JP6894242B2

JP6894242B2 - 非アルコール性肝障害抑制剤

Info

Publication number: JP6894242B2
Application number: JP2017009912A
Authority: JP
Inventors: 新井　利信; 利信新井; 麻子中澤; 敬弘關; 瀬戸　泰幸; 泰幸瀬戸
Original assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Current assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2017-01-24
Publication date: 2021-06-30
Anticipated expiration: 2037-01-24
Also published as: JP2018118915A

Description

本発明は、非アルコール性肝障害抑制剤に関する。より詳しくは、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体またはその培養物を有効成分とする非アルコール性肝障害抑制剤に関する。

近年、肥満者の増加に伴い非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）患者が世界的に増加している。日本でも食の欧米化が進んだこともあり肥満傾向にある日本人が増えている。生活習慣に起因するNAFLDはメタボリックシンドロームの肝病変であるといわれ、最も高頻度に存在する肝疾患であり成人の10〜30％が該当すると考えられている（例えば、非特許文献１）。また、NAFLDには非進行性の単純脂肪肝と肝硬変、肝発癌へと進展しうる非アルコール性脂肪肝炎（NASH）が含まれる。NASHは脂肪肝形成を基盤として、さらに酸化ストレスや炎症性サイトカインが誘導されることにより病態が形成される。
NASH患者は今後も増加していくと考えられているが、現状では標準となる治療法が確立されていない。

肝臓は人体の解毒機能を担う重要な器官であり、肝臓の保護効果、すなわち肝障害指標の改善効果は健康を支える上で重要なポイントである。肝障害指標を改善して脂肪肝を予防するためには、日常の栄養管理の徹底や適度な運動などの健康管理を継続的に行うことにより、エネルギー摂取と消費のバランスを良好な状態で維持することが必要となる。しかし、忙しい現代社会を取り巻く環境の中では、不規則な生活リズム、偏った栄養摂取、運動不足の状態から脱却することは容易ではないため、手軽かつ安全に実践できて十分な効果を期待できる方法が求められている。

乳酸菌菌体やその培養物を摂取することで脂肪肝や肝障害を抑制する方法として、以下の方法が挙げられる。
特許文献１には、エタノール及びラクトバチルス・ブレビスの菌体処理物を添加した飼料をマウスに投与したところ、エタノールのみを添加した場合に比べ血清中のＡＳＴ及びＡＬＴ、肝臓中の総コレステロール濃度及びトリグリセリド濃度が低下したことが記載されている。したがって、ラクトバチルス・ブレビスの菌体処理物をアルコール性肝障害の抑制剤として利用できることが記載されている。
特許文献２には、高脂肪食と四塩化炭素をマウスに投与してＮＡＳＨを誘発させるに際し、高脂肪食にラクトバチルス・プランタラムを添加することにより、血清中のＡＳＴおよびＡＬＴを有意に低下させ、肝臓の小葉内炎症や繊維化を抑制する効果があることから、ラクトバチルス・プランタラムを非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の予防治療剤として利用できることが記載されている。
特許文献３には、ラクトバチルス・ヘルベティカスを添加した高脂肪食をラット投与したところ、高脂肪食のみを投与した場合に比べ、肝臓中のコレステロール及びトリグリセリドが低下したことから、ラクトバチルス・ヘルベティカスを脂肪肝の予防、抑制剤として利用できることが記載されている。
非特許文献２には、エンテロコッカス・フェリカスを添加した高脂肪食をマウスに投与したところ、高脂肪食のみを投与した場合に比べ血清中のＡＳＴ及びＡＬＴが低下したことから、エンテロコッカス・フェリカスを肝機能改善剤として利用できることが記載されている。

特許第５２０３３９３号公報特開２０１４−２４７７６号公報特許第５８０４５４２号公報

橋本悦子、最新医学63巻9号 1672頁、2008 British Journal of Nutrition,112,p868-875,2014

しかし、上記はいずれもラクトバチルス属またはエンテロコッカス・フェリカスに属する乳酸菌の肝障害抑制効果であって、ビフィズス菌について当該効果があるかどうかは未だ明らかにされていない。なお、特許文献１では、ビフィズス菌であるビフィドバクテリウム・ビフィダムについても検討されているが、アルコール性の肝障害についての検討しかされておらず、非アルコール性の肝障害についての効果は不明である。
本発明は、ビフィズス菌の菌体又は培養物を有効成分とする非アルコール性肝障害抑制剤を提供することを課題とする。

本発明は、ビフィズス菌のうちでもビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体又は培養物を有効成分とする非アルコール性肝障害抑制剤および非アルコール性肝障害抑制用飲食品を提供する。
また、本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体または該菌培養物を有効成分とする非アルコール性脂肪肝抑制剤および非アルコール性脂肪肝抑制用飲食品を提供する。
また、本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体または該菌培養物を有効成分とする肝がん抑制剤および肝がん抑制用飲食品を提供する。
また、本発明は、上記作用を有する剤や飲食品を投与することにより非アルコール性肝障害を抑制する方法、非アルコール性脂肪肝を抑制する方法、または肝がん抑制方法を提供する。

本発明はビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体又は培養物を有効成分とする非アルコール性肝障害抑制剤および非アルコール性肝障害抑制用飲食品を提供することから、手軽かつ安全に実践できる方法で十分な肝障害抑制効果が期待できる。

各個体における肝臓の状況を示す写真である。（Ａ）脂肪肝ではない。（Ｂ）脂肪肝ではある印象だが、脂肪の蓄積が少ない。（Ｃ）明らかな脂肪肝を示す。（Ｄ）肝がんを示す。（Ｅ）明らかな脂肪肝であってかつ肝がんを示す。Ａ〜Ｄ群の肝障害指標であるＡＳＴ及びＡＬＴの測定結果を示すグラフである。Ａ群：普通食コントロール。Ｂ群：高脂肪食コントロール。Ｃ群：実施例。Ｄ群：比較例。

本発明の非アルコール性肝障害抑制剤は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の菌体及び／又はその培養物を有効成分とする。
ビフィドバクテリウム・ロンガムとしては、本発明の非アルコール性肝障害抑制効果を有する菌であれば特に限定されるものではないが、ＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭＰ−１０６５７）、基準株ＪＣＭ１２１７が挙げられる。本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムに属する菌は、常法に従って培養することができる。培地には、乳培地又は乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地など種々の培地を用いることができる。このような培地としては、還元脱脂乳培地などを例示することができる。
得られた培養物から遠心分離などの集菌手段によって分離された菌体をそのまま本発明の有効成分として用いることができる。濃縮、乾燥、凍結乾燥などした菌体を用いることもできるし、加熱乾燥などにより死菌体にしてもよい。
菌体として純粋に分離されたものだけでなく、培養物、懸濁物、その他の菌体含有物や、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分も用いることができる。
培養物などの形態としては、合成培地であるＧＡＭ培地（日水製薬社製）、還元脱脂乳培地など一般的にビフィドバクテリウム・ロンガムの培養に用いられる培地を用いた培養物だけでなく、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料などの乳製品などを例示することができるが特に限定されるものではない。
さらに、得られた培養物から遠心分離、濾過操作などの方法を用いて、乳タンパク質沈殿や菌体成分を除去することによって調製した培養上清なども本発明の培養物として用いることができる。固形分が少ない上清であるため、飲食品などへの適用範囲が広くなる。例えば、還元脱脂乳培養物を５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することにより培養上清を調製することができる。

本発明における非アルコール性肝障害抑制作用とは、アルコール性の肝障害を除く非アルコール性の肝障害（脂肪肝、肝炎、肝線維化、肝硬変、肝がん等）を抑制する作用をいう。
つまり、アルコールを摂取しないにもかかわらずアルコール性肝障害に類似した脂肪性肝障害を認める症状を抑制する作用を意味する。
ここで、「抑制」には、予防、治療、軽減、緩和等のいずれもが包含される。肝障害が抑制されたか否かは、例えば、高脂肪食の摂取による血清ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）若しくは血清ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の上昇、又は肝臓への脂肪（コレステロール、トリグリセリド等）の蓄積、が抑制されたか否かによって判定することができる。ＡＳＴ，ＡＬＴは健康診断でもよく知られた指標であり、これらは肝炎ウィルス、アルコール性肝障害、脂肪肝など種々の要因で増加することが知られており、肝臓疾患の指標になっている。

本発明の非アルコール性肝障害抑制剤の製剤化に際しては製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して濃縮、凍結乾燥するほか、加熱乾燥して死菌体にしてもよい。これらの乾燥物、濃縮物、ペースト状物も含有される。また、ビフィドバクテリウム・ロンガムに属する菌の非アルコール性肝障害抑制作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能であり、これらを経口的に投与することが望ましい。

本発明の非アルコール性肝障害抑制剤はどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。

本発明の非アルコール性肝障害抑制剤は、飼料に配合することができる。前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。

ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体又は培養物を配合して、非アルコール性肝障害抑制剤あるいは、非アルコール性肝障害抑制用飲食品、栄養組成物、飼料などの素材又はそれら素材の加工品に配合させて使用する場合、ビフィドバクテリウム・ロンガムに属する乳酸菌の菌体または培養物の配合割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量にあわせて適宜調節すればよい。投与対象者の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、通常成人の場合、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体０．１〜５，０００ｍｇを含有する培養物を１０〜２００ｇ、あるいは菌体自体を０．１〜５，０００ｍｇ摂取できるように配合量などを調整すればよい。このようにして摂取することにより所望の効果を発揮することができる。
以下、本発明を実施例をもとにさらに詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定して解釈されるものではない。

ビフィドバクテリウム・ロンガムの肝障害抑制効果を確認するための試験を行った。
１．試験方法
（１）ビフィズス菌の菌体粉末の調製
供試菌として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）ＳＢＴ２９２８、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B. pseudolongum）ＳＢＴ２９０８を選定した。脱脂乳培地（培地組成：１１．５５％（ｗ／ｗ）脱脂粉乳、０．５％（ｗ／ｗ）酵母エキス、０．１％（ｗ／ｗ）アスコルビン酸ナトリウム、０．０４％（ｗ／ｖ）Ｌ−システイン）に前培養物を３％（ｖ／ｖ）量植菌し、３７℃、１６〜１８時間培養を行った。培養にはジャーファーメンターを使用した。窒素雰囲気下において、２０％（ｗ／ｗ）炭酸アンモニウムによりｐＨ６を維持した条件にて培養した。培養終了後、培養物を凍結乾燥し、菌体粉末を調製した。

（２）ビフィドバクテリウム・ロンガム含有飼料の調製
リサーチダイエット社より購入したＤ１２４９２高脂肪食（脂肪６０％ｋｃａｌ、タンパク質２０％ｋｃａｌ、炭水化物２０％ｋｃａｌ）と１．５％（ｗ／ｗ）菌体粉末、０．５％（ｗ／ｗ）乳糖を混合した。また、高脂肪食摂取のコントロール群用の餌としてＤ１２４９２に１．５％（ｗ／ｗ）の凍結乾燥した脱脂乳培地、０．５％（ｗ／ｗ）乳糖を混合した餌を準備した。また、普通食摂取のコントロール群用の餌としてＣＥ−２（日本クレアより購入）を準備した。

（３）肝がんモデルマウスおよび飼育条件
マウス動物試験ではYoshimoto（参考文献1）らの試験系を使用した。これはマウスに高脂肪食を継続的に摂取させることでＮＡＳＨ肝がんを誘発する手法である。Yoshimotoらの報告ではマウスの肝臓に脂肪が蓄積し、肝障害指標（ＡＳＴ，ＡＬＴ）が増加することが報告されている（参考文献1、Supplementary Fig. 8）。
試験にはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄）を使用し、肝がんモデルに使用するマウスには、生後４〜５日の段階で発がん物質であるジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）を背中に一度塗布する操作を行った。
試験は下表の通り４群で行い、各群ともＮ＝１０とした。
Ａ群は「普通食」を給餌した普通食コントロール、Ｂ群は「高脂肪食＋脱脂乳培地」を給餌した高脂肪食コントロール、Ｃ群は「高脂肪食＋ビフィドバクテリウム・ロンガム」を給餌した本願実施例、Ｄ群は「高脂肪食＋ビフィドバクテリウム・シュードロンガム」を給餌した比較例、である。餌は毎日５ｇを提供し、各群とも個飼いのプラスチックゲージで３０週間飼育した。水および餌は自由摂取とした。
＜参考文献１＞
Yoshimoto S, Loo TM, Atarashi K, Kanda H, Sato S, Oyadomari S, Iwakura Y, Oshima K, Morita H, Hattori M, Honda K, Ishikawa Y, Hara E, Ohtani N. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome. Nature. 2013 Jul 4;499(7456):97-101.

（４）生体サンプルの調製および保存
Ｂ，Ｃ，Ｄ群の高脂肪食摂取マウスは体重４５ｇ以上の個体を肥満マウスとして採用した。飼育期間中に異常がみられた個体及び解剖日に体重が４５ｇ未満であった個体を対象から除外した。したがって、有効なＮ数としては、Ａ群１０匹、Ｂ群８匹、Ｃ群９匹、Ｄ群９匹となった。なお、Ｃ，Ｄ群における食餌量は、飼育期間中３ｇ程度を維持しており、最低でも１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ相当の生菌を摂取していたことになる。
飼育終了後の各マウスをイソフルラン雰囲気下で麻酔し、採血後、頚椎脱臼にて安楽死させた。各部位の状況を観察し、必要に応じてサンプリングして保存した。

（５）肝障害指標の測定
血清中の肝障害指標（ＡＳＴ，ＡＬＴ）について、ドライケム装置（富士フィルム製）を使用して添付のマニュアルに従って分析した。

２．各群のマウスの所見と肝障害指標の測定結果
各試験結果を表２及び図２に示した。
肝臓の重量（平均値）については、Ａ群（普通食コントロール）で１．４ｇ、Ｂ群（高脂肪食コントロール）で２．６ｇ、Ｃ群（ビフィドバクテリウム・ロンガム摂取群：実施例）で１．９ｇ、Ｄ群（ビフィドバテクリウム・シュードロンガム：比較例）で２．３ｇであり、Ｃ群はＢ群よりも低下傾向を示した。
また、肝臓の所見としては、明らかな脂肪肝の状態（図１中、（Ｃ）又は（Ｅ）の状態）を呈した個体の有効Ｎ数に対する割合はＡ群で０％、Ｂ群で８８％、Ｃ群で４４％、Ｄ群で６７％であり、やはりＣ群はＢ群よりも低かった。また、肝がんの状態（図１中、（Ｄ）又は（Ｅ）の状態）を呈した個体の有効Ｎ数に対する割合はＡ群で０％、Ｂ群で６３％、Ｃ群で５６％、Ｄ群で７８％であり、やはりＣ群はＢ群よりも低かった。
また、高脂肪食を摂取した群はいずれもＡＳＴ，ＡＬＴ値が増大し、ＡＳＴ／ＡＬＴ比も多くの個体で１を下回るなど、脂肪肝に認められる特徴が認められた。
高脂肪食摂取群（Ｂ，Ｃ，Ｄ群）の中で比較した場合、Ｃ群ではＢ群（コントロール群）に比較してＡＳＴ、ＡＬＴ値が有意に低下していたが（図２、ｔ−ｔｅｓｔ，ｐ＜０．０５）、Ｄ群では有意な低下が見られなかった（図２）。
以上のことから、ＮＡＳＨモデルにおいて本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムが脂肪肝及び肝がんを抑制するなどの肝臓への保護効果を奏することが示された。

１．ビフィズス菌菌体の調製（１）
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８をＧＡＭ（１％Ｇｌｃ添加）培地に植菌し、３７℃にて１６時間静置培養を行った。液体培養物を４℃、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、滅菌水による洗浄と遠心分離を３回繰り返して行い、洗浄菌体を得た。その後、凍結乾燥することによりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８粉末を得た。
２．ビフィズス菌菌体の調製（２）
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８を脱脂乳培地（培地組成：１１．５５％（ｗ／ｗ）脱脂粉乳、０．５％（ｗ／ｗ）酵母エキス、０．１％（ｗ／ｗ）アスコルビン酸ナトリウム、０．０４％（ｗ／ｖ）Ｌ−システイン）に植菌し、３７℃にて１６時間静置培養を行った。得られた培養物をそのまま凍結乾燥することによりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８粉末を得た。
上記１及び２で得られたビフィドバクテリウム・ロンガムの各菌体粉末は、下記実施例３，５，６，７において同等に用いることができる。

（錠剤の製造）
実施例２にて調製したビフィドバクテリウム・ロンガム菌体粉末１部に脱脂粉乳４部を混合し、この混合粉末を打錠機により１ｇずつ常法により打錠して、本発明のビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体２００ｍｇを含む錠剤をそれぞれ調製した。

（散剤の製造）
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８をＧＡＭ液体培地（日水製薬社製）５Ｌに摂取後、３７℃、１８時間静置培養を行った。培養終了後、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、培養液の１／５０量の濃縮菌体を得た。次いで、この濃縮菌体を、脱脂粉乳１０重量％、グルタミン酸ソーダ１重量％を含む分散媒と同量混合し、ｐＨ７に調整後、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物を６０メッシュのふるいで整粒化し、凍結乾燥菌末を製造した。第１３改正日本薬局方解説書製剤総則「散剤」の規定に準拠し、この凍結乾燥菌末１ｇにラクトース（日局）４００ｇ、バレイショデンプン（日局）６００ｇを加えて均一に混合し、散剤を得た。

（カプセル剤の製造）
表３に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに１０ｍｇずつ充填して、カプセル剤を製造した。

（スティック状健康食品の製造）
実施例２で得られたビフィドバクテリウム・ロンガムの粉末３０ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、スティック健康食品を製造した。

（飲料の製造）
表４に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、果汁飲料を製造した。

（発酵乳の製造）
ビフィドバクテリウム・ロンガムSBT2928をGAM（1%Glc添加）液体培地にて培養した。対数増殖期にある培養液を、0.3％の酵母エキスを添加した10％還元脱脂乳（115℃、20分間滅菌）に１％接種し、マザーカルチャーを作成した。
これをヨーグルトミックス（10％の還元脱脂乳を添加し、100℃にて10分間加熱したもの）に2.5％添加し、市販のスターターカルチャーとともに発酵は37℃で行った。乳酸酸度0.85に到達した時点で冷却し、発酵を終了させ、本発明の非アルコール性肝障害抑制作用を有する発酵乳を調製した。

本発明によれば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体又は培養物を有効成分とする非アルコール性肝障害抑制剤および非アルコール性肝障害抑制用飲食品を提供することができる。したがって、本願の非アルコール性肝障害抑制剤および非アルコール性肝障害抑制用飲食品を摂取することにより、手軽かつ安全な方法で十分な肝障害抑制効果が期待できる。

ＦＥＲＭＰ−１０６５７
[寄託生物材料への言及]
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＢＴ２９２８
イ当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
ロイの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成元年４月１３日
ハイの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭＰ−１０６５７

Claims

ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭＰ−１０６５７）の菌体または該菌培養物を有効成分とする非アルコール性肝障害抑制剤。
ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ２９２８（ＦＥＲＭＰ−１０６５７）の菌体または該菌培養物を有効成分とする非アルコール性肝障害抑制用飲食品。