria are selected by the following primary screening method and secondary screening method, the evaluation method of fatigue improvement effect, the evaluation method of blood flow improvement effect, the evaluation method of fecal odor improvement effect, growth
  • the physiological activity was evaluated by a method for evaluating the promoting effect.
  • Lactic acid bacteria were cultured in 10 mL of MRS liquid medium (MRS broth, 0.52 g manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd. dissolved in 10 mL of water and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes) at 37 ° C. for 24 hours to obtain a preculture solution. It was. 1 mL of the preculture was added to 100 mL of MRS liquid medium and cultured at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the culture, the mixture was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to separate the culture solution and the bacterial cells.
  • MRS liquid medium MRS liquid medium
  • the bacterial cell concentrate was freeze-dried (freeze dryer, VirTis, Advantage Plus; freezing conditions; ⁇ 30 ° C., 12 hours, drying conditions; 10 ⁇ 10 ⁇ 1 torr, shelf temperature: 20 ° C., 48 hours). A freeze-dried microbial cell was obtained.
  • Lactic acid bacteria selected by the primary screening method were cultured in 10 mL of MRS liquid medium at 37 ° C. for 24 hours to obtain a preculture solution.
  • 10 mL of the preculture was added to 1 L of MRS liquid medium and cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • the mixture was centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to separate the culture solution and the bacterial cells.
  • the microbial cells were washed with 1 L of sterilized water and then centrifuged again to separate the sterilized water and the microbial cells.
  • the microbial cells were made up to 20 mL with sterilized water to obtain a microbial cell concentrate.
  • the cell concentrate comprises 0.4% by weight of sucrose, 0.2% by weight of trehalose, 0.2% by weight of sodium glutamate, 0.2% by weight of histidine, and 0.2% by weight of malic acid. 2 mL of a solution in which the protective agent was dissolved was added and lyophilized under the same conditions as above to obtain lyophilized cells. The lyophilized cells were mixed with dextrin so that the viable cell count was 1.0 ⁇ 10 10 cfu / g to obtain a viable cell preparation.
  • survival rate (%) of viable bacteria in the viable preparation when stored at 40 ° C. for 4 months (number of viable cells per 1 g of viable preparation after storage at 40 ° C. for 4 months / 1.0 ⁇ 10 10 ) ⁇ 100
  • the vehicle was run at a speed of 5 m / min every 3 minutes, and the time until the rat became unable to run (maximum running time) was evaluated.
  • the left hand of the subject was immersed in 15 ° C. cold water for 10 seconds, and the skin temperature immediately after the cold water load and 10 minutes after the cold water load was measured using thermography (TVS 600, manufactured by Nippon Avionics Co., Ltd.). Evaluation was made based on whether or not a value obtained by subtracting the average skin temperature immediately after the cold water load (difference in average skin temperature) significantly increased from the average skin temperature 10 minutes after the cold water load by ingesting the test substance.
  • the average skin temperature was defined as the average value of the skin temperature at three points of the middle fingertip of the middle finger, the middle point of the middle phalanx of the middle finger, and the middle point of the third middle finger phalange.
  • Fecal odor was evaluated based on fecal odor index, hydrogen sulfide gas concentration, and acetic acid gas concentration, and the reduction rate of odor index, hydrogen sulfide gas concentration, and acetic acid gas concentration before and after the test was calculated.
  • the odor index was obtained by suspending 1 g of feces in 100 mL of odorless distilled water, allowing to stand at 25 ° C. for 30 minutes, and further diluting 10 times as test water, using a three-point comparative flask method.
  • the hydrogen sulfide gas concentration and the acetic acid gas concentration were measured by placing 100 g of stool on a glass petri dish in a 10 L polystyrene bag, exhausting all the air in the bag, and filling the bag with purified odorless air through activated carbon. After sealing and leaving still at room temperature of about 22 degreeC for 1 hour, it calculated
  • Enterococcus faecium DSM20477 which is the reference stock of Enterococcus faecium, is referred to as the reference stock.
  • the survival rate of viable bacteria when freeze-dried in the absence of the dispersion medium of the reference strain is 25%, and the survival of viable bacteria in the viable cell preparation when stored at 40 ° C. for 4 months The rate is 40%.
  • Example 1 For lactic acid bacteria 125 isolates (isolate 1-isolate 125) isolated from food materials, etc., live bacteria produced by lyophilization in the absence of a dispersion medium of each isolate by the primary screening method described above The remaining rate was calculated.
  • the viability of viable bacteria was 40% or more when two strains, isolate 17 and isolate 82, were lyophilized in the absence of a dispersion medium.
  • the survival rate of viable bacteria in the viable cell preparation was 80% or more.
  • isolate 82 is referred to as R30 strain.
  • Example 2 ⁇ Measurement of fatigue improvement effect of R30 strain>
  • freeze-dried cells of the R30 strain and the reference strain are prepared, and each freeze-dried cell is dextrin so that the viable cell count is 5.0 ⁇ 10 10 cfu / g.
  • a viable bacterial preparation mixed with the above was obtained.
  • the fatigue-reducing effect of the R30 strain administration group administered with 1 g / kg of the R30 strain viable preparation, the reference strain administration group administered with 1 g / kg of the reference strain viable preparation, and the dextrin administration group administered with 1 g / kg of dextrin The evaluation method was implemented. The results are shown in Table 2.
  • Example 3 ⁇ Measurement of blood flow improvement effect of R30 strain> R30 strain intake group that ingests 1 g / day of R30 strain viable preparation prepared in Example 2, 1 g / day of reference strain intake group that ingests 1 g / day of viable preparation of reference strain prepared in Example 2 and 1 g / dextrin
  • the evaluation method of the blood flow improvement effect was carried out. The results are shown in Table 3.
  • Example 4 ⁇ Measurement of stool odor improvement effect of R30 strain> According to the method described in the secondary screening method, lyophilized cells of the R30 strain were prepared, and the lyophilized cells were mixed with dextrin so that the viable cell count was 1.0 ⁇ 10 10 cfu / g. A fungal preparation was obtained. A test feed (R30 stock mixed feed) mixed with a standard feed (standard feed for broiler fattening early period; manufactured by Nippon Compound Feed Co., Ltd.) was prepared so that the viable preparation of the R30 strain was 0.3% by weight, and the above An evaluation method of fecal odor improvement effect was carried out. The results are shown in Table 4.
  • the R30 strain mixed feed group had a greater reduction rate of odor index, hydrogen sulfide gas concentration, and acetic acid gas concentration than the standard feed group. Therefore, it was revealed that the R30 strain has a fecal odor improving effect.
  • Example 5 ⁇ Measurement of growth promotion effect of R30 strain> Test feed (R30 strain mixed feed) mixed with standard feed (CE-2 powder feed; manufactured by CLEA Japan) so that the R30 strain viable preparation prepared in Example 4 was 0.1% by weight as the test substance ) And the evaluation method for the growth promoting effect was carried out. The ratio of the body weight of the group fed with the R30 strain mixed feed when the weight of the group fed with the standard feed at the end of the test was taken as 100% was calculated. The results are shown in Table 5.
  • the R30 strain has a fatigue improving effect, a blood flow improving effect, a fecal odor improving effect, and a growth promoting effect. It has mycological properties and the survival rate of viable bacteria when freeze-dried in the absence of a dispersion medium is 40% or more, and in a viable cell preparation when stored at 40 ° C. for 4 months It was decided to screen for lactic acid bacteria belonging to the genus Enterococcus faecium having a survival rate of 80% or more.
  • Example 6 ⁇ Screening of R28 strain> Ten strains (Enterococcus faecium strains 1 to 10) that showed the same mycological properties as those of the genus Enterococcus faecium were selected from lactic acid bacteria isolated from food materials and the like using API 20 Strep (manufactured by Sysmex Biomelieu). . Three strains (Enterococcus faecium strain 1, Enterococcus 1) that had a survival rate of 40% or more when the above-described primary screening method was performed on each strain and lyophilized in the absence of a dispersion medium. -Secondary screening was performed on Fesium strain 2, Enterococcus faecium strain 3), and the survival rate of viable bacteria in the viable cell preparation when stored at 40 ° C for 4 months was determined. The results are shown in Table 6.
  • the survival rate of Enterococcus faecium strain 1 when lyophilized in the absence of a dispersion medium is 40% or more and when stored at 40 ° C. for 4 months.
  • the survival rate of viable bacteria in the fungal preparation was 80% or more.
  • the sequence identity with Enterococcus faecium strain 1 was 99.9%.
  • Enterococcus faecium strain 1 is referred to as R28 strain.
  • Example 7 ⁇ Measurement of fatigue improvement effect and blood flow improvement effect of R28 strain> The fatigue improvement effect and blood flow improvement effect of the R28 strain obtained in Example 6 were examined in the same manner as in Example 2 and Example 3. The Enterococcus faecium strain 2 and Enterococcus faecium strain 4 were compared with the R28 strain. The results are shown in Table 7.
  • Table 7 reveals that the R28 strain has a significant fatigue improvement effect and blood flow improvement effect as compared to the Enterococcus faecium strain 2 and the Enterococcus faecium strain 4, and as a result, certain bacteriological results
  • the survival rate of viable bacteria when lyophilized in the absence of a dispersion medium is 40% or more, and the viable bacteria in the viable cell preparation when stored at 40 ° C. for 4 months It was revealed that lactic acid bacteria belonging to Enterococcus faecium having a survival rate of 80% or more have an excellent effect.
  • Example 8 ⁇ Measurement of fecal odor improving effect and growth promoting effect of R28 strain> The fecal odor improving effect and the growth promoting effect of the R28 strain were examined in the same manner as in Example 4 and Example 5. The results are shown in Table 8.
  • Example 9 ⁇ Production method of viable cell preparation using R30 strain and R28 strain>
  • the R30 strain was cultured in 1 L of MRS liquid medium at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the culture, the centrifuged cells were washed with 1 L of sterilized water, and then centrifuged again to separate the cells and sterilized water.
  • the protective agent consisting of sucrose, trehalose, sodium glutamate, histidine, malic acid is based on the dry cell weight in the bacterial cell concentrate. A solution in which the protective agent was dissolved to 0, 1, 3, 10, 100, 1000, and 10000% by weight was added and lyophilized.
  • the lyophilized cells were mixed with dextrin so that the viable cell count was 1.0 ⁇ 10 10 cfu / g, and the viable cell preparation was prepared and stored in the viable cell preparation at 40 ° C. for 4 months. The survival rate of viable bacteria was determined. The same experiment was conducted for the R28 strain. The results are shown in Table 9.
  • the survival rate of the viable cell preparation of the viable cell preparation when stored at 40 ° C. for 4 months was improved by adding 1% by weight or more of the protective agent to the dry cell weight.
  • the amount of the protective agent to 3% by weight, 10% by weight, and 100% by weight with respect to the dry cell weight, the viability of the live bacteria in the live cell preparation when stored at 40 ° C. for 4 months is increased. The remaining rate improved.
  • the present invention can be used in the field of manufacturing foods, feeds and pharmaceuticals such as functional foods and supplements using lactic acid bacteria.

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Abstract

　本発明は、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有し、安全性が高い乳酸菌を提供することを課題とする。さらには、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌、又は該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を有効成分とする製剤を提供することを課題とする。　本発明によれば、特定の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する新規乳酸菌、当該乳酸菌を含有する組成物、当該組成物を有効成分とする疲労改善剤、血流改善剤、便臭改善剤、又は成長促進剤のいずれかの剤、及び当該組成物の食品等への使用が提供される。

Description

新規乳酸菌
　本発明は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）菌種に属する新規乳酸菌、当該乳酸菌を含有する組成物、当該組成物を有効成分とする疲労改善剤、血流改善剤、便臭改善剤、又は成長促進剤のいずれかの剤、及び当該組成物の食品等への使用に関する。
　現代人は、過度のストレス、偏った食生活、睡眠不足などの不規則な生活習慣により腸内環境が悪化していると言われている。腸内環境は、健康状態と密接に関係しており、疲労の蓄積、血流障害による冷え性、肩こり、肌荒れ、腰痛といった身近な症状も腸内環境の悪化が原因の一つと捉えられている。これらの症状は不規則な生活習慣を変えることなどで腸内環境が正常な状態に戻れば、改善する可能性があるが、忙しい現代人において生活習慣を変えることは容易ではない。そこで、このような症状を緩和し、安全で日常的、継続的に摂取可能な食品、機能性食品、医薬品が求められている。
　また、畜産分野においては、生産性の向上を目的とした多頭飼育やワクチンなどの薬剤投与によるストレスが家畜などの腸内環境の悪化を引き起こし、発育の抑制、便臭の悪化、肉質や卵質の低下などの問題が発生している。これらの問題を回避するため、抗生物質などが使用されているが、抗生物質は低濃度ながら長期にわたり投与されることから、抗生物質に対する耐性菌の出現や残留した抗生物質がヒトに与える影響が懸念されている。このような背景から、畜産分野では、上記した問題を回避できる安全で日常的、継続的に使用可能な飼料や飼料添加物が求められている。
　一方、近年の健康志向などを背景に、ヒトや動物に有益な生理活性を発揮させる成分（いわゆる機能性成分）として、乳酸菌が注目されている。これまでに、ヒトや動物への経口投与によって、整腸作用、抗アレルギー作用、コレステロール低減作用、血圧降下作用など、菌株により様々な生理活性を発揮することが知られている（非特許文献１）。また、最近では、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ　Ｌａ１株（ＬＣ１乳酸菌）が脳内ヒスタミン神経系や体内時計の存在する視床下部視交叉上核を介して自律神経制御を行い、血圧や体温などに影響をあたえることが報告されており（非特許文献２）、新規な生理活性を有する乳酸菌株の研究が進められている。
　以上のように様々な乳酸菌がヒトや動物に有益な生理活性を有することが知られているものの、疲労や血流障害を改善する乳酸菌に関しては有効な効果を示す乳酸菌がないのが現状である。また、疲労や血流障害を改善する乳酸菌を家畜などに与えた際の効果、特に便臭改善や成長促進効果は検討されていない。
Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｊ　Ａｐｐｌ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１９８９；６６：３６５ 谷田　守他著、「ＬＣ１乳酸菌の自律神経を介する血圧低下作用」肥満研究　Ｖｏｌ．１２　Ｎｏ．３　２００６年
　本発明の目的は、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有し、安全性が高い乳酸菌を提供することを課題とする。さらには、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌を有効成分とする製剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに特定の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌が、優れた疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の発明を包含する。
[１] 以下の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
形態学的性質
　１）グラム染色：陽性
　２）胞子形成能：なし
　３）運動性：なし
生理学的性質
　１）カタラーゼ：陰性
　２）ピルピン酸ナトリウムの分解：陽性
　３）エスクリンの分解：陽性
　４）ピロリドニル－２－ナフチルアミドの分解：陽性
　５）２－ナフチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドの分解：陽性
　６）Ｌ－ロイシン－２－ナフチルアミドの分解：陽性
　７）Ｌ－アルギン酸の分解：陽性
　８）各種炭水化物の分解性
　Ｄ－リボース：＋
　Ｄ－マンニトール：＋
　乳糖：＋
　Ｄ－ソルビトール：－
　Ｄ－トレハロース：－
　Ｄ－ラフィノース：－
[２] 以下の化学分類学的性質を有することを特徴とする[１]に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
化学分類学的性質
配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１と９０％以上の配列同一性を示す塩基配列を有する。
[３] エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）、エンテロコッカス・フェシウムＲ２８株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６１）、又は前記菌株がＤＮＡ変異処理された変異体である、[１]又は[２]に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌。
[４] [１]～[３]のいずれかに記載の乳酸菌、又は該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を含有する組成物。
[５] さらに保護剤を含むことを特徴とする[４]に記載の組成物。
[６] 保護剤の含量が乾燥菌体重量に対して１重量％以上であることを特徴とする[５]に記載の組成物。
[７] 保護剤が、ショ糖、トレハロース、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸の群から選択される１種以上であることを特徴とする[５]に記載の組成物。
[８] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物を有効成分とする疲労改善剤。
[９] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物を有効成分とする血流改善剤。
[１０] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物を有効成分とする便臭改善剤。
[１１] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物を有効成分とする成長促進剤。
[１２] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物を含有する食品。
[１３] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物を含有する飼料または動物用医薬品。
[１４] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物を含有する医薬品。
[１５] 疲労、血流障害、便臭、及び成長不良から選ばれる少なくとも１種以上の状態の改善または緩和に使用するための、[４]～[７]のいずれかに記載の組成物。
[１６] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疲労または血流障害を改善する方法。
[１７] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、便臭を改善する方法。
[１８] [４]～[７]のいずれかに記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、成長促進方法。
　本発明は、２０１２年７月３１日に出願された日本国特許出願２０１２－１７０１３６号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
　本発明の特定の菌学的性質を有するエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌は、疲労や血流障害を改善することが認められたことから、本発明の乳酸菌、又は当該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を含有する組成物は、安全性が高く、且つ疲労や血流障害の改善作用を有する食品、医薬品に用いることができる。さらに、当該乳酸菌は、便臭改善効果や成長促進効果が認められたことから、本発明の乳酸菌、又は当該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を含有する組成物は、畜産分野等において、抗生物質などの薬剤の代替として、安全性が高く、且つ便臭改善効果や成長促進効果を有する飼料、飼料添加物に用いることができる。
　以下、本発明について詳述する。
１．本発明の乳酸菌
　本発明の乳酸菌は、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上、好ましくは分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が９０％以上、より好ましくは分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が９５％以上であるエンテロカッコス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）に属する乳酸菌である。
　分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％未満、又は４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％未満であると、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌が得られないため、好ましくない。
　本発明の「分散媒非存在下で凍結乾燥を行う」とは、常法により培養した培養液中の菌体を遠心分離器などを用いて集菌し、集菌した菌体に分散媒を添加しないで、水中で菌体を分散させ、凍結乾燥することである。「分散媒」とは、集菌した菌体を均一に分散できる物質であって、生理食塩水、リン酸生理食塩水、保護剤を含有した溶液などが挙げられる。前記「保護剤」とは、凍結や乾燥などが菌体へ与えるダメージを軽減できる物質であって、トレハロース、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳、グルタミン酸ナトリウム、L-アスコルビン酸、ヒスチジン、リンゴ酸、ホエー、グルコース、アスパラギン酸、メチオニン、デンプン、デキストリン、ショ糖、乳糖、塩化ナトリウム、リン酸塩などが挙げられる。
　本発明の乳酸菌は、以下に示すスクリーニング方法により得ることができる。
（１）１次スクリーニング（分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率の算出）
　乳酸菌が生育可能な培地を用いてスクリーニング株を３７℃で２４時間培養し、遠心分離により培養液と菌体を分離させ、培養液を除去し菌体を回収する。前記回収した菌体に、分散媒を添加しないで、適量の水を加え、分散させた菌体濃縮液を得る。当該菌体濃縮液中の総生菌数をコロニーカウント法などの常法により求める。次いで菌体濃縮液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥菌体中の総生菌数をコロニーカウント法などの常法により求める。そして、前記菌体濃縮液中の総生菌数と前記凍結乾燥菌体中の総生菌数により、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率を算出し、前記生残率が４０％以上である乳酸菌を選抜する。
（２）２次スクリーニング（４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率の測定）
　１次スクリーニングにおいて分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であった乳酸菌を３７℃で２４時間培養し、遠心分離により培養液と菌体を分離させ、培養液を除去し湿菌体を得る。前記湿菌体に分散媒を添加した後、凍結乾燥し凍結乾燥菌体を得る。得られた凍結乾燥菌体を生菌数が１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるよう賦形剤を添加し生菌製剤を調製する。調製した生菌製剤を４０℃のインキュベータ内で４ヶ月間保存した後、生菌製剤１ｇ当たりの生菌数をコロニーカウントなどの常法により求める。そして、保存前の生菌製剤中の生菌数（１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇ）と４０℃で４ヶ月保存した生菌製剤１ｇ当たりの生菌数により、４０℃で４ヶ月保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を算出し、前記生残率が８０％以上である乳酸菌を選抜する。
　上記スクリーニングにより得られた本発明の乳酸菌の例である、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）Ｒ３０株（以下、Ｒ３０株ともいう）及びＲ２８株（以下、Ｒ２８株ともいう）は２０１２年５月１６日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒292-0818　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－１３６２、ＮＩＴＥ　Ｐ－１３６１として寄託され、２０１３年４月２４日付でブタベスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２、ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６１としてそれぞれ国際寄託に移管されている。
　前記エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株及びＲ２８株は、以下に示す菌学的性質を有している。
形態学的性質
　１）グラム染色：陽性
　２）胞子形成能：なし
　３）運動性：なし
生理学的性質
　１）カタラーゼ：陰性
　２）ピルピン酸ナトリウムの分解：陽性
　３）エスクリンの分解：陽性
　４）ピロリドニル－２－ナフチルアミドの分解：陽性
　５）２－ナフチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドの分解：陽性
　６）Ｌ－ロイシン－２－ナフチルアミドの分解：陽性
　７）Ｌ－アルギン酸の分解：陽性
　８）各種炭水化物の分解性
　Ｄ－リボース：＋
　Ｄ－マンニトール：＋
　乳糖：＋
　Ｄ－ソルビトール：－
　Ｄ－トレハロース：－
　Ｄ－ラフィノース：－
　以上の菌学的性質をＡＰＩ２０ストレップ（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）等を用いて解析した結果、エンテロコッカス・フェシムと同一の菌学的性質を示した。また、１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列解析の結果から、Ｒ３０株が配列同一性９９．８％、Ｒ２８株が配列同一性９９．９％でエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＳＭ２０４７７株と一致した。但し、分散媒非存在下で凍結乾燥した時の生菌の生残率、及び４０℃で４ヶ月保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率に関しては、明らかにＤＳＭ２０４７７株とは異なっている。
　本発明のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌は、さらに以下の化学分類学的性質を有することを特徴とする。
化学分類学的性質
　配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１と９０％以上の配列同一性を示す塩基配列を有する。
　本発明のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌は、ＤＳＭ２０４７７の１６ＳｒＤＮＡの配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有すればよく、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上、９９．８％以上、１００％であると、優れた疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌を得ることができる点で好ましい。配列同一性が９０％未満であると、優れた疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌が得られない。
　また本発明においては、上記Ｒ３０株またはＲ２８株だけでなく、それらの変異体も同等の効果を有する限り、本発明の技術範囲に属し、前記Ｒ３０株またはＲ２８株の代わりに本発明の組成物に含有させることができる。「変異体」とは、ＤＮＡ変異処理された乳酸菌を示し、「ＤＮＡ変異処理」とは、放射線や突然変異誘導物質などの公知の手段によって人為的に突然変異を誘導させる処理をいい、また、ＤＮＡ変異には自然突然変異によるものも含まれる。
　本発明の乳酸菌の培養については、それらが生育可能な培地であればいかなる培地を使用してもよく、培養方法については、試験管培養、フラスコ培養、発酵槽による培養などにより培養することができ、特に制限されるものではないが、例えば、乳酸菌培養に一般的に使用されているＭＲＳ培地を用い、一般的な条件で通常の乳酸菌培養を行えばよい。
２．本発明の組成物及び各種製剤
　本発明の組成物は、前記の本発明の乳酸菌若しくはその変異体を含有する。また、本発明の組成物に含まれる乳酸菌若しくはその変異体は、菌体そのものであってもよく、当該乳酸菌若しくはその変異体の処理物若しくは抽出残渣であってもよい。
　本発明の組成物に含まれる菌体としては、生菌でも死菌（死滅菌）でもよい。ここで生菌とは、生きたままの乳酸菌であり、死菌（死滅菌）とは、加熱、加圧、薬物処理などにより殺菌処理を施した菌体のことである。
　本発明でいう「処理物」としては、乳酸菌の磨砕や破砕、抽出などによる液状化物、濃縮、ペースト化、乾燥（スプレードライ、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥など）、希釈から選ばれる少なくとも一つの処理を施した処理物が挙げられ、「抽出残渣」としては、例えば、菌体を煮沸水または熱水で処理し、菌体からエキスを抽出した後の残渣を遠心分離により回収した沈降物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の乳酸菌の生菌を含有した組成物は、例えば、常法で培養した培養液中の菌体を集菌し、集菌した菌体に保護剤を溶解した溶液を添加し、乾燥した後、適当な賦形剤と混合することで得ることができる。
　上記保護剤とは、トレハロース、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳、グルタミン酸ナトリウム、L-アスコルビン酸、ヒスチジン、リンゴ酸、ホエー、グルコース、アスパラギン酸、メチオニン、デンプン、デキストリン、ショ糖、乳糖、塩化ナトリウム、リン酸塩など、凍結や乾燥などが菌体へ与えるダメージを軽減できる物質であればよい。これらの保護剤は、単独または組み合わせて使用することができる。例えば、定法により培養した培養液中の菌体を遠心分離して集菌し、集菌した菌体に、トレハロース、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸、ショ糖等の保護剤を溶解した溶液を添加することができる。各保護剤の配合割合は限定されないが、保護剤総量の下限は、乾燥菌体重量に対して１重量％以上、好ましくは１０重量％以上、さらに好ましくは１００重量％以上である。保護剤の最終濃度が乾燥菌体重量に対して１重量％未満であると、凍結や乾燥などが菌体へ与えるダメージを十分に軽減できず、好ましくない。
　本発明の乳酸菌の死菌を含有した組成物は、例えば、常法で培養した培養液中の菌体を集菌し、集菌した菌体を殺菌処理し、乾燥した後、適当な賦形剤と混合することで得ることができる。
　上記殺菌処理とは、加熱、加圧、薬物処理等により菌を死滅させることであり、例えば、乾熱殺菌、蒸気殺菌、高圧蒸気殺菌、化学的殺菌、超音波殺菌、電磁波殺菌、紫外線殺菌等を挙げることができる。また、殺菌処理は、集菌した菌体を乾燥した後行ってもよい。
　本発明の組成物は、優れた疲労改善効果を有することから、疲労改善剤として使用できる。本発明の疲労改善剤は、過度のストレス、偏った食生活、睡眠不足などの不規則な生活習慣などによる疲労感の予防または改善、運動能力向上、持久力向上などの作用を有する。
　さらに本発明の組成物は、優れた血流改善効果を有することから、血流改善剤として使用できる。本発明の血流改善剤は、過度のストレス、偏った食生活、睡眠不足などの不規則な生活習慣などによる冷え性、肩こり、肌荒れ、腰痛などの病態を予防または改善する作用を有する。
　さらに本発明の組成物は、優れた便臭改善効果を有することから、便臭改善剤として使用できる。本発明の便臭改善剤は、腸内環境のバランスが乱れやすい乳幼児、高齢者、体力が低下したヒトの便臭を改善する作用を有する。また、多頭飼育やワクチンなどの薬剤投与によるストレスで腸内環境が悪化している家畜の便臭を改善する作用を有する。
　さらに本発明の組成物は、優れた成長促進効果を有することから、成長促進剤として使用できる。本発明の成長促進剤は、乳幼児などの成長を促進したり、老人、病人などの体重減少を抑制したりする作用を有する。また、多頭飼育やワクチンなどの薬剤投与によるストレスで腸内環境が悪化している家畜の成長を促進する作用を有する。
　本発明において、疲労改善効果は、例えば後述する実施例のように、トレッドミル装置を用いて、ラットを１０ｍ／ｍｉｎの速度で走行させ、３分毎に５ｍ／ｍｉｎずつ段階的に速度を上げていき、ラットが走行不能となるまでの時間（最大走行時間）を測定することで評価できる。被検物質投与前のラットの最大走行時間と比べ、被検物質投与後のラットの最大走行時間が延長していれば、当該被検物質は疲労改善効果を有すると評価する。
　本発明において、血流改善効果は、例えば後述する実施例のように、ボランティアに左手を１５℃の冷水に１０秒間浸水してもらい、冷水負荷直前、冷水負荷後１０分の時点での皮膚温度をサーモグラフィーを用いて測定することで評価できる。被検者の冷水負荷直後と冷水負荷後１０分の皮膚温度の差を比べ、被検物質摂取により、被検者の皮膚温度の差が大きくなれば、当該被検物質は血流改善効果を有すると評価する。
　本発明において、便臭改善効果は、例えば後述する実施例のように、鶏ひなの便臭を測定することで評価できる。被検物質投与前の便臭と、被検物質投与後の便臭とから、便臭の低減率を求め、便臭の低減率が大きければ、当該被検物質は便臭改善効果を有すると評価する。便臭は、官能評価で評価しても良いし、糞便中の酢酸ガス濃度などを測定することでも評価できる。
　本発明において、成長促進効果は、例えば後述する実施例のように、マウスの体重を測定することで評価できる。被検物質を投与していないマウスと比べ、被検物質を投与したマウスの体重が大きれば、当該被検物質は成長促進効果を有すると評価する。
３．本発明の組成物の使用
　本発明の組成物は、食品、機能性食品またはサプリメント、飼料（ペットフードを含む）、動物用医薬品、または医薬品として使用できる。
　本発明の組成物は、食品として日常的に摂取する場合、本発明の組成物を含有する食品の形態は、特には限定されず、例えば、食用油脂組成物、調理油類、スプレー油類、バター類、マーガリン類、ショートニング類、ホイップクリーム類、濃縮乳類、ホワイトナー類、ドレッシング類、ピックル液類、パン類、ケーキ類、パイ類、クッキー類、和菓子類、スナック菓子類、油菓子類、チョコレート及びチョコレート菓子類、米菓類、ルウ類、ソース類、たれ類、トッピング類、氷菓類、麺類、ベーカリーミックス類、フライ食品類、加工肉製品類、豆腐・こんにゃくなどその他加工品、水産練り製品類、冷凍アントレ類、畜産冷凍食品、農産冷凍食品などの冷凍食品類、米飯類、ジャム類、チーズ、チーズフード、チーズ様食品、ガム類、キャンディー類、発酵乳類、缶詰類、飲料類などの一般食品形態が挙げられる。尚、本発明の乳酸菌およびＤＮＡ変異処理された変異体を用いて一般食品を発酵した発酵物であってもよい。
　本発明の組成物を食品とする場合の乳酸菌又は乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣の含有量は特に限定されないが、例えば食品中の含有量の下限は、０．００００１重量％以上、好ましくは、０．００１重量％以上、さらに好ましくは０．１重量％以上、食品中の含有量の上限は、１００重量％以下、好ましくは５０重量％以下、さらに好ましくは３０重量％以下の割合となるように含有させることが出来る。
　本発明の組成物はまた、カプセル剤や錠剤などのサプリメント形態で、特定保健用食品、栄養機能食品などの保健機能食品や、健康食品、栄養補助食品などの機能性食品とすることができ、疲労状態の予防や改善、運動能力、持久力向上、及び／又は冷え性、肩こり、肌荒れ、腰痛の予防や改善、及び／又は便臭の軽減又は緩和、及び／又は成長促進のために用いるものであるとの表示をすることもできる。その場合は、本発明の組成物の投与量としては、乳酸菌又は乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣として、成人一日あたりの下限は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重以上、成人一日あたりの上限は、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは３００ｍｇ／ｋｇ体重以下を摂取できるように１回ないし数回に分けて投与する。
　本発明の組成物を機能性食品またはサプリメントとして用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容されるほかの製剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
　また、本発明の組成物を、飼料（ペットフードを含む）または動物用医薬品として用いる場合は、上記の乳酸菌又は乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を主原料として用いるが、通常の配合飼料に使用される原料を動物の種類、発育ステージ、地域などの飼育環境に応じて適宜配合してもよい。かかる原料としては、例えば穀物類または加工穀物類（とうもろこし、マイロ、大麦、小麦、ライ麦、燕麦、キビ、小麦粉、小麦胚芽粉等）、糟糠類（ふすま、米糠、コーングルテンフィード等）、植物性油粕類（大豆油粕、ごま油粕、綿実油粕、落花生粕、ヒマワリ粕、サフラワー粕等）、動物性原料（脱脂粉乳、魚粉、肉骨粉等）、ミネラル類（炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、食塩、無水ケイ酸等）、ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６ 、ビタミンＢ１２、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸等）、アミノ酸（グリシン、メチオニン等）、ビール酵母などの酵母類、無機物質の微粉末（結晶性セルロース、タルク、シリカ、白雲母、ゼオライト等）などが挙げられる。
　本発明の飼料は、上記の飼料原料に、配合飼料に通常使用される賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等の飼料用添加剤、所望によりその他の成分（抗生物質や殺菌剤、駆虫剤、防腐剤等）を配合してもよい。
　本発明の飼料の形態は特に限定されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、ペースト状、ペレット状、カプセル剤（ハードカプセル，ソフトカプセル）、錠剤等が挙げられる。本発明の飼料の給与対象となる動物は、特に限定されるものではないが、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜類、ニワトリ（ブロイラー、採卵鶏の両方を含む）、七面鳥、合鴨等の家禽類、マウス、ラット、モルモット等の実験動物、イヌ、ネコなどのペットなどが挙げられる。
　これらの場合、本発明の組成物は、乳酸菌又は乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣として、動物の種類に関わらず、一日あたりの摂取量の下限は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上、一日あたりの摂取量の上限は、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは５００ｍｇ／ｋｇ体重以下、が摂取できるよう１回ないし数回に分けて与える。
　本発明の組成物を、医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容されるほかの製剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
医薬品として用いる場合の本発明の組成物の投与量としては、前記の機能性食品またはサプリメントの投与量に準じればよい。
　以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。なお、実施例においては、以下に示す１次スクリーニング法、２次スクリーニング法で乳酸菌の選抜を行い、疲労改善効果の評価法、血流改善効果の評価法、便臭改善効果の評価法、成長促進効果の評価法により、生理活性を評価した。
＜１次スクリーニング法＞
　乳酸菌を１０ｍＬのＭＲＳ液体培地（ＭＲＳブイヨン、関東化学株式会社製０．５２ｇを１０ｍＬの水に溶解し１２１℃、１５分オートクレーブ滅菌したもの）で、３７℃、２４時間培養し前培養液を得た。前培養液１ｍＬを１００ｍＬのＭＲＳ液体培地に加え、３７℃、２４時間培養した。培養終了後、８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、培養液と菌体を分離させた。菌体を１００ｍＬの滅菌水で洗浄後、再度遠心分離により、滅菌水と菌体を分離し、菌体に滅菌水２ｍＬを加え、菌体濃縮液を得た。前記菌体濃縮液０．１ｍＬを０．９ｍＬの生理食塩水に懸濁し、さらに生理食塩水で１０６倍希釈した希釈液０．１ｍＬをＭＲＳ寒天培地（ＭＲＳ寒天培地、関東化学株式会社製１．２４ｇを２０ｍＬの水に溶解し１２１℃、１５分オートクレーブ滅菌したものを、９０φ×２０の滅菌シャーレに加え、固まらせたもの）に塗抹し、３７℃、２日間培養し出現するコロニー数をカウントし、菌体濃縮液中の総生菌数を求めた。また、前記菌体濃縮液を、凍結乾燥（凍結乾燥機　ＶｉｒＴｉｓ社製　ａｄｖａｎｔａｇｅ　Ｐｌｕｓ、凍結条件；　－３０℃、１２時間、乾燥条件；　１０×１０－１ｔｏｒｒ、棚温２０℃、４８時間）し、凍結乾燥菌体を得た。前記凍結乾燥菌体２０ｍｇを、１ｍＬの生理食塩水に分散した菌体懸濁液を生理食塩水で１０６倍希釈した希釈液０．１ｍＬをＭＲＳ寒天培地に塗抹し、３７℃、２日間培養し出現するコロニー数をカウントし、凍結乾燥菌体中の総生菌数を求め、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率を次式より算出し、生残率が４０％以上の乳酸菌を選抜した。
　分散媒非存在下で凍結乾燥した際の生菌の生残率（％）＝（乾燥菌体中の総生菌数／菌体濃縮液の総生菌数）×１００
＜２次スクリーニング法＞
　１次スクリーニング法で選抜した乳酸菌を１０ｍＬのＭＲＳ液体培地で３７℃、２４時間培養し前培養液を得た。前培養液１０ｍＬを１ＬのＭＲＳ液体培地に加え、３７℃、２４時間培養した。培養終了後、８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、培養液と菌体を分離させた。菌体を１Ｌの滅菌水で洗浄後、再度遠心分離により、滅菌水と菌体を分離し、菌体を滅菌水で２０ｍＬにメスアップし、菌体濃縮液を得た。該菌体濃縮液にショ糖が０．４重量％、トレハロースが０．２重量％、グルタミン酸ナトリウムが０．２重量％、ヒスチジンが０．２重量％、リンゴ酸が０．２重量％からなる保護剤を溶解した溶液２ｍＬ加えて、上記と同条件で凍結乾燥し、凍結乾燥菌体を得た。該凍結乾燥菌体を生菌数が１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるようにデキストリンに混合し、生菌製剤を得た。生菌製剤を１０ｇずつチャック付きポリエチレン袋（ユニパック　Ｂ－８、株式会社セイニチ社製）に分注したものを、シリカゲル１ｇ（富士シリシア化学株式会社製）を入れたアルミパウチ（ラミジップ、株式会社セイニチ社製）に梱包し、ヒートシールにより密閉したものを保存サンプルとした。保存サンプルを４０℃のインキュベーターで４ヶ月間保存した後、生菌製剤１００ｍｇを１ｍＬの生理食塩水に分散した菌体懸濁液を生理食塩水で１０７倍希釈した希釈液０．１ｍＬをＭＲＳ寒天培地に塗抹し、３７℃、２日間培養し出現するコロニー数をカウントし、４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を次式より算出した。そして前記生残率が８０％以上である乳酸菌を選抜した。
　４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率（％）＝（４０℃で４ヶ月間保存後の生菌製剤１ｇあたりの生菌数／１．０×１０１０）×１００
＜疲労改善効果の評価法＞
　疲労改善効果は、トレッドミル装置（５連式形式　ＭＫ－６８０Ｓ－０２Ａ、室町機会社製）を用いて、７～１０週齢のＳＤ系雄性ラット（１群；ｎ＝１０）を１０ｍ／ｍｉｎの速度で走行させ、３分ごとに５ｍ／ｍｉｎずつ段階的に速度を上げていき、ラットが走行不能となるまでの時間（最大走行時間）を測定することで評価した。被検物質投与前の最大走行時間と被検物質投与後２時間の最大走行時間を測定し、被検物質投与後２時間の最大走行時間から被検物質投与前の最大走行時間を引いた値（被検物質投与前後における最大走行時間の差）を算出し、被検物質投与により、被検物質投与前後における最大走行時間の差が増加しているか否かで評価した。
＜血流改善効果の評価法＞
　血流改善効果は、２０～５０歳の健常男性（１群；ｎ＝５）を対象に、被検物質を１週間摂取後に冷水負荷試験を実施することで評価した。冷水負荷試験は、被検者の左手を１５℃の冷水に１０秒間浸し、冷水負荷直後及び冷水負荷後１０分の皮膚温度をサーモグラフィー（ＴＶＳ　６００、日本アビオニクス社製）を用い測定した。被検物質摂取により、冷水負荷後１０分の平均皮膚温度から、冷水負荷直後の平均皮膚温度を引いた値（平均皮膚温度の差）が有意に増加しているか否かで評価した。平均皮膚温度は手背部の中指の指先、中指基節骨の中間点及び第３中指手骨の中間点の３ポイントの皮膚温度の平均値とした。
＜便臭改善効果の評価法＞
　便臭改善効果は、８日齢の雄の鶏ひな（１群；ｎ＝１０）に試験飼料を６日間与え、試験開始前及び試験終了時に回収した糞便の便臭を測定し、試験前後の便臭の低減率を算出することで評価した。被検物質を混合していない試験飼料（標準飼料）を与えた群の便臭の低減率と比べ、被検物質を混合した試験飼料（被検物質混合飼料）を与えた群の便臭の低減率が大きいか否かで評価した。便臭は、糞便の臭気指数、硫化水素ガス濃度、酢酸ガス濃度で評価し、試験前後の臭気指数、硫化水素ガス濃度、酢酸ガス濃度の低減率を算出した。臭気指数は、糞便１ｇを１００ｍＬの無臭蒸留水に懸濁し２５℃３０分間静置後、さらに１０倍希釈したものを試験水とし、３点比較式フラスコ法にて求めた。また、硫化水素ガス濃度及び酢酸ガス濃度は、糞便１００ｇをガラスシャーレに乗せ１０Ｌのポリスチレン製袋に入れ、袋内の空気を全て排出した後、活性炭を通し精製した無臭空気を袋内に充満させ密閉し、約２２℃の室温で１時間静置した後、袋内の硫化水素ガス及び酢酸ガス濃度をガス検知管で測定することで求めた。尚、回収した糞便は測定時まで密閉し、－８０℃で保管した。
＜成長促進効果の評価法＞
　成長促進効果は、５週齢のＩＣＲ雄性マウス（１群；ｎ＝１０）に試験飼料を１ヶ月間与え、試験終了時の体重を測定することで評価した。被検物質を混合していない試験飼料（標準飼料）を与えた群と比べ、被検物質を混合した試験飼料（被検物質混合飼料）を与えた群の体重が大きいか否かで評価した。試験期間中の各マウスの摂餌量を測定するため、マウスは個別飼育とし、試験飼料はローデンカフェ（オリエンタル酵母社製）付き粉末給餌器を用いて自由摂取させた。
　下記の実施例では、エンテロコッカス・フェシウムの基準株であるエンテロコッカス・フェシウム　ＤＳＭ２０４７７株を基準株と称する。尚、基準株の分散媒非存在下で凍結乾燥をした際の生菌の生残率は２５％であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率は４０％である。
（実施例１）＜Ｒ３０株のスクリーニング＞
　食品素材等から分離した乳酸菌１２５株（分離株１－分離株１２５）を対象に、上記１次スクリーニング法により、各分離株の分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率を求めた。
　１２５株中、分離株１７及び分離株８２の２株が分散媒非存在下で凍結乾燥をした際の生菌の生残率が４０％以上であった。
　次いで分離株１７及び分離株８２について、上記２次スクリーニング法により４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を求めた。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　２株中、分離株８２が４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であった。
　得られた分離株８２の菌学的性質をＡＰＩ２０ストレップ（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）を用いて調べた結果、エンテロコッカス・フェシウムと同一の菌学的性質を示した。さらに分離株８２の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の配列番号１との配列同一性を調べた結果、９９．８％の配列同一性であることが明らかとなり、分離株８２はエンテロコッカス・フェシウム属であることがわかった。以下実施例において、分離株８２はＲ３０株と称す。
（実施例２）＜Ｒ３０株の疲労改善効果の測定＞
　２次スクリーニング法に記載の方法に準じてＲ３０株及び基準株の凍結乾燥菌体を調製し、各々の凍結乾燥菌体を生菌数が５．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるようにデキストリンに混合した生菌製剤を得た。Ｒ３０株の生菌製剤を１ｇ／ｋｇ投与するＲ３０株投与群、基準株の生菌製剤を１ｇ／ｋｇ投与する基準株投与群、及びデキストリンを１ｇ／ｋｇ投与するデキストリン投与群について上記疲労改善効果の評価法を実施した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２より、Ｒ３０株投与群は、デキストリン投与群及び基準株投与群と比較して被検物質投与前後における最大走行時間の差が有意に増加した。したがって、Ｒ３０株は、疲労改善効果を有することが明らかとなった。
（実施例３）＜Ｒ３０株の血流改善効果の測定＞
　実施例２で調製したＲ３０株の生菌製剤を１ｇ／日摂取するＲ３０株摂取群、実施例２で調製した基準株の生菌製剤を１ｇ／日摂取する基準株摂取群及びデキストリンを１ｇ／日摂取するデキストリン摂取群について、上記血流改善効果の評価法を実施した。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３より、Ｒ３０株摂取群はデキストリン摂取群及び基準株摂取群と比較して、被検物質を１週間摂取後の平均皮膚温度の差が有意に増加した。したがって、Ｒ３０株は、血流改善効果を有することが明らかとなった。
（実施例４）＜Ｒ３０株の便臭改善効果の測定＞
　２次スクリーニング法に記載の方法に準じてＲ３０株の凍結乾燥菌体を調製し、該凍結乾燥菌体を生菌数が１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるようにデキストリンに混合した生菌製剤を得た。当該Ｒ３０株の生菌製剤が０．３重量％になるように標準飼料（ブロイラー肥育前期用標準飼料；日本配合飼料株式会社製）に混合した試験飼料（Ｒ３０株混合飼料）を調製し、上記便臭改善効果の評価法を実施した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４より、Ｒ３０株混合飼料群は、標準飼料群と比べ、臭気指数、硫化水素ガス濃度、酢酸ガス濃度の低減率が大きかった。したがって、Ｒ３０株は便臭改善効果を有することが明らかとなった。
（実施例５）＜Ｒ３０株の成長促進効果の測定＞
　被検物質として実施例４で調製したＲ３０株の生菌製剤が０．１重量％となるように標準飼料（ＣＥ－２粉末飼料；日本クレア社製）に混合した試験飼料（Ｒ３０株混合飼料）を調製し、上記成長促進効果の評価法を実施した。試験終了時の標準飼料を与えた群の体重を１００％とした時のＲ３０株混合飼料を与えた群の体重の割合を算出した。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５より、Ｒ３０株混合飼料を与えた群の体重の割合が１０７％と有意に高くなり、Ｒ３０株が成長促進効果を有することが明らかとなった。また、標準飼料を与えた群及びＲ３０株混合飼料を与えた群の試験期間中の総摂餌量の平均値は、各々２００ｇ、１９９ｇと差を認めないことから、Ｒ３０株は飼料効率向上効果を有することが明らかとなった。
　上記表２から表５の結果より、Ｒ３０株が疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果及び成長促進効果を有することが明らかとなったため、本発明者らはさらにＲ３０株と同一の菌学的性質を有し、且つ分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、４０℃で４カ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウム属である乳酸菌をスクリーニングすることにした。
（実施例６）＜Ｒ２８株のスクリーニング＞
　食品素材等から分離した乳酸菌を、ＡＰＩ２０ストレップ（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）を用いてエンテロコッカス・フェシウム属と同一の菌学的性質を示した１０株（エンテロコッカス・フェシウム株１～１０）を選抜した。各株に対して上記１次スクリーニング法を実施し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であった３株（エンテロコッカス・フェシウム株１、エンテロコッカス・フェシウム株２、エンテロコッカス・フェシウム株３）について２次スクリーニングを実施し、４０℃で４カ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を求めた。その結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６の結果より、エンテロコッカス・フェシウム株１が分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４カ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であった。また、エンテロコッカス・フェシウム株１について、１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列解析の結果、配列番号１と配列同一性が９９．９％であった。以下実施例において、エンテロコッカス・フェシウム株１をＲ２８株と称する。
（実施例７）＜Ｒ２８株の疲労改善効果及び血流改善効果の測定＞
　実施例６により得られたＲ２８株の疲労改善効果及び血流改善効果について、実施例２及び実施例３と同様に調べた。尚、エンテロコッカス・フェシウム株２及びエンテロコッカス・フェシウム株４はＲ２８株の比較対象とした。その結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７より、Ｒ２８株はエンテロコッカス・フェシウム株２及びエンテロコッカス・フェシウム株４と比較して、有意な疲労改善効果及び血流改善効果を有していることが明らかとなり、結果として特定の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌が優れた効果を持つことが明らかとなった。
（実施例８）＜Ｒ２８株の便臭改善効果及び成長促進効果の測定＞
　Ｒ２８株の便臭改善効果及び成長促進効果について、実施例４及び実施例５と同様に調べた。その結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８より、標準飼料のみを与えた群と比べＲ２８株混合飼料を与えた群は顕著な便臭改善効果、並びに、有意な成長促進効果を有することが明らかとなった。また、Ｒ２８株の成長促進効果の測定の結果、試験期間中の総摂餌量の平均値は標準飼料群、Ｒ２８混合飼料群共に２００ｇとなり、Ｒ２８株は、飼料効率向上効果を有することが明らかとなった。
（実施例９）＜Ｒ３０株、Ｒ２８株を用いた生菌製剤の製造方法＞
　Ｒ３０株を１ＬのＭＲＳ液体培地で３７℃、２４時間培養した。培養終了後、遠心分離した菌体を１Ｌの滅菌水で洗浄後、再度遠心分離することにより、菌体と滅菌水を分離させた。菌体を滅菌水で２０ｍＬにメスアップした菌体濃縮液に対して、ショ糖、トレハロース、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸からなる保護剤が菌体濃縮液中の乾燥菌体重量に対して、０、１、３、１０、１００、１０００、１００００重量％になるよう保護剤を溶解した溶液を添加し、凍結乾燥した。該凍結乾燥菌体を生菌数が１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるようにデキストリンに混合し、生菌製剤を調整し、４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を求めた。また、Ｒ２８株についても同様の実験を行った。その結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９の結果より、保護剤を乾燥菌体重量に対して１重量％以上添加することで、４０℃で４ヶ月間保存した際の生菌製剤の生菌の生残率が向上した。また、乾燥菌体重量に対して保護剤の量を、３重量％、１０重量％、１００重量％と増やすことで、４０℃で４ヶ月間保存した際の生菌製剤中の生菌の生残率は向上した。
　本発明は、乳酸菌を利用する機能性食品やサプリメントなどの食品、飼料、医薬品の製造分野において利用できる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。

Claims (14)

  1. 　以下の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
    形態学的性質
    　１）グラム染色：陽性
    　２）胞子形成能：なし
    　３）運動性：なし
    生理学的性質
    　１）カタラーゼ：陰性
    　２）ピルピン酸ナトリウムの分解：陽性
    　３）エスクリンの分解：陽性
    　４）ピロリドニル－２－ナフチルアミドの分解：陽性
    　５）２－ナフチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドの分解：陽性
    　６）Ｌ－ロイシン－２－ナフチルアミドの分解：陽性
    　７）Ｌ－アルギン酸の分解：陽性
    　８）各種炭水化物の分解性
    　Ｄ－リボース：＋
    　Ｄ－マンニトール：＋
    　乳糖：＋
    　Ｄ－ソルビトール：－
    　Ｄ－トレハロース：－
    　Ｄ－ラフィノース：－
  2. 　以下の化学分類学的性質を有することを特徴とする請求項１に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
    化学分類学的性質
    配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１と９０％以上の配列同一性を示す塩基配列を有する。
  3. 　エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）、エンテロコッカス・フェシウムＲ２８株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６１）、又は前記菌株がＤＮＡ変異処理された変異体である、請求項１又は２に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌。
  4. 　請求項１～３のいずれかに記載の乳酸菌、又は該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を含有する組成物。
  5. 　さらに保護剤を含むことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
  6. 　保護剤の含量が乾燥菌体重量に対して１重量％以上であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
  7. 　保護剤が、ショ糖、トレハロース、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸の群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
  8. 　請求項４～７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする疲労改善剤。
  9. 　請求項４～７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする血流改善剤。
  10. 　請求項４～７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする便臭改善剤。
  11. 　請求項４～７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする成長促進剤。
  12. 　請求項４～７のいずれかに記載の組成物を含有する食品。
  13. 　請求項４～７のいずれかに記載の組成物を含有する飼料または動物用医薬品。
  14. 　請求項４～７のいずれかに記載の組成物を含有する医薬品。
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