WO2021132453A1 - 毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、及び毛細血管新生促進剤 - Google Patents

毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、及び毛細血管新生促進剤 Download PDF

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WO2021132453A1
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capillary
strain
agent
enterococcus faecium
angiopathy
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PCT/JP2020/048408
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英己 藤野
愛郎 立垣
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国立大学法人神戸大学
株式会社カネカ
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • One or more embodiments of the present invention relate to any one of a capillary angiopathy inhibitor, a capillary angiopathy improving agent, and a capillary angiogenesis promoting agent.
  • One or more embodiments of the present invention also relate to preventive or inhibitory agents for diabetic complications.
  • Patent Document 1 discloses a blood glucose lowering agent and a diabetes treatment preventive agent containing a microorganism such as Enterococcus ferricus as an active ingredient.
  • Patent Document 2 discloses a blood pressure lowering agent and a hypoglycemic agent containing lactic acid bacteria cells such as Enterococcus ferricus as an active ingredient.
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 only describe that the blood glucose level is lowered or lowered, and do not describe the effect of directly suppressing or ameliorating the capillary disorder.
  • Patent Document 3 describes only the blood flow improving effect as an action of recovering the blood flow decreased under the low temperature condition when the temperature condition is returned to the normal temperature condition, and describes the effect of suppressing and improving the capillary disorder. Not.
  • one or more embodiments of the present invention have an object to provide a capillary angiopathy inhibitor, a capillary angiopathy improving agent, a capillary angiogenesis promoter, and a preventive or inhibitory agent for diabetic complications containing microorganisms as an active ingredient. did.
  • a capillary angiopathy inhibitor containing Enterococcus faecium R30 strain (accession number NITE BP-01362).
  • Disorder suppressant is 0.001 mg / kg body weight or more and 1000 mg / kg body weight or less.
  • the capillary angiogenesis-promoting agent according to (11) for improving or suppressing diabetic capillary disorders (12) The capillary angiogenesis-promoting agent according to (11) for improving or suppressing diabetic capillary disorders. (13) The capillary angiogenesis-promoting agent according to (11) or (12), which contains the killed bacteria of the strain. (14) The capillary according to any one of (11) to (13), wherein the dose of Enterococcus faecium R30 strain (accession number NITE BP-01362) is 0.001 mg / kg body weight or more and 1000 mg / kg body weight or less. Angiogenesis promoter.
  • a method for improving capillary disorders which comprises administering an effective amount of Enterococcus faecium R30 strain to a patient.
  • a method for promoting capillary angiogenesis which comprises administering an effective amount of Enterococcus faecium R30 strain to a patient.
  • the promotion method according to (26) wherein the patient is a patient who needs promotion of capillary angiogenesis.
  • a method for preventing or suppressing diabetic complications which comprises administering an effective amount of Enterococcus faecium R30 strain to a patient who needs prevention or suppression of diabetic complications.
  • (33) Use of (33), which comprises administering an effective amount of Enterococcus faecium R30 strain to a patient in need of promotion of capillary angiogenesis. (35) Use of Enterococcus faecium R30 strain for prevention or suppression of diabetic complications. (36) Use of (35), which comprises administering an effective amount of Enterococcus faecium R30 strain to a patient in need of prevention or suppression of diabetic complications. (37) The use according to any one of (29) to (36), which is a non-medical use. (38) The use according to any one of (29) to (36), which is a medical use.
  • Enterococcus faecium R30 strain for use in a method for suppressing capillary disorders.
  • Enterococcus faecium R30 strain for use in a method of promoting capillary angiogenesis.
  • the Enterococcus faecium R30 strain according to (45) wherein the method comprises administering an effective amount of Enterococcus faecium R30 strain to a patient in need of prevention or suppression of diabetic complications.
  • the capillary angiopathy inhibitor according to one or more embodiments of the present invention has an excellent capillary angiopathy inhibitory effect.
  • the capillary angiopathy improving agent or the angiogenesis promoting agent according to the present invention has an excellent effect of improving capillary angiopathy or promoting angiogenesis.
  • the capillary disorder inhibitor or ameliorating agent or the capillary angiogenesis promoter according to one or more embodiments of the present invention is effective for suppressing or ameliorating, for example, diabetic muscular tissue capillary disorder.
  • the preventive or suppressive agent for diabetic complications prevents or ameliorate diabetic complications by suppressing or ameliorating the capillary disorders that cause diabetic complications or promoting capillary neoplasia. It can be suppressed.
  • the preventive or suppressive agent for diabetic complications according to one or more embodiments of the present invention can prevent or suppress diabetic complications by an action different from that of a therapeutic agent for diabetes having a blood glucose lowering effect.
  • FIG. 2 shows the Wistar rat / saline administration group (CON / Salone), the Wistar rat / Enterococcus faecium R30 administration group (CON / R30), and the GK rat / saline administration group (GK /) in Example 3.
  • the measurement results of the capillary diameter of the flathead muscle after 8 weeks of rearing of Saline) and the GK rat / Enterococcus faecium R30 administration group (GK / R30) are shown.
  • FIG. 3 shows the soleus muscles of the GK rat / saline administration group (GK / Saline) and the GK rat / Enterococcus faecium R30 administration group (GK / R30) in Example 4 after 8 weeks of breeding. It is a three-dimensional image of a capillary vessel prepared by preparing a longitudinal section and constructing it with a confocal laser scanning microscope and fluorescence imaging software.
  • FIG. 4 shows the Wistar rat / saline administration group (CON / Salone), the Wistar rat / Enterococcus faecium R30 administration group (CON / R30), and the GK rat / saline administration group (GK /) in Example 5.
  • FIG. 5 shows the Wistar rat / saline administration group (CON / Salone), the Wistar rat / Enterococcus faecium R30 administration group (CON / R30), and the GK rat / saline administration group (GK /) in Example 5.
  • the capillary angiopathy inhibitor, ameliorating agent, the capillary angiogenesis promoter, and the preventive or inhibitory agent for diabetic complications include Enterococcus faecium R30 as an active ingredient. It is characterized by containing.
  • the Enterococcus faecium R30 strain may be simply abbreviated as "R30 strain”.
  • Enterococcus faecium R30 strain has been deposited with a depository institution as follows.
  • Accession number: NITE BP-01362 Enterococcus faecium R30 strain has the following mycological properties.
  • the method for culturing the R30 strain used in one or more embodiments of the present invention is not particularly limited as long as the R30 strain can be effectively cultured.
  • it can be cultured by in vitro culture, flask culture, culture in a fermenter, or the like.
  • the medium is not particularly limited, and any medium may be used as long as the R30 strain can be effectively cultured.
  • MRS medium generally used for culturing lactic acid bacteria can be used.
  • the R30 strain used in one or more embodiments of the present invention may be live or dead (killed sterilized).
  • the viable bacteria are R30 strains that are still alive, and include those that can grow and those that can grow again due to the presence of water even if they are not growing and are in a dormant state.
  • Dead bacteria are cells that have been sterilized by heating, pressurization, drug treatment, etc.
  • the sterilization treatment means is not particularly limited, and examples thereof include dry heat sterilization, steam sterilization, high-pressure steam sterilization, chemical sterilization, ultrasonic sterilization, electromagnetic wave sterilization, and ultraviolet sterilization.
  • the sterilization treatment may be performed after the collected bacterial cells have been dried.
  • the killed bacterium may be the killed bacterium itself or a processed product. Examples of the "processed product" include a processed product that has been subjected to at least one treatment selected from grinding and crushing of bacteria, concentration, pasting, drying, and dilution.
  • the means for drying the bacteria is not particularly limited, and examples thereof include spray drying, freeze drying, vacuum drying, and drum drying.
  • ⁇ Capillary angiopathy inhibitor> One or more embodiments of the present invention relate to a capillary angiopathy inhibitor containing the R30 strain. Another one or more embodiments of the present invention relate to the use of the R30 strain in the manufacture of a capillary angiopathy inhibitor.
  • the capillary angiopathy inhibitor may be a food or drink composition ingested for non-medical purposes, a pharmaceutical composition ingested for medical purposes, or a feed composition. You may. Specific examples of the food / drink composition, the pharmaceutical composition or the feed composition will be described later.
  • the pharmaceutical composition may be a human pharmaceutical composition or a non-human veterinary pharmaceutical composition, but is preferably a human pharmaceutical composition.
  • Another embodiment of the present invention is a method for suppressing capillary disorders, which comprises administering an effective amount of Enterococcus faecium R30 strain to a patient.
  • Another or more embodiment of the present invention is the use of Enterococcus faecium R30 strain for suppressing capillary damage.
  • Another embodiment of the present invention is Enterococcus faecium R30 strain for use in a method of suppressing capillary damage.
  • the R30 strain used in each of the above embodiments can be in the above various forms.
  • the capillary angiopathy inhibitor according to one or more embodiments of the present invention has an excellent capillary angiopathy inhibitory effect.
  • the capillary disorder inhibitor according to one or more embodiments of the present invention is effective in suppressing, for example, diabetic muscular tissue capillary disorder.
  • the capillary disorder refers to a disorder in which capillaries in a tissue regress. Therefore, the term “capillary disorder” is synonymous with “capillary regression” or “tissue capillary regression”.
  • Capillary disorders are typically diabetic capillary disorders, but may be capillary disorders caused by other causes.
  • Diabetic capillary disorders are disorders of the microcapillary network in tissues, especially caused by the production of advanced glycation end products and the increase of excess reactive oxygen species associated with elevated blood glucose levels, and are diabetic complications. Causes.
  • the capillary angiopathy inhibitor according to one or more embodiments of the present invention is characterized in that it suppresses tissue capillary angiopathy without suppressing an increase in blood glucose level. Therefore, when the anti-angiopathy agent according to one or more embodiments of the present invention and a drug having an action of suppressing blood glucose level are used in combination and administered to a patient suffering from diabetes and diabetic complications, the blood glucose level It is preferable because the dose of a drug having an action of suppressing diabetes can be reduced.
  • the capillary angiopathy inhibitor of one or more embodiments of the present invention can suppress capillary angiopathy without administering a drug having an action of suppressing blood glucose level.
  • the capillary angiopathy inhibitor according to one or more embodiments of the present invention can also be administered to a patient having a side effect on a drug having an action of suppressing a blood glucose level, and it is necessary to limit the patients to be administered. It is useful because there is no such thing.
  • the administration of the capillary angiopathy inhibitor according to one or more embodiments of the present invention to a patient can be performed in combination with exercise therapy for the patient.
  • the patient in "administration to a patient” may be a patient who needs suppression of capillary angiopathy as described later, and although the symptoms of capillary angiopathy have not become apparent in addition to the patient with capillary angiopathy. Includes those who may develop or become manifest in the future, those who need to prevent capillary disorders, and those who want to.
  • the inhibitory effect on capillary disorders can be evaluated, for example, by measuring the diameter of the soleus muscle of Goto-Kakizaki (GK) rats, which is a spontaneous type 2 diabetes model. If the soleus muscle capillary diameter of the soleus muscle capillaries of the GK rat to which the test substance is administered is larger than that of the experimental animal to which the test substance is not administered, it can be evaluated that the test substance has an inhibitory effect on capillary damage. The inhibitory effect can also be evaluated by visually observing an image of capillaries in the soleus muscle of the rat that has been fluorescently stained.
  • GK Goto-Kakizaki
  • the frequency and dose of administration of the capillary angiopathy inhibitor according to one or more embodiments of the present invention to a patient may be appropriately adjusted according to the age, sex, condition, etc. of the patient to be administered.
  • the daily dose of the R30 strain may be appropriately adjusted, and may be, for example, 0.001 mg / kg body weight or more and 1000 mg / kg body weight or less.
  • the dose is preferably 0.01 mg / kg body weight or more, more preferably 0.1 mg / kg body weight or more, more preferably 10 mg / kg body weight or more, preferably 800 mg / kg body weight or less, and preferably 550 mg / kg body weight or less. More preferred.
  • the number of administrations per day may be appropriately adjusted, but can be, for example, 1 or more and 5 or less.
  • the route of administration may be oral administration or parenteral administration, but oral administration is preferable.
  • the patient to be administered may be a patient who needs to suppress capillary disorders, for example, a human or a non-human animal, and preferably a human.
  • non-human animals include farmed animals, pet animals, and competitive animals.
  • the farmed animals are not particularly limited, but livestock such as horses, cows, pigs, sheep, goats, camels, and llamas; experimental animals such as mice, rats, guinea pigs, and rabbits; and poultry such as chickens, ducks, turkeys, and ostriches. Be done.
  • the pet animal is not particularly limited, but examples thereof include dogs and cats.
  • the competition animal is not particularly limited, but includes a racehorse and the like.
  • the non-human animal is particularly preferably a mammal.
  • the capillary angiopathy inhibitor according to one or more embodiments of the present invention can contain various additives such as a mold release agent. Specific examples of the various additives will be described later.
  • the content of the R30 strain in the capillary angiopathy inhibitor when the capillary angiopathy inhibitor contains the various additives is not particularly limited, but the lower limit is preferably 0.001% by weight or more, for example. 0.01% by weight or more and 0.1% by weight or more are more preferable.
  • the upper limit is preferably 100% by weight or less, and more preferably 50% by weight or less and 30% by weight or less, for example.
  • the content of the R30 strain contained in each formulation is not particularly limited and may be adjusted as appropriate. However, it may be, for example, 0.1 mg / agent or more and 1000 mg / agent or less.
  • the content of the R30 strain contained in the one preparation is preferably 5 mg / agent, 10 mg / agent, 30 mg / agent, 50 mg / agent, or 100 mg / agent.
  • the capillary disorder inhibitor according to one or more embodiments of the present invention is a food or drink composition, a pharmaceutical composition or a feed composition, or when the capillary disorder inhibitor according to one or more embodiments of the present invention is eaten or eaten.
  • the content in the food or drink composition, the pharmaceutical composition or the feed composition can be 0.00001% by weight or more as the lower limit.
  • the lower limit for example, 0.001% by weight or more and 0.01% by weight or more are preferable.
  • the upper limit can be 90% by weight or less.
  • the upper limit is preferably 80% by weight or less, 70% by weight or less, 60% by weight or less, and 50% by weight or less. More preferably, it is 30% by weight or less.
  • ⁇ Capillary angiopathy improving agent> One or more embodiments of the present invention relate to a capillary angiopathy improving agent containing the R30 strain. Another one or more embodiments of the present invention relate to the use of the R30 strain in the manufacture of a capillary angiopathy improving agent.
  • the capillary angiopathy improving agent may be an edible composition ingested for non-medical purposes or a pharmaceutical composition ingested for medical purposes, similarly to the above-mentioned capillary angiopathy inhibitor. It may be a feed composition or it may be a feed composition. Specific examples of the food / drink composition, the pharmaceutical composition or the feed composition will be described later.
  • the pharmaceutical composition may be a human pharmaceutical composition or a non-human veterinary pharmaceutical composition, but is preferably a human pharmaceutical composition.
  • Another embodiment of the present invention is a method for improving capillary disorders, which comprises administering an effective amount of Enterococcus faecium R30 strain to a patient.
  • Another or more embodiment of the present invention is the use of Enterococcus faecium R30 strain for ameliorating capillary disorders.
  • Another one or more embodiment of the present invention is Enterococcus faecium R30 strain for use in a method of ameliorating capillary disorders.
  • the R30 strain used in each of the above embodiments can be in the above various forms.
  • the capillary disorder improving agent according to one or more embodiments of the present invention is effective for improving, for example, diabetic muscular tissue capillary disorder.
  • the capillary angiopathy improving agent according to one or more embodiments of the present invention can improve the capillary angiopathy caused by an increase in blood glucose level without ingesting a diabetes therapeutic agent having an action of suppressing blood glucose level. it can. Therefore, the capillary angiopathy improving agent according to one or more embodiments of the present invention is preferable because the intake amount can be reduced when used in combination with a diabetes therapeutic agent having an action of suppressing a blood glucose level. In addition, the above-mentioned capillary angiopathy improving agent is useful because the administration of a diabetic therapeutic agent can be administered to a patient who has been stopped due to a side effect.
  • the administration of the capillary angiopathy improving agent according to one or more embodiments of the present invention to a patient can be performed in combination with exercise therapy to the patient.
  • the patient in "administration to a patient” may be a patient who needs improvement of capillary angiopathy, and other than the patient with capillary angiopathy, although the symptoms of capillary angiopathy have not become apparent, they will develop or develop in the future. It also includes those who may become manifest, those who need to prevent capillary disorders, and those who want to.
  • the ameliorating effect of capillary angiopathy can be evaluated, for example, by measuring the diameter of the soleus muscle of Goto-Kakizaki (GK) rat, which is a spontaneous type 2 diabetes model. If the soleus muscle capillary diameter of the GK rat to which the test substance is administered is larger than that of the experimental animal to which the test substance is not administered, it can be evaluated that the test substance has a capillary improving effect.
  • the improving effect can also be evaluated by visually observing an image of capillaries in the soleus muscle of the rat that has been fluorescently stained. If an image in which the capillaries of the GK rat to which the test substance is administered is larger than that of the experimental animal to which the test substance is not administered can be observed, it can be evaluated that the test substance has a capillary improving effect.
  • the frequency and dose of administration of the capillary angiopathy improving agent according to one or more embodiments of the present invention to a patient can be selected from the above-mentioned examples of the capillary angiopathy inhibitor.
  • the capillary disorder improving agent according to one or more embodiments of the present invention is a food or drink composition, a pharmaceutical composition or a feed composition, or when the capillary disorder improving agent according to one or more embodiments of the present invention is eaten or eaten.
  • the vascular improver is in the form of a formulation such as a capsule or a tablet
  • the content of the R30 strain contained in each formulation can be selected from the above-mentioned examples of the capillary disorder inhibitor.
  • One or more embodiments of the present invention relate to a capillary angiogenesis promoter containing the R30 strain. Another embodiment of the present invention relates to the use of the R30 strain in the production of a capillary angiogenesis promoter.
  • the capillary angiogenesis-promoting agent may be an edible composition taken for non-medical purposes, or a pharmaceutical product taken for medical purposes, like the above-mentioned capillary angiopathy inhibitor and capillary angiopathy improving agent. It may be a composition or a feed composition. Specific examples of the food / drink composition, the pharmaceutical composition or the feed composition will be described later.
  • the pharmaceutical composition may be a human pharmaceutical composition or a non-human veterinary pharmaceutical composition, but is preferably a human pharmaceutical composition.
  • Another embodiment of the present invention is a method for promoting capillary angiogenesis, which comprises administering an effective amount of Enterococcus faecium R30 strain to a patient.
  • Another or more embodiment of the present invention is the use of Enterococcus faecium R30 strain for promoting capillary angiogenesis.
  • Another one or more embodiment of the present invention is Enterococcus faecium R30 strain for use in a method of promoting capillary angiogenesis.
  • the R30 strain used in each of the above embodiments can be in the above various forms.
  • the capillary angiogenesis promoter according to the present invention is effective for improving or suppressing diabetic muscular tissue capillary disorders, for example.
  • the capillary angiogenesis promoter according to one or more embodiments of the present invention can promote angiogenesis and improve capillary disorders such as capillary regression.
  • administration of the capillary angiogenesis-promoting agent according to one or more embodiments of the present invention to a patient can be performed in combination with exercise therapy for the patient.
  • the patient in "administration to a patient” may be a patient who requires new capillaries, and in addition to patients with capillary disorders, the symptoms of capillary disorders have not become apparent, but they will develop or become apparent in the future. It also includes those who may become ill, those who need to prevent capillary disorders, and those who want to.
  • the promoting action of capillary angiogenesis can be evaluated, for example, by measuring the capillary diameter of the soleus muscle of Goto-Kakizaki (GK) rat, which is a spontaneous type 2 diabetes model. If the soleus muscle capillary diameter of the soleus muscle capillaries of the GK rat to which the test substance is administered is larger than that of the experimental animal to which the test substance is not administered, it can be evaluated that the test substance has a capillary angiogenesis-promoting effect.
  • the promoting action can also be evaluated by visually observing an image of capillaries in the soleus muscle of the rat that has been fluorescently stained. If an image in which the capillaries of the GK rat to which the test substance is administered is larger than that of the experimental animal to which the test substance is not administered can be observed, it can be evaluated that the test substance has a capillary angiogenesis-promoting effect.
  • the frequency and dose of administration of the capillary angiogenesis-promoting agent according to one or more embodiments of the present invention to a patient can be selected from the above-mentioned examples of a capillary angiopathy inhibitor and a capillary improving agent.
  • the capillary angiogenesis promoter according to one or more embodiments of the present invention is a food or drink composition, a pharmaceutical composition or a feed composition, or when the capillary angiogenesis promoter according to one or more embodiments of the present invention is eaten or eaten.
  • the angiogenesis-promoting agent is in the form of a preparation such as a capsule or a tablet
  • the content of the R30 strain contained in each preparation can be selected from the above-mentioned examples of the capillary damage inhibitor.
  • One or more embodiments of the present invention relate to a prophylactic or inhibitory agent for diabetic complications containing the R30 strain. Another embodiment of the present invention relates to the use of the R30 strain in the manufacture of a prophylactic or inhibitor of diabetic complications.
  • the food or drink composition for preventing or suppressing diabetic complications may be a food or drink composition ingested for non-medical purposes, or a food or drink composition ingested for medical purposes. It may be a feed composition. Food and Beverage Composition Specific examples of the food and drink composition, the pharmaceutical composition or the feed composition are as described later.
  • the pharmaceutical composition may be a human pharmaceutical composition or a non-human veterinary pharmaceutical composition, but is preferably a human pharmaceutical composition.
  • Another embodiment of the present invention is a method for preventing or suppressing diabetic complications, which comprises administering an effective amount of the R30 strain to a patient in need of preventing or suppressing diabetic complications.
  • Another embodiment of the present invention is the use of Enterococcus faecium R30 strain for the prevention or control of diabetic complications.
  • Another one or more embodiment of the present invention is Enterococcus faecium R30 strain for use in a method for preventing or suppressing diabetic complications.
  • the R30 strain used in each of the above embodiments can be in the above various forms.
  • prevention of diabetic complications refers to preventing the onset or prevalence of diabetic complications
  • suppression of diabetic complications refers to suppressing the progression of diabetic complications
  • the preventive or suppressive agent for diabetic complications can prevent or suppress diabetic complications by suppressing the capillary angiopathy that causes diabetic complications.
  • the targeted diabetic complications may be type 1 diabetic complications or type 2 diabetic complications.
  • the preventive or inhibitory agent for diabetic complications according to one or more embodiments of the present invention and a diabetic therapeutic agent having an action of suppressing blood glucose level are used in combination and administered to a patient suffering from diabetes and diabetic complications. It is preferable because the dose of the diabetes therapeutic agent can be reduced. Further, the preventive or suppressive agent for diabetic complications according to one or more embodiments of the present invention is also effective for patients who have stopped administration of a diabetic therapeutic agent having an action of suppressing blood glucose level due to side effects. Is. Administration of a preventive or inhibitory agent for diabetic complications according to one or more embodiments of the present invention to a patient can be performed in combination with exercise therapy for the patient.
  • the frequency and dose of administration of the preventive or suppressive agent for diabetic complications according to one or more embodiments of the present invention to a patient requiring prevention or suppression of diabetic complications is the age, sex, and condition of the patient to be administered. It may be adjusted appropriately according to the above.
  • the daily dose of the R30 strain may be appropriately adjusted, and may be, for example, 0.001 mg / kg body weight or more and 1000 mg / kg body weight or less.
  • the dose is preferably 0.01 mg / kg body weight or more, more preferably 0.1 mg / kg body weight or more, more preferably 10 mg / kg body weight or more, preferably 800 mg / kg body weight or less, and preferably 550 mg / kg body weight or less. More preferred.
  • the number of administrations per day may be appropriately adjusted, but can be, for example, 1 or more and 5 or less.
  • the route of administration may be oral administration or parenteral administration, but oral administration is preferable.
  • the patient to be administered may be a patient who needs to suppress capillary disorders, for example, a human or a non-human animal, and preferably a human. Examples of non-human animals are as described above.
  • the agent is a food composition, pharmaceutical composition or feed composition, or prevention of diabetic complications according to one or more embodiments of the present invention.
  • the inhibitor when used in the production of a food or drink composition, a pharmaceutical composition or a feed composition, the content of the R30 strain in the food or drink composition, the pharmaceutical composition or the feed composition is not particularly limited and is appropriately adjusted.
  • the content in the food or drink composition, the pharmaceutical composition, or the feed composition can be 0.00001% by weight or more and 50% by weight or less.
  • the ratio is preferably 0.001% by weight or more, more preferably 0.01% by weight or more, and preferably 30% by weight or less.
  • the shape of the capillary angiopathy inhibitor, the capillary angiopathy improving agent, the capillary angiogenesis promoter, or the preventive or inhibitory agent for diabetic complications according to one or more embodiments of the present invention is not particularly limited.
  • it may be the R30 strain itself of the above-mentioned various forms, or it may be a composition containing the R30 strain and other components.
  • the composition containing the R30 strain and other components can be a composition according to the purpose such as a pharmaceutical composition, a food / drink composition, a feed composition, and the like.
  • the capillary angiopathy inhibitor, the capillary angiopathy improving agent, the capillary angiopathy promoter, or the preventive or inhibitory agent for diabetic complications is highly effective when orally administered as in the examples below.
  • pharmaceutical compositions, food and drink compositions, and feed compositions that are orally ingested or administered are preferable.
  • the "capillary angiopathy inhibitor, capillary angiopathy improving agent, capillary angiogenesis promoter or preventive or inhibitory agent for diabetic complications” according to one or more embodiments of the present invention is simply referred to as "one or more of the present invention". It may be referred to as "the agent according to the embodiment".
  • a composition containing viable bacteria of R30 strain cells of R30 strain are collected in a culture solution cultured by a conventional method, a solution in which a protective agent is dissolved is added to the collected cells, and the mixture is dried. After that, it can be produced by mixing with a suitable excipient.
  • the protective agent refers to a component that protects bacterial cells from the external environment, maintains the viable cell count, or suppresses the decrease in the viable cell count.
  • the protective agent examples include trehalose, bovine serum albumin, defatted milk powder, sodium glutamate, L-ascorbic acid, histidine, malic acid, whey, glucose, aspartic acid, methionine, starch, dextrin, sucrose, lactose, sodium chloride, etc. Any substance such as phosphate that can reduce the damage to the cells may be used. These protective agents can be used alone or in combination.
  • the blending ratio of each protective agent is not limited, but the lower limit of the total amount of the protective agent is preferably 1% by weight or more based on the weight of the dried cells. When the above ratio is 1% by weight or more, the damage suffered by the bacterial cells can be more reliably reduced.
  • the upper limit of the above ratio is not particularly limited, but can be, for example, 50,000% by weight or less.
  • the ratio is more preferably 10% by weight or more, further preferably 50% by weight or more, further preferably 100% by weight or more, still more preferably 20,000% by weight or less, still more preferably 10,000% by weight or less.
  • the composition containing the killed bacteria of the R30 strain can be prepared, for example, by collecting the cells in the culture solution cultured by a conventional method, sterilizing the collected cells, drying the cells, and then using an appropriate excipient. It can be manufactured by mixing.
  • the capillary angiopathy inhibitor, the capillary angiopathy improving agent, the capillary angiogenesis promoter, or the preventive or inhibitory agent for diabetic complications are various additives used in the production of general preparations.
  • the agent may be contained in an appropriate amount.
  • additives include excipients, binders, disintegrants, acidulants, foaming agents, artificial sweeteners, fragrances, lubricants, colorants, stabilizers, pH adjusters, surfactants and the like. Can be mentioned.
  • excipients include starches such as corn starch, horse bell starch, wheatco starch, rice starch, partially pregelatinized starch, pregelatinized starch, and perforated starch, sugars such as lactose, sucrose, and glucose, mannitol, xylitol, and the like.
  • sugars such as lactose, sucrose, and glucose, mannitol, xylitol, and the like.
  • sugar alcohols such as erythritol, sorbitol and martitol
  • inorganic compounds such as magnesium aluminometasilicate, hydrotalcite, anhydrous calcium phosphate, precipitated calcium carbonate, calcium silicate and light anhydrous silicic acid.
  • examples of the excipient include gum arabic, lactose, microcrystalline cellulose, starch, sodium starch glycolate, calcium hydrogen phosphate, magnesium stearate, talc, colloidal silicon dioxide and the like.
  • binder examples include hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, gum arabic powder, gelatin, pullulan and the like.
  • disintegrant examples include starch, agar, carmellose calcium, sodium carboxymethyl starch, croscarmellose sodium, crospovidone, crystalline cellulose, F-MELT (trademark, manufactured by Fuji Chemical Industry Co., Ltd.) and the like.
  • Examples of the acidulant include citric acid, tartaric acid, malic acid, ascorbic acid and the like.
  • Examples of the foaming agent include sodium hydrogen carbonate and sodium carbonate.
  • Examples of the sweetener include sodium saccharin, dipotassium glycyrrhizin, aspartame, stevia, thaumatin and the like.
  • Examples of the fragrance include lemon oil, orange oil, menthol and the like.
  • Examples of the lubricant include magnesium stearate, sucrose fatty acid ester, polyethylene glycol, talc, stearic acid, and stearyl sodium fumarate.
  • Examples of the colorant include edible pigments such as edible yellow No. 5, edible red No. 2, edible blue No. 2, edible rake pigment, iron sesquioxide and the like.
  • stabilizer examples include sodium edetate, tocopherol, cyclodextrin and the like.
  • pH adjuster examples include citrate, phosphate, carbonate, tartrate, fumarate, acetate, amino acid salt and the like.
  • surfactant examples include polysorbate 80, methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, sodium carboxylmethyl cellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, gum arabic, powdered tragant and the like.
  • the agent according to one or more embodiments of the present invention is a pharmaceutical composition, a food or drink composition, or a feed composition will be described.
  • the agent containing the R30 strain can be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition can be in the form of tablets, powders, capsules, sugar-coated tablets, granules, extracts, elixirs, syrups, tinctures, limonades and the like.
  • the pharmaceutical composition can contain a pharmaceutically acceptable additive (also referred to as a pharmaceutically acceptable carrier), depending on the desired dosage form.
  • a pharmaceutically acceptable additive include, for example, excipients, disintegrants, lubricants, antioxidants, flavors, seasonings, sweeteners, colorants, thickening stabilizers, color formers, bleaching agents, preservatives, gum bases.
  • the pharmaceutical composition can be produced by a conventional method depending on the dosage form and the like.
  • the pharmaceutical composition may be a pharmaceutical composition administered to humans or a pharmaceutical composition administered to non-human animals. Specific examples of non-human animals are as described above.
  • the pharmaceutical composition administered to a non-human animal may be a composition further containing, in addition to the R30 strain as an active ingredient, an ingredient acceptable as a feed that can be blended in a feed composition described later.
  • the agent containing the R30 strain can be used as a food and drink composition.
  • the food and drink composition may be a general food and drink composition such as general foods and beverages, so-called health foods, supplements, functional foods, functional foods, nutritional supplements, foods for specified health use. , Nutritional functional foods, health functional foods, special purpose foods, nursing foods, smile care foods, chewing / swallowing supplements, concentrated liquid foods, sick foods, dietary supplements, etc. Good.
  • the food or drink composition as an agent according to one or more embodiments of the present invention contains an ingredient acceptable as a food or drink in addition to the R30 strain.
  • the form of the food or drink composition is not particularly limited, and for example, beverages such as milk drinks, frozen desserts, sports drinks, nutritional drinks, beauty drinks, liquid nutritional supplements; chewing gum, chocolate, candies, jellies, cakes, pies, cookies. , Japanese confectionery, snack confectionery, oil confectionery, rice confectionery, biscuits, crackers and other confectionery; ice cream, frozen desserts and other frozen desserts; udon, Chinese noodles, spaghetti, instant noodles and other confectionery; Seasonings such as dressings, mayonnaise, sauces, sauces; bread, ham, miscellaneous dishes, rice, soups, retort foods, frozen foods, edible oil and fat compositions, cooking oils, spray oils, butters, margarines, shortening Other processed products such as whipped creams, concentrated milks, whiteners, dressings, pickle liquids, bakery mixes, fried foods, processed meat products, tofu and konjac; jams, fermented milks, etc. Examples thereof include common forms of food and drink compositions such as canned
  • the food or drink composition is a food for specified health use, a food with functional claims, or a dietary supplement
  • the food or drink composition is wrapped in a package, and the package is used to suppress capillary disorders or cause capillary disorders.
  • Functions related to improvement of, promotion of capillary neoplasia, and prevention or suppression of diabetic complications may be displayed.
  • the package is not particularly limited, and examples thereof include a box, a container, a wrapping film, and a wrapping paper.
  • the functions displayed on the package include suppression of capillary disorders, improvement of capillary disorders, promotion of capillary neoplasia, prevention or suppression of diabetic complications, functions related to them, and capillaries.
  • the purposes and effects described in the present specification include the action of suppressing disorders, the action of improving capillary disorders, the action of promoting capillary neoplasia, and the action of preventing or suppressing diabetic complications.
  • the expressions may be different.
  • Functional foods are foods that have the effect of angiopathy-suppressing agents permitted and designated by the national government and public organizations.
  • foods with functional health such as nutritional functional foods and foods for specified health use, special uses. Food, etc.
  • the names and regulations change depending on the situation and the times, those that are essentially the same are included in the present invention.
  • Food and beverage compositions as agents according to one or more embodiments of the present invention include capsules, syrups, tablets, pills, powders, granules, drinks, injections, infusions, nasal drops, eye drops, etc. It may be in the form of a suppository, a patch, a spray, or the like.
  • other components permitted as foods and drinks such as excipients, disintegrants, lubricants, binders, antioxidants, colorants, antioxidants, and absorption promotion It can be prepared by appropriately adding an agent, a solubilizing agent, a stabilizer and the like.
  • the agent according to one or more embodiments of the present invention can be a feed composition (including pet food).
  • the feed composition contains components that are acceptable as feed and the R30 strain, which are selected according to the breeding environment such as the type of animal, the growth stage, and the area.
  • Acceptable ingredients for feed include general feed ingredients and feed additives commonly used in formula feeds (eg, excipients, bulking agents, binders, thickeners, emulsifiers, colorants, fragrances, etc.) Examples include food additives, seasonings, etc.) and ingredients other than feed additives (eg, antibiotics, bactericides, insecticides, preservatives, etc.).
  • Examples of general feed raw materials include grains or processed grains, rice bran, vegetable oil cakes, animal raw materials, minerals, vitamins, amino acids, yeasts such as brewer's yeast, and fine powders of inorganic substances. Can be mentioned.
  • Examples of cereals or processed cereals include corn, mylo, barley, wheat, rye, swallow, millet, wheat flour, wheat germ flour and the like.
  • Examples of bran include bran, rice bran, and corn gluten feed.
  • Examples of vegetable oil cakes include soybean oil cakes, sesame oil cakes, cottonseed oil cakes, peanut cakes, sunflower cakes, and saflower cakes.
  • Examples of animal raw materials include skim milk powder, fish meal, meat-and-bone meal and the like.
  • Examples of minerals include calcium carbonate, calcium phosphate, salt, silicic anhydride and the like.
  • Examples of vitamins include vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, vitamin B12, calcium pantothenate, nicotinic acid amide, and folic acid.
  • Examples of amino acids include glycine and methionine.
  • Examples of the fine powder of the inorganic substance include crystalline cellulose, talc, silica, muscovite, and zeolite.
  • the form of the feed composition is not particularly limited, and examples thereof include powder, granule, paste, pellet, capsule, and tablet.
  • the capsule may be a hard capsule or a soft capsule.
  • the non-human animals to be fed the feed composition are not particularly limited. Specific examples of non-human animals are as described above.
  • Example 1 Preparation of lyophilized cells of Enterococcus faecium R30 strain MRS bouillon (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) (0.52 g) is dissolved in water (10 mL) and then sterilized by heating at 121 ° C. for 15 minutes in an autoclave. This prepared the MRS liquid medium. A glycerol stock suspension (100 ⁇ L) of Enterococcus faecium R30 strain (accession number NITE BP-01362) was inoculated into the liquid medium (10 mL) and cultured at 37 ° C. for 24 hours to obtain a preculture solution. ..
  • the preculture solution (1 mL) was added to the above MRS liquid medium (100 mL), and the mixture was further cultured at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the culture, the cells were centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to separate the culture solution and the cells. The cells were washed with sterile water (100 mL) and then centrifuged again to separate the cells from the sterile water. Sterilized water (2 mL) was added to the cells, and the cells were sterilized by heating at 90 ° C. for 30 minutes and then freeze-dried to obtain freeze-dried cells of Enterococcus faecium R30 strain.
  • Each group was preliminarily bred for 1 week with free intake of water in addition to normal feed (“CE-2”, manufactured by Japan Marie). Then, the lyophilized cells of the Enterococcus faecium R30 strain prepared in Example 1 were dispersed in physiological saline, and the dose of the cells was reduced to 500 mg per kg of body weight in the CON / R30 group and the GK / R30 group. So, using a sonde (oral tube), the animals were orally administered twice a day and bred for 8 weeks.
  • Diabetes was evaluated by a glucose tolerance test 8 weeks after breeding. Diabetes is evaluated by collecting blood after 18 hours of fasting (0 minutes), orally administering 10 mL of a glucose aqueous solution adjusted to 0.2 g / mL per rat body weight (kg), and collecting blood after 15, 30, 60 and 120 minutes. The blood glucose level in each blood sample was measured using a blood glucose meter (“Precision Exceed”, manufactured by Abbott Laboratories, Inc.). The measurement results are shown in FIG.
  • the increase in blood glucose level after glucose administration in the GK / Salon group in which physiological saline was administered to GK rats, which is a spontaneous type 2 diabetes model, indicates that the GK rats are in a diabetic state. Understand.
  • the GK / R30 group in which Enterococcus faecium R30 strain was administered to GK rats also had an elevated blood glucose level after glucose administration, indicating that the GK / R30 group is also in a diabetic state.
  • Example 3 Effect of Enterococcus cesium R30 strain on the diameter of capillaries of flathead muscle
  • a cannula was inserted into the abdominal aorta, the skeletal muscle capillaries were perfused with physiological saline, and a 1% fluorescent substance (fluorescent marker supplement ink Tombow) was added to an 8% gelatin solution (manufactured by Sigma Aldrich) liquefied at 42 ° C. After perfusion with a fluorescent contrast medium containing (manufactured by), the capillaries were removed.
  • the excised fluffy muscle was frozen at -80 ° C, a longitudinal section with a thickness of 100 ⁇ m was prepared with a cryostat, fixed with 4% paraformaldehyde, and confocal laser scanning microscope (C2 + NIKON) using an argon laser (488 nm). Capillaries existing at every 1 ⁇ m of muscle section were scanned with fluorescence imaging software (manufactured by NIS-Elements NIKON), and the capillaries were measured. The measurement results are shown in FIG.
  • the number of measurements (n number) of the capillary diameter in the Wistar rat / saline administration group (CON / Salone) was 29, the n number in the Wistar rat / Enterococcus faecium R30 administration group (CON / R30) was 29, and GK rat /
  • the number of n in the saline administration group (GK / Salone) was 27, and the number of n in the GK rat / Enterococcus faecium R30 administration group (GK / R30) was 23.
  • the capillary diameter (average 7.2 ⁇ m) of the CON / R30 group is equivalent to that of the capillary diameter (average 7.0 ⁇ m) of the CON / Saline group.
  • the average capillary diameter is 6.0 ⁇ m, and the capillary diameter is significantly smaller than that in the CON / Saline group, resulting in capillary damage due to the diabetic state. You can see that.
  • the average capillary diameter was 7.0 ⁇ m, and the capillary diameter was significantly larger than that in the GK / Salon group, which was equivalent to that in the non-diabetic CON / Salon group. It can be seen that it is the diameter of the capillaries. From this result, it was clarified that Enterococcus faecium R30 lactic acid bacterium has an effect of suppressing capillary damage.
  • the lyophilized cells of the Enterococcus faecium R30 strain prepared in Example 1 were dispersed in physiological saline, and the GK / R30 group was subjected to a sonde so that the dose of the cells was 500 mg / kg body weight.
  • Oral tube was orally administered twice a day and bred for 8 weeks. Eight weeks after breeding, after anesthesia with sodium pentobarbital (50 mg / kg), a cannula was inserted into the abdominal aorta, the skeletal muscle capillaries were perfused with physiological saline, and an 8% gelatin solution liquefied at 42 ° C.
  • FIG. 3 is a three-dimensional image of capillaries constructed with a confocal laser scanning microscope and fluorescence imaging software.
  • Example 5 Capillary angiogenesis confirmation test
  • the soleus muscle excised in Example 3 and frozen at -80 ° C was homogenized in HEPES buffer to which a protease inhibitor was added, and then the supernatant was recovered by centrifugation. ..
  • the total amount of protein in the supernatant was measured, the concentration was adjusted so that the total amount of protein between the samples was the same, and the sample was subjected to SDS-PAGE.
  • the protein developed by electrophoresis is transferred to the PVDF membrane, and after blocking, a 100-fold diluted solution of anti-thrombospondin-1 (TSP-1) antibody (“sc-59887” manufactured by Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-VEGF antibody.
  • TSP-1 anti-thrombospondin-1
  • the amount of ⁇ -actin biosynthesis was measured, and the amount of TSP-1 and VEGF biosynthesis in each sample was standardized by the amount of ⁇ -actin biosynthesis in the same sample and standardized as a relative value to CON / Analyzer.
  • One-way ANOVA and Turkey-Kramer multiple comparison test were performed on the measured values.
  • the results are shown in FIGS. 4 and 5.
  • "*" indicates a significant difference at p ⁇ 0.05 with the CON / Saline group
  • "#" indicates p ⁇ 0.05 with the GK / Saline group. Indicates that there is a significant difference.
  • the biosynthetic amounts of TSP-1 and VEGF in each group are shown as relative values when the biosynthetic amount of TSP-1 and VEGF in the CON / Saline group is 100, respectively.
  • TSP-1 which is an angiogenesis inhibitor
  • the expression level of TSP-1 is significantly higher in both the GK / Saline group and the GK / R30 group than in the CON / Saline group, which is a non-diabetic control rat. ..
  • the GK / R30 group has a significantly higher amount of VEGF biosynthesis involved in capillary angiogenesis than the CON / Saline group and the GK / Saline group. From this, it was clarified that Enterococcus faecium R30 lactic acid bacterium has a capillary angiogenesis-promoting effect in a state where capillary angiopathy due to a diabetic state occurs.

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Abstract

本発明の一以上の実施形態は、微生物を有効成分とする毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、毛細血管新生促進剤又は糖尿病合併症の予防又は抑制剤を提供する。　本発明の一以上の実施形態は、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）を含有する毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤又は毛細血管新生促進剤に関する。本発明の別の一以上の実施形態は、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を含有する糖尿病合併症の予防又は抑制剤に関する。

Description

毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、及び毛細血管新生促進剤
　本発明の一以上の実施形態は毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、毛細血管新生促進剤のいずれかの剤に関する。本発明の一以上の実施形態はまた糖尿病合併症の予防又は抑制剤に関する。
　糖尿病患者においては、血糖値の上昇に伴う終末糖化産物の産生や過剰な活性酸素の増加が原因で組織の微小血管網が退行し、糖尿病合併症を発症することが知られている（毛細血管障害）。従来は、糖尿病性の毛細血管障害の抑制や改善には血糖値の低下が必須であると考えられていた。
　例えば特許文献１では、エンテロコッカス・フェリカス等の微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤及び糖尿病治療予防剤が開示されている。特許文献２では、エンテロコッカス・フェリカス等の乳酸菌菌体を有効成分として含有する血圧降下剤及び血糖降下剤が開示されている。
　一方、本出願人は、特許文献３において、疲労改善や血流改善作用を持つ乳酸菌としてエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を報告している。
国際公開第２００５／０７７３９０号パンフレット 特開平１０－７５７７号公報 国際公開第２０１４／０２１２０５号パンフレット
　毛細血管障害を抑制することができれば、糖尿病合併症を予防又は抑制することが出来ると期待できる。しかし特許文献１及び特許文献２では、血糖値が低下または降下することのみ記載されており、毛細血管障害を直接的に抑制または改善できる効果については記載されていない。また特許文献３では低温条件で低下した血流が、常温条件に戻したときに回復する作用としての血流改善効果のみが記載されており、毛細血管障害を抑制、改善する効果に関しては記載されていない。
　そこで本発明の一以上の実施形態は、微生物を有効成分とする毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、毛細血管新生促進剤及び糖尿病合併症の予防又は抑制剤を提供することを課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、以下の発明を完成するに至った。
（１）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）を含有する毛細血管障害抑制剤。
（２）糖尿病性の毛細血管障害を抑制するための、（１）に記載の毛細血管障害抑制剤。
（３）前記株の死菌を含有する、（１）又は（２）に記載の毛細血管障害抑制剤。
（４）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）の投与量が０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下である（１）～（３）のいずれかに記載の毛細血管障害抑制剤。
（５）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）の含有量が０．００１重量％以上、１００重量％以下である、（１）～（４）のいずれかに記載の毛細血管障害抑制剤。
（６）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）を含有する毛細血管障害改善剤。
（７）糖尿病性の毛細血管障害を改善するための、（６）に記載の毛細血管障害改善剤。
（８）前記株の死菌を含有する、（６）又は（７）に記載の毛細血管障害改善剤。
（９）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）の投与量が０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下である、（６）～（８）のいずれかに記載の毛細血管障害改善剤。
（１０）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）の含有量が０．００１重量％以上、１００重量％以下である、（６）～（９）のいずれかに記載の毛細血管障害改善剤。
（１１）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）を含有する毛細血管新生促進剤。
（１２）糖尿病性の毛細血管障害を改善又は抑制するための、（１１）に記載の毛細血管新生促進剤。
（１３）前記株の死菌を含有する、（１１）又は（１２）に記載の毛細血管新生促進剤。
（１４）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）の投与量が０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下である、（１１）～（１３）のいずれかに記載の毛細血管新生促進剤。
（１５）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）の含有量が０．００１重量％以上、１００重量％以下である、（１１）～（１４）のいずれかに記載の毛細血管新生促進剤。
（１６）エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）を含有する糖尿病合併症の予防又は抑制剤。
（１７）前記株の死菌を含有する、（１６）に記載の糖尿病合併症の予防又は抑制剤。
（１８）毛細血管障害抑制剤の製造における、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用。
（１９）毛細血管障害改善剤の製造における、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用。
（２０）毛細血管新生促進剤の製造における、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用。
（２１）糖尿病合併症の予防又は抑制剤の製造における、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用。
（２２）患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む毛細血管障害の抑制方法。
（２３）前記患者が、糖尿病性の毛細血管障害の抑制を必要とする患者である、（２２）に記載の抑制方法。
（２４）患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む毛細血管障害の改善方法。
（２５）前記患者が、糖尿病性の毛細血管障害の改善を必要とする患者である、（２４）に記載の改善方法。
（２６）患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む毛細血管新生の促進方法。
（２７）前記患者が、毛細血管新生の促進を必要とする患者である、（２６）に記載の促進方法。
（２８）糖尿病合併症の予防又は抑制を必要とする患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む、糖尿病合併症の予防又は抑制方法。
（２９）毛細血管障害抑制のための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用。
（３０）毛細血管障害の抑制を必要とする患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む、（２９）の使用。
（３１）毛細血管障害改善のための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用。
（３２）毛細血管障害の改善を必要とする患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む、（３１）の使用。
（３３）毛細血管新生促進のための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用。
（３４）毛細血管新生の促進を必要とする患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む、（３３）の使用。
（３５）糖尿病合併症の予防又は抑制のための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用。
（３６）糖尿病合併症の予防又は抑制を必要とする患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む、（３５）の使用。
（３７）非医療的な使用である、（２９）～（３６）のいずれかに記載の使用。
（３８）医療的な使用である、（２９）～（３６）のいずれかに記載の使用。
（３９）毛細血管障害を抑制する方法に使用するための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株。
（４０）前記方法が、毛細血管障害の抑制を必要とする患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む、（３９）のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株。
（４１）毛細血管障害を改善する方法に使用するための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株。
（４２）前記方法が、毛細血管障害の改善を必要とする患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む、（４１）のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株。
（４３）毛細血管新生を促進する方法に使用するための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株。
（４４）前記方法が、毛細血管新生の促進を必要とする患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む、（４３）のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株。
（４５）糖尿病合併症を予防又は抑制する方法に使用するための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株。
（４６）前記方法が、糖尿病合併症の予防又は抑制を必要とする患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む、（４５）のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１９－２３９０５７号及び日本国特許出願番号２０２０－０９１４２０号の開示内容を包含する。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤は、優れた毛細血管障害抑制効果を有する。本発明に係る毛細血管障害改善剤または毛細血管新生促進剤は、優れた毛細血管障害の改善または血管新生促進効果を有する。本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤または改善剤または毛細血管新生促進剤は、例えば、糖尿病性の筋組織毛細血管障害の抑制または改善に有効である。
　本発明の一以上の実施形態に係る糖尿病合併症の予防又は抑制剤は、糖尿病合併症の原因となる毛細血管障害を抑制または改善あるいは毛細血管新生を促進する作用により、糖尿病合併症を予防又は抑制することができる。本発明の一以上の実施形態に係る糖尿病合併症の予防又は抑制剤は、血糖値降下作用を有する糖尿病の治療薬とは異質な作用により糖尿病合併症を予防又は抑制することができる。
図１は、実施例２での、Ｗｉｓｔａｒラット／生理食塩水投与群（ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ：ｎ＝６）、Ｗｉｓｔａｒラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＣＯＮ／Ｒ３０：ｎ＝７）、ＧＫラット／生理食塩水投与群（ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ：ｎ＝６）、及び、ＧＫラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＧＫ／Ｒ３０：ｎ＝６）の、糖負荷直後（０分）、糖負荷から１５分後、３０分後、６０分後及び１２０分後の血糖値の測定結果を示す。 図２は、実施例３での、Ｗｉｓｔａｒラット／生理食塩水投与群（ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ）、Ｗｉｓｔａｒラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＣＯＮ／Ｒ３０）、ＧＫラット／生理食塩水投与群（ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ）、及び、ＧＫラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＧＫ／Ｒ３０）の、８週間飼育後のヒラメ筋の毛細血管径の測定結果を示す。＊ｐ＜０．０５　ｖｓ．ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ、＃ｐ＜０．０５　ｖｓ．ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ 図３は、実施例４での、ＧＫラット／生理食塩水投与群（ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ）、及び、ＧＫラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＧＫ／Ｒ３０）の、８週間飼育後のヒラメ筋の縦断切片を作成し、共焦点レーザー顕微鏡および蛍光イメージングソフトウエアで構築した毛細血管の３次元像である。 図４は、実施例５での、Ｗｉｓｔａｒラット／生理食塩水投与群（ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ）、Ｗｉｓｔａｒラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＣＯＮ／Ｒ３０）、ＧＫラット／生理食塩水投与群（ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ）、及び、ＧＫラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＧＫ／Ｒ３０）の、８週間飼育後のヒラメ筋での、血管新生抑制因子ＴＳＰ－１の生合成量の測定結果を示す。＊ｐ＜０．０５　ｖｓ．ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ 図５は、実施例５での、Ｗｉｓｔａｒラット／生理食塩水投与群（ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ）、Ｗｉｓｔａｒラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＣＯＮ／Ｒ３０）、ＧＫラット／生理食塩水投与群（ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ）、及び、ＧＫラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＧＫ／Ｒ３０）の、８週間飼育後のヒラメ筋での、毛細血管新生に関与するＶＥＧＦの生合成量の測定結果を示す。＊ｐ＜０．０５　ｖｓ．ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ、＃ｐ＜０．０５　ｖｓ．ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ
＜エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株＞
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤、改善剤及び毛細血管新生促進剤ならびに糖尿病合併症の予防又は抑制剤は、有効成分として、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ　Ｒ３０）を含有することを特徴とする。以下、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を単に「Ｒ３０株」と略記する場合がある。 
　エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）寄託機関の名称およびあて名 
　名称：　独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター 
　あて名：　日本国　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室 
（ｉｉ）　国内受託日：　２０１２年５月１６日
（ｉｉｉ）　国際寄託への移管請求受領日：　２０１３年４月２４日 
（ｉｖ）　受託番号：　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２ 
　エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株は、以下の菌学的性質を有する。 
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　本発明の一以上の実施形態で用いるＲ３０株の培養方法は、Ｒ３０株を有効に培養できるものである限り特に制限されない。例えば、試験管培養、フラスコ培養、発酵槽による培養などにより培養することができる。培地についても特に制限されず、Ｒ３０株を有効に培養できるものである限りいかなる培地を使用してもよく、例えば、乳酸菌培養に一般的に使用されているＭＲＳ培地などを用いることができる。 
　本発明の一以上の実施形態で用いるＲ３０株は、生菌であっても死菌（死滅菌）であってもよい。
　生菌とは、生きたままのＲ３０株であり、増殖可能なものの他、増殖しておらず休眠状態のものであっても、水の存在などにより再び増殖できるものも含まれるものとする。 
　死菌（死滅菌）とは、加熱、加圧、薬物処理などにより殺菌処理を施した菌体のことである。殺菌処理手段は特に制限されず、例えば、乾熱殺菌、蒸気殺菌、高圧蒸気殺菌、化学的殺菌、超音波殺菌、電磁波殺菌、紫外線殺菌などを挙げることができる。また、殺菌処理は、集菌した菌体を乾燥した後に行ってもよい。また、死菌は、死菌体そのものでも、処理物であってもよい。「処理物」としては、菌の磨砕や破砕、濃縮、ペースト化、乾燥、希釈から選ばれる少なくとも１つの処理を施した処理物が挙げられる。菌の乾燥手段は特に制限されず、スプレードライ、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥などを挙げることができる。
＜毛細血管障害抑制剤＞
　本発明の一以上の実施形態は、Ｒ３０株を含有する毛細血管障害抑制剤に関する。
　本発明の別の一以上の実施形態は、毛細血管障害抑制剤の製造における、Ｒ３０株の使用に関する。
　毛細血管障害抑制剤は、非医療的な目的で摂取される飲食品組成物であってもよいし、医療的な目的で摂取される医薬品組成物であってもよいし、飼料組成物であってもよい。飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物の具体例は後述する通りである。医薬品組成物はヒト用医薬品組成物であってもよいし、非ヒト動物用医薬品組成物であってもよいが、好ましくはヒト用医薬品組成物である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む毛細血管障害の抑制方法である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、毛細血管障害抑制のための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、毛細血管障害を抑制する方法に使用するための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株である。
　上記の各実施形態に用いるＲ３０株は上記の各種形態であることができる。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤は、優れた毛細血管障害抑制効果を有する。本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤は、例えば、糖尿病性の筋組織毛細血管障害の抑制に有効である。
　本開示において毛細血管障害とは、組織における毛細血管が退行する障害を指す。このため「毛細血管障害」という用語は、「毛細血管退行」又は「組織毛細血管退行」と同義である。毛細血管障害は、典型的には糖尿病性の毛細血管障害であるが、他の原因により生じる毛細血管障害であってもよい。糖尿病性の毛細血管障害とは、特に、血糖値の上昇に伴う終末糖化産物の産生や過剰な活性酸素種の増加に起因して生じる、組織における微小毛細血管網の障害であり、糖尿病合併症の原因となる。
　従来は、糖尿病性の組織毛細血管障害の抑制には血糖値のコントロールが必須であると考えられていた。これに対して、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤は、血糖値の上昇を抑制せずとも、組織毛細血管障害を抑制することを特徴とする。このため、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤と、血糖値を抑制する作用を有する薬とを併用して、糖尿病及び糖尿病合併症を患う患者に投与する場合、血糖値を抑制する作用を有する薬の投与量を低減することができるため好ましい。前記血糖値を抑制する作用を有する薬の投与量を低減できれば、薬による望まない副作用を軽減できるともに医薬品代の削減にもつながり有用である。また、患者が血糖値を抑制する作用を有する薬の投与を、副作用が原因で停止している場合、時間の経過と共に毛細血管障害が進行し、四肢末端に血液が運ばれず、最悪の場合には四肢の壊死につながる。しかし、本発明の一以上の実施形態の毛細血管障害抑制剤は、血糖値を抑制する作用を有する薬を投与しなくとも、毛細血管障害を抑制することができる。つまり、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤は、血糖値を抑制する作用を有する薬に対する副作用を有する患者に対しても投与可能であり、投与対象の患者を制限する必要がないため有用である。
　また、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤の患者への投与は、当該患者への運動療法と組み合わせて行うことができる。
　「患者への投与」における患者は、後述する様に毛細血管障害の抑制を必要とする患者であれば良く、毛細血管障害の患者の他に、毛細血管障害の症状は顕在化してはいないものの、今後発症または顕在化する可能性のある者や、毛細血管障害を予防する必要がある者、したいと考える者も含む。
　毛細血管障害の抑制作用は、例えば、自然発症の２型糖尿病モデルであるＧｏｔｏ－Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）ラットのヒラメ筋の毛細血管径を測定することで評価することができる。被検物質を投与していない実験動物と比べ、被検物質を投与したＧＫラットのヒラメ筋毛細血管径が大きければ、当該被検物質は毛細血管障害抑制作用を有すると評価することができる。また、前記抑制作用は、蛍光染色した前記ラットのヒラメ筋における毛細血管の画像を目視で観察することでも評価できる。被検物質を投与していない実験動物と比べ、被検物質を投与したＧＫラットの毛細血管が大きい画像が観察できれば、被検物質は毛細血管障害抑制作用を有すると評価することができる。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤の患者への投与頻度や投与量は、投与対象患者の年齢、性別、状態などに応じて適宜調整すればよい。一日あたりのＲ３０株の投与量は適宜調整すればよいが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下とすることができる。当該投与量としては、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上がより好ましく、１０ｍｇ／ｋｇ体重以上がより好ましく、８００ｍｇ／ｋｇ体重以下が好ましく、５５０ｍｇ／ｋｇ体重以下がより好ましい。一日あたりの投与回数も適宜調整すればよいが、例えば、１回以上、５回以下とすることができる。投与経路は経口投与であってもよいし、非経口投与であってもよいが、好ましくは経口投与である。投与対象患者としては毛細血管障害の抑制を必要とする患者であればよく、例えばヒト又は非ヒト動物であり、好ましくはヒトである。非ヒト動物としては、例えば、養殖動物、愛玩動物、競技動物などが挙げられる。養殖動物としては特に限定されないが、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜；マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物；ニワトリ、アヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽が挙げられる。愛玩動物としては特に限定されないが、イヌ、ネコなどが挙げられる。競技動物としては特に限定されないが、競走馬などが挙げられる。非ヒト動物は哺乳動物であることが特に好ましい。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤は、賦型剤等の種々の添加剤を含むことができる。前記種々の添加剤の具体例については後述する。また、上記毛細血管障害抑制剤が、前記種々の添加剤を含む場合における毛細血管障害抑制剤中のＲ３０菌株の含有量は特に限定されないが、下限としては０．００１重量％以上が好ましく、例えば０．０１重量％以上、０．１重量％以上がより好ましい。また上限しては、１００重量％以下が好ましく、例えば５０重量％以下、３０重量％以下がより好ましい。
　また、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管抑制剤がカプセル剤や錠剤などの製剤の形態である場合に一製剤あたりに含まれるＲ３０株の含有量は特に限定されず、適宜調整すれば良いが、例えば０．１ｍｇ／剤以上、１０００ｍｇ／剤以下とすることができる。前記一製剤あたりに含まれるＲ３０株の含有量としては、好ましくは、５ｍｇ／剤、１０ｍｇ／剤、３０ｍｇ／剤、５０ｍｇ／剤、または、１００ｍｇ／剤である。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤が飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物である場合、または本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤を飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物の製造に用いる場合、製造される飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物中のＲ３０株の含有量は特に限定されず、適宜調整すればよいが、例えば、飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物中の含有量は、下限としては０．００００１重量％以上、とすることができる。前記下限としては例えば、０．００１重量％以上、０．０１重量％以上が好ましい。また上限としては、９０重量％以下とすることができる。前記上限としては、８０重量％以下、７０重量％以下、６０重量％以下、５０重量％以下が好ましい。さらに好ましくは３０重量％以下が好ましい。
＜毛細血管障害改善剤＞
　本発明の一以上の実施形態は、Ｒ３０株を含有する毛細血管障害改善剤に関する。
　本発明の別の一以上の実施形態は、毛細血管障害改善剤の製造における、Ｒ３０株の使用に関する。
　毛細血管障害改善剤は、上述した毛細血管障害抑制剤と同様に、非医療的な目的で摂取される飲食用組成物でもよいし、医療的な目的で摂取される医薬品組成物であってもよいし、飼料組成物であってもよい。飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物の具体例は後述する通りである。医薬品組成物はヒト用医薬品組成物であってもよいし、非ヒト動物用医薬品組成物であってもよいが、好ましくはヒト用医薬品組成物である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む毛細血管障害の改善方法である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、毛細血管障害改善のための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、毛細血管障害を改善する方法に使用するための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株である。
　上記の各実施形態に用いるＲ３０株は上記の各種形態であることができる。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害改善剤は、例えば、糖尿病性の筋組織毛細血管障害の改善に有効である。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害改善剤は、血糖値を抑制する作用を有する糖尿病治療薬を摂取しなくとも、血糖値の上昇に伴って生じる毛細血管障害を改善することができる。そのため、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害改善剤は、血糖値を抑制する作用を有する糖尿病治療薬と併用する場合には、摂取量を低減できるため好ましい。また、前記毛細血管障害改善剤は、糖尿病治療薬の投与を副作用が原因で停止されている患者に対して投与することができるため有用である。
　また、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害改善剤の患者への投与は、当該患者への運動療法と組み合わせて行うことができる。
　「患者への投与」における患者は、毛細血管障害の改善を必要とする患者であれば良く、毛細血管障害の患者の他に、毛細血管障害の症状は顕在化してはいないものの、今後発症または顕在化する可能性のある者や、毛細血管障害を予防する必要がある者、したいと考える者も含む。
　毛細血管障害の改善作用は、例えば、自然発症の２型糖尿病モデルであるＧｏｔｏ－Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）ラットのヒラメ筋の毛細血管径を測定することで評価することができる。被検物質を投与していない実験動物と比べ、被検物質を投与したＧＫラットのヒラメ筋毛細血管径が大きければ、当該被検物質は毛細血管改善作用を有すると評価することができる。また、前記改善作用は、蛍光染色した前記ラットのヒラメ筋における毛細血管の画像を目視で観察することでも評価できる。被検物質を投与していない実験動物と比べ、被検物質を投与したＧＫラットの毛細血管が大きい画像が観察できれば、被検物質は毛細血管改善作用を有すると評価することができる。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害改善剤の患者への投与頻度や投与量は、毛細血管障害抑制剤について上述した例から選択できる。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害改善剤が飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物である場合、または本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害改善剤を飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物の製造に用いる場合の、飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物中のＲ３０株の含有量や、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管改善剤がカプセル剤や錠剤などの製剤の形態である場合の、一製剤あたりに含まれるＲ３０株の含有量は、毛細血管障害抑制剤について上述した例から選択できる。
＜毛細血管新生促進剤＞
　本発明の一以上の実施形態は、Ｒ３０株を含有する毛細血管新生促進剤に関する。
　本発明の別の一以上の実施形態は、毛細血管新生促進剤の製造における、Ｒ３０株の使用に関する。
　毛細血管新生促進剤は、上述した毛細血管障害抑制剤や毛細血管障害改善剤と同様に、非医療的な目的で摂取される飲食用組成物でもよいし、医療的な目的で摂取される医薬品組成物であってもよいし、飼料組成物であってもよい。飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物の具体例は後述する通りである。医薬品組成物はヒト用医薬品組成物であってもよいし、非ヒト動物用医薬品組成物であってもよいが、好ましくはヒト用医薬品組成物である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、患者に対して、有効量のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与することを含む毛細血管新生の促進方法である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、毛細血管新生促進のための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、毛細血管新生を促進する方法に使用するための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株である。
　上記の各実施形態に用いるＲ３０株は上記の各種形態であることができる。
　本発明に係る毛細血管新生促進剤は、例えば、糖尿病性の筋組織毛細血管障害の改善又は抑制に有効である。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管新生促進剤は、血管新生を促進し、毛細血管退行等の毛細血管障害を改善することができる。また、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管新生促進剤の患者への投与は、当該患者への運動療法と組み合わせて行うことができる。
　「患者への投与」における患者は、毛細血管の新生を必要とする患者であれば良く、毛細血管障害の患者の他に、毛細血管障害の症状は顕在化してはいないものの、今後発症または顕在化する可能性のある者や、毛細血管障害を予防する必要がある者、したいと考える者も含む。
　毛細血管新生の促進作用は、例えば、自然発症の２型糖尿病モデルであるＧｏｔｏ－Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）ラットのヒラメ筋の毛細血管径を測定することで評価することができる。被検物質を投与していない実験動物と比べ、被検物質を投与したＧＫラットのヒラメ筋毛細血管径が大きければ、当該被検物質は毛細血管新生促進作用を有すると評価することができる。また、前記促進作用は、蛍光染色した前記ラットのヒラメ筋における毛細血管の画像を目視で観察することでも評価することができる。被検物質を投与していない実験動物と比べ、被検物質を投与したＧＫラットの毛細血管が大きい画像が観察できれば、当該被検物質は毛細血管新生促進作用を有すると評価することができる。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管新生促進剤の患者への投与頻度や投与量は、毛細血管障害抑制剤や毛細血管改善剤について上述した例から選択できる。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管新生促進剤が飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物である場合、または本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管新生促進剤を飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物の製造に用いる場合の、飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物中のＲ３０株の含有量や、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管新生促進剤がカプセル剤や錠剤などの製剤の形態である場合の、一製剤あたりに含まれるＲ３０株の含有量は、毛細血管障害抑制剤について上述した例から選択できる。
＜糖尿病合併症の予防又は抑制剤＞
　本発明の一以上の実施形態は、Ｒ３０株を含有する糖尿病合併症の予防又は抑制剤に関する。
　本発明の別の一以上の実施形態は、糖尿病合併症の予防剤又は抑制剤の製造における、Ｒ３０株の使用に関する。
　糖尿病合併症の予防又は抑制のための飲食品組成物は、非医療的な目的で摂取される飲食品組成物であってもよいし、医療的な目的で摂取される飲食品組成物であってもよし、飼料組成物であってもよい。飲食品組成物飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物の具体例は後述する通りである。医薬品組成物はヒト用医薬品組成物であってもよいし、非ヒト動物用医薬品組成物であってもよいが、好ましくはヒト用医薬品組成物である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、糖尿病合併症の予防又は抑制を必要とする患者に、有効量のＲ３０株を投与することを含む、糖尿病合併症の予防又は抑制方法である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、糖尿病合併症の予防又は抑制のための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の使用である。
　本発明の別の一以上の実施形態は、糖尿病合併症を予防又は抑制する方法に使用するための、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株である。
　上記の各実施形態に用いるＲ３０株は上記の各種形態であることができる。
　上記の各実施形態において、糖尿病合併症の予防とは、糖尿病合併症の発症又は罹患を未然に防ぐことを指し、糖尿病合併症の抑制とは、糖尿病合併症の進展を抑制することを指す。
　本発明の一以上の実施形態に係る糖尿病合併症の予防又は抑制剤は、糖尿病合併症の原因となる毛細血管障害を抑制する作用により、糖尿病合併症を予防又は抑制することができる。標的とする糖尿病合併症は、１型糖尿病の合併症であってもよいし、２型糖尿病の合併症であってもよい。
　本発明の一以上の実施形態に係る糖尿病合併症の予防又は抑制剤と、血糖値を抑制する作用を有する糖尿病治療薬とを併用して、糖尿病及び糖尿病合併症を患う患者に投与する場合、糖尿病治療薬の投与量を低減することができるため好ましい。また、血糖値を抑制する作用を有する糖尿病治療薬の投与を副作用が原因で停止している患者に対しても、本発明の一以上の実施形態に係る糖尿病合併症の予防又は抑制剤は有効である。
　本発明の一以上の実施形態に係る糖尿病合併症の予防又は抑制剤の患者への投与は、当該患者への運動療法と組み合わせて行うことができる。
　本発明の一以上の実施形態に係る糖尿病合併症の予防又は抑制剤の、糖尿病合併症の予防又は抑制を必要とする患者への投与頻度や投与量は、投与対象患者の年齢、性別、状態などに応じて適宜調整すればよい。一日あたりのＲ３０株の投与量は適宜調整すればよいが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下とすることができる。当該投与量としては、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上がより好ましく、１０ｍｇ／ｋｇ体重以上がより好ましく、８００ｍｇ／ｋｇ体重以下が好ましく、５５０ｍｇ／ｋｇ体重以下がより好ましい。一日あたりの投与回数も適宜調整すればよいが、例えば、１回以上、５回以下とすることができる。投与経路は経口投与であってもよいし、非経口投与であってもよいが、好ましくは経口投与である。投与対象患者としては毛細血管障害の抑制を必要とする患者であればよく、例えばヒト又は非ヒト動物であり、好ましくはヒトである。非ヒト動物の例は上記の通りである。
　本発明の一以上の実施形態に係る糖尿病合併症の予防又は抑制剤が食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物である場合、または本発明の一以上の実施形態に係る糖尿病合併症の予防又は抑制剤を飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物の製造に用いる場合の、飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物中のＲ３０株の含有量は特に限定されず、適宜調整すればよいが、例えば、飲食品組成物、医薬品組成物又は飼料組成物中の含有量としては０．００００１重量％以上、５０重量％以下とすることができる。当該割合としては、０．００１重量％以上が好ましく、０．０１重量％以上がより好ましく、また、３０重量％以下が好ましい。 
＜組成物＞
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、毛細血管新生促進剤或いは糖尿病合併症の予防又は抑制剤の形状は特に問わない。例えば、上記各種形態のＲ３０株自体であってもよいし、Ｒ３０株と他の成分とを含有する組成物であってもよい。Ｒ３０株と他の成分とを含有する組成物は、医薬品組成物、飲食品組成物、飼料組成物等の目的に応じた組成物であることができる。
　本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、毛細血管新生促進剤或いは糖尿病合併症の予防又は抑制剤は、後記の実施例のとおり経口投与で高い効果を示し、また、摂取や服用のし易さからも、経口摂取又は投与される医薬品組成物、飲食品組成物、飼料組成物であることが好ましい。以下、本発明の一以上の実施形態に係る「毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、毛細血管新生促進剤又は糖尿病合併症の予防又は抑制剤」を、単に「本発明の一以上の実施形態に係る剤」という場合がある。
　例えば、Ｒ３０株の生菌を含有する組成物は、常法で培養した培養液中のＲ３０株の菌体を集菌し、集菌した菌体に保護剤を溶解した溶液を添加し、乾燥した後、適当な賦形剤と混合することにより製造することができる。上記保護剤とは、外的環境から菌体を保護し、生菌数を維持したり或いは生菌数の減少を抑制したりする成分をいう。保護剤としては、例えば、トレハロース、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳、グルタミン酸ナトリウム、Ｌ－アスコルビン酸、ヒスチジン、リンゴ酸、ホエー、グルコース、アスパラギン酸、メチオニン、デンプン、デキストリン、ショ糖、乳糖、塩化ナトリウム、リン酸塩など、菌体へ与えるダメージを軽減できる物質であればよい。これらの保護剤は、単独又は組み合わせて使用することができる。各保護剤の配合割合は限定されないが、保護剤総量の下限は、乾燥菌体重量に対して１重量％以上が好ましい。上記割合が１重量％以上であれば、菌体が被るダメージをより確実に軽減することができる。一方、上記割合の上限は特に制限されないが、例えば５００００重量％以下とすることができる。上記割合としては１０重量％以上がより好ましく、５０重量％以上がよりさらに好ましく、１００重量％以上がよりさらに好ましく、また、２００００重量％以下がより好ましく、１００００重量％以下がよりさらに好ましい。
　Ｒ３０株の死菌を含有する組成物は、例えば、常法で培養した培養液中の菌体を集菌し、集菌した菌体を殺菌処理し、乾燥した後、適当な賦形剤と混合することで製造することができる。
　また、本発明の一以上の実施形態に係る毛細血管障害抑制剤、毛細血管障害改善剤、毛細血管新生促進剤或いは糖尿病合併症の予防又は抑制剤は、一般製剤の製造に用いられる種々の添加剤を適当量含んでいてもよい。このような添加剤として、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、酸味料、発泡剤、人工甘味料、香料、滑沢剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などが挙げられる。
　賦形剤としては、例えばトウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、コムギコデンプン、コメデンプン、部分アルファー化デンプン、アルファー化デンプン、有孔デンプン等のデンプン類、乳糖、ショ糖、ブドウ糖などの糖、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、ソルビトール、マルチトールなどの糖アルコール、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、ハイドロタルサイト、無水リン酸カルシウム、沈降炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、軽質無水ケイ酸などの無機化合物などが挙げられる。
　賦形剤としては更に、例えば、アラビアガム、ラクトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイド性二酸化ケイ素などを挙げることができる。
　結合剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム末、ゼラチン、プルランなどが挙げられる。
　崩壊剤としては、例えばデンプン、寒天、カルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、結晶セルロース、Ｆ－ＭＥＬＴ（商標、富士化学工業（株）製）などが挙げられる。
　酸味剤としては、例えばクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、アスコルビン酸などが挙げられる。発泡剤としては、例えば炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどが挙げられる。
甘味料としては、例えばサッカリンナトリウム、グリチルリチン二カリウム、アスパルテーム、ステビア、ソーマチンなどが挙げられる。
　香料としては、例えばレモン油、オレンジ油、メントールなどが挙げられる。
　滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルク、ステアリン酸、フマル酸ステアリルナトリウムなどが挙げられる。着色剤としては、例えば食用黄色５号、食用赤色２号、食用青色２号などの食用色素、食用レーキ色素、三二酸化鉄などが挙げられる。
　安定化剤としては、エデト酸ナトリウム、トコフェロール、シクロデキストリン等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、クエン酸塩、リン酸塩、炭酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、アミノ酸塩などが挙げられる。
　界面活性剤としては、ポリソルベート８０、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ナトリウムカルボキシルメチルセルロース、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、アラビアガム、粉末トラガントなどが挙げられる。
　以下、本発明の一以上の実施形態に係る剤が、医薬品組成物、飲食品組成物又は飼料組成物である場合の具体的な実施形態について説明する。
　本発明の一以上の実施形態に係るＲ３０株を含有する剤は医薬品組成物であることができる。前記医薬品組成物は、錠剤、散剤、カプセル剤、糖衣錠、顆粒剤、エキス剤、エリキシル剤、シロップ剤、チンキ剤、リモナーデ剤等の剤形であることができる。医薬組成物は、所望の剤形に応じて、医薬品として許容される添加剤（薬学的に許容される担体ともいう）を含有することができる。かかる添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、酸化防止剤、香料、調味料、甘味料、着色料、増粘安定剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、結合剤、等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、凝集防止剤、吸収促進剤、凝固剤などを挙げることができる。医薬品組成物は、剤形などに応じて常法により製造することができる。
　前記医薬品組成物は、ヒトに投与される医薬品組成物であってもよいし、非ヒト動物に投与される医薬品組成物であってもよい。非ヒト動物の具体例は上記の通りである。非ヒト動物に投与される医薬組成物は、有効成分としてのＲ３０株に加えて、後述する飼料組成物に配合し得る飼料として許容される成分を更に含む組成物であってもよい。
　本発明の一以上の実施形態に係るＲ３０株を含有する剤は飲食品組成物として用いることができる。前記飲食用組成物は、一般食品や飲料などの一般的な飲食品組成物であってもよいし、いわゆる健康食品、サプリメント、機能性食品、機能性表示食品、栄養補助食品、特定保健用食品、栄養機能食品、保健機能食品、特定用途食品、介護食品、スマイルケア食、咀嚼・嚥下補助食品、濃厚流動食品、病者用食品、ダイエタリーサプリメントなどの用途の飲食品組成物であってもよい。本発明の一以上の実施形態に係る剤としての飲食品組成物は、Ｒ３０株に加えて飲食品として許容される成分を含有する。
　前記飲食品組成物の形態は特に限定されず、例えば、乳飲料、清涼飲料、スポーツドリンク、栄養ドリンク、美容ドリンク、液体栄養剤などの飲料；チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ケーキ、パイ、クッキー、和菓子、スナック菓子、油菓子、米菓、ビスケット、クラッカーなどの菓子類；アイスクリーム、氷菓などの冷菓類；うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類；蒲鉾、竹輪、半片などの練り製品；ドレッシング、マヨネーズ、たれ、ソースなどの調味料；パン、ハム、雑炊、米飯、スープ、レトルト食品、冷凍食品、さらに、食用油脂組成物、調理油類、スプレー油類、バター類、マーガリン類、ショートニング類、ホイップクリーム類、濃縮乳類、ホワイトナー類、ドレッシング類、ピックル液類、ベーカリーミックス類、フライ食品類、加工肉製品類、豆腐・こんにゃくなど、その他加工品；ジャム類、発酵乳類、缶詰類など、一般的な飲食品組成物の形態が挙げられる。なお、前記飲食品組成物は、Ｒ３０株を用いて一般的な飲食品組成物を発酵した発酵物であってもよい。 
　前記飲食品組成物が、特定保健用食品、機能性表示食品、ダイエタリーサプリメントである場合には、前記飲食品組成物をパッケージに包み、当該パッケージに、毛細血管障害の抑制や、毛細血管障害の改善や、毛細血管新生の促進や糖尿病合併症の予防又は抑制に関連する機能を表示してもよい。パッケージとしては、特に制限されないが、例えば、箱、容器、包装フィルム、包装紙などを挙げることができる。また、パッケージに表示する機能としては、毛細血管障害の抑制や、毛細血管障害の改善や、毛細血管新生の促進や糖尿病合併症の予防又は抑制の他に、それらに関連する機能や、毛細血管障害の抑制作用や毛細血管障害の改善作用や毛細血管新生の促進作用や、糖尿病合併症の予防又は抑制作用の目的や効果として本明細書に記載されたものが挙げられる。勿論、これらに類する機能であれば、表現は異なっていても差し支えない。 
　なお、機能性食品とは、国や公共団体が許可・指定している血管障害抑制剤的な効能を有する食品であり、例えば、栄養機能食品や特定保健用食品などの保健機能食品、特別用途食品などである。なお、状況や時代により名称や規程が変化するが、本質的に同じであるものは本発明に含まれる。
　本発明の一以上の実施形態に係る剤としての飲食品組成物は、カプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤等の形状であってもよい。製剤化においては、Ｒ３０株に加えて、飲食品として許容される他の成分、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。 
　本発明の一以上の実施形態に係る剤は飼料組成物（ペットフードを含む）であることができる。前記飼料組成物は、動物の種類、発育ステージ、地域などの飼育環境に応じて選択される飼料として許容される成分とＲ３０株とを含む。飼料として許容される成分としては、一般的な飼料原料や、配合飼料に通常使用される飼料用添加剤（例えば賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料など）や、飼料用添加物以外の成分（例えば抗生物質、殺菌剤、駆虫剤、防腐剤など）が挙げられる。一般的な飼料原料としては、例えば、穀物類又は加工穀物類、糟糠類、植物性油粕類、動物性原料、ミネラル類、ビタミン類、アミノ酸、ビール酵母などの酵母類、無機物質の微粉末などが挙げられる。穀物類又は加工穀物類としては、とうもろこし、マイロ、大麦、小麦、ライ麦、燕麦、キビ、小麦粉、小麦胚芽粉などが挙げられる。糟糠類としては、ふすま、米糠、コーングルテンフィードなどが挙げられる。植物性油粕類としては、大豆油粕、ごま油粕、綿実油粕、落花生粕、ヒマワリ粕、サフラワー粕などが挙げられる。動物性原料としては、脱脂粉乳、魚粉、肉骨粉などが挙げられる。ミネラル類としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、食塩、無水ケイ酸などが挙げられる。ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸などが挙げられる。アミノ酸としては、グリシンやメチオニンなどが挙げられる。無機物質の微粉末としては、結晶性セルロース、タルク、シリカ、白雲母、ゼオライトなどが挙げられる。 
　前記飼料組成物の形態は特に限定されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、ペースト状、ペレット状、カプセル剤、錠剤などが挙げられる。カプセルは、ハードカプセルでもソフトカプセルでもよい。前記飼料組成物の給与対象となる非ヒト動物は特に限定されるものではない。非ヒト動物の具体例は上記の通りである。
実施例１：エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の凍結乾燥菌体の調製
　ＭＲＳブイヨン（関東化学社製）（０．５２ｇ）を水（１０ｍＬ）に溶解した後、オートクレーブ中、１２１℃で１５分間加熱滅菌することにより、ＭＲＳ液体培地を調整した。当該液体培地（１０ｍＬ）に、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１３６２）のグリセロールストック懸濁液（１００μＬ）を植菌し、３７℃で２４時間培養することにより前培養液を得た。当該前培養液（１ｍＬ）を上記ＭＲＳ液体培地（１００ｍＬ）に加え、さらに３７℃で２４時間培養した。培養終了後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、培養液と菌体を分離させた。菌体を滅菌水（１００ｍＬ）で洗浄後、再度遠心分離することにより、滅菌水と菌体を分離した。菌体に滅菌水（２ｍＬ）を加え、９０℃で３０分加熱殺菌した後、凍結乾燥して、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の凍結乾燥菌体を得た。
実施例２：エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株が血糖値に与える影響の確認試験
　５週齢のＷｉｓｔａｒ（ＣＯＮ）ラット１３匹および、５週齢の雄性Ｇｏｔｏ－Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）ラット（２型糖尿病モデル動物）１２匹を、Ｗｉｓｔａｒラット／生理食塩水投与群（ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ：ｎ＝６）、Ｗｉｓｔａｒラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＣＯＮ／Ｒ３０：ｎ＝７）、ＧＫラット／生理食塩水投与群（ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ：ｎ＝６）、ＧＫラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＧＫ／Ｒ３０：ｎ＝６）に分けた。各群には通常飼料（「ＣＥ－２」、日本クレア社製）に加えて水を自由摂取させつつ１週間予備飼育した。その後、上記実施例１で作製したエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の凍結乾燥菌体を生理食塩水に分散させ、ＣＯＮ／Ｒ３０群、ＧＫ／Ｒ３０群には当該菌体の投与量が体重１ｋｇあたり５００ｍｇになるように、ゾンデ（経口用チューブ）を用い、１日２回経口投与し、８週間飼育した。
　飼育８週後に糖負荷試験による糖尿病の評価を行った。糖尿病の評価は、１８時間絶食後、採血を行い（０分）、０．２ｇ／ｍＬに調整したグルコース水溶液をラット体重（ｋｇ）あたり１０ｍＬ経口投与し、１５、３０、６０及び１２０分後に採血を行い、各々の血液サンプル中の血糖値を血糖値測定器（「プレシジョンエクシード」、アボット社製）を用いて測定した。測定結果を図１に示した。
　図１に示す結果の通り、自然発症の２型糖尿病モデルであるＧＫラットに生理食塩水を投与したＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ群のグルコース投与後の血糖値の上昇より、ＧＫラットが糖尿病状態であることがわかる。また、ＧＫラットにエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与したＧＫ／Ｒ３０群も同様にグルコース投与後の血糖値が上昇していることから、ＧＫ／Ｒ３０群も糖尿病状態であることがわかる。
　一方、非糖尿病コントロールラットであるＷｉｓｔａｒラットに生理食塩水を投与したＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ群のグルコース投与後の血糖値は上昇していないことから、ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ群は糖尿病状態でなく、Ｗｉｓｔａｒラットにエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を投与したＣＯＮ／Ｒ３０群も糖尿病状態ではないことがわかる。
実施例３：エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株がヒラメ筋毛細血管径に与える影響
　上記実施例２の各群とも、飼育８週間後の前記糖負荷試験後に、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔後、腹大動脈にカニューレを挿入して、生理食塩水で骨格筋毛細血管内を灌流し、４２℃で液状にした８％ゼラチン溶液（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に１％蛍光物質（蛍光マーカー補充インク　Ｔｏｍｂｏｗ社製）を加えた蛍光造影剤を灌流した後、ヒラメ筋を摘出した。摘出したヒラメ筋は－８０℃で凍結し、クリオスタットで厚さ１００μｍの縦断切片を作成した後、４％パラフォルムアルデヒドにて固定、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を用いた共焦点レーザー顕微鏡（Ｃ２＋　ＮＩＫＯＮ社製）および蛍光イメージングソフトウエア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ＮＩＫＯＮ社製）で筋切片１μｍ毎に存在する毛細血管をスキャンニングし、毛細血管径を測定した。測定結果を図２に示した。Ｗｉｓｔａｒラット／生理食塩水投与群（ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ）の毛細血管径の測定回数（ｎ数）は２９、Ｗｉｓｔａｒラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＣＯＮ／Ｒ３０）のｎ数は２９、ＧＫラット／生理食塩水投与群（ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ）のｎ数は２７、ＧＫラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＧＫ／Ｒ３０）のｎ数は２３であった。
　図２に示す結果の通り、ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ群の毛細血管径（平均７．０μｍ）と比べ、ＣＯＮ／Ｒ３０群の毛細血管径（平均７．２μｍ）は同等であることが分かる。一方、糖尿病状態であるＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ群では、毛細血管径は平均６．０μｍであり、ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ群と比べ毛細血管径が有意に縮小しており、糖尿病状態による毛細血管障害が起こっていることが分かる。それに対して、ＧＫ／Ｒ３０群では、毛細血管径が平均７．０μｍであり、ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ群と比べ毛細血管径が有意に拡大しており、非糖尿病状態であるＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ群と同等の毛細血管径であることが分かる。本結果より、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０乳酸菌は毛細血管障害抑制効果を有することが明らかとなった。
実施例４：エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株がヒラメ筋毛細血管新生に与える影響
　５週齢の雄性Ｇｏｔｏ－Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）ラット（２型糖尿病モデル動物）６匹を、ＧＫラット／生理食塩水投与群（ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ：ｎ＝３）、ＧＫラット／エンテロコッカス・フェシウムＲ３０投与群（ＧＫ／Ｒ３０：ｎ＝３）に分けた。各群には通常飼料（「ＣＥ－２」、日本クレア社製）に加えて水を自由摂取させつつ１週間予備飼育した。その後、上記実施例１で作製したエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の凍結乾燥菌体を生理食塩水に分散させ、ＧＫ／Ｒ３０群には当該菌体の投与量が体重１ｋｇあたり５００ｍｇになるように、ゾンデ（経口用チューブ）を用い、１日２回経口投与し、８週間飼育した。飼育８週間後に、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔後、腹大動脈にカニューレを挿入して、生理食塩水で骨格筋毛細血管内を灌流し、４２℃で液状にした８％ゼラチン溶液（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に１％蛍光物質（蛍光マーカー補充インク　Ｔｏｍｂｏｗ社製）を加えた蛍光造影剤を灌流した後、ヒラメ筋を摘出した。摘出したヒラメ筋は－８０℃で凍結し、クリオスタットで厚さ１００μｍの縦断切片を作成した後、４％パラフォルムアルデヒドにて固定、アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を用いた共焦点レーザー顕微鏡（Ｃ２＋　ＮＩＫＯＮ社製）および蛍光イメージングソフトウエア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ＮＩＫＯＮ社製）で筋切片１μｍ毎にスキャンニングし、３次元毛細血管像を構築した。図３は、共焦点レーザー顕微鏡および蛍光イメージングソフトウエアで構築した毛細血管の３次元像である。
　図３に示す通り、糖尿病状態であるＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ群では、毛細血管径が縮小しており、糖尿病状態による毛細血管障害が起こっていることが分かる。一方、ＧＫ／Ｒ３０群では、ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ群と比較して毛細血管が密集しており、新たに毛細血管が新生していることが分かる。このことから、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０乳酸菌は毛細血管障害の改善効果及び／または毛細血管新生促進効果を有することが明らかとなった。
実施例５：毛細血管新生確認試験
　実施例３で摘出し、－８０℃で凍結したヒラメ筋を、プロテアーゼ阻害剤を追加したＨＥＰＥＳバッファー中でホモジナイズした後、遠心分離することにより上清を回収した。上清中の総タンパク質量を測定し、サンプル間の総タンパク質量が同一となるように濃度を調整した上でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。電気泳動により展開されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ブロッキング後、抗トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）抗体（「ｓｃ－５９８８７」Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）の１００倍希釈液、抗ＶＥＧＦ抗体（「ｓｃ－７２６９」Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）の２００倍希釈液または抗βアクチン抗体（「ｓｃ－４７７７８」Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）の２００倍希釈液を加え、インキュベート後、さらにＨＲＰ標識した二次抗体を添加し、ＨＲＰ用検出試薬（「イージーウエストルミワン」アトー社製）を用いて発色させた。ルミノ・イメージアナライザー（「ＬＡＳ－１０００」富士フィルム社製）で画像を取り込み、画像解析ソフト（「Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌａｂ」富士フィルム社製）を用いて光学密度を測定することにより、ＴＳＰ－１、ＶＥＧＦ、βアクチンの生合成量を測定し、各試料でのＴＳＰ－１及びＶＥＧＦの生合成量を、同じ試料におけるβアクチンの生合成量で標準化し、ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅに対する相対値として規格化した。測定値に関して、一元配置分散分析とＴｕｒｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定を行った。結果を図４及び図５に示す。図４及び図５中、「＊」はＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ群との間でｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＃」はＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ群との間でｐ＜０．０５で有意差があることを示す。図４及び図５では、それぞれ、各群のＴＳＰ－１及びＶＥＧＦの生合成量を、ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ群でのＴＳＰ－１及びＶＥＧＦの生合成量を１００としたときの相対値として示した。
　図４に示す通り、ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ群、ＧＫ／Ｒ３０群は共に、非糖尿病コントロールラットであるＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ群と比べ、血管新生抑制因子であるＴＳＰ－１の発現量が有意に高いことが分かる。また、図５に示す通り、ＧＫ／Ｒ３０群は、ＣＯＮ／Ｓａｌｉｎｅ群、ＧＫ／Ｓａｌｉｎｅ群よりも毛細血管新生に関与するＶＥＧＦの生合成量が有意に高いことが分かる。このことから、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０乳酸菌は、糖尿病状態による毛細血管障害が起きている状態で、毛細血管新生促進効果を有することが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. 　エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を含有する毛細血管障害抑制剤。
  2. 　糖尿病性の毛細血管障害を抑制するための、請求項１に記載の毛細血管障害抑制剤。
  3. 　前記株の死菌を含有する、請求項１又は２に記載の毛細血管障害抑制剤。
  4. 　エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を含有する毛細血管障害改善剤。
  5. 　前記株の死菌を含有する、請求項４に記載の毛細血管障害改善剤。
  6. 　エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を含有する毛細血管新生促進剤。
  7. 　前記株の死菌を含有する、請求項６に記載の毛細血管新生促進剤。
  8. 　エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を含有する糖尿病合併症の予防又は抑制剤。
  9. 　前記株の死菌を含有する、請求項８に記載の糖尿病合併症の予防又は抑制剤。
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